CN117617056A - 一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于本发明属于农业领域技术领域，具体涉及一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法。本发明提供了一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法，在人工条件下，接种丽江块菌三个月后，能够成功侵染美国山核桃，形成菌根，菌根合成率达到95%以上，为丽江块菌后期的人工培育奠定基础；接种丽江块菌的美国山核桃株高更高，基径更粗，促进了美国山核桃的生长发育，同时美国山核桃又有效地促进了丽江块菌的生长发育，打破了野外丽江块菌只在云南丽江一带分布的局限性，为丽江块菌的多地种植提供了可能性。本发明的制备方法简单、实用、高效，生产成本较低，并且不受季节的影响，经济效益显著。

Description

一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法。

背景技术

丽江块菌（Tuber lijiangense），俗名黄块菌、黄栗子菌等，是中国的特有种，迄今仅在云南丽江一带发现，其菌肉质感细腻，味道鲜美，具有较好的可食性。研究发现，块菌含有200余种特殊气味成分，富含18种氨基酸、蛋白质以及不饱和脂肪酸、雄性酮、甾醇、鞘脂类等50余种生理活性成分及多样的微量元素，并含有人体必需的8种氨基酸、锌、锰、铁、钙、磷、硒等必需营养微量元素，能够预防和治疗糖尿病、防治老年痴呆及中老年心血管硬化、降低胆固醇；具有保肝护肝、增强免疫力、增智、抗衰老、益胃、清神、止血、疗痔、治疗便秘等药用价值；具有抗癌活性，对癌细胞、肿瘤有一定的抑制作用，可以激发脑细胞活力，块菌药效广泛，营养价值丰富，具有较高的药用和食用价值。由于野生丽江块菌产量低、目前只发现分布于云南丽江一带，需要依靠人工栽培来满足日益增长的市场需求，而有效的接种方法不仅是丽江块菌菌根化生产的前提，也是块菌栽培成败的关键。

美国山核桃（Carya illinoinensis）隶属胡桃科（Juglandaceae）山核桃属（Carya），又名长山核桃、薄壳山核桃，为高大乔木，是世界四大坚果之一，原产地为美国和墨西哥，在法国、意大利、以色列、南非、澳大利亚、日本、中国等地有较大面积引种。该树种是一个极具市场竞争力的高效生态经济型干果油料树种，其果壳薄，较易取出果仁，出仁率高（50%~70%），含油率达到70%~80%，不饱和脂肪酸含量较高，为60%左右；与油橄榄相比，不饱和脂肪酸和对人体有益的各种氨基酸较高，且富含维生素B1和B2；同时在园林绿化中应用也较为广泛，其优良的材质，美观的树形，根系发达，使其具有良好的水土保持和生态功能，因而被广泛用作经济林、用材林、生态林和园林绿化的首选树种。美国山核桃用途较广、受益时间长（50~70年），其经济效益、社会效益和生态效益十分明显。美国山核桃是核桃品种中唯一一个适合低海拔栽培的树种，中国于19世纪末20世纪初开始引种美国山核桃，引种历史悠久，引种范围较广，我国最早在江苏、上海、浙江等地引种美国山核桃，引种效果良好，生长结实正常，小范围的生长结实性状和坚果品质达到甚至超过了原产地的平均水平。但目前国内的美国山核桃的栽培面积、种植规模与国内的消费需求严重不匹配，供不应求，大部分还是依赖于进口，因此对美国山核桃的开发非常有必要。

丽江块菌因其极高的经济价值，遭到人类的过度采挖，破坏了其生境，严重影响了其产量；此外，块菌与树木形成菌根非常不易，从侵染宿主植物开始到产生块菌子实体需要5~8年的时间，现在人工种植虽然已经有地区种植成功，但是如此的破坏自然块菌资源，无异于加剧了块菌成为濒危物种的步伐。目前，丽江块菌尚不能人工栽培，国内外还没有关于丽江块菌的栽培接种技术的报道。菌根化苗制备就是建立丽江块菌与其宿主树的共生关系，是实现丽江块菌人工栽培的基础。现有技术中报道了攀枝花块菌接种美国山核桃制备菌根化苗，菌根合成率最高为87.8%（参见CN201710413848.0攀枝花块菌的菌根苗培育方法），菌根合成率较低。目前还未见丽江块菌和美国山核桃制备菌根化苗的报道。

发明内容

现有丽江块菌并未有人工栽培的报道，为了解决这一问题，本发明的目的是提供一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法，通过宿主植物幼苗培育和营造菌种生长环境，形成丽江块菌菌根化苗，为丽江块菌的人工种植奠定基础，同时接种丽江块菌的美国山核桃株高更高，基径更粗，促进了美国山核桃的生长发育，使其更加适应云南的生长环境。

本发明提供了一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法，所述方法包括如下步骤：

利用丽江块菌子实体菌悬液对美国山核桃无菌幼苗根系进行浸泡，得到接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗；

将浸泡后剩余的丽江块菌子实体菌悬液与移栽基质混合，得到接种基质；

将所述接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗栽种于接种基质中进行培养，得到丽江块菌菌根化苗；丽江块菌子实体菌悬液中有效孢子数为≥5×10⁷个孢子/mL；所述接种基质的pH值为7.0~7.5。

优选的，所述美国山核桃无菌幼苗的须根数量为4~5个，须根长度为7~12cm。

优选的，所述美国山核桃无菌幼苗在浸泡之前进行修剪。

优选的，每棵美国山核桃无菌幼苗施用0.25g~0.7g丽江块菌子实体制备得到的丽江块菌子实体菌悬液。

优选的，所述丽江块菌子实体菌悬液的制备方法包括：粉碎丽江块菌子实体得到浆液；将所述浆液与无菌水混合得到丽江块菌子实体菌悬液。

优选的，所述移栽基质包括腐质土、蛭石和珍珠岩。

优选的，所述移栽基质和水混合后应用，所述腐质土、蛭石、珍珠岩和水的体积比为2：2：（1~1.5）：2.5。

优选的，所述浸泡的时间为2~6min。

优选的，所述培养的温度为15~26℃、湿度为75%~85%；光照强度为30000~35000lux。

优选的，所述美国山核桃无菌幼苗的培育方法包括：

将美国山核桃种子依次进行春化、刷洗、浸种、筛种和消毒后，将美国山核桃种子与催芽基质混合后进行催芽培养，得到无菌幼苗。

本发明的有益效果：本发明提供了一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法，所述方法包括如下步骤：利用丽江块菌子实体菌悬液浸泡美国山核桃无菌幼苗根系，得到接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗；再将浸泡后剩余的丽江块菌子实体菌悬液与移栽基质混合，得到接种基质；将所述接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗栽种于接种基质中进行培养，得到丽江块菌菌根化苗；丽江块菌子实体菌悬液中有效孢子数为≥5×10⁷个孢子/mL；所述接种基质的pH值为7.0~7.5。

