CN109136319A - 一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的方法与应用。本发明研究发现在能够产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的微生物的发酵培养液中加入适量的过氧化氢，可以大大提高吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的产量，该方法成本低廉，操作非常简单，效率高，有推广应用价值。

Description

一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的方法与 应用

技术领域

本发明涉及微生物活性代谢产物研究领域，具体涉及一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的方法与应用。

背景技术

分子生物学技术对微生物基因序列的分析表明，大部分真菌全基因组长度超过30Mb，大于放线菌（8 Mb）和粘细菌（11 Mb），真菌所具有的生物合成基因更复杂，其合成能力远远超出其在常规培养下所产生的代谢产物种类的多样性。据推测，目前可培养的微生物中表达出来的基因还不到其所具有的基因簇数量的10%，这些在常规条件下没有表达的基因被称为“沉默基因”。微生物大量“沉默基因”的存在为天然产物化学家展现了一个潜在的、结构多样的活性物质宝库。因此，如何激活这些“沉默基因”，充分发掘微生物的生物合成潜力，使其产生结构类型更加多样的代谢产物，是微生物代谢产物研究的关键之一。

微生物代谢产物的产生受到培养条件的影响。微生物培养方法很多，在国外有学者试图系统地改变培养条件，比如：培养基的组成（碳源、氮源、NaCl的浓度），海洋营养成分（海洋底泥滤出液、海洋动物或植物的提取物、海洋生物材料或由它制成的海洋多糖、海洋蛋白等）、培养器皿的选择，通氧，加入酶抑制剂（具细胞毒和F-肌动蛋白抑制活性的Jasplakinolide）、混合培养等，来促使单一菌株产生更多数目的代谢产物。Zeeck Axel等称这一策略为“OSMAC (One Strain- Many Compounds) approach”。可见，改变微生物的培养条件，可以激活“沉默基因”，充分发掘微生物的生物合成潜力，该方法简便、有效。

过氧化氢（H₂O₂）是活性氧（Reactive Oxygen Species, 简称ROS）的一种。正常生理条件下，在氧化磷酸化代谢过程中电子从线粒体呼吸链中逸出被分子氧所捕获后形成超氧阴离子，然后在超氧化物歧化酶（SOD）、黄嘌呤氧化酶、细胞色素P450、脂氧合酶、D-氨基酸氧化酶等的作用下转化形成过氧化氢等ROS。ROS作为第二信使，通过对细胞信号转导和蛋白质功能的调控，参与细胞增殖、分化、凋亡的调节。在细胞内同时存在生成ROS的体系和拮抗其生成的抗氧化剂体系。如果机体ROS成分与抗氧化系统之间平衡失调，细胞内ROS大量积累，将造成氧化应激（Oxidative Stress）。高浓度ROS导致脂质、蛋白质和DNA过氧化；导致膜相结构脂质双分子层稳定性下降；使DNA单链破坏与断裂，促进含硫蛋白质相互交联，导致多肽破裂成碎片。

