CN102559795A - 发酵生产洛伐他汀的方法和所用发酵培养基 - Google Patents

Abstract

本发明提供发酵生产洛伐他汀的方法和所用发酵培养基。该发酵培养基以麦芽糖为碳源，并且该培养基不包含葡萄糖。应用该发酵培养基发酵生产洛伐他汀的方法包括将生产洛伐他汀的土曲霉(Aspergillus terreus)在本发明的发酵培养基中进行发酵培养。本发明使得洛伐他汀的发酵单位提高了10％左右，同时缩短了发酵周期，并降低了生产成本，适合工业化生产。

Description

发酵生产洛伐他汀的方法和所用发酵培养基

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种用于发酵生产洛伐他汀的发酵培养基和一种应用该发酵培养基发酵生产洛伐他汀的方法。

背景技术

洛伐他汀(Lovastatin)是微生物来源的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂类降胆固醇药物，其化学结构如下式I所示。因其作用机理明确，临床疗效显著，是目前临床上重要的防治心脑血管疾病药物。

式I

洛伐他汀是真菌的次生代谢产物，工业上主要的产生菌有土曲霉(Aspergillus terreus)和红曲霉(Monascus ruber)。

在现有技术中发酵生产洛伐他汀的培养基碳源主要为葡萄糖，或者为葡萄糖和糊精混合碳源，或者为葡萄糖和乳糖混合碳源。例如，专利文献CN1240229A中所涉及的发酵培养基的碳源为米粉，专利文献CN1373208A中提到的发酵培养基的碳源为葡萄糖和/或蔗糖。而直接利用麦芽糖作为主要碳源并且不包含葡萄糖的发酵培养基国内外尚未出现相关报道。

用葡萄糖作为碳源发酵生产洛伐他汀的方法存在以下缺陷：原材料成本较高，发酵液中洛伐他汀含量偏低，发酵周期较长。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种低成本、高效的用于发酵生产洛伐他汀的发酵培养基和一种应用该发酵培养基制备洛伐他汀的方法。

具体而言，本发明提供：

(1)一种用于发酵生产洛伐他汀的发酵培养基，其中，所述发酵培养基以麦芽糖为碳源，并且该发酵培养基不包含葡萄糖。

(2)根据(1)所述的发酵培养基，其中，使用该发酵培养基发酵生产洛伐他汀的菌种为土曲霉(Aspergillus terreus)。

(3)根据(1)所述的发酵培养基，其中，所述麦芽糖在所述发酵培养基中的含量以重量/体积百分比计为18-20％。其中是重量/体积百分比按每100mL发酵培养基中所含有的组分的克重数进行计算的。

(4)根据(3)所述的发酵培养基，其中，所述麦芽糖的含量为20.0％。

(5)根据(3)或(4)所述的发酵培养基，其中，所述发酵培养基还含有分别具有以下重量/体积百分比的以下组分：4.0％的棉籽粉，1.0％的蛋白胨，0.5％的固体麦精，0.2％的氯化钠，0.05％的磷酸二氢钾，0.05％的硫酸镁；并且所述发酵培养基的pH值为6.5。

(6)根据(5)所述的发酵培养基，其中，所述发酵培养基还含有重量/体积百分比为0.05％的消泡剂。

(7)一种发酵生产洛伐他汀的方法，该方法包括，将生产洛伐他汀的土曲霉在(1)-(6)中任一项所述的发酵培养基中进行发酵培养。

(8)根据(7)所述的方法，其中，所述发酵培养的时间为155-160小时。

(9)根据(8)所述的方法，其中，所述时间为160小时。

(10)根据(7)-(9)中任一项所述的方法，其中，所述发酵培养的温度为27.5-28.5℃。

(11)根据(10)所述的方法，其中，所述发酵培养的温度为28℃。

与使用葡萄糖作为碳源的发酵培养基相比，本发明具有以下有益效果：

1)洛伐他汀的产量提高了10％；

2)缩短了发酵周期。目前现有技术发酵周期较长，在184h-240h之间，而本发明可将发酵周期缩短至155-160h左右；

3)生产成本大大降低。首先，在原料成本方面，葡萄糖相比麦芽糖价格偏高40-50％左右，将碳源替换为麦芽糖后，原料成本大幅降低。其次，发酵周期的缩短也降低了生产成本，适合工业化生产。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

在本文中“土曲霉(Aspergillus terreus)”可以是任何能主要产生洛伐他汀的土曲霉或其变种。例如，在中国典型培养物保藏中心保藏的土曲霉CCTCC AF93208。

