CN115443851B - V8蔬菜汁在培养白块菌菌丝体中的应用、培养白块菌菌丝体及合成白块菌菌根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物与微生物技术交叉领域，具体涉及V8蔬菜汁在培养白块菌菌丝体中的应用、培养白块菌菌丝体及合成白块菌菌根的方法。本发明所述V8蔬菜汁购买自美国金宝公司(Campbell’s，USA)，富含碳源、钾素、钠素营养、维生素E和维生素C。利用V8蔬菜汁培养白块菌可快速、大量扩繁培养菌丝体，得到紧密、白色、菌落大和长势旺盛的白块菌菌丝，利用菌丝合成菌根，能够规避不成熟块菌孢子无法进行菌根合成的弊端，从根本上突破种源限制的瓶颈，合成白块菌菌根。
Description
技术领域
本发明属于植物与微生物技术交叉领域，具体涉及V8蔬菜汁在培养白块菌菌丝体中的应用、培养白块菌菌丝体及合成白块菌菌根的方法。
背景技术
块菌在全球久负盛名，是名贵的食药用真菌。我国块菌的人工栽培尚处在初期探索阶段，难以形成规模化的种植。菌根的形成，是块菌实现人工栽培的首要条件。目前，国内虽然已有块菌菌根合成的研究案例，也有种植园实现了块菌的人工种植，但是相关的研究主要集中在黑块菌上，如印度块菌(Tuber indicum)，而白块菌的人工种植尚无成功报道。
白块菌栽培难度大，最首要的原因，一是块菌与宿主植物的共生机制较为复杂，另一方面因为块菌的菌种分离极为困难。目前块菌在国内外的人工栽培方式，主要是利用成熟的块菌孢子接种宿主根系合成菌根，然后移栽至种植园。该方式对于价值较低的块菌物种，以及可持续产出子实体作为菌剂来源的国外种植园较为经济适用。但是在国内，该方式对野生块菌资源存在过度依赖，严重受限于野生成熟块菌的生长周期和成熟周期，而且块菌长于地下，在野外难以精准采获成熟的子实体，所采获的未成熟块菌品质低廉，更重要的是无法利用其孢子进行菌根合成。此外，该方式极易伴生野外污染性的外源菌根真菌，从而抑制块菌菌根的形成，导致周期成本和经济成本大幅增加，更重要的，还会对资源和生态造成了极大的破坏。如何合成白块菌菌根，实现白块菌的人工种植显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供V8蔬菜汁在培养白块菌菌丝体中的应用、培养白块菌菌丝体及合成白块菌菌根的方法，快速、大量扩繁白块菌丝体，规避不成熟块菌孢子无法进行菌根合成的弊端，从根本上突破种源限制的瓶颈，合成白块菌菌根。
本发明提供了V8蔬菜汁在培养白块菌菌丝体中的应用。
优选的，所述白块菌包括金沙江块菌(Tuber jinshajiangense)和/或会东块菌(Tuber huidongense)
本发明还提供了一种用于培养白块菌菌丝体的培养基，包括100mL/L V8蔬菜汁。
优选的，所述培养基还包括0.02g/L Ca(NO3)2、0.5g/L KH2PO4和20g/L琼脂。
本发明还提供了一种培养白块菌菌丝体的方法，包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的培养基培养白块菌，得到白块菌菌丝体。
优选的，所述培养的温度为18～24℃，pH为6.5～8。
本发明还提供了上述技术方案所述方法得到的白块菌菌丝体在白块菌菌根合成中的应用。
本发明还提供了一种合成白块菌菌根的方法，包括如下步骤：
将上述技术方案所述方法得到的白块菌菌丝体和白块菌宿主共同栽培到基质中培养，得到所述白块菌菌根。
优选的，所述培养的温度为21～25℃，湿度为30％～45％，光照为1500～3000lx，时间为40～52天；
所述基质包括腐殖土、蛭石、沙和珍珠岩；所述腐殖土、蛭石、沙和珍珠岩的体积比为1：1：0.5：0.25。
优选的，所述白块菌宿主包括松属和/或栗属宿主。
本发明提供了V8蔬菜汁在培养白块菌菌丝体中的应用，V8蔬菜汁含有大量适合白块菌生长的碳源、钾素、钠素营养、维生素E和维生素C，利用V8蔬菜汁培养白块菌可快速、大量扩繁培养菌丝体，得到紧密、白色、菌落大和长势旺盛的白块菌菌丝。
利用本发明分离得到的白块菌菌丝体与松属和/或栗属宿主进行菌根合成，为实现白块菌的人工菌根合成及其种植提供了关键核心技术，极大缩短了白块菌菌根合成周期，加快幼苗菌根化的程度，大幅度地降低时间和材料成本，规避野生块菌孢子接种所带来的外源真菌污染风险；同时还增强幼苗吸收营养水分的能力和对环境的适应性，使菌根苗的生长得到改善，显著促进了菌根苗株高地径的生长，具有明显的通用性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为金沙江块菌菌丝形态；
图2为金沙江块菌菌丝电镜形态；
图3为分离到的金沙江块菌菌丝体分子鉴定及接种华山松、板栗形成的菌根分子鉴定结果；
图4为会东块菌菌丝形态；
图5为会东块菌菌丝电镜形态；
图6为分离到的会东块菌菌丝体分子鉴定及接种华山松、板栗形成的菌根分子鉴定结果；
图7为金沙江块菌接种华山松形成的菌根宏观形态；
图8为金沙江块菌接种板栗形成的菌根宏观形态；
图9为会东块菌菌丝体接种华山松形成的菌根宏观形态；
图10为会东块菌菌丝体接种板栗形成的菌根宏观形态。
具体实施方式
本发明提供了V8蔬菜汁在培养白块菌菌丝体中的应用。
本发明对所述白块菌的具体类型没有严格要求，常规选择白块菌物种即可。本发明在具体实施过程中以金沙江块菌(Tuber jinshajiangense)和会东块菌(Tuberhuidongense)为例进行说明，但是不能仅将其理解为本发明的保护范围。本发明所述V8蔬菜汁优选为的原味V8蔬菜汁，购买自美国金宝公司(Campbell’s，USA)，富含碳源、钾素、钠素营养、维生素E和维生素C。利用V8蔬菜汁培养白块菌可快速、大量扩繁培养菌丝体，得到紧密、白色、菌落大和长势旺盛的白块菌菌丝。
本发明还提供了一种用于培养白块菌菌丝体的培养基，包括100mL/L V8蔬菜汁，优选还包括0.02g/L Ca(NO3)2、0.5g/L KH2PO4和20g/L琼脂。本发明所述培养基能够促进白块菌菌丝生长，使白块菌菌丝体快速、大量地扩繁，得到紧密、白色、菌落大和长势旺盛的白块菌菌丝。
