CN102234677B - 一种串珠镰孢菌发酵转化人参二醇组皂苷的方法 - Google Patents

一种串珠镰孢菌发酵转化人参二醇组皂苷的方法 Download PDF

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本发明公开了一种串珠镰孢菌发酵转化人参二醇组皂苷的方法，利用串珠镰孢菌发酵转化人参二醇组皂苷，增加了中药生物转化中的菌种选择，串珠镰孢菌对含有二醇组人参皂苷的发酵底物具有广泛的适应性和稳定性，发酵工艺简单，转化率高，操作容易，有利于工业化应用。

Description

一种串珠镰孢菌发酵转化人参二醇组皂苷的方法
技术领域
本发明涉及微生物转化人参皂苷方法，尤其是公开了一种串珠镰孢菌发酵转化人参二醇组皂苷的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
在生物医药技术领域中，目前对人参皂苷转化主要通过酶转化法和微生物发酵法：其中，酶转化法存在转化酶制备困难，底物成本高等缺点，使人参皂苷的转化受到很大限制；而微生物发酵法对人参皂苷转化主要是肠道厌氧菌和从参地土中分离筛选的菌株，原料一般要求人参皂苷，制备成本昂贵，转化率偏低。
本发明涉及的串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme) 为植物病原真菌镰刀属真菌，经检索在用于转化人参皂苷二醇组皂苷方面的文献未见报道。
发明内容
本发明公开了一种串珠镰孢菌发酵转化人参皂苷二醇组皂苷的方法，具有很高的转化率，适用于产业化生产。
本发明的技术解决方案如下：
1、串珠镰孢菌发酵转化人参二醇组皂苷的方法，包括以下步骤：
将串珠镰孢菌菌种经活化后制作液体菌种，液体菌种接种于含有人参二醇组皂苷的发酵基质上，发酵培养过程中在菌丝体酶系的作用将人参二醇组皂苷Rb1，Rd进行转化，得到产物人参皂苷Compound K，得到本发明。
所述的发酵基质包括含有人参二醇组皂苷的中药材人参、西洋参、三七或绞股蓝药材本身，药材提取得到的总皂苷以及它们茎叶的总苷。
2、所述的转换方法，其特征在于液体发酵方式转化：将串珠镰孢菌制作液体菌种，菌种接入发酵基质中进行生物转化，接种量5%，摇床培养24小时，得到本发明。
3、所述的转换方法，其特征在于固体发酵方式转化：将串珠镰孢菌制作液体菌种，菌种接入固体发酵基质进行生物转化，接种量4mL，进行24℃暗培养，得到本发明。
4、所述的转换方法，其特征在于直接将单体人参皂苷Rb1进行生物转化，接种量11%，续代培养24小时，取人参皂苷Rb1水溶液，加入菌株发酵液中，摇床连续培养15d，得到本发明。
本发明的积极效果在于：利用串珠镰孢菌发酵转化人参二醇组皂苷，增加了中药生物转化中的菌种选择，串珠镰孢菌对含有二醇组人参皂苷的发酵底物具有广泛的适应性和稳定性，发酵工艺简单，转化率高，操作容易，有利于工业化应用。
附图说明：
图1为串珠镰孢菌转化三七茎叶总苷的TLC检测图；
其中，0为三七茎叶总皂苷； PF8*为未添加皂苷的串珠镰孢菌发酵液；
PF8为串珠镰孢菌的三七茎叶总皂苷发酵液； C-K为人参皂苷Compound K标准品。
图2为串珠镰孢菌转化三七茎叶总苷的HPLC-ELSD检测结果图；
其中，A.串珠镰孢菌发酵液(未添加三七茎叶总皂苷)； B.三七茎叶总皂苷与PDB培养基；C.三七茎叶总皂苷的串珠镰孢菌转化发酵液； D.人参皂苷混合标准品。
图3为串珠镰孢菌以西洋参为基质发酵培养中人参皂苷含量变化分析图。