在本文中“发酵单位”是指发酵液中洛伐他汀的含量。

在本文中“固体麦精”是指Malt extract，别名麦芽提取物。

在本文中“重量/体积百分比”是按每100mL发酵培养基中所含有的组分的克重数进行计算的。例如，发酵培养基含有重量/体积百分比为20％的麦芽糖是指每100mL发酵培养基中含有20g麦芽糖。

在本发明的研究过程中，发明人在摇瓶实验中使用了多种碳源以替代葡萄糖(包括麦芽糖、麦芽糊精、淀粉、乳糖和甘油)，发现麦芽糖作为发酵的主要碳源时结果最优，发酵单位高于碳源为葡萄糖的配方。发明人接着在中试和试生产中发现，当洛伐他汀发酵碳源替换为麦芽糖后，通过改善发酵前期控制条件(包括提高转速和加大空气流量)，使发酵代谢速度加快，周期从184h缩短至160h左右，且发酵单位提高10％以上。

因此，本发明提供了一种用于发酵生产洛伐他汀的发酵培养基，该发酵培养基以麦芽糖为碳源，并且该培养基不包含葡萄糖。使用该发酵培养基发酵生产洛伐他汀的菌种优选为土曲霉。

优选的是，本发明的发酵培养基中含有重量/体积百分比为18.0-20.0％的麦芽糖，例如含有重量/体积百分比为18％、19％、20％的麦芽糖。更优选的是，本发明的发酵培养基中含有重量/体积百分比为20.0％的麦芽糖。

本发明的发酵培养基配方按重量/体积百分比计优选为：麦芽糖18.0-20.0％，棉籽粉4.0％，蛋白胨1.0％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，pH6.5。

更优选的是，该发酵培养基配方按重量/体积百分比计为：麦芽糖20.0％，棉籽粉4.0％，蛋白胨1.0％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，pH6.5。

此外，还可在上述发酵培养基配方中添加重量/体积百分比为0.05％的消泡剂。消泡剂的例子包括但不限于：泡敌(聚醚GPE消泡剂)。

本发明还提供了一种应用前述发酵培养基发酵生产洛伐他汀的方法。

发酵培养前，可以先将土曲霉孢子接入750mL摇瓶中，摇瓶培养基通常含有葡萄糖，棉籽粉，蛋白胨，固体麦精，金属盐等，在26.5-27.5℃培养一定时间后转入一级种子培养基，一级种子培养基通常含有葡萄糖，棉籽粉，蛋白胨，固体麦精，金属盐等，在26.5-27.5℃培养一定时间后转入二级种子培养基，二级种子培养基通常含有葡萄糖，棉籽粉，蛋白胨，固体麦精，金属盐等，在26.5-27.5℃培养一定时间后可转入本发明的发酵培养基。优选的是，在27.5-28.5℃进行发酵培养；更优选的是，在28℃进行发酵培养。还优选的是，发酵培养进行155-160小时；更优选的是，发酵培养进行160小时。

为了更好的理解本发明，以下通过具体例子进一步解释或说明本发明内容，但这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。

在下述例子中，棉籽粉可购自北京康明威培养基技术有限公司；蛋白胨可购自贵州新华高蛋白胨饲料有限公司；固体麦精可购自上海优品生化有限公司；消泡剂可购自武汉瑞美特化工有限公司。

在下述例子中洛伐他汀有效成分含量的检验方法如下：

(1)工作对照品溶液的配制

精密称定洛伐他汀工作对照品10mg于25ml容量瓶中，用适量甲醇溶解后，用流动相稀释并定容至刻度，摇匀即得。

(2)供试品溶液的配制

取均匀的洛伐他汀发酵液10ml于三角瓶中，用约6mol/L盐酸溶液调节pH至3.5左右(约2滴)，加入冰醋酸20ml，震荡30min后取下，加入170ml甲醇溶液，混匀，过滤即得。

(3)色谱条件

检测波长：237nm

色谱柱：C8(5um 4.6×250mm)

温度：室温

流动相：量取0.1mol/L冰醋酸溶液与甲醇溶液按2∶8比例混匀，抽滤即得。

流速：1.0ml/min

(4)测定

开启高效液相色谱仪(agilent1100，美国安捷伦公司)，待系统稳定后，按照色谱条件准确吸取对照品溶液10μl注入色谱仪中，记录色谱图。平行进样三次，取三次峰面积的平均值作为对照品溶液的峰面积。另取供试液注入色谱仪中，记录色谱图，按下式计算各供试液中洛伐他汀有效成分的含量。