本发明在人工条件下，接种丽江块菌三个月后，能够成功侵染美国山核桃，形成菌根，菌根合成率达到95%以上，为丽江块菌后期的人工培育奠定基础；提高丽江块菌的接种成功率，降低生产成本，接种丽江块菌的美国山核桃株高更高，基径更粗，促进了美国山核桃的生长发育，同时美国山核桃又有效地促进了丽江块菌的生长发育，打破了野外丽江块菌只在云南丽江一带分布的局限性，为丽江块菌的多地种植提供了可能性。本发明的制备方法简单、实用、高效，生产成本较低，并且不受季节的影响，经济效益显著。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1丽江块菌与美国山核桃形成的外生菌根外观形态图；

图2为实施例1丽江块菌与美国山核桃形成的菌根横切面图。

具体实施方式

本发明提供一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法，所述方法包括如下步骤：

利用丽江块菌子实体菌悬液对美国山核桃无菌幼苗根系进行浸泡，得到接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗；

将浸泡后剩余的丽江块菌子实体菌悬液与移栽基质混合，得到接种基质；

将所述接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗栽种于接种基质中进行培养，得到丽江块菌菌根化苗；丽江块菌子实体菌悬液中有效孢子数为≥5×10⁷个孢子/mL；所述接种基质的pH值为7.0~7.5。

在本发明中，所述丽江块菌子实体菌悬液的制备方法优选包括：丽江块菌子实体粉碎后得到浆液；所述浆液与无菌水混合后得到丽江块菌子实体菌悬液。

本发明所述丽江块菌子实体优选为新鲜采集的子实体或放置于-20℃冷冻保存的子实体。当应用-20℃冷冻保存的丽江块菌子实体时，优选先解冻子实体后再进行粉碎。本发明对所述粉碎的参数无特殊限定，采用常规参数即可。本发明优选在所述粉碎过程中加入冰块和冰水防止温度过高，破坏子实体的活性。本发明优选将所述浆液与无菌水混合后得到丽江块菌子实体菌悬液。本发明所述丽江块菌子实体菌悬液中有效孢子数≥5×10⁷个孢子/mL，更优选为1.0×10⁸~1.4×10⁸个孢子/mL。本发明所述丽江块菌子实体菌悬液计数时优选从丽江块菌子实体菌悬液的上层、中层、下层各取一滴丽江块菌子实体菌悬液使用血球计数板进行计数。

本发明优选每棵美国山核桃无菌幼苗施用0.25g~0.7g丽江块菌子实体制备得到的丽江块菌子实体菌悬液，更优选为0.5g。本发明利用丽江块菌子实体制备丽江块菌子实体菌悬液具有无需菌液培养时间成本，方便，接种率高优势。

在本发明中，所述美国山核桃无菌幼苗的培养方法优选包括如下步骤：对美国山核桃种子依次进行春化、刷洗、浸种、筛种和消毒后，将所述美国山核桃种子与催芽基质混合后进行催芽培养，得到无菌幼苗。

本发明美国山核桃种子的育苗时间优选为每年2~3月份。本发明所述美国山核桃种子优选为果形较大、较为饱满且连续结果能力较强的美国山核桃的种子。本发明对所述美国山核桃种子采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本发明所述春化优选在冰箱中完成。本发明所述春化的温度优选为4℃，时间优选为58~62d，更优选为60d。本发明对所述刷洗的方式没有特殊限定，采用常规的方法即可，刷洗到水清澈即可。本发明所述浸种采用的生长调节剂优选包括赤霉素和/或乙烯利，更优选为赤霉素和乙烯利。本发明浸种用水溶液中的赤霉素质量浓度优选为140~158mg/L，更优选为150mg/L；本发明浸种用水溶液中的乙烯利的质量浓度优选为143~151mg/L，更优选为150mg/L。本发明所述浸种的时间优选为7~8d，本发明所述浸种过程中优选每隔3~4d更换一次溶液。浸种后，本发明优选对所述美国山核桃种子进行筛种和消毒。本发明筛种可以提高美国山核桃的发芽率和出苗后的整齐度，所述筛种优选利用清水完成，沉下去的种子为筛种所得物，对筛种所得物进行消毒处理。本发明所述消毒优选利用质量浓度为0.3%的高锰酸钾溶液完成，所述消毒的时间优选为3~4h，更优选为3.5h。消毒后，本发明优选利用无菌水对所述美国山核桃种子进行冲洗，所述冲洗的次数优选为3~4次，洗去消毒液。

在本发明中，所述催芽基质优选包括珍珠岩和蛭石；本发明所述珍珠岩和蛭石优选高温高压蒸汽灭菌后应用。本发明所述高温高压蒸汽灭菌的参数优选为在121℃、1个标准大气压下灭菌1h。选择珍珠岩和蛭石是由于蛭石能够疏松土壤，它还具有良好的透气性、吸水性，温度变化也较小，所以它能够促进植物的生长；此外，蛭石具有一定的保肥性，且可以释放一定的营养元素，长时间提供植物生长所必需的营养，从生长初期促进植物较快生长；珍珠岩具有较好的通透性，易于排水，易于通气。

本发明优选将预处理后的种子与珍珠岩和蛭石混合后进行催芽培养，得到无菌幼苗。本发明所述催芽培养在幼苗冒出催芽基质之前，优选为暗培养，幼苗长出催芽基质2~5cm后进行光照培养。在本发明中，所述珍珠岩和蛭石优选按照体积比（1~2）：（1~2）拌匀后应用，更优选为1:1。本发明优选所述珍珠岩和蛭石分别先进行灭菌后再拌匀。

