CN102382866B - 脑苷脂的制备、纯化及含量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脑苷脂的制备、纯化及含量检测方法，属于脑苷脂的制备领域。本发明所述脑苷脂的制备方法包括：将块菌属(Tuber)菌株进行生物发酵，得到含有脑苷脂的菌丝体。本发明对液体发酵中各步骤中的培养基的组成和培养条件进行了优化和筛选，最大限度的提高了脑苷脂的产率。本发明还公开了一种从上述菌丝体中分离纯化脑苷脂及其含量检测的方法。本发明利用块菌液体发酵生产脑苷脂与现有的脑苷脂生产方法相比，具有成本低、周期短、操作简单、质量可控、分离过程简单等优点。

Description

脑苷脂的制备、纯化及含量检测方法

技术领域

本发明涉及一种鞘脂类化合物的制备方法，尤其涉及一种脑苷脂的制备及纯化方法，本发明还涉及一种检测脑苷脂含量的方法，属于脑苷脂的制备领域。

背景技术

脑苷脂是一种糖基鞘脂类化合物(又名cerebroside或glycoceramide)，主要存在于哺乳动物的脑组织、表皮，以及心脏、肝脏、红细胞的膜组织中；在一些大型真菌和高等植物以及一些海洋生物(海盘车、海星等)中也有分布。其结构特征是由神经酰胺和糖两部分组成，神经酰胺是由长链脂肪酸中的羧基与神经鞘氨醇(又称长链碱)的氨基经脱水以酰氨键相连形成的一类酰胺类化合物。神经酰胺通过C-1位上羟基与已糖通过β-糖苷键连接而成脑苷脂。存在于真菌、陆生植物、海洋生物中的脑苷脂类基本上只含有1个糖基且糖的种类较为固定，多为葡萄糖、半乳糖或氨基糖。

葡萄糖脑苷脂的结构式如下图所示：

脑苷脂据报道其具有调控细胞生长，抗肿瘤、调节免疫、心血管保护、肝保护、保湿、等功能(Pharmacol Res 2003；47(5)：383-392，Fitoterapia 2007；78：490-495，Vaccine 2008；26(15)：1807-1816，J Ethnopharmacol 2001；77(1)：129-131，JAgric Food Chem，2002，50(5)：1150-1160)越来越广泛地应用于医药、食品和化妆品领域中，可用于抗衰老、抗肿瘤、调节免疫功能药物的研究，化妆品的开发等。

目前应用的脑苷脂多为天然提取物，取自猪皮、牛脑、鸡蛋、血细胞、植物(如小麦)和酵母细胞等，但产量低，工业提取价值不高，这些因素导致了脑苷脂的价格高昂。因此寻找一种适合大规模工业化生产脑苷脂的技术和方法，成为脑苷脂研发的重中之重。

块菌(truffle)在生物分类学上属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、块菌目(Tuberales)、块菌科(Tuberaceae)、块菌属(Tuber)。常见的块菌有黑孢块菌(Tuber melanosporum)、夏块菌(Tuber aestivum)、白块菌(Tuber magnatum)、印度块菌(Tuber indicum)和中国块菌(Tuber sinense)。目前，市场上的块菌主要来源于野生及半人工模拟栽培。野生的块菌资源相当有限，而且地域局限性和生长环境要求苛刻。半人工模拟栽培块菌，从接种到形成子实体需要7-9年，而且人工栽培过程的质量无法控制。物以稀为贵，素有“黑色钻石”之称的黑孢块菌在国际市场上价格高达1000多美元每公斤。高锦明等曾对印度块菌子实体的活性成分进行分析鉴定，首次分离得到4个新的神经酰胺类化合物(未命名)(Chin Chem Lett 2002；13(4)：325-326，Chem Phys Lipids 2004；131：205-213)。

