CN103548575A - 白块菌菌根合成方法 - Google Patents

Abstract

白块菌菌根合成方法，具体涉及国产白块菌（攀枝花白块菌T.panzhihuanense sensu lato）与华山松菌根合成方法。包括华山松种子和白块菌菌种及其子实体的筛选、无菌树苗的培育、菌剂制备、育苗基质配伍及其pH值的调节及其优选，菌剂浓度、接种要求，菌根苗的培养与菌根形态解剖与基因水平DNA分子检测和确认，移栽种植等步骤，为实现国产白块菌（攀枝花白块菌T.panzhihuanense sensu lato）的人工种植提供了必备的关键核心技术，本方法可应用于荒山荒坡土壤修复与改良、退耕还林植树造林及植被的修复与重建，对于开发利用石灰岩山地粘质土壤区域及偏僻山地林区具有巨大潜力，最终实现人工菌根合成及其种植白块菌，实现稀有物种的保护和持续利用。本发明的方法操作简易，容易广泛应用与推广。

Description

白块菌菌根合成方法

技术领域：

本发明属于植物与微生物技术交叉领域，具体地，涉及白块菌菌根合成方法，特别涉及国产白块菌与华山松菌根的合成方法。

背景技术：

块菌在国际贸易上被称为“松露（truffles）”；黑色的称为黑块菌（黑松露）；浅色的称为白块菌（白松露）。白块菌是自然界更为稀缺的生物资源，具有重大的科学研究价值和不可取代的生态价值。由于其味香特殊，价甚钻石，被誉为“舌尖上的钻石”、“上帝的食物”，而成为闻名遐迩的奇珍异馐，是块菌家族中最昂贵的类群。近10多年来国际需求强劲，价格攀升，导致掠夺性采集，自然资源量锐减，白块菌已处于极度濒危状态。

采用人为接种感染宿主植物无菌幼苗形成白块菌类菌根是目前唯一的途径，菌根合成已成为实现白块菌菌根合成及其种植中的关键核心技术。

迄今，现有技术中未见有白块菌菌根合成方法，以及白块菌与华山松菌根合成方法的报道和记载。本发明即是为解决这一技术难题而经长期探索形成的。

发明内容：

本发明的目的在于提供白块菌菌根合成方法，以及白块菌与华山松菌根合成方法。该方法涉及一系列程序与步骤，即华山松种子和块菌菌种子实体的筛选、宿主植物无菌树苗的培育、菌剂制备、育苗基质pH值的调节及其配置和优选，菌剂浓度、接种要求，菌根苗的培养与菌根形态解剖与DNA分子检测和确认，移栽种植，以最终实现人工种植白块菌，实现保护和持续利用的目的。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

白块菌与华山松菌根合成方法，包括下述步骤：

（1）华山松播种和无菌苗培育

A、种子筛选和消毒杀菌：取4-8℃冰箱内保藏不超过1年的华山松种子，30%H₂O₂浸泡2小时，无菌水冲洗数次，弃去漂浮的种子，再用无菌水浸泡48小时，捞出，用机械方式使种子轻微破口，复用75%酒精棉纱擦拭消毒，放培养皿中备用；

B、育苗基质制备：取未过筛蛭石与珍珠岩按体积比1：1混匀，加入水使其含水量达30%，121-126℃下高压蒸汽灭菌1小时；或取新生产的蛭石和珍珠岩按1：1比例混均备用；

C、播种：将（1）A步骤中备好的种子，以开口端向下的方向播入基质，播种深度为1.5-2cm，覆盖培养；

D、育苗：播种后适时无菌水浇灌；播种后第10日开始出芽，30日种子出芽大部分完成；苗龄在1.5-3月时开始接菌剂。

（2）白块菌菌剂制备和接种，

A、菌剂制备：选国产的成熟白块菌，显微镜下鉴定确认，观察到黑褐色的孢子与未成熟黄褐色孢子的比例达95:5为成熟子囊果，成熟子囊果用自来水清洗干净后，无菌水冲洗3遍，4-8℃冷藏10-20天后，再在-24℃冷冻保存不超过18个月备用。

菌剂制备前将冷冻子囊果取出，自然解冻，将每一子囊果切为数块，放置于搅拌机中，加无菌水粉碎，显微镜下镜检，确定95%的子囊游离，5%的孢子从子囊分离出为止，菌剂的浓度为每克子囊果/水=1g/3-5ml；