本发明还提供了一种培养白块菌菌丝体的方法，包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的培养基培养白块菌，得到白块菌菌丝体。
本发明优选利用上述技术方案所述的培养基培养白块菌的子实体。本发明对所述白块菌的子实体的来源没有严格要求，常规获得即可。本发明所述培养的温度优选为18～24℃，进一步优选为20～22℃；所述培养的pH优选为7～8；所述培养优选为黑暗培养。本发明优选在培养一个月后，选择生长良好的菌丝进行ITS鉴定，确认为白块菌菌丝体后转移至新的培养基上进行纯化培养。
本发明还提供了上述方法得到的白块菌菌丝体在白块菌菌根合成中的应用；所述白块菌优选包括金沙江块菌和/或会东块菌。本发明利用上述方法得到的白块菌菌丝体紧密、菌落大且长势旺盛，能够取代白块菌孢子，有效规避不成熟块菌孢子无法进行菌根合成的弊端，从根本上突破种源限制的瓶颈，排除野生外源真菌对块菌菌根合成的污染和抑制，为白块菌的菌根合成和人工栽培提供了新技术。同时，为经济价值较高或受威胁程度较高的濒危块菌物种提供了资源保育的新途径。
本发明还提供了一种合成白块菌菌根的方法，包括如下步骤：
将上述方法得到的白块菌菌丝体和白块菌宿主共同栽培到基质中培养，得到所述白块菌菌根。
本发明将上述方法得到的白块菌菌丝体和白块菌宿主同时栽培到基质中进行共培养，菌丝体放置于宿主根部；所述培养的温度优选为21～25℃，进一步优选为 22～24℃；所述培养的湿度优选为30％～45％，进一步优选为32％～42％，更优选为 35％～40％，最优选为38％；所述培养的光照强度优选为1500～3000lx，进一步优选为 1800～2800lx，更优选为2000～2500lx，最优选为2200lx；所述培养的时间优选为 45～52d，进一步优选为48～50d。
在本发明中，所述基质优选包括腐殖土、蛭石、沙和珍珠岩；所述腐殖土、蛭石、沙和珍珠岩的体积比优选为1：1：0.5：0.25。本发明所述基质优选还包括石灰粉，所述石灰粉调节基质的pH。本发明所述基质的pH优选为7.5。本发明对所述石灰粉的用量没有严格要求，将基质的pH调节至7.5即可。本发明优选对所述基质中的成分进行预处理；所述预处理的方式优选包括：分别对所述腐殖土和沙进行灭菌处理，其余成分不灭菌；所述腐殖土的灭菌时间优选为3h，沙的灭菌时间优选为1h。本发明对所述灭菌的方式没有严格要求，常规操作即可。
本发明在具体实施过程中，优选将所述白块菌菌丝体接种至所述白块菌宿主侧根附近，实现白块菌菌丝体和白块菌宿主共同栽培；所述白块菌宿主优选包括松属和/或栗属宿主；所述松属宿主优选包括华山松，所述栗属宿主优选为板栗。本发明首次利用白块菌菌丝体与松属、栗属宿主进行菌根合成，所述白块菌菌丝体可以与包括华山松在内的多种松属宿主，以及板栗在内的多种栗属宿主共生，促进宿主生长，在块菌菌根苗生产中具有明显的通用性和有效性。实施例结果表明，使华山松和板栗幼苗接种金沙江白块菌菌丝体后，华山松最快在第45天即可形成菌根，单株侵染率达到65％；板栗幼苗最快在52天形成菌根，单株侵染率达到73％；使华山松和板栗幼苗接种会东白块菌菌丝体后，华山松最快在第40天即可形成菌根，单株侵染率达到75％；板栗幼苗最快在48天形成菌根，单株侵染率达到67％。相较于孢子接种的现有技术(孢子接种一般需要3个月形成菌根)，极大地缩短了块菌菌根合成周期，加快了幼苗菌根分化程度，降低了时间和材料成本，克服了野生块菌孢子接种所带来的外源真菌污染风险的技术难题；同时还增强了幼苗吸收营养水分的能力和对环境的适应性，使菌根苗的生长得到改善，促进菌根苗株高地径的生长。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种用于培养白块菌菌丝体的培养基及其应用、培养白块菌菌丝体及合成白块菌菌根的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
如无特殊说明，本发明具体实施过程中使用的培养基组成均为常规获得。
实施例1
一种培养基(记为V8培养基)，由0.02g Ca(NO3)2、0.5g KH2PO4、100mL V8 蔬菜汁和20g琼脂，加蒸馏水定容至1L组成。
对比例1
一种培养基(记为M1)，由20g马铃薯葡萄糖水(PDB)、0.5g Ca(NO3)2和20g琼脂，加蒸馏水定容至1L组成。
对比例2
一种培养基(记为M2)，由5g马铃薯葡萄糖水(PDB)、0.820g Ca(NO3)2、 10mL甘油和20g琼脂，加蒸馏水定容至1L组成。
对比例3
一种培养基(记为M3)，由0.820g Ca(NO3)2、10mL甘油、3g麦芽浸提粉和20g琼脂，加蒸馏水定容至1L组成。
对比例4
一种培养基(记为PDA)，由45g马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)加蒸馏水定容至 1L组成。
对比例5
一种培养基(记为YMT)，由2g KH2PO4、1g MgSO4·7H2O、10g葡萄糖粉、2g 酵母提取物、5g麦芽浸提粉、200μg Sigma Thiamine-HCl和20g琼脂，加蒸馏水定容至1L组成。
对比例6
一种培养基(记为NA)，由30g Powder营养琼脂粉加蒸馏水定容至1L组成。
实施例2
金沙江块菌菌种分离与纯化培养
(1)菌种分离
取金沙江块菌新鲜子实体，记为995(ascocarp)，轻拭块菌子实体表面杂物，用蒸馏水进行简单清洗，再用75％的酒精对子实体表面进行消毒。将清洗干净的块菌子实体于超净台内掰开，用灭菌的镊子取约1mm3大小的干净产孢组织，接种于实施例1得到的培养基上。将接种好的培养基置于20℃培养箱中黑暗培养。一个月后观察菌丝(记为M)形态，结果如图1～2，选择生长良好的菌丝做ITS鉴定，构建系统发育树，如图3所示，其中图3中M1、M2、M5、M6、M157、M158和M159为部分菌丝。根据图1～3可以看出，本发明培养基能够实现金沙江块菌菌丝体扩繁培养，得到紧密、白色、菌落大和长势旺盛的金沙江块菌菌丝。
(2)纯化培养
1.向实施例1得到的V8培养基中加入浓度为50mM的N-三(羟甲基)甲基-3- 氨基丙磺酸(TAPS)，用1mol/L NaOH将培养基pH调节到6.5，放入高压灭菌锅，在121℃灭菌20min。灭菌结束后，在超净台内，将培养液倒入9cm培养皿中。待培养基凝固后，在其表面放上直径为9cm的无菌玻璃纸。