总之，目前脑苷脂的制备方法普遍存在规模小、产量低、成本高等一系列问题，有待改进，开发出一种廉价易行、可规模化工业生产的脑苷脂的制备方法将具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术所存在的规模小、产量低、成本高等不足，提供一种新的脑苷脂的制备方法，该方法切实可行、操作简单、周期短、质量可控、无毒性、成本低、易规模化工业生产。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种脑苷脂的制备方法，包括：将块菌属(Tuber)菌株进行生物发酵，得到含有脑苷脂的菌丝体。

所述的块菌属(Tuber)优选为中国块菌(Tuber sinense)、印度块菌(Tuberindium)、黑孢块菌(Tuber melanosporum)、白块菌(Tuber magnatum)或夏块菌(Tuber aestivum)；这些块菌属菌株都可从商业途径购买得到。

其中，所述的生物发酵依次包括以下步骤：斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、液体发酵；其中所述的液体发酵包括摇瓶或生物反应器规模的发酵过程。

上述各个步骤中所用到的培养基和培养条件可以是块菌属(Tuber)菌株在进行液体发酵时所常用的培养基和培养条件。

作为参考，所述的培养基和培养条件分别如下：

(1)斜面菌种培养：

培养基：葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；

培养条件：培养温度为15-40℃。

(2)一级液体种子培养：

培养基：葡萄糖10-500克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1-100克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、pH值2-9；

培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟。

(3)二级液体种子培养：

培养基：葡萄糖10-500克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1-100克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升；pH值2-9；

培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟；

(4)液体发酵：

培养基：蔗糖10-1000克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1-100克/升，硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、pH值2-9；

摇瓶中的发酵条件：发酵温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟；

生物反应器中的发酵条件：发酵温度为15-40℃、pH值2-9、搅拌转速为50-1500转/分钟、通气速率为0.01-100升/分钟。

为了使微生物发酵朝着更有利于脑苷脂生物合成的方向发展，本发明以黑孢块菌作为上述各个菌株的代表，对其各个阶段的培养基和培养条件进行了优化，最终发现，当各个培养阶段分别采用以下培养基和培养条件时，相比于其它的培养基和培养条件，发酵产物中脑苷脂的含量有了明显的提高：

一、斜面菌种培养：

培养基：葡萄糖20克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；培养条件：培养温度为30℃。

二、一级液体种子培养：

一级液体种子的培养基的组成优选为：葡萄糖100-500克/升、蛋白胨30-100克/升、酵母膏30-100克/升、硫酸镁10-40克/升、磷酸二氢钾20-40克/升；pH值为7.0-9.0；更优选的，一级液体种子的培养基的组成为：葡萄糖300克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏60克/升、硫酸镁20克/升、磷酸二氢钾30克/升；pH值为8.0；

培养条件优选为：培养温度35-40℃，摇床转速为200-300转/分钟；更优选为：培养温度35℃，摇床转速为250转/分钟；

三、二级液体种子培养

培养基组成优选为：葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁1克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为5.5；

培养条件优选为：培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟。

四、液体发酵：

(一)摇瓶规模：

(1)培养基组成：蔗糖100-400克/升、蛋白胨20-40克/升、酵母膏30-50克/升、硫酸镁2-10克/升、磷酸二氢钾2-10克/升；pH值为6-7；更优选的，培养基的组成为：蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为7；

(2)发酵条件：发酵温度30-35℃，摇床转速为150-200转/分钟；更优选的，发酵温度30℃，摇床转速为150转/分钟。

(二)生物反应器规模：

(1)培养基组成：蔗糖100克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏15克/升、硫酸镁10克/升、磷酸二氢钾10克/升；pH值为7；发酵条件：发酵温度30℃，摇床转速为600转/分钟，通气速率为50升/分钟。