本发明所述催芽基质的体积是所述预处理后种子的体积的3倍以上。本发明所述预处理后的种子与催芽基质混合的方式优选包括：在育苗盘底部铺第一部分催芽基质；将所述预处理后的种子与第一部分催芽基质混合得到混合物；第二部分催芽基质用无菌水淋湿后再与所述混合物混匀，得到培养物。本发明所述第一部分催芽基质在育苗盘中的高度优选为5cm，取第二部分的催芽基质覆盖住种子，所述第二部分的催芽基质在育苗盘中的高度优选为2~5cm。本发明所述第一部分催芽基质和第二部分催芽基质的总量即为应用的全部催芽基质。本发明所述第一部分催芽基质和第二部分催芽基质在育苗盘中的高度优选为7~10cm；本发明所述育苗盘的厚度优选为9~15cm，更优选为12.5~14.5cm。本发明所述培养物的湿度优选为手握成团，松开即散。

本发明优选将所述培养物放入培养箱中进行培养得到美国山核桃无菌幼苗。本发明优选在所述培养物中每隔0.7~1cm插入一根消毒后的吸管，保证通气，促进种子发芽。本发明所述培养箱的温度优选为22~25℃；湿度优选为73%~78%，更优选为75%，本发明优选在培养过程中经保持基质的湿润和通气，以防止种子霉烂。于所述培养过程中，本发明优选直接掰断长出育苗盘外的胚根，使其更好的生长出须根。本发明优选所述美国山核桃无菌幼苗的须根上的数量为4~5个且须根的长7~12cm时开始接种丽江块菌子实体菌悬液，更优选为美国山核桃无菌幼苗的地径为0.2cm~0.5cm，须根上的数量为4~5个且须根的长7~12cm时开始接种丽江块菌子实体菌悬液。之所以长出须根后进行接种是为了提高接种成功率，增加菌种感染植物根系的面积，因为菌种一般都只会感染在宿主植物的须根上，这样菌根才能够实现帮助植物吸收土壤中的水分和养分，促进植物的生长和发育。

得到美国山核桃无菌幼苗和丽江块菌子实体菌悬液后，本发明将美国山核桃无菌幼苗根系放入丽江块菌子实体菌悬液中进行浸泡，得到接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗；本发明将所述丽江块菌子实体菌悬液施用于美国山核桃无菌幼苗之前，优选先对美国山核桃无菌幼苗的根尖和须根进行修剪，通常剪去1~2cm，便整个根系上面长，下面短，整体上呈一个扇形。修剪的作用为产生根系创口，更易于丽江块菌接种，提高接种效率。本发明所述浸种的时间优选为2~6min，更优选为4min。本发明所述浸种的时间优选为早上6:00或者傍晚，中午施用不利于美国山核桃无菌幼苗生长。

浸种后，本发明将浸种后剩余的丽江块菌子实体菌悬液与移栽基质混合，得到接种基质。本发明所述丽江块菌子实体菌悬液先浸泡美国山核桃无菌幼苗，再与移栽基质混合，可以充分利用丽江块菌子实体菌悬液，降低丽江块菌子实体菌悬液的应用量和生产成本。本发明所述移栽基质优选包括腐质土、蛭石和珍珠岩；所述移栽基质优选和水混合后应用，所述腐质土、蛭石、珍珠岩和水的体积比优选为2：2：（1~1.5）：2.5，更优选为2:2:1.5:2.5。本发明所述移栽基质加入适量丽江块菌子实体菌悬液得到接种基质。本发明优选将所述腐质土、珍珠岩和蛭石分别先进行高温高压蒸汽灭菌后再拌匀。本发明优选对所述珍珠岩和蛭石进行高温高压蒸汽灭菌的参数优选为在121℃、1个标准大气压下灭菌1h；对所述腐质土进行高温高压蒸汽灭菌的参数优选为在121℃、1个标准大气压下灭菌4h。本发明所述接种基质的pH值优选为7.0~7.5，更优选为7.0。本发明所述接种基质的pH值的调节优选利用石灰和/或石粉完成。本发明所述接种基质的pH值、丽江块菌子实体菌悬液的浸染方式是丽江块菌菌根化苗是否能够生长的关键，接种基质的pH值高或低，或者改变丽江块菌浸染方式均不能制备得到丽江块菌菌根化苗。

得到接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗和接种基质后，本发明将所述接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗栽种于接种基质中进行培养，得到丽江块菌菌根化苗。本发明培养用的容器优选为育苗袋，本发明优选将育苗袋放入温室大棚中进行培养。本发明所述培养的湿度优选为75%~85%，更优选为77%~80%；温度优选为15~26℃，更优选为20~23℃；本发明所述培养优选在光照条件下完成，本发明所述光照强度优选为30000~35000lux，更优选为31000~34000lux。本发明所述温室优选在上方覆盖密度为30%的遮荫网，同时通过通风来调节室内温度，根据接种基质湿度控制浇水时间和频度，接种基质采用自来水灌溉，培养期间不使用任何杀虫剂和农药。

本发明使用丽江块菌子实体菌悬液接种美国山核桃，形成丽江块菌菌根化苗，丽江块菌的菌根合成率达到95%以上。该技术方案具有可靠、接种率高、成本低等优点，适用于菌根大规模生产和应用。

本发明在生产过程中通过高温高压蒸汽灭菌方法有效控制接种基质、宿主植物培育过程中造成的污染，通过拌种法节约了生产成本，且充分考虑到了美国山核桃幼苗及丽江块菌自身的生长周期及生物活性，在美国山核桃大约三个月长出须根后，再接种丽江块菌形成菌根，并通过调整接种基质的pH值、丽江块菌的接种方式、基质消毒时间充分拌种，使其更适合美国山核桃丽江块菌菌根化苗的生长，接种丽江块菌的美国山核桃株高更高，基径更粗，促进了美国山核桃的生长发育，同时美国山核桃又有效地促进了丽江块菌的生长发育，打破了野外丽江块菌只在云南丽江一带分布的局限性，为丽江块菌的多地种植提供了可能性。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.美国山核桃种子预处理

选取产于云南楚雄的果形较大、较为饱满且连续结果能力较强的美国山核桃的种子。首先，将种子置于4℃冰箱春化2个月，使用刷子清洗种子表面，洗到水清为止；其次，用添加赤霉素GA3和乙烯利的水溶液浸种催芽处理7d，每3d换一次水；水溶液中赤霉素GA3的质量浓度为150mg/L，乙烯利的质量浓度为150mg/L（质量浓度为400 g/kg乙烯利溶液稀释后得到质量浓度为150mg/L的乙烯利水溶液）；催芽处理后使用质量浓度0.3%的高锰酸钾溶液对种子进行表面消毒，消毒时间为3h；之后再用无菌水冲洗3次；得到预处理后的美国山核桃种子，置于育苗盘中备用。