图4为串珠镰孢菌转化单体人参皂苷Rb1的HPLC-MS检测结果图；
其中，A：标品HPLC-MS图；B:发酵1d样图品；C：发酵4d样品图；D：发酵8d样品图；E：发酵14d样品图；F空白菌液样品图。
图5为串珠镰孢菌对人参皂苷Rb1的转化过程中单体皂苷含量变化。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1：
串珠镰孢经液体发酵转化三七茎叶总苷，转化得到人参皂苷Compound K，具体步骤如下：
1．液体菌种制作：串珠镰孢试管菌种接种于PDA培养基平板，25℃暗培养至菌落接近长满平板。在菌落边缘打取菌饼，接种至装有50mL PDB培养基的三角瓶中，每瓶接入3枚，置于温度为27 ℃，转速为180 r·min-1摇床上暗培养48小时，作为发酵的种子液。
2．皂苷转化：吸取5mL种子液，加入到装有50 mLPDB培养基的100 mL三角瓶中，接种3瓶，置于摇床上继续培养24小时。吸取1 mL浓度为20 mg·mL-1灭菌三七茎叶总皂苷水溶液，加入到以上每种菌株的其中2瓶，另外1瓶留作对照。此外，保留2瓶PDB培养基，不接种菌株，只加入1 mL三七茎叶总皂苷水溶液。摇床继续培养10天。水饱和正丁醇萃取发酵转化完成的菌液，萃取3次后合并正丁醇相，挥干正丁醇，将残渣用甲醇定容至1 mL，使用0.22 μｍ微孔滤膜过滤，做为TLC检测和HPLC-ELSD检测的样品。
3. 仪器与设备：高效液相色谱仪(日本岛津10AvP），LC-10AtvP型液相色谱泵，SIL-10AdvP型自动进样器，CTO-AvP型色谱柱恒温箱，CLASS-vP色谱工作站，色谱柱：SHI-MADZUC185 μm(4.6×250 mm)，蒸发光散射检测器(美国SofTA公司300s)，氮空发生器(北京汇佳精仪公司GNA-300)，电子分析天平(sartorius CPA225D型)，三七茎叶总皂苷,人参皂苷Rb1、Rd、C-K标准品，层析硅胶(G)—薄板(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)
4．薄层测定条件：样品和标准品点样于薄层层析板上，展开剂为：氯仿:甲醇(5:1, v/v)，喷10%硫酸—乙醇溶液后于105 ℃显色3分钟。
5．HPLC-ELSD检测条件：分别精密称取1.0 mg人参皂苷Rb1、Rd、Compound K标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，制成人参皂苷混合标准品。流速1.0 mL·min-1，柱温25℃，洗脱条件见表2。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度70 ℃，载气流速350 mi·min-1。
5．薄层层析检测的结果：在（图1）可以看出，三七茎叶总皂苷添加到串珠镰孢菌的发酵液中，经过10天的液态发酵转化过程，有新的低极性人参皂苷成分产生，该成分在未添加三七茎叶总皂苷的发酵液中不存在，同时也不是来自所使用的三七茎叶总皂苷底物，由此可以得出三七茎叶总皂苷是在串珠镰孢菌的生物转化作用下产生了新的人参皂苷成分Compound K。
6．HPLC-ELSD检测结果：在(图2)发酵过程中三七茎叶总皂苷的成分发生变化。通过比较未添加三七茎叶总皂苷的发酵液、三七茎叶总皂苷与PDB培养基、三七茎叶总皂苷转化发酵液和人参皂苷混合标准品的HPLC图，底物中的人参皂苷Rb1几乎转化完全，人参皂苷Rd的含量也明显减少，而人参皂苷Copound K在底物中完全不含有，经过发酵转化后含量显著增加，因此，串珠镰孢液体发酵转化三七茎叶总苷可以将二醇组皂苷进行转化，得到人参皂苷Copound-K。