2.用直径为8mm的打孔器切取步骤(1)得到的菌丝块置于步骤2的培养基中，并置于18℃的培养箱中黑暗培养。
实施例3～17
按照实施例2中(2)的方式进行金沙江块菌菌种不同纯化条件下的培养，区别在于：
实施例3～5纯化培养过程中，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节的pH与实施例2不同，培养温度相同；
实施例6、10和14纯化培养过程中，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节的 pH与实施例2相同，培养温度不同；
其余实施例纯化培养过程中，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节的pH与实施例2不同，培养温度也不同；具体列于表1中。
表1实施例2～17纯化培养过程中的pH和温度
对比例7～39
按照实施例2中步骤(1)的方式分离得到紧密、白色、菌落大和长势旺盛的金沙江块菌菌丝后，按照实施例2中步骤(2)的方式进行菌种的纯化培养，区别在于，与实施例2步骤(2)中纯化的pH和/或温度条件不用，具体如下：
对比例7～9纯化培养过程中，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节的pH与实施例2不同，培养温度相同；
对比例10～27纯化培养过程中，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节的pH与实施例2不同，培养温度也不同；
对比例28～39纯化培养过程中，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节的pH与实施例2相同，培养温度不同；具体列于表2中。
表2对比例7～39纯化培养过程中的pH和温度
测试例1
实施例2～17以及对比例7～39培养45天后，用十字交叉法测量菌丝直径，结果如表3。
表3不同处理方式菌丝直径(cm)
注：表中含有不同小写字母表示相同pH条件下不同温度的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)；表中含有不同大写字母表示相同温度下不同pH条件的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)。
根据表3可以看出，温度为28℃和30℃时，各pH值间的金沙江块菌菌丝不生长，当pH为9时，各温度间的金沙江块菌菌丝不生长，温度为24℃，pH为8.5的菌丝直径不生长，并且当温度为26℃，pH为6、7、7.5或8.5时，金沙江块菌菌丝也不生长；在不同温度和同一pH值条件下，18℃～22℃生长的菌丝与24℃和26℃生长的菌丝呈极显著差异；在相同温度和不同pH值条件下，当pH为8时生长的菌丝直径最大，并且与其他五个pH值生长的菌丝间呈极显著差异；本发明培养基和培养条件适合金沙江块菌菌丝生长，并且在pH为8，温度为22℃的条件下生长状态最好。
对比例40～333
按照实施例2的方式进行培养，其中：对比例40～88纯化培养时使用对比例1 的培养基；对比例89～137纯化培养时使用对比例2的培养基；对比例138～186纯化培养时使用对比例3的培养基；对比例187～235纯化培养时使用对比例4的培养基；对比例236～284纯化培养时使用对比例5的培养基；对比例285～333纯化培养时使用对比例6的培养基。各对比例培养pH和温度具体列于表4～9中。
表4对比例40～88纯化培养过程中的培养基、pH和温度
| 对比例40 | 对比例41 | 对比例42 | 对比例43 | 对比例44 | 对比例45 | 对比例46 |
| pH 6、18℃ | pH 6、20℃ | pH 6、22℃ | pH 6、24℃ | pH 6、26℃ | pH 6、28℃ | pH 6、30℃ |
| 对比例47 | 对比例48 | 对比例49 | 对比例50 | 对比例51 | 对比例52 | 对比例53 |
| pH 6.5、18℃ | pH 6.5、20℃ | pH 6.5、22℃ | pH 6.5、24℃ | pH 6.5、26℃ | pH 6.5、28℃ | pH 6.5、30℃ |
| 对比例54 | 对比例55 | 对比例56 | 对比例57 | 对比例58 | 对比例59 | 对比例60 |
| pH 7.0、18℃ | pH 7.0、20℃ | pH 7.0、22℃ | pH 7.0、24℃ | pH 7.0、26℃ | pH 7.0、28℃ | pH 7.0、30℃ |
| 对比例61 | 对比例62 | 对比例63 | 对比例64 | 对比例65 | 对比例66 | 对比例67 |
| pH 7.5、18℃ | pH 7.5、20℃ | pH 7.5、22℃ | pH 7.5、24℃ | pH 7.5、26℃ | pH 7.5、28℃ | pH 7.5、30℃ |
| 对比例68 | 对比例69 | 对比例70 | 对比例71 | 对比例72 | 对比例73 | 对比例74 |
| pH 8、18℃ | pH 8、20℃ | pH 8、22℃ | pH 8、24℃ | pH 8、26℃ | pH 8、28℃ | pH 8、30℃ |
| 对比例75 | 对比例76 | 对比例77 | 对比例78 | 对比例79 | 对比例80 | 对比例81 |
| pH 8.5、18℃ | pH 8.5、20℃ | pH 8.5、22℃ | pH 8.5、24℃ | pH 8.5、26℃ | pH 8.5、28℃ | pH 8.5、30℃ |
| 对比例82 | 对比例83 | 对比例84 | 对比例85 | 对比例86 | 对比例87 | 对比例88 |
| pH 9、18℃ | pH 9、20℃ | pH 9、22℃ | pH 9、24℃ | pH 9、26℃ | pH 9、28℃ | pH 9、30℃ |
表5对比例89～137纯化培养过程中的培养基、pH和温度