据文献报道，真菌代谢产物的生源合成途径易受ROS影响，氧化应激是多种真菌毒素生源合成的关键要素。黄曲霉毒素(Aflatoxins)、单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)、赭曲霉素A (Ochratoxin A)、橘霉素(Citrinin)、洛伐他汀(Lovastatin)、棒曲霉素(Patulin)等的生源合成均发生在真菌形态和代谢转换过程中，即ROS累积的阶段，如受外源氧化刺激，真菌将启动各种基因调控，真菌毒素基因簇表达的转录因子得到活化，真菌毒素的合成将启动或者产量大大增加。很多曲霉菌能产生黄曲霉毒素，调控黄曲霉毒素的生源合成是与氧化应激相关的转录因子Yap1。在真菌Aspergillus flavus培养基中加入2.4μg/g的H₂O₂，可诱导其产生黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 (含量达0.34 μg/g)。在真菌A. flavus和A. parasiticus的培养液中添加各种抗氧化成分，如咖啡酸、黄酮、酚酸（五倍子酸、阿魏酸），不影响真菌生长，但促进真菌细胞的抗氧化反应，SOD、CAT、GPX酶活性增强，黄曲霉毒素合成基因表达下调，黄曲霉毒素产量降低99%以上。真菌A. terreus能产胆固醇合成抑制剂洛伐他汀，繁殖期累积的ROS调控生源合成基因。在培养液中添加H₂O₂能导致早熟基因的表达和洛伐他汀的合成产量提升。加入抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）能降低ROS的累积和洛伐他汀的产量。固态培养时添加100 mM的NAC能使ROS的累积量降低53%，洛伐他汀的产量降低79%。真菌Fusarium培养基中添加H₂O₂和联胺，能诱导真菌产生B型单端孢霉烯毒素、去氧瓜萎镰菌醇（deoxynivalenol）和15-乙酰基-去氧瓜萎镰菌醇。真菌F. graminearum培养液中添加非致死剂量的H₂O₂，毒素单端孢霉烯产量大增。在培养液中加入过氧化氢酶，清除H₂O₂，毒素产量明显减少。抗氧化剂阿魏酸能抑制F. graminearum和F. culmorum产瓜萎镰菌醇(nivalenol), 去氧瓜萎镰菌醇，15-乙酰基-去氧瓜萎镰菌醇和醋酸瓜类萎蔫醇（fusarenone）。阿魏酸还能使真菌F. verticillioides产烟曲霉毒素B1的产量降低。Penicillium expansum能产生棒曲霉素，而添加抗氧化剂槲皮素和7-羟基香豆素后该合成得到抑制。在真菌Inonotus obliquus的培养液中加入H₂O₂ (1 mM浓度，加入速度为1.6 mL/h)和30 mg/L的熊果苷，该真菌黑色素的产量达到7.0 g/L，酚类化合物（黄酮，黄酮甙，多酚，小分子酚类化合物）产量达200-300 mg/L，远大于正常对照培养条件。

吲哚喹唑啉类生物碱，结构复杂，目前主要从海洋真菌中发现。1992年，Numata 等从海鱼Pseudolabrus japonicus的胃肠道中分离出1株烟曲霉Aspergillus fumigates，从该真菌发酵液中首次分离得到3个吲哚喹唑啉类 (Fumiquinazolines) 生物碱fumiquinazolines A―C。1995年，同一研究小组 Takahashi等又从此株真菌中分离得到4个新吲哚喹唑啉类生物碱fumiquinazolines D―G。化合物fumiquinazolines A―G对P388肿瘤细胞系表现出中等强度的细胞毒活性，ED₅₀分别为 6.1、16.0、52.0、13.5、13.8、14.6和17.7 μg/m L。后来，在2000年，Belofsky等从加勒比海鞘Ecteinascidia turbinata样品中分离到的一株枝顶孢霉属真菌Acremonium sp.中发现了fumiquinazolines H和I，化合物fumiquinazolines H和I对白假丝酵母菌具有弱的生长抑制活性。 海洋真菌Aspergillus sydowi PFW-13产生的 fumiquinazoline J 对tsFT210、A549、BEL-7402、HL60、P388有细胞毒性。2012年从海洋真菌Aspergillus fumigatus KMM4631分离得到fumiquinazoline K。2013年，从珊瑚中分离得到的真菌Scopulariopsis sp.中分离得到fumiquinazoline L。后来，又从海绵真菌Aspergillus sp. 中发现了fumiquinazolinesK-P；从Penicillium expansum Y32中得到fumiquinazoline Q。2015年，从海洋真菌Aspergillus sp.中分离得到fumiquinazoline S。2016年，从红树林真菌Neosartorya udagawae HDN13-313中分离得到新的吲哚喹唑啉类生物碱neosartoryadins A和B，它们具有抗流感病毒 (H1N1)的活性，IC₅₀值分别为66 和58 mM。2016年，从海洋真菌Aspergillus versicolor LZD-14-1分离得到versiquinazolines A-K，有硫氧还蛋白还原酶的抑制活性。从生源学的角度，吲哚喹唑啉类化合物是由邻氨基苯甲酸，色氨酸，丙氨酸（或者缬氨酸）衍生而来。该类化合物具有多种活性，但通过真菌发酵获得的产量均比较低。

发明内容

本发明为了解决吲哚喹唑啉类化合物在常规培养方法产量低的缺点，提供一种利用在培养基中添加适量过氧化氢提高产量的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱的方法，具体为，在能够产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的微生物的发酵培养液中加入一定量的过氧化氢。