B、接种基质制备及pH值调整：腐殖质土2目过筛，适量拌入水，使水分含量30%，高压灭菌3小时后备用；腐殖质与蛭石以体积比1/1的比例混合，加入石灰粉，混匀，调整pH为7.6—8.3，备用；

C、接种：按每株接种1.2×10⁷个孢子的量折算出每株需接种的菌剂的体积，取稀释菌剂浇入基质，拌匀；将步骤（1）所得幼苗自育苗基质中取出，剪去根末端，将幼苗的根系全部浸入步骤（2）A制备的菌剂稀释液中沾取孢子后取出，植入步骤（2）B的制备的接种基质中培育；

（3）菌根苗培育：接种的幼苗置于自然通风大棚，自来水浇灌，干湿交替培养，培养温度10-26℃，每天太阳光照10-14小时。

华山松块菌菌根苗培育5-6个月后，通过形态解剖及分子水平的确认块菌菌根形成，并达到95%以上的菌根合成率，即可移植。

本发明技术方案的提出基于下述的块菌菌根合成原理：块菌是一类与木本植物（主要为松科Pinaceae、壳斗科Fagaceae、榛科Corylaceae、桦木科Betulaceae、杨柳科Salicaceae等）形成外生菌根的共生性地下生子囊菌类真菌，其生长发育及子实体形成都必须与这些植物的根系共生才能实现。因此采用人工配置的特定基质和育苗条件来合成菌根培育菌根树苗，用白块菌的组织和孢子制成块菌菌种菌剂接种，在人为干预和控制的条件下，通过根部创伤促进幼苗产生更多的新幼根，以此满足白块菌孢子萌发时能够快速感染到幼根的需求，促成菌根的形成，把合成的菌根树苗种植栽培在适宜的山地（pH值7.6-8.3、炭氮比C/N≥10），实现珍稀物种白块菌的有效保护和人工种植，确保持续发展。

本发明白块菌与华山松菌根合成的方法，优化了菌根树苗的培育、培养基质和菌剂制作及菌根合成和菌根的检测与确认。

本发明更具体的合成步骤和技术方法如下：

1、基质制备与育苗

基质制备：蛭石与珍珠岩按体积比1/1混匀，加入自来水使其含水量达30%，121-126℃下高压蒸汽灭菌1小时后冷却备用（若为新生产的蛭石和珍珠岩也可不必灭菌，可直接使用）。

播种与育苗：挑选成熟饱满的种子，用75%酒精表面消毒灭菌，以机械的方法使其开裂微口，开口端向下播入上述基质。播种深度1.5-2cm为宜；要适时浇灌；播种后第10日开始出芽，30日后几乎全部种子出芽完成，萌发率的统计从第6日至第30日；苗龄在1.5-3月时即可接种。

2.菌剂及其制备

子实体筛选与保藏：首先使用显微镜镜检鉴定白块菌，确认块菌子实体准确无误，避免其它杂菌混入；从中选取成熟的白块菌，以深黑褐色的孢子量比率达95%以上的为成熟子囊果；冲刷清洗去除泥土后，用无菌水冲洗；4-8℃冷藏箱保藏10-20天后，移入-24℃冷冻室保存备用。

菌剂制备：冷冻子囊果自然解冻，用小刀将每一子囊果切为数块；将小切块放置于搅拌机中，加无菌水粉碎，显微镜下镜检，以确定无肉眼可见的组织块，使95%的子囊游离，约5%的孢子从子囊分离出为止。菌剂的浓度以每克子囊果/水=1g/3-5ml为宜。

3.接种

基质制备及pH值调整：腐殖质土过筛，适量拌入水，水分含量30%，高压灭菌3小时备用；灭菌后的腐殖质与蛭石以体积比1/1的比例混均，加入石灰粉，充分混匀，调整pH为7.6—8.3时即可备用。

接种与培育：根据每株接种含有1.2×10⁷个孢子菌剂的剂量要求，取上述制成的菌剂原液稀释20倍，取1ml稀释菌液移入基质，搅拌均匀；取上述培养的幼苗剪去根端，并将整个根系浸入稀释菌剂之后移植基质培育。接种后的幼苗置于自然通风大棚培育。