| 对比例89 | 对比例90 | 对比例91 | 对比例92 | 对比例93 | 对比例94 | 对比例95 |
| pH 6、18℃ | pH 6、20℃ | pH 6、22℃ | pH 6、24℃ | pH 6、26℃ | pH 6、28℃ | pH 6、30℃ |
| 对比例96 | 对比例97 | 对比例98 | 对比例99 | 对比例100 | 对比例101 | 对比例102 |
| pH 6.5、18℃ | pH 6.5、20℃ | pH 6.5、22℃ | pH 6.5、24℃ | pH 6.5、26℃ | pH 6.5、28℃ | pH 6.5、30℃ |
| 对比例103 | 对比例104 | 对比例105 | 对比例106 | 对比例107 | 对比例108 | 对比例109 |
| pH 7.0、18℃ | pH 7.0、20℃ | pH 7.0、22℃ | pH 7.0、24℃ | pH 7.0、26℃ | pH 7.0、28℃ | pH 7.0、30℃ |
| 对比例110 | 对比例111 | 对比例112 | 对比例113 | 对比例114 | 对比例115 | 对比例116 |
| pH 7.5、18℃ | pH 7.5、20℃ | pH 7.5、22℃ | pH 7.5、24℃ | pH 7.5、26℃ | pH 7.5、28℃ | pH 7.5、30℃ |
| 对比例117 | 对比例118 | 对比例119 | 对比例120 | 对比例121 | 对比例122 | 对比例123 |
| pH 8、18℃ | pH 8、20℃ | pH 8、22℃ | pH 8、24℃ | pH 8、26℃ | pH 8、28℃ | pH 8、30℃ |
| 对比例124 | 对比例125 | 对比例126 | 对比例127 | 对比例128 | 对比例129 | 对比例130 |
| pH 8.5、18℃ | pH 8.5、20℃ | pH 8.5、22℃ | pH 8.5、24℃ | pH 8.5、26℃ | pH 8.5、28℃ | pH 8.5、30℃ |
| 对比例131 | 对比例132 | 对比例133 | 对比例134 | 对比例135 | 对比例136 | 对比例137 |
| pH 9、18℃ | pH 9、20℃ | pH 9、22℃ | pH 9、24℃ | pH 9、26℃ | pH 9、28℃ | pH 9、30℃ |
表6对比例138～186纯化培养过程中的培养基、pH和温度
| 对比例138 | 对比例139 | 对比例140 | 对比例141 | 对比例142 | 对比例143 | 对比例144 |
| pH 6、18℃ | pH 6、20℃ | pH 6、22℃ | pH 6、24℃ | pH 6、26℃ | pH 6、28℃ | pH 6、30℃ |
| 对比例145 | 对比例146 | 对比例147 | 对比例148 | 对比例149 | 对比例150 | 对比例151 |
| pH 6.5、18℃ | pH 6.5、20℃ | pH 6.5、22℃ | pH 6.5、24℃ | pH 6.5、26℃ | pH 6.5、28℃ | pH 6.5、30℃ |
| 对比例152 | 对比例153 | 对比例154 | 对比例155 | 对比例156 | 对比例157 | 对比例158 |
| pH 7.0、18℃ | pH 7.0、20℃ | pH 7.0、22℃ | pH 7.0、24℃ | pH 7.0、26℃ | pH 7.0、28℃ | pH 7.0、30℃ |
| 对比例159 | 对比例160 | 对比例161 | 对比例162 | 对比例163 | 对比例164 | 对比例165 |
| pH 7.5、18℃ | pH 7.5、20℃ | pH 7.5、22℃ | pH 7.5、24℃ | pH 7.5、26℃ | pH 7.5、28℃ | pH 7.5、30℃ |
| 对比例166 | 对比例167 | 对比例168 | 对比例169 | 对比例170 | 对比例171 | 对比例172 |
| pH 8、18℃ | pH 8、20℃ | pH 8、22℃ | pH 8、24℃ | pH 8、26℃ | pH 8、28℃ | pH 8、30℃ |
| 对比例173 | 对比例174 | 对比例175 | 对比例176 | 对比例177 | 对比例178 | 对比例179 |
| pH 8.5、18℃ | pH 8.5、20℃ | pH 8.5、22℃ | pH 8.5、24℃ | pH 8.5、26℃ | pH 8.5、28℃ | pH 8.5、30℃ |
| 对比例180 | 对比例181 | 对比例182 | 对比例183 | 对比例184 | 对比例185 | 对比例186 |
| pH 9、18℃ | pH 9、20℃ | pH 9、22℃ | pH 9、24℃ | pH 9、26℃ | pH 9、28℃ | pH 9、30℃ |
表7对比例187～235纯化培养过程中的培养基、pH和温度
| 对比例187 | 对比例188 | 对比例189 | 对比例190 | 对比例191 | 对比例192 | 对比例193 |
| pH 6、18℃ | pH 6、20℃ | pH 6、22℃ | pH 6、24℃ | pH 6、26℃ | pH 6、28℃ | pH 6、30℃ |
| 对比例194 | 对比例195 | 对比例196 | 对比例197 | 对比例198 | 对比例199 | 对比例200 |
| pH 6.5、18℃ | pH 6.5、20℃ | pH 6.5、22℃ | pH 6.5、24℃ | pH 6.5、26℃ | pH 6.5、28℃ | pH 6.5、30℃ |
| 对比例201 | 对比例202 | 对比例203 | 对比例204 | 对比例205 | 对比例206 | 对比例207 |
| pH 7.0、18℃ | pH 7.0、20℃ | pH 7.0、22℃ | pH 7.0、24℃ | pH 7.0、26℃ | pH 7.0、28℃ | pH 7.0、30℃ |
| 对比例208 | 对比例209 | 对比例210 | 对比例211 | 对比例212 | 对比例213 | 对比例214 |