2.美国山核桃无菌幼苗培育

分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后按照1:1的体积比拌匀作为催芽基质；混合种子体积的3倍以上珍珠岩和蛭石进行贮藏催芽；每个育苗盘内育种50~70颗美国山核桃种子，每一个种子的体积为10~12cm³。贮藏催芽步骤如下：先在育苗盘底部铺一层5cm厚的催芽基质（记为催芽基质1），把步骤1预处理好的美国山核桃种子混入催芽基质1中，得到混合物；再另取剩余催芽基质（记为催芽基质2），撒在混合物之上，覆盖混合物约2~5cm，用无菌水淋湿。混合后的催芽基质的湿度以手握成团，松开即散为宜；种子与催芽基质的总厚度为7~10 cm。为保证通气，育苗盘中每隔0.7~1cm插入1根消毒后的吸管，放入培养箱，胚根长出育苗盘之后，直接掰断长出育苗盘外的胚根，使其更好的生长出须根。美国山核桃无菌幼苗的须根上的数量为4~5个且须根的长7~12cm时开始接种丽江块菌子实体菌悬液。

3.丽江块菌子实体菌悬液制备

丽江块菌子实体的保存。将成熟的丽江块菌子实体洗净表面泥沙后，用75%酒精消毒30~50s，对每一个块菌子实体进行编号并测序确认，放入-20℃冰箱中长期保存备用。丽江块菌子实体成熟期为每年的11月份，美国山核桃无菌幼苗培育的时间为每年的2~3月份，因此，丽江块菌子实体需要先进行冷冻保存后应用。

丽江块菌子实体制备丽江块菌子实体菌悬液：接种前，将储存于-20℃的块菌子囊果取出，室温自然解冻后称重，用刀将块菌切成小块，再放入粉碎机充分粉碎呈均匀的浆液，粉碎使块菌子囊果中的孢子游离出来，得到孢子悬浮液。粉碎过程中加入冰块和冰水防止温度过高。粉碎所得的孢子悬浮液的具体计数方法如下：将孢子悬浮液定容至10mL，从上中下层各取1mL悬浮液分别置于3个量筒内，分别加入9mL无菌水进行稀释，混匀，分别从3个量筒的稀释后的悬浮液的上层、中层和下层取一滴悬浮液，使用血球计数板在光学显微镜下进行孢子计数，得到每克块菌所含的孢子数（根据真菌孢子计数表进行计数），经计算，块菌含孢子数为2.0×10⁸个孢子/g。一棵美国山核桃无菌幼苗大约接种0.25g丽江块菌，0.25g丽江块菌制备得到的子实体孢子悬浮液的浓度为5×10⁷个孢子/mL。

4.制备移栽基质

分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后备用；腐质土在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌3h，冷却备用。

将腐质土、蛭石、珍珠岩和水按照2:2:1:2.5的体积比混合均匀，得到移栽基质，备用。

5.美国山核桃无菌幼苗接种丽江块菌子实体菌悬液

实验组：

（1）取步骤2得到美国山核桃无菌幼苗，将幼苗主根长出育苗盘外的部分剪去，大约1~3cm，便于长出须根；须根长好后，进行须根的修剪，修剪整个须根根系，挨近土壤的上面一圈须根，每一个须根修剪1~2cm左右；靠近主根的下面一圈须根修剪2~3cm左右；须根根系修剪为上面长，下面短，使所有须根呈一个扇形，以便于与菌液进行更好的接触。

步骤3的丽江块菌子实体菌悬液充分混匀后放入小盆中，小盆已经用体积浓度75%的酒精消毒并晾干；把修剪好须根的美国山核桃幼苗浸泡入丽江块菌子实体菌悬液，浸泡2min，得到浸丽江块菌子实体菌悬液后的美国山核桃幼苗；

（2）取出浸泡后的美国山核桃幼苗，再将步骤（1）剩余的丽江块菌子实体菌悬液和无菌水拌入步骤4的移栽基质中，得到接种基质，调整含水量，使接种基质的含水量变为手握时指缝流出水，但是不滴落，握成团的基质丢下地面可以松散开；制备好的接种基质中加入一定量的过筛后的石灰及石粉调节至pH值为7.0，石灰粉粒度为200目左右。

（3）育苗袋内先装入步骤（2）的部分接种基质，装入量为育苗袋体积的1/3。再将步骤（1）的美国山核桃幼苗移栽至装有相应基质的育苗袋内，具体为：左手拇指与食指拿好悬空于育苗袋中，小指放在育苗袋的边缘，固定住美国山核桃苗，右手放入基质，使其没过根部，手指按压一下，后稍微提一下核桃苗，再用步骤（2）剩余的接种基质填满育苗袋，最后浇入一些定根水50~70mL/每棵苗，把栽好的苗放入温室，保持光照，通风，温度控制在15℃~26℃，湿度保持在75%~80%。

对照组：同实验组，唯一的区别在于：将丽江块菌子实体菌悬液替换为相同体积的无菌水。

6.接种苗的管理

将步骤5得到的接种丽江块菌后的美国山核桃苗和对照组的美国山核桃苗，移栽到温室条件下培养，温度为15℃~26℃之间，最适温度为25℃，温室上方覆盖密度为30%的遮荫网，同时通过通风来调节室内温度，根据基质湿度10%~20%，最适湿度为15%，控制浇水时间和频度，自来水灌溉，培养期间不使用任何杀虫剂和农药。

7.苗期菌根检查

步骤5美国山核桃苗于接种两个月后开始抽查是否有菌根形成，每次随机抽两株苗，每两周抽查一次直至观察到有菌根形成，观察菌根形态、外延菌丝，切片观察横切面；使用CTAB法提取DNA，进行PCR扩增目标片段后进行测序比对，确认接种的丽江块菌是否感染菌根，PCR扩增结果在NCBI进行比对，比对结果为653/657（相似度为99%），则确认丽江块菌感染美国山核桃幼苗。

实施例2

1.美国山核桃种子预处理：选取产于云南楚雄的果形较大、较为饱满、连续结果能力较强的美国山核桃的种子。首先，将种子置于4℃冰箱春化2个月，使用刷子清洗种子表面，洗到水清为止；其次，用添加赤霉素GA3和乙烯利的水溶液浸种催芽处理7d，每4d换一次水；水溶液中赤霉素GA3的质量浓度为150mg/L，乙烯利的质量浓度为150mg/L；催芽处理后使用质量浓度0.3%的高锰酸钾溶液对种子进行表面消毒，消毒时间为3.5h；之后再用无菌水冲洗3~4次；得到预处理后的美国山核桃种子，置于育苗盘中备用。