4.菌根形态及分子水平验证：

外观特征：菌根形成后菌根末级分枝棒状或近圆柱状，表面光滑，多数情况具有明显外延菌丝，末端透明、乳白色至淡黄色，向基部颜色由浅褐色至褐色渐变，常形成深浅相间的蛇纹样斑纹；菌套明显，有时表面覆盖形成外延菌丝，菌套细胞不透明。抽样统计每株菌根数量均为700-800个，单株根系感染率可以达95%以上。

解剖特征：外菌套平面观非胶质化，拟薄壁组织（pseudoparenchymatous tissue）M型，表面具表皮样细胞（epidermal cells）。内菌套平面观介于疏丝组织型（pletenchymatous tissue）与拟薄壁组织型之间，近似H型，多数部位近哈蒂氏状（Hartig net-like），菌丝排列较紧密，粗1–3μm，薄壁，透明；外延菌丝放射状分布，近等粗，针状，薄壁，不分枝，无色。

分子水平验证：经过白块菌制菌剂子实体和截取华山松菌根树苗菌根总DNA的提取，采用了改进的CTAB法和真菌DNA试剂盒、PCR扩增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5对比分析，分别都得到100%的一致性，表明所培育合成获得的华山松幼苗菌根是由白块菌菌丝侵入形成的；形态特征与分子水平均确认华山松与白块菌菌根合成是成功的。

具体实施方式：

为了更好地了解本发明，下面用本发明的实施例证来进一步说明本发明的内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

白块菌与华山松菌根苗的合成：

1、华山松育苗：

（1）备种

秋季采集成熟华山松种子，4-8℃冰箱内保藏，保藏期不超过1年。用前取出，30%H₂O₂浸泡2小时，其间搅动数次→无菌水冲洗数次→弃去漂浮的种子→无菌水浸泡48小时，捞出→用机械方式，使种子轻微破口→复用75%酒精棉纱擦拭消毒，放培养皿中备用。

（2）基质

蛭石（未过筛）与珍珠岩按体积比1/1混匀，加入自来水使其含水量达30%，121-126℃下高压蒸汽灭菌1小时；若为新生产的蛭石和珍珠岩也可不灭菌直接使用。

（3）播种

将备好的种子，以开口端向下的方向播入基质。播种深度为1.5-2cm；容器为425×340×200mm透水塑料筐。

（4）育苗

自来水浇灌；播种后第10日开始出芽，30日后几乎全部种子出芽完成，萌发率的统计从第6日至第30日，发芽率约为80%；苗龄1.5-3月时即可接种。

2、菌剂

为了确保获得成熟的孢子，选2-3月份国产成熟白块菌（攀枝花白块菌T.panzhihuanensesensu lato及其近缘种会东块菌T.huidongense、T.cf.liyuanum），不分大小；在显微镜下逐个镜检子实体孢子形态等分类学特征以确定种的正确性；孢子成熟度，即以黑褐色孢子（成熟）与黄褐色孢子（未成熟）的比例达95:5为成熟孢子。硬毛刷在自来水中洗刷去表面泥土并清洗至无泥土残留，无菌水冲洗3遍；4-8℃冷藏10-20天后，-24℃冷冻保存；保存期不应超过18个月。

菌剂制备前将冷冻子囊果从冰箱内取出，自然解冻。解冻后用小刀将每一子囊果切为数块；将切块放置于PHILIPS HR2839型二合一搅拌粉碎机中，每次放子囊果约200g，加无菌水粉碎，最初加水少许，后逐渐增加水量，适量加冰块以降温，粉碎约3-4分钟，显微镜下镜检，以确定无肉眼可见的组织块，95%的子囊彼此分离，约5%以上的孢子从子囊内分离出为止。菌剂的浓度以每克子囊果/水=1g/3-5ml为宜。

孢子计数：菌剂原液充分搅匀，在容器上中下部位各取1ml，置于3个量筒内，量筒内1ml稀释至10ml，搅匀；每一量筒上中下部各取一滴，置血球计数板；算出单位体积原液折合的孢子数目；同时，取原液10ml菌剂以无菌水稀释20倍后置烧杯中供接种时蘸根。

3、接种

（1）基质制备及pH值确定

腐殖质2目过筛，适量拌入自来水，使水分含量约30%，121-126℃高压蒸汽灭菌3小时以上，高压灭菌后的腐殖质与蛭石（灭菌或否）以体积比按1/1的比例混合后备用；