| pH 7.5、18℃ | pH 7.5、20℃ | pH 7.5、22℃ | pH 7.5、24℃ | pH 7.5、26℃ | pH 7.5、28℃ | pH 7.5、30℃ |
| 对比例215 | 对比例216 | 对比例217 | 对比例218 | 对比例219 | 对比例220 | 对比例221 |
| pH 8、18℃ | pH 8、20℃ | pH 8、22℃ | pH 8、24℃ | pH 8、26℃ | pH 8、28℃ | pH 8、30℃ |
| 对比例222 | 对比例223 | 对比例224 | 对比例225 | 对比例226 | 对比例227 | 对比例228 |
| pH 8.5、18℃ | pH 8.5、20℃ | pH 8.5、22℃ | pH 8.5、24℃ | pH 8.5、26℃ | pH 8.5、28℃ | pH 8.5、30℃ |
| 对比例229 | 对比例230 | 对比例231 | 对比例232 | 对比例233 | 对比例234 | 对比例235 |
| pH 9、18℃ | pH 9、20℃ | pH 9、22℃ | pH 9、24℃ | pH 9、26℃ | pH 9、28℃ | pH 9、30℃ |
表8对比例236～284纯化培养过程中的培养基、pH和温度
| 对比例236 | 对比例237 | 对比例238 | 对比例239 | 对比例240 | 对比例241 | 对比例242 |
| pH 6、18℃ | pH 6、20℃ | pH 6、22℃ | pH 6、24℃ | pH 6、26℃ | pH 6、28℃ | pH 6、30℃ |
| 对比例243 | 对比例244 | 对比例245 | 对比例246 | 对比例247 | 对比例248 | 对比例249 |
| pH 6.5、18℃ | pH 6.5、20℃ | pH 6.5、22℃ | pH 6.5、24℃ | pH 6.5、26℃ | pH 6.5、28℃ | pH 6.5、30℃ |
| 对比例250 | 对比例251 | 对比例252 | 对比例253 | 对比例254 | 对比例255 | 对比例256 |
| pH 7.0、18℃ | pH 7.0、20℃ | pH 7.0、22℃ | pH 7.0、24℃ | pH 7.0、26℃ | pH 7.0、28℃ | pH 7.0、30℃ |
| 对比例257 | 对比例258 | 对比例259 | 对比例260 | 对比例261 | 对比例262 | 对比例263 |
| pH 7.5、18℃ | pH 7.5、20℃ | pH 7.5、22℃ | pH 7.5、24℃ | pH 7.5、26℃ | pH 7.5、28℃ | pH 7.5、30℃ |
| 对比例264 | 对比例265 | 对比例266 | 对比例267 | 对比例268 | 对比例269 | 对比例270 |
| pH 8、18℃ | pH 8、20℃ | pH 8、22℃ | pH 8、24℃ | pH 8、26℃ | pH 8、28℃ | pH 8、30℃ |
| 对比例271 | 对比例272 | 对比例273 | 对比例274 | 对比例275 | 对比例276 | 对比例277 |
| pH 8.5、18℃ | pH 8.5、20℃ | pH 8.5、22℃ | pH 8.5、24℃ | pH 8.5、26℃ | pH 8.5、28℃ | pH 8.5、30℃ |
| 对比例278 | 对比例279 | 对比例280 | 对比例281 | 对比例282 | 对比例283 | 对比例284 |
| pH 9、18℃ | pH 9、20℃ | pH 9、22℃ | pH 9、24℃ | pH 9、26℃ | pH 9、28℃ | pH 9、30℃ |
表9对比例285～333纯化培养过程中的培养基、pH和温度
| 对比例285 | 对比例286 | 对比例287 | 对比例288 | 对比例289 | 对比例290 | 对比例291 |
| pH 6、18℃ | pH 6、20℃ | pH 6、22℃ | pH 6、24℃ | pH 6、26℃ | pH 6、28℃ | pH 6、30℃ |
| 对比例292 | 对比例293 | 对比例294 | 对比例295 | 对比例296 | 对比例297 | 对比例298 |
| pH 6.5、18℃ | pH 6.5、20℃ | pH 6.5、22℃ | pH 6.5、24℃ | pH 6.5、26℃ | pH 6.5、28℃ | pH 6.5、30℃ |
| 对比例299 | 对比例300 | 对比例301 | 对比例302 | 对比例303 | 对比例304 | 对比例305 |
| pH 7.0、18℃ | pH 7.0、20℃ | pH 7.0、22℃ | pH 7.0、24℃ | pH 7.0、26℃ | pH 7.0、28℃ | pH 7.0、30℃ |
| 对比例306 | 对比例307 | 对比例308 | 对比例309 | 对比例310 | 对比例311 | 对比例312 |
| pH 7.5、18℃ | pH 7.5、20℃ | pH 7.5、22℃ | pH 7.5、24℃ | pH 7.5、26℃ | pH 7.5、28℃ | pH 7.5、30℃ |
| 对比例313 | 对比例314 | 对比例315 | 对比例316 | 对比例317 | 对比例318 | 对比例319 |
| pH 8、18℃ | pH 8、20℃ | pH 8、22℃ | pH 8、24℃ | pH 8、26℃ | pH 8、28℃ | pH 8、30℃ |
| 对比例320 | 对比例321 | 对比例322 | 对比例323 | 对比例324 | 对比例325 | 对比例326 |
| pH 8.5、18℃ | pH 8.5、20℃ | pH 8.5、22℃ | pH 8.5、24℃ | pH 8.5、26℃ | pH 8.5、28℃ | pH 8.5、30℃ |
| 对比例327 | 对比例328 | 对比例329 | 对比例330 | 对比例331 | 对比例332 | 对比例333 |