2.美国山核桃无菌幼苗培育：分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后按照1:1的体积比拌匀作为催芽基质；混合种子体积的3倍以上珍珠岩和蛭石进行贮藏催芽。步骤如下：先在育苗盘底部铺一层5cm厚的催芽基质（记为催芽基质1），把步骤1预处理好的美国山核桃种子混入催芽基质1中，得到混合物；再另取剩余催芽基质（记为催芽基质2），用无菌水淋湿，覆盖住混合物，约2~5cm；混合后的催芽基质的湿度以手握成团，松开即散为宜；种子与催芽基质的总厚度为7~10 cm。为保证通气，育苗盘中每隔0.7~1 cm插入1根消毒后的吸管，放入培养箱，胚根长出育苗盘之后，直接掰断长出育苗盘外的胚根，使其更好的生长出须根。美国山核桃无菌幼苗的须根上的数量为4~5个且须根的长7~12cm时开始接种丽江块菌子实体菌悬液。

3.丽江块菌子实体菌悬液

丽江块菌子实体的保存。将成熟的丽江块菌子实体洗净表面泥沙后，用75%酒精消毒30~50s，对每一个块菌子实体进行编号并测序确认，放入-20℃冰箱中长期保存备用。

丽江块菌子实体制备丽江块菌子实体菌悬液：接种前，将储存于-20℃的块菌子囊果取出，室温自然解冻后称重，用刀将块菌切成小块，再放入粉碎机充分粉碎呈均匀的浆液，粉碎使块菌子囊果中的孢子游离出来，得到孢子悬浮液；粉碎过程中加入冰块和冰水防止温度过高影响孢子的活性。粉碎所得的孢子悬浮液的具体计数方法同实施例1。一棵美国山核桃无菌幼苗大约接种0.5g丽江块菌，0.5g丽江块菌制备得到的子实体孢子悬浮液的浓度为1×10⁸个孢子/mL。

4.制备移栽基质

分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后备用；腐质土在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌4h，冷却备用。

按照2:2:1.5:2.5的体积比，将腐质土、蛭石、珍珠岩和水混合均匀，得到移栽基质。

5.美国山核桃无菌幼苗接种丽江块菌子实体菌悬液

实验组：

（1）步骤2得到美国山核桃无菌幼苗，对幼苗根尖和须根进行修剪，将幼苗主根长出育苗盘外的部分剪去，大约1~3cm，便于长出须根；须根长好后，进行须根的修剪，修剪整个须根根系，挨近土壤的上面一圈须根，每一个须根修剪1~2cm左右；靠近主根的下面一圈须根修剪2~3cm左右；须根根系修剪为上面长，下面短，使所有须根呈一个扇形，以便于与菌液进行更好的接触。

步骤3的丽江块菌子实体菌悬液充分混匀后放入小盆中，小盆已经用体积浓度75%的酒精消毒并晾干；把修剪好须根的美国山核桃幼苗浸泡入丽江块菌子实体菌悬液，浸泡4min，得到浸菌液后的美国山核桃幼苗；

（2）将步骤（1）剩余的丽江块菌子实体菌悬液拌入步骤4的移栽基质中，得到接种基质，使接种基质的含水量变为手握时指缝流出水，但是不滴落，握成团的基质丢下地面可以松散开；接种基质的pH值调整至7.0，pH值调节应用过筛后的石灰及石粉完成。

（3）育苗袋内先装入步骤（2）的部分接种基质，接种基质装入量为育苗袋体积的1/3。再将步骤（1）的美国山核桃幼苗移栽至装有相应基质的育苗袋内，左手拇指与食指拿好悬空于育苗袋中，小指放在育苗袋的边缘，固定住美国山核桃苗，右手放入基质，使其没过根部，手指按压一下，后稍微提一下核桃苗，再用步骤（2）剩余的接种基质填满育苗袋，最后浇入一些定根水50~70mL/每棵苗，把栽好的苗放入温室，保持光照，通风，温度控制在15~26℃，湿度保持在75%~85%。

对照组：同实验组，唯一的区别在于：将丽江块菌子实体菌悬液替换为相同体积的无菌水。

6.接种苗的管理：同实施例1。

7.苗期菌根检查：同实施例1。

实施例3

1.美国山核桃种子预处理：选取产于云南楚雄的果形较大、较为饱满、连续结果能力较强的美国山核桃的种子。首先，将种子置于4℃冰箱春化2个月，使用刷子清洗种子表面，洗到水清为止；其次，用添加赤霉素GA3和乙烯利的水溶液浸种催芽处理8d，每4d换一次水；水溶液中赤霉素GA3的质量浓度为150mg/L，乙烯利的质量浓度为150mg/L；催芽处理后使用质量浓度0.3%的高锰酸钾溶液对种子进行表面消毒，消毒时间为4h；之后再用无菌水冲洗3~4次；得到预处理后的美国山核桃种子，置于育苗盘中备用。

2.美国山核桃无菌幼苗培育：分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后按照1:1的体积比拌匀作为催芽基质；混合种子体积的3倍以上珍珠岩、蛭石进行贮藏催芽。具体步骤如下：先在育苗盘底部铺一层5cm厚的催芽基质（记为催芽基质1），把步骤1预处理好的美国山核桃种子混入催芽基质1中，得到混合物；再另取剩余催芽基质（记为催芽基质2），用无菌水淋湿，覆盖住混合物，约2~5cm；混合后的催芽基质的湿度以手握成团，松开即散为宜；种子与催芽基质的总厚度为7~10cm。为保证通气，育苗盘中每隔0.7~1cm插入1根消毒后的吸管，放入培养箱，胚根长出育苗盘之后，直接掰断长出育苗盘外的胚根，使其更好的生长出须根。美国山核桃无菌幼苗的须根上的数量为4~5个且须根的长7~12cm时开始接种丽江块菌子实体菌悬液。