现有技术中公开的可以产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的微生物都可以利用本发明的方法来提高其产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的产量。优选地，本发明所指的微生物为真菌、细菌、放线菌，其来源可以是陆源的，也可以是海洋的。

更优选地，所述微生物为Aspergillus、Neosartorya、Scedosporium、Penicillium、Acremonium、Dichotomomyces属的真菌。

更优选地，所述微生物为海洋真菌Scedosporium apiospermum、Aspergillus fumigates、Aspergillus versicolor、Aspergillus sydowi、Neosartorya udagawae、Neosartorya pseudofischeri、Dichotomomyces cejpii、Penicillium expansum。

作为优选实施方式，所述过氧化氢的添加量为一升发酵培养液中加入1mg～20g的过氧化氢。

作为优选实施方式，过氧化氢的添加方式可以为：直接加入到发酵培养液中，作为培养液的一种组成成分，或者可以和菌种同时加入到发酵培养液中，或者也可以在微生物培养过程中加入；过氧化氢可以一次性加入，也可以按照一定的时间间隔分批次，或者连续性加入。

作为优选实施方式，加入过氧化氢后，继续发酵1～60天。

一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的方法，包括如下步骤：将海洋真菌Scedosporium apiospermum接种GPY发酵培养液中，摇瓶培养7 d后，加入过氧化氢，继续摇瓶培养14 d，所述过氧化氢的添加量为一升GPY发酵培养液中加入1mg～20g的过氧化氢。

一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的方法，包括如下步骤：将海洋真菌Scedosporium apiospermum接种发酵培养液中，摇瓶培养7 d后，向发酵液中加入过氧化氢，继续摇瓶培养7 d，再向发酵液中加入过氧化氢，继续摇瓶培养7 d；两次加入的过氧化氢的总量与发酵培养液的质量体积比为1mg～20g /1L；所述发酵培养液的配方为：土豆200 g（煮水去渣），葡萄糖10 g，邻氨基苯甲酸 1 g、色氨酸 2 g、缬氨酸 1 g，粗海盐25g，加水配成1 L溶液，pH 7.5。

一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的方法，包括如下步骤：将海洋真菌Dichotomomyces cejpii接种GPY发酵培养液中，摇瓶培养7 d后，加入过氧化氢，继续摇瓶培养14 d，所述过氧化氢的添加量为一升GPY发酵培养液中加入1mg～20g的过氧化氢。

本发明所指的吲哚喹唑啉类生物碱是指具有下式1所述骨架结构的化合物，其中6-6-6三环骨架是由邻氨基苯甲酸、色氨酸、丙氨酸或者缬氨酸为生源前体合成而来。

式1 几种吲哚喹唑啉类生物碱化合物的结构

如上所述方法制备得到的吲哚喹唑啉类生物碱具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎镇痛、降压、降血脂等心血管疾病治疗药物应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发现在能够产吲哚喹唑啉类生物碱的微生物的发酵培养液中添加适量过氧化氢，能大大提高具有潜在的药用价值的吲哚喹唑啉类生物碱化合物的产量。该方法具有成本低、条件易控、效率高，推广应用价值高。

附图说明

图1为海洋真菌Scedosporium apiospermum的代谢产物高效液相色谱分析结果；A.以GPY（葡萄糖、蛋白胨、酵母膏）为培养基；B. GPY+1 ml/L 30%的H₂O₂；C. GPY+2 ml/L30%的H₂O₂分别培养。

图2为海洋真菌Dichotomomyces cejpii代谢产物高效液相色谱分析结果；A.以GPY（葡萄糖、蛋白胨、酵母膏）为培养基；B. GPY+1 ml/L 30%的H₂O₂。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下列实施例中所用海洋真菌Scedosporium apiospermum和Dichotomomyces cejpii分离自海南三亚西岛海域软珊瑚Lobophytum crassum的体内， 通过分析该菌的ITSrDNA，与BLAST 数据库检索比较，确定种属。菌种–80℃保藏于中山大学化学学院天然产物研究室；菌株Scedosporium apiospermum已于2017年在文章[Amino Acid-DirectedStrategy for Inducing the Marine-Derived Fungus Scedosporium apiospermum F41–1 to Maximize Alkaloid Diversity. Organic Letters. 2017, 19(18), 4888−4891.DOI: 10.1021/acs.orglett.7b02238.] 中公开报道；菌株Dichotomomyces cejpii已于2017年在文章[Diverse Secondary Metabolites from the Marine-Derived FungusDichotomomyces cejpii F31-1. Marine Drugs. 2017, 15(11), 339. DOI: 10.3390/md15110339.]中公开报道。