| pH 9、18℃ | pH 9、20℃ | pH 9、22℃ | pH 9、24℃ | pH 9、26℃ | pH 9、28℃ | pH 9、30℃ |
测试例2
实施例40～333以及对比例7～39培养45天后，用十字交叉法测量菌丝直径，结果如表10～15。
表10对比例40～88菌丝直径(cm)
注：表中含有不同小写字母表示相同pH条件下不同温度的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)；表中含有不同大写字母表示相同温度下不同pH条件的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)。
表11对比例89～137菌丝直径(cm)
| 对比例89 | 对比例90 | 对比例91 | 对比例92 | 对比例93 | 对比例94 | 对比例95 |
| 3.40±0.346abAB | 4.27±0.076aA | 3.75±1.447abAB | 1.45±0.312aC | 3.52±0.814aAB | 2.07±0.076bBC | 0±0 |
| 对比例96 | 对比例97 | 对比例98 | 对比例99 | 对比例100 | 对比例101 | 对比例102 |
| 2.10±1.308abcC | 2.48±0.115bBC | 5.18±0.275aA | 1.28±0.076aC | 3.63±0.539aB | 2.47±0.115aBC | 0±0 |
| 对比例103 | 对比例104 | 对比例105 | 对比例106 | 对比例107 | 对比例108 | 对比例109 |
| 1.80±0.910bcBC | 2.67±0.126bABC | 3.77±1.329abA | 1.48±0.153aC | 3.22±0.208aAB | 2.22±0.029bABC | 0±0 |
| 对比例110 | 对比例111 | 对比例112 | 对比例113 | 对比例114 | 对比例115 | 对比例116 |
| 3.60±0.527aA | 4.03±0.208aA | 4.67±0.765aA | 1.73±0.404aB | 4.32±0.506aA | 2.05±0.180bB | 0±0 |
| 对比例117 | 对比例118 | 对比例119 | 对比例120 | 对比例121 | 对比例122 | 对比例123 |
| 1.47±0.202cA | 0±0 | 1.80±0.350bA | 1.83±0.252aA | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
| 对比例124 | 对比例125 | 对比例126 | 对比例127 | 对比例128 | 对比例129 | 对比例130 |
| 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
| 对比例131 | 对比例132 | 对比例133 | 对比例134 | 对比例135 | 对比例136 | 对比例137 |
| 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
注：表中含有不同小写字母表示相同pH条件下不同温度的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)；表中含有不同大写字母表示相同温度下不同pH条件的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)。
表12对比例138～186菌丝直径(cm)
注：表中含有不同小写字母表示相同pH条件下不同温度的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)；表中含有不同大写字母表示相同温度下不同pH条件的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)。
表13对比例187～235菌丝直径(cm)
| 对比例187 | 对比例188 | 对比例189 | 对比例190 | 对比例191 | 对比例192 | 对比例193 |
| 1.72±0.225aAB | 1.75±0.050bAB | 2.27±0.104aA | 1.37±0.379bB | 1.80±0.346bAB | 0±0 | 0±0 |
| 对比例194 | 对比例195 | 对比例196 | 对比例197 | 对比例198 | 对比例199 | 对比例200 |
| 1.83±0.029aC | 3.27±0.629aAB | 2.45±0.650aBC | 3.42±0.144aA | 1.80±0.087bC | 0±0 | 0±0 |
| 对比例201 | 对比例202 | 对比例203 | 对比例204 | 对比例205 | 对比例206 | 对比例207 |
| 1.53±0.153aC | 1.57±0.126bBC | 2.10±0.444aAB | 1.15±0.087bC | 2.35±0.312aA | 0±0 | 0±0 |
| 对比例208 | 对比例209 | 对比例210 | 对比例211 | 对比例212 | 对比例213 | 对比例214 |
| 1.53±0.189aB | 1.22±0.144bB | 2.38±0.252aA | 1.72±0.584bB | 1.73±0.153bB | 0±0 | 0±0 |
| 对比例215 | 对比例216 | 对比例217 | 对比例218 | 对比例219 | 对比例220 | 对比例221 |
| 0.95±0.173bA | 1.15±0.050bA | 0±0 | 1.10±0.265bA | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
| 对比例222 | 对比例223 | 对比例224 | 对比例225 | 对比例226 | 对比例227 | 对比例228 |