3.丽江块菌子实体菌悬液

丽江块菌子实体的保存。将成熟的丽江块菌子实体洗净表面泥沙后，用75%酒精消毒30~50s，对每一个块菌子实体进行编号并测序确认，放入-20℃冰箱中长期保存备用。

丽江块菌子实体制备丽江块菌子实体菌悬液：接种前，将储存于-20℃的块菌子囊果取出，室温自然解冻后称重，用刀将块菌切成小块，再放入粉碎机充分粉碎呈均匀的浆液，粉碎使块菌子囊果中的孢子游离出来，得到孢子悬浮液，粉碎过程中加入冰块和冰水防止温度过高。粉碎所得的孢子悬浮液的具体计数方法同实施例1。一棵美国山核桃无菌幼苗大约接种0.7g丽江块菌，0.7g丽江块菌制备得到的子实体孢子悬浮液的浓度为1.4×10⁸个孢子/mL。

4.制备移栽基质

分别将珍珠岩、蛭石在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌1h，冷却后备用；腐质土在121℃、1atm（1个标准大气压）下，高温高压蒸汽灭菌3~4h，冷却备用。

基质和水混合后应用。将腐质土、蛭石、珍珠岩和水按照体积比2:2:1.5:2.5，混合均匀，得到移栽基质。

5.美国山核桃无菌幼苗接种丽江块菌子实体菌悬液

实验组：具体操作为：

（1）步骤2得到美国山核桃无菌幼苗，对幼苗根尖和须根进行修剪，将幼苗主根长出育苗盘外的部分剪去，大约1~3cm，便于长出须根；须根长好后，进行须根的修剪，修剪整个须根根系，挨近土壤的上面一圈须根，每一个须根修剪1~2cm左右；靠近主根的下面一圈须根修剪2~3cm左右；须根根系修剪为上面长，下面短，使所有须根呈一个扇形，以便于与菌液进行更好的接触。

步骤3的丽江块菌子实体菌悬液充分混匀后放入小盆中，小盆已经用体积浓度75%的酒精消毒并晾干；把修剪好须根的美国山核桃幼苗浸泡入丽江块菌子实体菌悬液，浸泡6min，得到浸菌液后的美国山核桃幼苗。

（2）将步骤（1）剩余的丽江块菌子实体菌悬液拌入步骤4的接种基质中，使接种基质的含水量变为手握时指缝流出水，但是不滴落，握成团的基质丢下地面可以松散开；接种基质中加入一定量的过筛后的石灰及石粉调节至pH值为7.5。

（3）育苗袋内先装入步骤（2）的部分接种基质，装入量为育苗袋体积的1/3。再将步骤（1）的美国山核桃幼苗移栽至装有相应基质的育苗袋内，左手拇指与食指拿好悬空于育苗袋中，小指放在育苗袋的边缘，固定住美国山核桃苗，右手放入基质，使其没过根部，手指按压一下，后稍微提一下苗，再用步骤（2）剩余的接种基质填满育苗袋，最后浇入一些定根水50~70mL/每棵苗，把栽好的苗放入温室，保持光照，通风，温度控制在15℃~26℃，湿度保持在75%~80%。

对照组：同实验组，唯一的区别在于：将丽江块菌子实体菌悬液替换为相同体积的无菌水。

6.接种苗的管理：同实施例1。

7.苗期菌根检查

同实施例1。

实施例1~3的丽江块菌与美国山核桃幼苗培养后均可以形成菌根，以实施例1的菌根图进行说明：

丽江块菌与美国山核桃形成的菌根幼嫩根尖到基部呈现出从透明-浅黄色-浅褐色-褐色-浅褐色渐变；菌根的顶端较为粗壮，颜色为淡黄色且发亮，形状为单轴状和羽状（如图1中A）。菌根顶端直，表面有毛。外延菌丝较少（如图1中B和图1中C），呈棉絮状，透明，菌丝基本不分支，长度为0.3~1.1cm，在Leica S8AP0解剖镜下测量单根菌根长1.8~4.1cm，直径为0.3~1.2mm。

利用光学显微镜（Leica DMI6000 B）观察实施例1菌根的横切面切片，观察结果见图2，图2中A和图2中B为外菌套，图2中为C外延菌丝，图2中D~F为菌根横切面及哈氏网；根据图2中A~F可知，外延菌丝较短，未见隔，菌丝在皮层细胞间隙之间生长，菌丝在营养根表面繁殖，交织成网状，层层交织形成菌套，外菌套式样为表皮状拟薄壁组织。菌套横切面厚32~71μm，由球形、不规则球形、椭圆形和不规则椭圆形的菌丝细胞组成，3~6层，细胞壁薄或稍厚，浅褐色或褐色，分层不明显，接种美国山核桃的菌根横切面上能观察到发达的哈蒂氏网结构。图2中A的显微镜比例尺为20μm，图2中B~D的显微镜比例尺为50μm，图2中E~F的显微镜比例尺为100μm。

统计实施例1~3接种丽江块菌第93d时美国山核桃幼苗的菌根合成率、株高及基径，观察感染丽江块菌的美国山核桃幼苗的生长影响，见表1~表3。

1菌根合成率

菌根合成率根据如下公式计算：

菌根合成率（%）=菌根感染率（%）=菌根感染的根段数/检查的根段总数×100%；

表1实施例1~3的丽江块菌后的菌根合成率

根据表1可知，在接种第93d时，实施例1~3的美国山核桃都有菌根形成，菌根合成率高。

2接种丽江块菌后对美国山核桃植株的影响

测量实验组与对照组的美国山核桃株高与基径，使用SPSS进行分析，结果如表2和表3所示。根据表2和表3可知，接种丽江块菌后美国山核桃植株的基径更粗，显著大于未接种前；接种丽江块菌后美国山核桃植株的株高虽然也增加了，但是影响未达到显著水平。

表2 美国山核桃实验组与对照组的基径数据统计

表3美国山核桃实验组与对照组的株高数据统计

对比例1

同实施例1，唯一的区别在于丽江块菌替换成云南硬皮马勃，不能形成美国山核桃菌根。

对比例2

同实施例1，唯一的区别在于美国山核桃种子预处理中的消毒方法为：催芽处理后先使用75%的酒精溶液消毒25min，之后使用质量浓度为0.3%的高锰酸钾溶液消毒1.8h。对比例2共接种了20棵美国山核桃幼苗，设置了两个平行实验。

该消毒方法的确可以形成美国山核桃菌根，菌根形成率为85~91%，但是美国山核桃菌根会有一些污染，可能是消毒力度不够。结果显示：平行实验1中5棵美国山核桃幼苗形成菌根，15棵未形成菌根；平行实验2中有6棵美国山核桃幼苗形成菌根，14棵未形成菌根；以此计算菌根的污染率，平行实验1的菌根污染率为75%，平行实验2的菌根污染率为70%，因此，菌根污染率为70%~75%。