(5)计算

洛伐他汀有效成分含量(μg/ml)＝(A1+A2)/A×C×N

公式中，A1——供试液中洛伐他汀酸的峰面积；

A2——供试液中洛伐他汀的峰面积；

A——工作对照品溶液的峰面积；

C——工作对照品溶液浓度(μg/ml)

N——样品稀释倍数

试验例1：种子培养过程(1M³种子罐)

将土曲霉孢子接入750mL摇瓶中制备洛伐他汀种子液，培养基配方按重量/体积百分比为：葡萄糖10.0％，棉籽粉2.0％，蛋白胨0.5％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，消泡剂0.05％，pH6.5。121℃灭菌30min，26±0.5℃培养72h。

将洛伐他汀种子液接入1M³种子罐(消后体积600L)中，种子培养基配方按重量/体积百分比为：葡萄糖10.0％，棉籽粉2.0％，蛋白胨0.5％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，消泡剂0.05％，pH6.5。121℃灭菌30min，接种量0.1％，转速150r/min，27±0.5℃培养96h。

试验例2：种子培养过程(10M³种子罐)

将试验例1制备好的洛伐他汀种子液接入10M³种子罐(消后体积6M³)中，种子培养基配方按重量/体积百分比为：葡萄糖10.0％，棉籽粉2.0％，蛋白胨0.5％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，消泡剂0.05％，pH6.5。121℃灭菌30min，接种量10％，转速150r/min，27±0.5℃培养72h。

比较例1

本比较例以5M³发酵罐为例说明以葡萄糖为碳源发酵生产洛伐他汀的过程。

发酵培养基配方按重量/体积百分比为：葡萄糖20.0％，棉籽粉4.0％，蛋白胨1.0％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，消泡剂0.05％，pH6.5。

发酵培养基的制备方法如下：

1.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的各原材料(除葡萄糖外)，搅拌均匀，用泵输送至5M³发酵罐中，用饮用水定容至一定体积，121℃灭菌30min。

2.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的葡萄糖，搅拌均匀，用泵输送至糖罐中，用饮用水定容至一定体积，118℃灭菌40min，然后混入5M³发酵罐中。

发酵生产过程如下：

按试验例1的方式在1M³种子罐中制备洛伐他汀种子，按10％的接种量接入5M³发酵罐(消后体积4M³)中，培养温度28±0.5℃，转速160r/min，空气流量160M³/h，培养184h后放罐。HPLC测得最终发酵液中洛伐他汀含量为8.5g/l。

比较例2

本比较例以50M³发酵罐为例说明以葡萄糖为碳源发酵生产洛伐他汀的过程。

发酵培养基配方按重量/体积百分比为：葡萄糖20.0％，棉籽粉4.0％，蛋白胨1.0％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，消泡剂0.05％，调pH为6.5。

发酵培养基的制备方法如下：

1.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的各原材料(除葡萄糖外)，搅拌均匀，用泵输送至50M³发酵罐中，用饮用水定容至一定体积，121℃灭菌30min。

2.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的葡萄糖，搅拌均匀，用泵输送至糖罐中，用饮用水定容至一定体积，118℃灭菌40min，然后混入50M³发酵罐中。

发酵生产过程如下：

按试验例2的方式在10M³种子罐中制备洛伐他汀种子，按10％的接种量接入50M³发酵罐(消后体积44M³)中，培养温度28±0.5℃，转速120r/min，空气流量1600M³/h，培养160h后放罐。HPLC测定最终发酵液中洛伐他汀含量为8.3g/l。

实施例1

本实施例以5M³发酵罐为例说明本发明的发酵制备洛伐他汀的过程。

发酵培养基配方按重量/体积百分比为：麦芽糖20.0％，棉籽粉4.0％，蛋白胨1.0％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，消泡剂0.05％，调pH为6.5。

发酵培养基的制备方法如下：

1.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的各原材料(除麦芽糖外)，搅拌均匀，用泵输送至5M³发酵罐中，用饮用水定容至一定体积，121℃灭菌30min。

2.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的麦芽糖，搅拌均匀，用泵输送至糖罐中，用饮用水定容至一定体积，118℃灭菌40min，然后混入5M³发酵罐中。

发酵生产过程如下：

按试验例1的方式在1M³种子罐中制备洛伐他汀种子，按10％的接种量接入5M³发酵罐(消后体积4M³)中，培养温度28±0.5℃，转速180r/min，空气流量180M³/h，培养160h后放罐。HPLC测定最终发酵液中洛伐他汀含量为9.4g/l，产量相对于比较例1提高了10.6％。