以上基质取一定质量（如100g），分为4等份，在各等份中分别加入不同质量的熟石灰粉，充分混匀，每份各取30ml，加入150ml蒸馏水，其间搅动数次，1小时后，用精密pH试纸（5.5-9.0）测得每份基质的pH值。计算pH为7.6—8.3时基质与石灰的质量比。按以上比例在基质中加入石灰，充分混匀后备用。

（2）接种

方法：按每株接种1.2×10⁷个孢子的量折算出每株需接种的菌剂原液的体积，如菌剂原液稀释20倍后，以量筒量取1ml菌剂后浇入基质，将菌剂与基质拌匀备用；幼苗自育苗基质中取出，用剪刀剪去根的末端以促使生出更多的侧根；将根系全部浸没入步骤2制备的稀释菌剂后取出，容器底部1/5放入接种基质后将幼苗植入；基质占容器容积的4/5。

4、菌根苗培育

接种苗置于自然通风大棚，自来水浇灌，干、温交替，培养温度10-30℃，每天光照10-14小时。

5、菌根形态

接种后约需5-6个月，块菌菌丝侵入幼苗根系形成菌根。确认菌根是否形成，需要从菌根形态及其解剖特征和分子水平（即亲子鉴定）予以确认。

外观特征：菌根系统（mycorrhizal systems）二叉状（dichotomous），偶简单不分枝状（unramified），有时近珊瑚状（coralloid）或介于类型之间，总长2-5.2mm，具1–4级次生分枝，有时数个具3-4级分枝的菌根沿根紧密排列形成近簇状；末级分枝棒状或近圆柱状，顶端直，长0.7-4.1mm，顶端直径（220）300–450μm，基部粗200-300μm，表面光滑，有时具外延菌丝，顶端透明、乳白色至淡黄色，中部浅褐色或浅红褐色，向基部颜色渐深，菌根老化后顶端与基部同色，常形成深浅相间的蛇纹样；菌套明显，有时表面覆外延菌丝，菌套细胞不透明；皮层细胞不可见；外延菌丝缺或仅限于最末一级分枝，针状，短，透明，明显。菌索末见。菌核末见。

解剖特征：外菌套平面观非胶质化，拟薄壁组织（pseudoparenchymatous tissue）M型（依Agerer，1987-2002），表面具表皮样细胞（epidermal cells），不具菌丝网（hyphal nets），细胞薄壁，浅褐色或黄褐色，菌丝颜色透明，表面光滑无附属物，长10–35μm，粗2–4μm，每20μm×20μm方块内7–10个细胞（包含完整的与仅部分位于样方的细胞）。内菌套平面观介于疏丝组织型（pletenchymatous tissue）与拟薄壁组织型之间，接近H型（依Agerer，1987-2002），多数部位近哈蒂氏状（Hartig net-like），菌丝排列较紧密，粗2–4μm，薄壁，无色；外延菌丝放射状分布，近等粗，针状，粗1–2μm，薄壁，无分枝，颜色透明。锁状联合缺。囊状体和厚垣孢子缺。

分子水平验证：经过制菌剂子实体和截取华山松菌根树苗菌根总DNA的提取，采用了改进的CTAB法和真菌DNA试剂盒、PCR扩增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5对比分析，分别都得到100%的一致性，表明所培育获得的华山松幼苗菌根是由白块菌菌丝侵入形成的；确认华山松白块菌菌根合成成功。

菌根数量：抽样统计每株菌根数量为700-800个，单株根系感染率（菌根数/（不感染根尖数+菌根数）为95%。

注：此处“一个菌根”的定义为：由连续的可识别的菌套所覆盖的区域所形成的一个单元。多分枝的菌根，若由连续的菌套所覆盖，视为一个菌根。

与现有技术相比，本发明具备的优益性在于：

1、本发明为实现国产白块菌的人工菌根合成及其种植提供了必备的关键核心技术。

2、通过本发明实现了国产白块菌与华山松菌根的合成，利用本方法可以批量规模化合成培育白块菌菌根树苗，为下一步块菌的人工种植产业化提供技术支撑与保障。

3、本发明可应用于荒山荒坡土壤修复与改良、退耕还林植树造林及植被的修复与重建，对于开发利用石灰岩山地粘土区域及偏僻山地林区具有巨大潜力和广阔的应用前景。

4、本发明的方法操作简易，容易广泛应用与推广。

5、本发明为生物学（微生物学、菌物学）与农学与林学（栽培学和林业）及其交叉学科菌根学Mycorrhizology领域的技术交叉，汲取了多个学科的多重优点，具有实用简便的优势。