对比例3

同实施例1，唯一的区别在于：制备接种基质时，将腐质土、蛭石、珍珠岩和水的体积比为2：1.5：1：3混合后应用。

使用该基质配比方法，接种丽江块菌子实体菌悬液之后，可能是因为疏水性不够，导致美国山核桃幼苗生长状态不好，大部分幼苗在菌根生长之前就感染叶枯病，影响了菌根的形成，形成菌根的部分幼苗感染率为80%左右。

对比例4

同实施例1，唯一的区别在于：制备接种基质时，将腐质土、蛭石、珍珠岩和水的体积比为3：2：1.5：3混合后应用。

使用该基质配比方法，接种丽江块菌子实体菌悬液之后，可能是因为腐殖质量太多，导致营养过剩，美国山核桃幼苗叶子发黄，生长状态不是很良好，间接影响了菌根的形成，此外，形成部分菌根的美国山核桃幼苗感染率为79%~83%。

对比例5

同实施例1，唯一的区别在于：接种基质的消毒方法为：珍珠岩、蛭石在121℃、1个大气压下，高温高压蒸汽灭菌30 min，冷却备用；腐质土在121℃、1个大气压下，高温高压蒸汽灭菌2.5h，冷却备用。对比例5共接种了20棵美国山核桃幼苗，设置了两个平行实验。

对比例5获得的美国山核桃菌根化苗的外源竞争菌侵染较多，目标菌种丽江块菌生长相对较少。结果显示：平行实验1中接种20棵美国山核桃幼苗，约有7棵侵染丽江块菌，形成丽江块菌菌根化苗，其他的13棵侵染上外源竞争菌；平行实验2中接种20棵美国山核桃幼苗，约有8棵侵染丽江块菌，形成丽江块菌菌根化苗，其他的12棵侵染上外源竞争菌。菌根污染率为60%~65%。接种20棵美国山核桃幼苗，约有7~8棵侵染丽江块菌，形成丽江块菌菌根化苗；其他的12~13棵侵染上外源竞争菌，外源竞争菌主要为棉革菌属（Tomentella sp1）、埃尔默小垫革菌（Thelephora ellisii）、光硬皮马勃（Scleroderma cepa）、思茅乳菇（Lactarius kesiyae）等杂菌。

对比例6

同实施例1，唯一的区别在于：接种基质的消毒方法为：珍珠岩、蛭石不灭菌；腐质土在121℃、1个大气压下，高温高压蒸汽灭菌3h，冷却备用。因为珍珠岩、蛭石为高温煅烧制成，可不进行灭菌。对比例6共接种了20棵美国山核桃幼苗，设置了两个平行实验。

对比例6获得的美国山核桃菌根化苗的外源竞争菌侵染较多，目标菌种丽江块菌生长相对较少。结果显示：平行实验1中接种20棵美国山核桃幼苗，有9棵侵染丽江块菌，形成丽江块菌菌根化苗，其他的11棵侵染上外源竞争菌；平行实验2中接种20棵美国山核桃幼苗，有10棵侵染丽江块菌，形成丽江块菌菌根化苗，其他的10棵侵染上外源竞争菌。菌根污染率为50%~55%。接种20棵美国山核桃幼苗，约有9~10棵侵染丽江块菌，形成丽江块菌菌根化苗；其他的10~11棵侵染上外源竞争菌，外源竞争菌主要为外源竞争菌主要为棉革菌属（Tomentella sp1）、埃尔默小垫革菌（Thelephora ellisii）、光硬皮马勃（Sclerodermacepa）、思茅乳菇（Lactarius kesiyae）等杂菌。菌根污染率为50%~55%。

对比例7

1.美国山核桃种子预处理。同实施例1。

2.美国山核桃无菌幼苗培育。同实施例1。

3.阔孢块菌子实体菌悬液制备。同实施例1，唯一的区别在于将丽江块菌替换成阔孢块菌。

4.制备移栽基质。同实施例1。

5.美国山核桃无菌幼苗接种阔孢块菌子实体菌悬液。同实施例1。

6.接种苗的管理。同实施例1。

7.苗期菌根检查

步骤5美国山核桃苗于接种了两个月时开始抽查是否有菌根形成，每次随机抽两株苗，每两周抽查一次。接种七个月后，未见实验组和对照组生成目标菌根，则确认阔孢块菌未感染美国山核桃幼苗。

对比例7中，使用本发明的方法美国山核桃苗接种阔孢块菌子实体菌悬液之后并未形成该菌种的目标菌根，可能是因为该方法不适合阔孢块菌的生长，接种七个月后对美国山核桃苗的根进行检测，结果显示：美国山核桃苗的根被外源竞争菌侵染，外源竞争菌主要为外源竞争菌主要为棉革菌属（Tomentella sp1）、埃尔默小垫革菌（Thelephoraellisii）、光硬皮马勃（Scleroderma cepa）、思茅乳菇（Lactarius kesiyae）等杂菌。此外，根据邓晓娟在其毕业论文《印度块菌菌根际及其子囊果内微生物多样性研究——兼论中国白块菌新分类群》对中国块菌进行形态学分类及系统发育相结合的研究，攀枝花块菌和阔孢块菌都为中国的白块菌，在该研究中，证明了攀枝花块菌和阔孢块菌亲缘关系较近，因此该方法可能也不一定适合攀枝花块菌的栽培，该方法更适合丽江块菌的生长。

对比例8

1.美国山核桃种子预处理

选取产于云南楚雄的果形较大、较为饱满且连续结果能力较强的美国山核桃的种子。将种子置于4℃冰箱春化2个月，使用刷子清洗种子表面，洗到水清为止；之后进行催芽，催芽时，将美国山核桃种子用清水冲洗干净，再用质量浓度为0.3%高锰酸钾溶液浸种消毒48h，清水冲洗干净。清洗干净的美国山核桃种子用纱布包好放置在30℃的恒温箱中进行催芽，坚持每天用清水冲洗，防止杂菌滋生，并捡出裂口的种子，未裂口的继续放入恒温箱中催芽。

2.美国山核桃无菌幼苗培育

基质按照珍珠岩和蛭石1：1的体积比均匀混合装入布袋中，在121~126℃下灭菌2h。珍珠岩和蛭石灭菌后装于育苗盘中。将步骤1检出的裂口的种子接种于育苗盘中进行育苗。