实施例2

本实施例以5M³发酵罐为例说明本发明的发酵制备洛伐他汀的过程。

发酵培养基配方按重量/体积百分比为：麦芽糖18.0％，棉籽粉4.0％，蛋白胨1.0％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，调pH为6.5。

发酵培养基的制备方法如下：

1.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的各原材料(除麦芽糖外)，搅拌均匀，用泵输送至5M³发酵罐中，用饮用水定容至一定体积，121℃灭菌30min。

2.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的麦芽糖，搅拌均匀，用泵输送至糖罐中，用饮用水定容至一定体积，118℃灭菌40min，然后混入5M³发酵罐中。

发酵生产过程如下：

按试验例1的方式在1M³种子罐中制备洛伐他汀种子，按10％的接种量接入5M³发酵罐中的种子培养基(消后体积4M³)中，培养温度28±0.5℃，转速180r/min，空气流量180M³/h，培养160h后放罐。HPLC测定最终发酵液中洛伐他汀含量为9.2g/l，产量相对于比较例1提高了8.2％。

实施例3

本实施例以50M³发酵罐为例说明本发明的发酵制备洛伐他汀的过程。

发酵培养基配方按重量/体积百分比为：麦芽糖20.0％，棉籽粉4.0％，蛋白胨1.0％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，消泡剂0.05％，调pH为6.5。

发酵培养基的制备方法如下：

1.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的各原材料(除麦芽糖外)，搅拌均匀，用泵输送至50M³发酵罐中，用饮用水定容至一定体积，121℃灭菌30min。

2.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的麦芽糖，搅拌均匀，用泵输送至糖罐中，用饮用水定容至一定体积，118℃灭菌40min，然后混入50M³发酵罐中。

发酵生产过程如下：

按试验例2的方式在10M³种子罐中制备洛伐他汀种子，按10％的接种量接入50M³发酵罐(消后体积44M³)中，培养温度28±0.5℃，转速140r/min，空气流量1800M³/h，培养160h后放罐。HPLC测定最终发酵液中洛伐他汀含量为9.3g/l，产量相对于比较例2提高了12.0％。

实施例4

本实施例以50M³发酵罐为例说明本发明的发酵制备洛伐他汀的过程。

发酵培养基配方按重量/体积百分比为：麦芽糖18.0％，棉籽粉4.0％，蛋白胨1.0％，固体麦精0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，调pH为6.5。

发酵培养基的制备方法如下：

1.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的各原材料(除麦芽糖外)，搅拌均匀，用泵输送至50M³发酵罐中，用饮用水定容至一定体积，121℃灭菌30min。

2.在配料桶中加适量饮用水，接着投入配方量的麦芽糖，搅拌均匀，用泵输送至糖罐中，用饮用水定容至一定体积，118℃灭菌40min，然后混入50M³发酵罐中。

发酵生产过程如下：

按试验例2的方式在10M³种子罐中制备洛伐他汀种子，按10％的接种量接入50M³发酵罐(消后体积44M³)中，培养温度28±0.5℃，转速140r/min，空气流量1800M³/h，培养160h后放罐。HPLC测定最终发酵液中洛伐他汀含量为9.1g/l，产量相对于比较例2提高了9.6％。

Claims (11)

1.一种用于发酵生产洛伐他汀的发酵培养基，其中，所述发酵培养基以麦芽糖为碳源，并且该发酵培养基不包含葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中，使用该发酵培养基发酵生产洛伐他汀的菌种为土曲霉(Aspergillus terreus)。

3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其中，所述麦芽糖在所述发酵培养基中的含量以重量/体积百分比计为18-20％。

4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其中，所述麦芽糖的含量为20.0％。

5.根据权利要求3或4所述的发酵培养基，其中，所述发酵培养基还含有分别具有以下重量/体积百分比的以下组分：4.0％的棉籽粉，1.0％的蛋白胨，0.5％的固体麦精，0.2％的氯化钠，0.05％的磷酸二氢钾，0.05％的硫酸镁；并且所述发酵培养基的pH值为6.5。

6.根据权利要求5所述的发酵培养基，其中，所述发酵培养基还含有重量/体积百分比为0.05％的消泡剂。

7.一种发酵生产洛伐他汀的方法，该方法包括，将生产洛伐他汀的土曲霉在权利要求1-6中任一项所述的发酵培养基中进行发酵培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述发酵培养的时间为155-160小时。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述时间为160小时。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，所述发酵培养的温度为27.5-28.5℃。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述发酵培养的温度为28℃。