实施例中所述scequinadoline A和scequinadoline E的结构式、NMR数据已在Amino Acid-Directed Strategy for Inducing the Marine-Derived FungusScedosporium apiospermum F41–1 to Maximize Alkaloid Diversity. OrganicLetters. 2017, 19(18), 4888−4891.文章中公开报道。实施例中所述fiscalin C的结构式、NMR数据已在Diverse Secondary Metabolites from the Marine-Derived FungusDichotomomyces cejpii F31-1. Marine Drugs. 2017, 15(11), 339.文章中公开报道。

仪器和试剂

日本岛津公司高效液相色谱仪：LC20AT泵，SPD-20A检测器，检测波长254和230 nm。分析性型色谱柱Inertsil® ODS-SP，5 μm，250×4.6 mm；制备型色谱柱Shim-pack PRC-ODS，15 μm，250×20 mm。瑞士Bruker公司 Avance II 400 MHz核磁共振仪。

过氧化氢，30%，分析纯；乙腈，HPLC级。乙酸乙酯为市售AR 试剂。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏为生化试剂。

实施例1

一种提高海洋真菌Scedosporium apiospermum产吲哚喹唑啉类生物碱化合物scequinadoline A的产量的方法，包括以下步骤：

1、以葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏2 g，海水1 L，pH 7.5（简称GPY）为真菌培养基配方。取60个1000 mL 的干净锥形瓶，每瓶分装500 mL的GPY液体培养基，灭菌。将培养瓶随机平均分成3组，每组20瓶。1～3组均接入海洋真菌Scedosporium apiospermum。真菌在28℃下120转/分摇瓶培养7 d后，第2组的添加30% H₂O₂ 1 ml/L，第3组的添加30% H₂O₂ 2 ml/L，继续摇瓶培养14 d。各组真菌培养液用等体积乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋转蒸发浓缩得到提取物。

高效液相色谱分析采用线性梯度洗脱程序，乙腈-水作为洗脱剂，流速0.5 ml/min。0-10 min，30%乙腈–70%水；40 min，100%乙腈；60 min，100%乙腈。

2、海洋真菌Scedosporium apiospermum产吲哚喹唑啉类生物碱化合物scequinadoline E的分析：将各实验组的乙酸乙酯提取物用乙腈溶解，以乙腈-水为梯度洗脱剂，进行 HPLC分析（结果见图1）。经HPLC分析发现加入H₂O₂后，生物碱类化合物的含量明显上升，其中最强峰为化合物scequinadoline E。经对各提取物进行分离，发现在以GPY（葡萄糖、蛋白胨、酵母膏）为培养基、GPY+1 ml/L 30%的H₂O₂、以及GPY+2 ml/L 30%的H₂O₂培养条件下scequinadoline E的产率分别为0.17%、1.47%、0.98%（表1），因此，加入过氧化氢能显著提高吲哚喹唑啉类生物碱化合物scequinadoline E的产率。

表1 各培养条件下scequinadoline E的产率

实验组	GPY为培养基	GPY+1 ml/L 30%的H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>	GPY+2 ml/L 30%的H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
				10 L培养液的乙酸乙酯提取物重量	3.46 g	3.69 g	3.22 g
分离得到的scequinadoline E重量	6.1 mg	54.6 mg	31.7 mg
				scequinadoline E的产率	0.17%	1.47%	0.98%

实施例2

一种提高海洋真菌Scedosporium apiospermum产吲哚喹唑啉类生物碱化合物scequinadoline A的产量的方法，包括如下步骤：

1、以土豆200 g（煮水去渣），葡萄糖10 g，邻氨基苯甲酸 1 g、色氨酸 2 g、缬氨酸 1g，粗海盐25 g，加水配成1 L溶液，pH 7.5为真菌培养基配方。取40个1000 mL 的干净锥形瓶，每瓶分装500 mL上述液体培养基，灭菌。将培养瓶随机平均分成2组，每组20瓶。每组均接入海洋真菌Scedosporium apiospermum，真菌在28℃下120转/分摇瓶培养7 d后，第2组的添加30% H₂O₂ 0.5 ml/L，继续培养7 d后第2组的再添加30% H₂O₂ 0.5 ml/L，继续摇瓶培养7 d。各组真菌培养液用等体积乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋转蒸发浓缩得到提取物。