7．实验用培养基配方说明：PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL，pH自然；PDB培养基：配制方法同PDA培养基，不加入琼脂。
实施例2：
串珠镰孢经固体发酵转化西洋基质中人参皂苷，转化得到人参皂苷Compound K，具体步骤如下：
1.液体菌种制作：实施方案1中1液体菌种制作；
2.固体发酵培养：选取5年生健康无病鲜西洋参，洗净后除去须根，留取主根，切为厚约2mm参片，选用100mL三角瓶，每瓶装入参片10g，121度灭菌30min，接种4mL液体菌种，每菌种做6瓶，置于24度黑暗培养，整个培养时间为40天。每5天取样一次，即在固体发酵培养的5天，10天，15天，20天，25天，30天，35天，40天取样。取样后按1g：5mL加入甲醇静置提取，提取时间2天，过滤后定容于50mL，待测。测定指标包括人参皂苷Rb1，Rd，Compound K。
3. 仪器与设备：高效液相色谱仪(日本岛10AvP），LC-10AtvP型液相色谱泵，SIL-10AdvP型自动进样器，CTO-AvP型色谱柱恒温箱，CLASS-vP色谱工作站，色谱柱：SHI-MADZUC185 μm(4.6×250 mm)，蒸发光散射检测器(美国SofTA公司300s)，氮空发生器(北京汇佳精仪公司GNA-300)，电子分析天平(sartorius CPA225D型)。
4．HPLC-ELSD检测条件：分别精密称取1.0 mg人参皂苷Rb1、Rd、C-K标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，制成人参皂苷混合标准品。流速1.0 mL·min-1，柱温25℃，洗脱条件见表1。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度70℃，载气流速350
mi·min-1。
5. HPLC-ELSD测定结果分析：在发酵培养过程中，西洋参基质中的人参皂苷Rb1含量表现为减少趋势，迅速减少发生在5-10天和15-20天，培养结束时基质中不含有人参皂苷Rb1；人参皂苷Rd含量表现为先升高后降低，0-10天含量明显增加，10-20天含量迅速减少，培养结束时基质中不含有人参皂苷Rd；人参皂苷Compound-K出现在培养的20天，20-30天含量增加， 30-40天含量降低；串珠镰孢菌对西洋参基质中人参皂苷Rb1，Rd，Compound-K具有生物转化作用，培养一定时间可以将人参皂苷Rb1，Rd完全转化，在培养过程中转化出稀有皂苷Compound-K，最高含量为1.5mg/g。
实施例3：
串珠镰孢经固体发酵转化绞股蓝中人参皂苷，转化得到人参皂苷Compound K，具体步骤如下：
1.液体菌种制作：实施例1中1液体菌种制作；
2.固体发酵培养：选取干燥绞股蓝根部，切为厚约3mm参片，选用100mL三角瓶，每瓶装入切片5g加水10mL，121度灭菌30min，接种4mL液体菌种，每菌种做8瓶，置于24度黑暗培养，整个培养时间为40天。每5天取样一次，即在固体发酵培养的5天，10天，15天，20天，25天，30天，35天，40天取样。取样后冻干，按1g：5mL加入甲醇静置提取，提取时间2天，过滤后定容于25mL，待测。测定指标包括人参皂苷Rb1，Rd，Compound K。
3. 仪器与设备：实施例3中3.