| 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
| 对比例229 | 对比例230 | 对比例231 | 对比例232 | 对比例233 | 对比例234 | 对比例235 |
| 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
注：表中含有不同小写字母表示相同pH条件下不同温度的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)；表中含有不同大写字母表示相同温度下不同pH条件的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)。
表14对比例236～284菌丝直径(cm)
注：表中含有不同小写字母表示相同pH条件下不同温度的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)；表中含有不同大写字母表示相同温度下不同pH条件的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)。
表15对比例285～333菌丝直径(cm)
| 对比例285 | 对比例286 | 对比例287 | 对比例288 | 对比例289 | 对比例290 | 对比例291 |
| 3.18±0.473abBCD | 4.82±0.355aA | 3.67±0.340aBC | 2.62±0.176bD | 3.83±0.551aB | 2.80±0.500bCD | 0±0 |
| 对比例292 | 对比例293 | 对比例294 | 对比例295 | 对比例296 | 对比例297 | 对比例298 |
| 4.00±0.492aA | 1.63±0.161cC | 3.18±0.333abACB | 2.20±0.260cBC | 2.80±0.917abABC | 3.62±1.221bAB | 0±0 |
| 对比例299 | 对比例300 | 对比例301 | 对比例302 | 对比例303 | 对比例304 | 对比例305 |
| 3.05±0.520bB | 2.90±0.819bB | 2.77±0.076bB | 3.20±0.304aB | 2.90±1.097abB | 4.97±0.161aA | 0±0 |
| 对比例306 | 对比例307 | 对比例308 | 对比例309 | 对比例310 | 对比例311 | 对比例312 |
| 3.75±0.218abB | 5.03±0.126aA | 1.80±0.260cC | 1.68±0.104dC | 1.70±0.100bC | 1.48±0.029cC | 0±0 |
| 对比例313 | 对比例314 | 对比例315 | 对比例316 | 对比例317 | 对比例318 | 对比例319 |
| 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
| 对比例320 | 对比例321 | 对比例322 | 对比例323 | 对比例324 | 对比例325 | 对比例326 |
| 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
| 对比例327 | 对比例328 | 对比例329 | 对比例330 | 对比例331 | 对比例332 | 对比例333 |
| 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 | 0±0 |
注：表中含有不同小写字母表示相同pH条件下不同温度的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)；表中含有不同大写字母表示相同温度下不同pH条件的菌丝直径之间的差异显著(p<0.01)。
根据表10～15可以看出，对比例1～6配制的培养基，虽然也能促进金沙江块菌菌丝生长，但是生长情况不如本发明实施例1配置得到的培养基，具体的，在培养45天时，对比例1配制的培养基培养的金沙江块菌菌丝最长为3.57cm(对比例48)，对比例2配制的培养基培养的金沙江块菌菌丝最长为4.67cm(对比例112)，对比例3配制的培养基培养的金沙江块菌菌丝最长为6.05cm(对比例128～139)，对比例4配制的培养基培养的金沙江块菌菌丝最长为3.42cm(对比例197)，对比例5 配制的培养基培养的金沙江块菌菌丝最长为5.23cm(对比例240)，对比例6配制的培养基培养的金沙江块菌菌丝最长为5.03cm(对比例307)，实施例1配制的培养基培养的金沙江块菌菌丝长度7.60cm(实施例13)，相比对比例1～6金沙江块菌菌丝生长量分别提高112.89％、62.74％、25.62％、122.22％、45.32％和51.09％。本发明配制的培养基能够可进行快速、大量的金沙江块菌菌丝体扩繁培养，得到紧密、白色、菌落大和长势旺盛的金沙江块菌菌丝。
实施例18
同实施例16(培养pH为7.5，温度为24℃)，区别在于将金沙江块菌替换为会东块菌，并进行两个平行实验，依次记为958-4(ascocarp)和958-6(ascocarp)，培养40d后菌丝形态如图4～5，ITS鉴定结果如图6所示。根据图4～6可以看出，本发明培养基能够实现会东块菌菌丝体扩繁培养，得到紧密、白色、菌落大和长势旺盛的会东块菌菌丝。
实施例19
合成白块菌菌根
1.种子的萌发
1年内新鲜健康的华山松种子用无菌水冲洗后，用浓30％的H2O2浸泡30min进行表面消毒，期间加以搅拌，后用无菌水冲洗种子以去除表面残留的H2O2。催芽用 50℃温水浸种，自然冷却后浸泡24小时，取出晾干备用。灭过菌的蛭石和珍珠岩按 1:1的体积比混合均匀后平铺于育苗容器中，以开口端向下的方向播入基质，播种深度为1.5～2cm，浇无菌水。播种后用塑料薄膜覆盖保湿保温，以确保出苗整齐。种子萌发2个月后，选择侧根发达的松苗备用。
2.基质配制
腐殖土(产于针阔叶混交林下，室外自然分解2年)、蛭石、沙、珍珠岩按体积比1：1：0.5：0.25进行配制。配置前腐殖土灭菌3h，沙灭菌1h，其余成份不用灭菌。加入石灰粉，混匀，使pH达到7.5，备用。