Claims (3)

1.白块菌菌根合成方法，包括下述步骤：

(1)华山松播种和育苗，

A、种子：筛选华山松饱满种子，在4-8℃冰箱内保藏2-12个月；育苗时取出在30％H₂O₂浸泡2小时后，用无菌水冲洗5-6次，弃去漂浮的种子，用无菌水浸泡48小时，捞出，用破壳器机械方式使种子轻微破口，再用75％酒精棉纱擦拭消毒，置于培养皿中备用；

B、基质：取未过筛蛭石与珍珠岩按体积比1:1混匀，加入水使其含水量达30％，在高温（121～126℃）高压（102.97～137KPa）下蒸汽灭菌至少1小时；

C、播种：将(1)A步骤中备好的种子，以开口端向下的方向播入基质中，播种深度为1.5-2cm，覆盖（1）B步骤中制备的基质，并抚平踏实；

D、育苗：将上述播种好的育苗筐在育苗室育苗，室内温度控制在16-25℃，确保通风透光，适时浇水育苗；

(2)白块菌菌剂制备和接种

A、菌剂制备：选1-2月份产的成熟白块菌，显微镜下观察孢子形态，孢子纹饰清晰，黑褐色孢子与未成熟黄褐色孢子的比例达95∶5为成熟子囊果，成熟子囊果用自来水清洗干净后，无菌水冲洗3遍，4-8℃冷藏10-20天后，再在-24℃冷冻保存不超过18个月备用；菌剂制备前将冷冻子囊果取出，自然解冻，逐一镜检确认物种准确，将每一子囊果切为数块颗粒状，置于搅拌粉碎机中，加无菌水粉碎，显微镜下镜检，确定95％的子囊游离，5％的子囊孢子从子囊分离出为止，菌剂的浓度为每克子囊果/3-5ml水；

B、接种基质制备：腐熟的腐殖质土过筛，适量拌入水，使水分含量30％，高温（121～126℃）高压（102.97～137KPa）灭菌3小时备用；腐殖质、蛭石、砂、珍珠岩以体积比1:1:0.5:0.25的比例混合后，加入适量石灰粉使pH值调整为7.6—8.3，备用；

C、接种，按每株接种1.2×10⁷个孢子的量折算出每株需接种的菌剂的体积，取菌剂浇入步骤（2）B制备的基质中，拌匀；同时，将步骤(1)培育所获得的幼苗自育苗基质中取出，剪去根的1/3末端以造成创伤，促进生根，将幼苗根系全部浸入步骤(2)A制备的菌剂后取出，植入步骤(2)B的已接种的基质中；

(3)、菌根苗培育，已接种的幼苗置于自然通风、光照充足的育苗大棚内，自来洁净水浇灌，干、温交替培养，培养温度10-26℃，太阳光照10-14小时。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

(1)、华山松种子筛选和育苗，

A、种子的筛选与消毒杀菌：选取保藏在4-8℃冰箱1年以内的华山松种子，用30％H₂O₂浸泡2小时，期间每15分钟搅拌1次，之后无菌水冲洗4-5次，弃去漂浮的种子，再用无菌水浸泡48小时，捞出，用破壳器机械方式使种子轻微破口，反复用75％酒精棉纱擦拭消毒，置于培养皿中备用；

B、基质的制备：取未过筛的蛭石与珍珠岩按体积比1/1的比例混匀，加入水使其含水量达30％，在121-126℃下高压蒸汽灭菌锅内灭菌1个小时；将制备好的基质在无菌的条件下分装入容器为425×340×200mm透水塑料容器备用；

C、播种：将(1)A步骤中备好的种子，以开口端向下的方向播入步骤(1)B制备好的基质容器内，播种深度为1.5-2cm，覆盖培养；

D、育苗：无菌水浇灌，为获得健壮幼苗，严格控制浇水次数，干、湿交替，满足通风透光要求；播种后通常第10日开始出芽，30日种子出芽大部分完成；苗龄在2-3月时开始接种。