块菌作为一种高等真菌具有可培养性，通过控制培养条件，块菌的菌丝体能够在营养成份丰富的培养基迅速生长。因此，采用发酵的方法，利用廉价的培养基在摇瓶和生物反应器中培养块菌菌丝体，具有周期短、成本低、操作简单、易培养、能够按照需求人为的控制原料供应量等众多优势。本发明利用微生物代谢工程的原理，可以有针对性地对块菌菌丝体的生长进行代谢调控，使发酵朝着有利于脑苷脂生成的方向发展。

上述制备方法中还可包括从含有脑苷脂的菌丝体中分离纯化出脑苷脂的方法，包括以下步骤：

(1)将生物转化基质离心，收集发酵菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；(2)制备发酵菌丝体待分离纯化样品；(3)使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得。

优选的，步骤(2)所述菌丝体待分离纯化样品的制备方法，包括：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的活性成分，得菌丝体待分离纯化样品；

优选的，步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以中极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；更优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；将凝胶以二氯甲烷-甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以二氯甲烷-甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于二氯甲烷-甲醇中，进行上样吸附，然后用二氯甲烷-甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种从上述发酵菌丝体中检测脑苷脂含量的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种从上述发酵菌丝体中检测脑苷脂含量的方法，包括：

(1)收集样品：将发酵产物离心，收集菌丝体沉淀；

(2)制备待测样品：

将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的活性成分，得菌丝体待测样品；

(3)检测：待测样品使用液相色谱-紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器或电化学检测器或蒸发光检测器或示差折光检测器或质谱检测器检测，色谱柱为高效反相液相色谱住或高效正相液相色谱柱或Innovation高效液相色谱柱；通过对比相同色谱条件下脑苷脂对照品出峰时间和离子碎片信息对样品中脑苷脂进行定性，通过内标法或外标法对待测样品中脑苷脂的含量进行定量。

优选的，步骤(1)中将发酵产物在8000-15000转/分钟的转速下离心；

优选的，步骤(2)中所述的菌丝体待测样品优选按照以下步骤制备：将菌丝体进行回流提取，控制温度在30-100℃；用氯仿-甲醇有机溶剂富集活性成分，得菌丝体待测样品；

步骤(3)中所述的检测优选按照以下条件进行：色谱柱温度为0-80℃；进样方式为分流或不分流方式，体积1-20微升，流速0.2-2毫升/分钟；紫外检测器的检测波长为200-400nm；质谱所采用的电离方式为ESI电离，扫描离子质荷比范围为300-900，特征碎片离子质荷比分别为815、744、754。

按照上述方法对本发明所制备的发酵液或菌丝体中的脑苷脂含量进行检测，其结果为：菌丝体(干重计)中三种脑苷脂总量达到0.01-30毫克/100毫克菌丝体。

当然，上述检测方法中，供试样品可用其他的预处理方法进行处理，如对样品衍生化等；对供试样品进行分析时，也可采用其它的检测方法，如用气相色谱-碳同位素燃烧质谱联用、气相色谱-电子捕获检测器联用、液相色谱-质谱联用、液相色谱-荧光检测器联用等。

本发明采用块菌液体发酵方法生产脑苷脂至少从两方面解决了脑苷脂产业化的难题。一是，液体发酵技术应用于块菌，从根本上解决了现有块菌资源稀缺。二是，液体发酵技术属于绿色技术，避免了化学合成导致有机残留、规模小、产量低、成本高等不利因素。同时作为一种绿色安全的大规模生产方式有着无可比拟的巨大优势，利用块菌发酵法生产脑苷脂具有成本低、周期短、操作简单、易培养、质量可控、分离过程简单等优势。本发明方法在很大程度给脑苷脂的大规模工业化生产提供了一种新思路，改换了现有的脑苷脂生产模式。

附图说明

图1块菌发酵菌丝体中所得到的三种脑苷脂的结构式。

图2用于制备本发明菌丝体待测样品的回流提取装置。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

1、块菌菌种：中国块菌(Tuber sinense)、印度块菌(Tuber indium)、黑孢块菌(Tuber melanosporum)、白块菌(Tuber magnatum)、夏块菌(Tuberaestivum)，均从四川省绵阳市食用菌研究所购买得到，其商品名称分别为“中国块菌”、“印度块菌”、“黑孢块菌”、“白块菌”和“夏块菌”。