4．HPLC-ELSD检测条件：实施例3中4。
5. HPLC-ELSD测定结果分析：在发酵培养过程中，绞股蓝基质中的人参皂苷Rb1含量表现为减少趋势，迅速减少发生在0-20，培养结束时基质中不含有人参皂苷Rb1；人参皂苷Rd含量表现为先升高后降低，0-15天含量明显增加，15-30天含量迅速减少，培养结束时基质中不含有人参皂苷Rd；人参皂苷Compound-K出现在培养的25天，25-35天含量降低；串珠镰孢菌对绞股蓝基质中人参皂苷Rb1，Rd，Compound-K具有生物转化作用，培养一定时间可以将人参皂苷Rb1，Rd完全转化，在培养过程中转化出稀有皂苷Compound-K，最高含量为0.5mg/g。
实施例4：
串珠镰孢经液体发酵转化人参皂苷Rb1为人参皂苷Compound K，具体步骤如下：
1.液体菌种制作：将试管种接于PDA平板上，25℃黑暗培养至菌落接近长满平板。在菌落边缘打取直径5mm的菌饼，将菌饼接种于装有50mLPDB培养基的100mL三角瓶中，每瓶接入3枚菌饼，置于180r·min-1的摇床上27℃下培养48h，作为发酵种子液。
2.人参皂苷Rb1溶液配制：精确称取100mg人参皂苷Rb1，用蒸馏水定容至10mL，
制成10mg/mL的三七茎叶总皂苷水溶液，使用无菌微孔滤膜过滤溶液。
3.发酵转化：吸取10mL种子液，接入到装有90mL复合PDB培养基的250mL三角瓶中，置于180r·min-1的摇床上27℃下继代培养24h。吸取1mL人参皂苷Rb1水溶液，加入菌株发酵液中，摇床连续培养15d。
4．取样测定：发酵转化人参皂苷Rb1的过程中，从0时开始每隔1d吸取5mL菌液，使用水饱和正丁醇超声萃取，离心后取上层正丁醇相，重复3次，合并萃取液，40℃挥干溶剂，残渣用甲醇定容至1mL，使用0.22μｍ针筒式滤膜过滤器过滤，滤液做为HPLC-MS检测的样品。
5.仪器与设备： Sartorius group公司生产电子分析天平型号CPA225D，1200Agilent高效液相色谱仪，电喷雾-离子阱质谱仪6310Agilent，色谱柱TC-C18(2) 4.6×250mm, 5μm Agilent。
6．标准品制备：分别精密称取3.0mg人参皂苷Rb1、Rd、F2、Compound K标准品，混合后用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，制成浓度为300μg/mL的人参皂苷标准品溶液。
7.色谱与质谱条件：
色谱条件：流动相A为醋酸铵(5mM)-水，B为醋酸铵(5mM)-90%乙腈的水溶液，流速1.0mL·min-1，柱温35℃，洗脱条件见表4.1。
质谱条件：ESI离子源，负离子模式，雾化气压力25psi，干燥气流量7L·min-1，干燥气温度350℃。
8.HPLC-MS测定结果：由图4选取发酵1d,4d,8d,14d的样品测定图进行分析，可知，
1d时样品种Rb1含量最多，有少量Rd，不含有F2与Compound K；4d时Rb1转化完全，Rd增多，出现少量F2，未出现Compound K；8d时Rd含量继续减少，F2增多，含有Compound K；14d时Rd含量很少，F2含量减少，Compound K含量达到最高值；空白菌液中不含有本次所测定的这4种人参皂苷；由图中还可以知道转化过程中伴随有一些未知的人参皂苷出现，这些未知人参皂苷还有待进一步深入研究。因此串珠镰孢可以将人参皂苷Rb1进行转化，产物人参皂苷Compound K转化率为76%串珠镰孢菌转化人参皂苷Rb1为人参皂苷Compound K的转化途径分析：由图5分析，人参皂苷Rb1的转化在发酵的开始到4d发生，4d时Rb1含量为0；人参皂苷Rd的出现在发酵的1d，1d-4d含量升高，随后直到发酵结束含量逐渐降低；F2出现在发酵的3d，8d时最多，随后逐渐降低；Compound K出现在发酵的6d，14d达到最高含量，然后逐渐降低。结合图4的分析可以可得出，人参皂苷Rb1的转化为Compound K的主要途径应该为Rb1→Rd→F2→Compound K，但在串珠镰孢液体发酵转化Rb1为Compound K的过程中在菌体复杂酶系的作用下还有一些其他皂苷伴随出现。

Claims (1)

1.串珠镰孢菌在转化为人参皂苷Compound K中的用途；
所述串珠镰孢菌是通过以下方法制备的：串珠镰孢试管菌种接种于PDA培养基平板，25℃暗培养至菌落接近长满平板；在菌落边缘打取菌饼，接种至装有50mL PDB培养基的三角瓶中，每瓶接入3枚，置于温度为27 ℃，转速为180 r·min-1摇床上暗培养48小时，得发酵的种子液；
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，pH自然；
PDB培养基：配制方法同PDA培养基，不加入琼脂。
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