3.将步骤1幼苗根末端进行修剪，生成创口便于菌丝侵染。放入直径10cm，高 20cm的苗盆中，将实施例16(培养pH为7.5，温度为24℃)培养40d后制得的金沙江块菌菌丝体切成1cm3大小(3-5块)，小心放到松苗侧根附近，然后倒入备好的基质，将苗栽好。在温度21～25℃、湿度30～45％、光照1500～3000lx的条件下，共培养45天，得基于金沙江块菌菌丝体接种形成的菌根，具体如图7所示，并且单株侵染率达到65％(单株华山松形成的菌根数量比上华山松总根数量)。本发明培养得到的金沙江块菌菌丝体在共培养45天即可合成菌根，极大地缩短了块菌菌根合成周期、加快了幼苗菌根化的程度，大幅度的降低了时间和材料成本，有效规避了野生块菌孢子接种所带来的外源真菌污染风险；同时还增强了幼苗吸收营养水分的能力和对环境的适应性，使菌根苗的生长得到改善，菌根苗株高和地径生长情况如表16所示。
表16菌根苗株高和地径生长情况
注：CK处理组只是种植华山松菌根苗，不接种金沙江块菌。
根据表16可以看出，本发明接种金沙江块菌后显著促进了华山松菌根苗株高和地径的生长。
实施例20
同实施例19，区别在于将步骤1华山松种子替换为板栗种子。共培养52天，得基于金沙江块菌菌丝体接种形成的菌根，具体如图8所示，并且单株平均侵染率达到73％(单株板栗形成的菌根数量比上板栗总根数量)。本发明培养得到的金沙江块菌菌丝体在共培养45天即可合成菌根，极大地缩短了块菌菌根合成周期、加快了幼苗菌根化的程度，大幅度的降低了时间和材料成本，有效规避了野生块菌孢子接种所带来的外源真菌污染风险；同时还增强了幼苗吸收营养水分的能力和对环境的适应性，使菌根苗的生长得到改善，菌根苗株高和地径生长情况如表17所示。
表17菌根苗株高和地径生长情况
注：CK处理组只是种植板栗菌根苗，不接种金沙江块菌。
根据表17可以看出，本发明接种金沙江块菌后显著促进了板栗菌根苗株高和地径的生长。结合实施19，基于nrDNA-ITS全序列采用最大似然法，构建金沙江与华山松和板栗形成的菌根系统发育树，结果如图3所示。根据图3、图7～8可以看出，利用本发明所述的金沙江块菌菌丝体可以与包括华山松在内的多种松属宿主，以及板栗在内的多种栗属宿主共生，促进其生长，具有明显的通用性。
实施例21
同实施例19，区别在于将步骤3中金沙江块菌菌丝体替换为实施例18培养40 天后制得的会东块菌菌丝体，共培养40天，得基于会东块菌菌丝体接种形成的菌根，具体如图9所示，并且单株平均侵染率达到75％(单株华山松形成的菌根数量比上华山松总根数量)。本发明培养得到的会东块菌菌丝体在共培养40天即可合成菌根，极大地缩短了块菌菌根合成周期、加快了幼苗菌根化的程度，大幅度的降低了时间和材料成本，有效规避了野生块菌孢子接种所带来的外源真菌污染风险；同时还增强了幼苗吸收营养水分的能力和对环境的适应性，使菌根苗的生长得到改善，菌根苗株高和地径生长情况如表18所示。
表18菌根苗株高和地径生长情况
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注：CK处理组只是种植华山松菌根苗，不接种会东块菌。
根据表18可以看出，本发明接种会东块菌后显著促进了华山松菌根苗株高和地径的生长。
实施例22
同实施例21，区别在于将步骤1华山松种子替换为板栗种子。共培养48天，得基于会东块菌菌丝体接种形成的菌根，具体如图10所示，并且单株侵染率达到67％ (单株华山松形成的菌根数量比上华山松总根数量)。本发明培养得到的会东块菌菌丝体在共培养48天即可合成菌根，极大地缩短了块菌菌根合成周期、加快了幼苗菌根化的程度，大幅度的降低了时间和材料成本，有效规避了野生块菌孢子接种所带来的外源真菌污染风险；同时还增强了幼苗吸收营养水分的能力和对环境的适应性，使菌根苗的生长得到改善，菌根苗株高和地径生长情况如表19所示。
表19菌根苗株高和地径生长情况
注：CK处理组只是种植板栗菌根苗，不接种会东块菌。
根据表19可以看出，本发明接种会东块菌后显著促进了板栗菌根苗株高和地径的生长。结合实施例21，本发明所述的东白块菌菌丝体可以与包括华山松在内的多种松属宿主，以及板栗在内的多种栗属宿主共生，促进其生长，具有明显的通用性。
结合上述实施例，本发明提供的用于培养白块菌菌丝体的培养基可快速、大量扩繁白块菌丝体，规避不成熟块菌孢子无法进行菌根合成的弊端，从根本上突破种源限制的瓶颈，合成白块菌菌根。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.一种培养白块菌菌丝体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用培养基培养白块菌，获得白块菌菌丝体；
所述培养基包括100mL/LV8蔬菜汁、0.02g/L Ca(NO3)2、0.5g/LKH2PO4和20g/L琼脂；
所述培养的温度为18～24℃，pH为6.5～8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白块菌包括金沙江块菌(Tuberjinshajiangense)和/或会东块菌(Tuber huidongense)。
3.权利要求1或2所述方法得到的白块菌菌丝体在白块菌菌根合成中的应用。
4.一种合成白块菌菌根的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1或2所述方法得到的白块菌菌丝体和白块菌宿主共同栽培到基质中培养，得到所述白块菌菌根。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为21～25℃，湿度为30％～45％，光照为1500～3000lx，时间为40～52天；
所述基质包括腐殖土、蛭石、沙和珍珠岩；所述腐殖土、蛭石、沙和珍珠岩的体积比为1：1：0.5：0.25。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述白块菌宿主包括松属和/或栗属宿主。
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