实施例1

采用的菌种：黑孢块菌(Tuber melanosporum)

1、第一阶段制备含有脑苷脂的块菌菌丝体：

1)、斜面菌种培养：本实施例中所采用的斜面菌种培养基配方为：葡萄糖20克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；灭菌条件为：121℃、20分钟。培养温度为30℃，培养时间为7天；

2)、一级液体种子培养：培养基配方为葡萄糖300克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏60克/升、硫酸镁20克/升、磷酸二氢钾30克/升；pH值为8.0；(2)培养条件：培养温度35℃，摇床转速为250转/分钟；

将斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中即可进行一级液体种子培养。培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟，培养时间为7天；

3)、二级液体种子培养：培养基配方为葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁1克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为7；培养条件：培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟，培养时间为3天；

4)、摇瓶中的液体发酵：培养基的配方为：蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升，硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升、pH值7.0；发酵温度为30℃，摇床转速为150转/分钟。接种量按体积比计为10％，装液量为每500毫升摇瓶装200毫升液体。

2、块菌菌丝体中脑苷脂的分离纯化：

1)、制备待分离样品：取步骤1所得块菌菌丝体置于60℃烘箱中4天，待菌丝体完全干燥后以粉碎机粉碎至粉末状样品，取1000克该样品于2升的圆底烧瓶中并加入少量碎瓷片，加入氯仿-甲醇(85/15，v/v)1升，圆底烧瓶上端连接回流提取器，提取器上端连接冷凝管冷水回流(图2)。加热至沸腾保持2小时后结束为一次，共回流提取三次。将经过过滤后的氯仿-甲醇旋转蒸发，并对样品进行真空干燥，保存于4℃的冰箱中作为菌丝体供分离样品。

2)分离纯化脑苷脂：依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化。

A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统：色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿∶甲醇(85∶15)系统作为洗脱液，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶甲醇(85∶15)系统作为展开剂，将Rf值0.3的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。

B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以二氯甲烷∶甲醇(4∶6)平衡。将待纯化样品以溶于5毫升二氯甲烷∶甲醇(4∶6)中，以0.5毫升/分钟的流速上样吸附，然后用400毫升二氯甲烷∶甲醇(4∶6)以0.5毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿∶甲醇(85∶15)系统作为展开剂，将Rf值0.3的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥并以氯仿重结晶，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供鉴定样品。

3、脑苷脂含量的测定：

1)、制备待分离样品：取步骤1所得块菌菌丝体置于60℃烘箱中4天，待菌丝体完全干燥后以粉碎机粉碎至粉末状样品，取100毫克该样品于50毫升的圆底烧瓶中并加入少量碎瓷片，加入氯仿-甲醇(85/15，v/v)20毫升，圆底烧瓶上端连接回流提取器，提取器上端连接冷凝管冷水回流(图2)。加热至沸腾保持2小时。将经过过滤后的氯仿-甲醇旋转蒸发，并对样品进行真空干燥，取10毫升甲醇进行复溶，保存于4℃的冰箱中作为菌丝体供分析样品。

2)、供试样品用液相色谱进行检测：进样量20微升，用反相高效色谱柱(Venusil XBP，4.6×250mm，5μm)或者相似极性柱分离；紫外检测波长210纳米；甲醇系统作为流动相，流速恒流1毫升/分钟；色谱柱温度40℃。