2、经对代谢产物进行分离、鉴定，发现提取物中分离得到吲哚喹唑啉类生物碱化合物scequinadoline A的含量较高，从第1组的提取物中分离得到scequinadoline A 共21mg，而添加了过氧化氢的培养组纯化得到scequinadoline A共65 mg，产率提高了3.1倍。

实施例3

一种提高海洋真菌Dichotomomyces cejpii产吲哚喹唑啉类生物碱化合物fiscalin C的产量的方法，包括如下步骤：

1、海洋真菌Dichotomomyces cejpii以葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏2 g，海水1 L，pH 7.5（简称GPY）为真菌培养基配方。取40个1000 mL 的干净锥形瓶，每瓶分装500 mL的GPY液体培养基，灭菌。将培养瓶随机平均分成2组，每组20瓶。每组均接入海洋真菌Dichotomomyces cejpii。真菌在28℃下120转/分摇瓶培养7 d后，第2组的添加30% H₂O₂ 1ml/L，继续摇瓶培养14 d。各组真菌培养液用等体积乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋转蒸发浓缩得到提取物。

2、海洋真菌Dichotomomyces cejpii以GPY（葡萄糖、蛋白胨、酵母膏）和GPY+1 ml/L 30%的H₂O₂为培养基所得提取物经高效液相色谱分析，代谢产物的组成和含量有显著变化（结果见图2）。经对代谢产物进行分离、鉴定，发现提取物中分离得到吲哚喹唑啉类生物碱化合物fiscalin C的含量较高，从GPY培养组的3.83 g提取物中分离得到fiscalin C 共2.3 mg，而GPY+1 ml/L 30%的H₂O₂培养组得到3.46 g提取物，经纯化得到fiscalin C共11.8mg，产率提高了5.1倍。

Claims (9)

1.一种提高微生物产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的方法，其特征在于，在能够产吲哚喹唑啉类活性生物碱化合物的微生物的发酵培养液中加入一定量的过氧化氢。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过氧化氢的添加量为一升发酵培养液中加入1mg～20g的过氧化氢。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微生物为真菌、细菌或放线菌，微生物的来源为陆源或海洋源。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物为Aspergillus、Neosartorya、Scedosporium、Penicillium、Acremonium、Dichotomomyces属的真菌。

5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物为海洋真菌Scedosporium apiospermum、Dichotomomyces cejpii。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过氧化氢的添加方式为：直接加入到发酵培养液中，作为发酵培养液的一种组成成分；或者，和菌种同时加入发酵培养液中；或者，在微生物发酵培养过程中加入，过氧化氢可以一次性加入，也可以按照一定的时间间隔分批次，或者连续性加入。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将海洋真菌Scedosporium apiospermum接种GPY发酵培养液中，摇瓶培养7 d后，向发酵液中加入过氧化氢，继续摇瓶培养14 d，所述过氧化氢的添加量为一升GPY发酵培养液中加入1mg～20g的过氧化氢。

8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将海洋真菌Scedosporium apiospermum接种发酵培养液中，摇瓶培养7 d后，向发酵液中加入过氧化氢，继续摇瓶培养7 d，再向发酵液中加入过氧化氢，继续摇瓶培养7 d；两次加入的过氧化氢的总量与发酵培养液的质量体积比为1mg～20g /1L；所述发酵培养液的配方为：土豆200 g，葡萄糖10 g，邻氨基苯甲酸 1 g、色氨酸 2 g、缬氨酸 1 g，粗海盐25 g，加水配成1 L溶液，pH 7.5。

9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将海洋真菌Dichotomomyces cejpii接种GPY发酵培养液中，摇瓶培养7 d后，加入过氧化氢，继续摇瓶培养14 d，所述过氧化氢的添加量为一升GPY发酵培养液中加入1mg～20g的过氧化氢。