(2)、白块菌菌剂制备和接种，

A、菌剂制备：

选取成熟的白块菌子实体，显微镜下镜检子囊孢子确认满足成熟条件，并逐一检查确认无其它块菌混入；镜检观察到网纹清晰、黑褐色的子囊孢子达到95％以上子实体为成熟的子囊果；成熟子囊果用毛刷及自来水清洗干净后，无菌水冲洗3-5遍，置4-8℃冷藏冰箱内冷藏10-20天后，移入-24℃冷冻保藏箱内保藏备用；冷冻保藏时间不超过18个月；

菌剂制备前将冷冻子囊果取出，常温下自然解冻，将每一子囊果切为数块，置于粉碎机中，加无菌水粉碎；显微镜下镜检，确定95％以上的子囊游离，5％的子囊孢子从子囊中分离出为止；菌剂的浓度为每克子囊果用水3-5ml稀释为宜，制成菌剂原液备用；使用时可再稀释20倍；

B、接种基质制备及pH值调整：腐殖质土过筛，适量拌入水，使水分含量达30％（即轻握成团，一触即散），高温（121～126℃）高压（102.97～137KPa）灭菌3小时；灭菌后的腐殖质与蛭石、砂、珍珠岩以体积比1:1:0.5:0.25的比例混合后，加入适量石灰粉，混匀调整pH值为7.6-8.3，备用；

C、接种，按每株需接种1.2×10⁷个孢子的量折算出每株需接种的菌剂的体积，取菌剂原液稀释后浇入上述灭菌后的基质内，充分拌匀；将步骤(1)所得无菌幼苗自育苗基质中取出，剪去根1/3末端，将幼苗根系全部浸入步骤(2)A制备的菌剂稀释夜中以沾取孢子菌剂后取出，植入步骤(2)B制备的接种基质中育苗培养；

(3)、菌根幼苗的培育与管理：接种幼苗置于自然通风、光照充足的塑料大棚内，自来水浇灌，干、湿交替培养，培养温度为10-26℃，每天光照10-14小时；华山松印度菌根苗培育5-6个月后，通过菌根苗菌根的确认后即可移植。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中菌根苗菌根的确认是从菌根形态及其解剖特征和分子水平予以确认：

外观特征：菌根系统（mycorrhizal systems）二叉状（dichotomous），偶简单不分枝状（unramified），有时近珊瑚状（coralloid）或介于类型之间，总长2-5.2mm，具1–4级次生分枝，有时数个具3-4级分枝的菌根沿根紧密排列形成近簇状；末级分枝棒状或近圆柱状，顶端直，长0.7-4.1mm，顶端直径（220）300–450μm，基部粗200-300μm，表面光滑，有时具外延菌丝，顶端透明、乳白色至淡黄色，中部浅褐色或浅红褐色，向基部颜色渐深，菌根老化后顶端与基部同色，常形成深浅相间的蛇纹样；菌套明显，有时表面覆外延菌丝，菌套细胞不透明；皮层细胞不可见；外延菌丝缺或仅限于最末一级分枝，针状，短，透明，明显。菌索末见，菌核末见；

解剖特征：外菌套平面观非胶质化，拟薄壁组织（pseudoparenchymatous tissue）M型（依Agerer，1987-2002），表面具表皮样细胞（epidermal cells），不具菌丝网（hyphal nets），细胞薄壁，浅褐色或黄褐色，菌丝颜色透明，表面光滑无附属物，长10–35μm，粗2–4μm，每20μm×20μm方块内7–10个细胞（包含完整的与仅部分位于样方的细胞），内菌套平面观介于疏丝组织型（pletenchymatous tissue）与拟薄壁组织型之间，接近H型（依Agerer，1987-2002），多数部位近哈蒂氏状（Hartig net-like），菌丝排列较紧密，粗2–4μm，薄壁，无色；外延菌丝放射状分布，近等粗，针状，粗1–2μm，薄壁，无分枝，颜色透明，锁状联合缺，囊状体和厚垣孢子缺；

分子水平验证：经过制菌剂子实体和截取华山松菌根树苗菌根总DNA的提取，采用了改进的CTAB法和真菌DNA试剂盒、PCR扩增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5对比分析。