根据与同样条件下脑苷脂对照品的出峰时间确定脑苷脂后，根据两者的峰面积比与浓度比，通过外标法得出原菌丝体中脑苷脂的浓度。

3)、检测结果：实施例1所制备的菌丝体中，脑苷脂产量为120.6毫克/升。

实施例2

将中国块菌(Tuber sinense)、印度块菌(Tuber indium)、黑孢块菌(Tubermelanosporum)、白块菌(Tuber magnatum)和夏块菌(Tuber aestivum)分别在不同规模下进行液体发酵。发酵培养基成分及培养条件见表1。斜面菌种培养，一级液体种子培养和二级液体种子培养同实施例1。脑苷脂含量的检测方法同实施例1。所得块菌发酵液及菌丝体中脑苷脂的产量见表2所示。

表1.不同发酵规模的培养基成分及培养条件

表2.不同发酵规模条件下脑苷脂产量的比较

实施例3

改变黑孢块菌(Tuber melanosporum)斜面菌种培养基主要成分的浓度及培养温度(见表3)，考察其对黑孢块菌液体发酵生产脑苷脂的影响。一级液体种子培养，二级液体种子培养和液体发酵同实施例1。脑苷脂含量的检测方法同实施例1。所得黑孢块菌(Tuber melanosporum)发酵液及菌丝体中脑苷脂的产量如表3所示。

表3.斜面菌种培养对黑孢块菌液体发酵生产脑苷脂的影响

实施例4

改变黑孢块菌(Tuber melanosporum)一级液体种子培养基主要成分的浓度及培养条件(见表4)，考察其对黑孢块菌液体发酵生产脑苷脂的影响。斜面菌种培养，二级液体种子培养和液体发酵同实施例1。脑苷脂含量的检测方法同实施例1。所得黑孢块菌(Tuber melanosporum)发酵液及菌丝体中脑苷脂的产量如表4所示。

表4.一级液体种子培养对黑孢块菌液体发酵生产脑苷脂的影响

实施例5

改变黑孢块菌(Tuber melanosporum)二级液体种子培养基主要成分及培养条件(见表5)，考察其对黑孢块菌液体发酵生产脑苷脂的影响。斜面菌种培养，一级液体种子培养和液体发酵同实施例1。脑苷脂含量的检测方法同实施例1。所得黑孢块菌(Tuber melanosporum)发酵液及菌丝体中脑苷脂的产量如表5所示。

表5.二级液体种子培养对黑孢块菌液体发酵生产脑苷脂的影响

说明：从表5所提供的试验数据来看，条件3-5的脑苷脂产量分别为69.0毫克/升、65.2毫克/升、61.8毫克/升；相比于条件1有显著性提高，与条件2相比差别不大。考虑到培养基成本，优选条件2为最佳条件。

实施例6

在装液量为200毫升的500毫升摇瓶中，改变黑孢块菌(Tuber melanosporum)液体发酵培养基成分及培养条件(见表6)生产脑苷脂。斜面菌种培养，一级液体种子培养和二级液体种子培养同实施例1。脑苷脂含量的检测方法同实施例1。所得黑孢块菌(Tuber melanosporum)发酵液及菌丝体中脑苷脂的产量如表6所示。

表6.发酵条件对黑孢块菌发酵生产脑苷脂产量的影响

实施例7

将中国块菌(Tuber sinense)、印度块菌(Tuber indium)、黑孢块菌(Tubermelanosporum)、白块菌(Tuber magnatum)和夏块菌(Tuber aestivum)分别在200升生物反应器中进行液体发酵。在发酵温度为30℃的条件下，改变发酵培养基成分及培养条件(见表7。斜面菌种培养，一级液体种子培养和二级液体种子培养同实施例1。脑苷脂含量的检测方法同实施例1。所得块菌发酵液及菌丝体中脑苷脂的产量见表8所示。

表7 200升生物反应器的培养基成分及培养条件

表8 200升生物反应器不同发酵条件对脑苷脂产量的影响

Claims (2)

1.从含有脑苷脂的菌丝体中分离纯化脑苷脂的方法，其特征在于，包括：

（1）将块菌属(Tuber)菌株进行生物发酵得到的生物发酵产物在8000-15000转/分钟的转速下离心，收集发酵菌丝体沉淀；菌丝体真空干燥；备用；

（2）制备发酵菌丝体待分离纯化样品，包括：将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的活性成分，得菌丝体待分离纯化样品；

（3）将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；以体积比为85：15的氯仿：甲醇系统作为洗脱液；将凝胶以二氯甲烷-甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于二氯甲烷-甲醇中，进行上样吸附，然后用二氯甲烷-甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得；

所述的生物发酵依次包括以下步骤：斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体发酵；

所述的一级液体种子培养的培养基组成和培养条件分别为：(1)培养基组成：葡萄糖300克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏60克/升、硫酸镁20克/升、磷酸二氢钾30克/升；pH值为8.0；(2)培养条件：培养温度35℃，摇床转速为250转/分钟；

所述的二级液体种子培养的培养基和培养条件为：(1)培养基组成：培养基组成为：葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁1克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为5.5；（2）培养条件：培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟；

所述的液体发酵的培养基组成和发酵条件为：

（一）摇瓶规模：

（1）培养基组成：蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为7；

（2）摇瓶中的发酵条件：发酵温度30℃，摇床转速为150转/分钟；

（二）生物反应器规模：

（1）培养基组成：蔗糖100克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏15克/升、硫酸镁10克/升、磷酸二氢钾10克/升，pH值为7；

（2）发酵条件：发酵温度30℃，搅拌转速为600转/分钟，通气速率为50升/分钟；

所述的块菌属选自中国块菌(Tuber sinense)、印度块菌(Tuber indium)、黑孢块菌(Tuber melanosporum)、白块菌(Tuber magnatum)或夏块菌(Tuber aestivum)。

2.检测含有脑苷脂的菌丝体中脑苷脂含量的方法，包括：

(1)收集样品：将块菌属(Tuber)菌株进行生物发酵得到的发酵产物在8000-15000转/分钟的转速下离心，收集菌丝体沉淀；

(2)制备待测样品：

将菌丝体进行蒸馏回流提取，控制温度在30-150摄氏度；用氯仿-甲醇富集蒸馏液中的中极性成分，得菌丝体待测样品；

(3)检测：所述的检测按照以下条件进行：色谱柱温度为0-80℃；进样方式为分流或不分流方式，体积1-20微升，流速0.2-2毫升/分钟；紫外检测器的检测波长为200-660nm；质谱所采用的电离方式为ESI电离，扫描离子质荷比范围为300-900，特征碎片离子质荷比分别为815、744、754；核磁共振谱用核磁共振仪测定，TMS为内标，氘代甲醇和氘代氯仿为溶剂，质谱数据以离子阱质谱仪测定；

所述的生物发酵依次包括以下步骤：斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体发酵；

所述的一级液体种子培养的培养基组成和培养条件分别为：(1)培养基组成：葡萄糖300克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏60克/升、硫酸镁20克/升、磷酸二氢钾30克/升；pH值为8.0；(2)培养条件：培养温度35℃，摇床转速为250转/分钟；

所述的二级液体种子培养的培养基和培养条件为：(1)培养基组成：培养基组成为：葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁1克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为5.5；（2）培养条件：培养温度30℃，摇床转速为150转/分钟；

所述的液体发酵的培养基组成和发酵条件为：

（一）摇瓶规模：

（1）培养基组成：蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为7；

（2）摇瓶中的发酵条件：发酵温度30℃，摇床转速为150转/分钟；

（二）生物反应器规模：

（1）培养基组成：蔗糖100克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏15克/升、硫酸镁10克/升、磷酸二氢钾10克/升，pH值为7；

（2）发酵条件：发酵温度30℃，搅拌转速为600转/分钟，通气速率为50升/分钟；

所述的块菌属选自中国块菌(Tuber sinense)、印度块菌(Tuber indium)、黑孢块菌(Tuber melanosporum)、白块菌(Tuber magnatum)或夏块菌(Tuber aestivum)。

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