每个育苗盘内育种50~70颗美国山核桃种子，每一个种子的体积为10~12cm³。

3.阔孢块菌子实体菌悬液制备

阔孢块菌子实体的保存：将成熟的阔孢块菌子实体洗净表面泥沙后，用75%酒精消毒30~50s，对每一个块菌子实体进行编号并测序确认，放入-20℃冰箱中长期保存备用。

阔孢块菌子实体制备阔孢块菌子实体菌悬液：接种前，将储存于-20℃的块菌子囊果取出，室温自然解冻后称重，用刀将块菌切成小块，再放入粉碎机充分粉碎呈均匀的浆液，粉碎使块菌子囊果中的孢子游离出来，得到孢子悬浮液。粉碎过程中加入冰块和冰水防止温度过高。粉碎所得的孢子悬浮液的具体计数方法如下：将孢子悬浮液定容至10mL，从上中下层各取1mL悬浮液分别置于3个量筒内，分别加入9mL无菌水进行稀释，混匀，分别从3个量筒的稀释后的悬浮液的上层、中层和下层取一滴悬浮液，使用血球计数板在光学显微镜下进行孢子计数，得到每克块菌所含的孢子数（根据真菌孢子计数表进行计数），经计算，阔孢块菌含孢子数为2.0×10⁸个孢子/g。

4.制备移栽基质

移植和接种苗培育基质按照腐殖土和蛭石的体积比1：3的比例混合均匀，在121~126℃下灭菌2 h，冷却备用，再用1mol/L的生石灰溶液调pH值至7左右装入布袋中，得到移栽基质，备用。

5.美国山核桃无菌幼苗接种阔孢块菌子实体菌悬液

实验组：

（1）取步骤2得到美国山核桃无菌幼苗，选择根系发达、苗色较好的幼苗，用经过消毒的剪刀剪去主根。

步骤3的阔孢块菌子实体菌悬液充分混匀后放入小盆中，小盆已经用体积浓度75%的酒精消毒并晾干；把修剪好须根的美国山核桃幼苗浸泡入阔孢块菌子实体菌悬液，浸泡2min，得到浸阔孢块菌子实体菌悬液后的美国山核桃幼苗；

（2）在黑色育苗袋中先装入1/3的上述移栽基质，将美国山核桃无菌幼苗放入育苗袋中，再将配置好的阔孢块菌菌种按照每株接种0.5g阔孢块菌，0.5g阔孢块菌制备得到的子实体孢子悬浮液的浓度为1×10⁸个孢子/mL，使幼苗根系与菌种紧密结合，最后添加移栽基质，压实。最后浇入一些定根水50~70mL/每棵苗，挂牌并标明接种时间、接种菌名。把栽好的苗放入温室，保持光照，通风，温度控制在15℃~26℃，湿度保持在75%~80%。

对照组：同实验组，唯一的区别在于：将阔孢块菌子实体菌悬液替换为相同体积的无菌水。

6.接种苗的管理

同实施例1。

7.苗期菌根检查

自步骤5美国山核桃苗于接种两个月时开始抽查是否有菌根形成，每次随机抽两株苗，每两周抽查一次直至观察到有菌根形成。

美国山核桃苗接种七个月后，未见美国山核桃无菌幼苗接种阔孢块菌子实体菌悬液的实验组和对照组生成目标菌根，则确认阔孢块菌未感染美国山核桃幼苗。

美国山核桃苗接种七个月后对美国山核桃苗的根进行检测，结果显示：美国山核桃苗的根被外源竞争菌侵染，外源竞争菌主要为外源竞争菌主要为棉革菌属（Tomentellasp1）、埃尔默小垫革菌（Thelephora ellisii）、光硬皮马勃（Scleroderma cepa）、思茅乳菇（Lactarius kesiyae）等杂菌。

对比例9

对比例9的步骤1~步骤7同对比例8，唯一的区别在于将阔孢块菌替换成丽江块菌。

美国山核桃苗于接种丽江块菌两个月后开始抽查是否有菌根形成，每次随机抽两株苗，每两周抽查一次直至观察到有菌根形成，美国山核桃苗接种丽江块菌七个月后，未见美国山核桃无菌幼苗接种丽江块菌子实体菌悬液处理的实验组和对照组生成目标菌根，则确认丽江块菌未感染美国山核桃幼苗。接种七个月后对美国山核桃苗的根进行检测，美国山核桃苗的根被外源竞争菌侵染，外源竞争菌主要为外源竞争菌主要为棉革菌属（Tomentella sp1）、埃尔默小垫革菌（Thelephora ellisii）、光硬皮马勃（Sclerodermacepa）、思茅乳菇（Lactarius kesiyae）等杂菌。

本发明中的丽江块菌接种美国山核桃的方法，和对比例9相比，缩短了美国山核桃种子的消毒时间，极大程度节约时间成本，并保持美国山核桃种子的活性；规范了美国山核桃育苗方法，能够获得生长状况较一致，生长状态良好的美国山核桃无菌苗；此外改良了美国山核桃的接种基质，加入珍珠岩，并调整比例，增加接种基质的疏水性，保证美国山核桃无菌苗有较好的生长状态，使美国山核桃生长良好，能够更好的接种上菌种。

综上，本发明在人工条件下，接种丽江块菌三个月后，能够成功侵染美国山核桃，形成菌根，菌根合成率达到96%。接种丽江块菌的美国山核桃株高更高，基径更粗，促进了美国山核桃的生长发育，同时美国山核桃又有效地促进了丽江块菌的生长发育，打破了野外丽江块菌只在云南丽江一带分布的局限性，为丽江块菌的多地种植提供了可能性。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种美国山核桃接种丽江块菌制备丽江块菌菌根苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

利用丽江块菌子实体菌悬液对美国山核桃无菌幼苗根系进行浸泡，得到接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗；

将浸泡后剩余的丽江块菌子实体菌悬液与移栽基质混合，得到接种基质；

将所述接种丽江块菌子实体菌悬液的美国山核桃无菌幼苗栽种于接种基质中进行培养，得到丽江块菌菌根化苗；丽江块菌子实体菌悬液中有效孢子数为≥5×10⁷个孢子/mL；所述接种基质的pH值为7.0~7.5。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述美国山核桃无菌幼苗的须根数量为4~5个，须根长度为7~12cm。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述美国山核桃无菌幼苗在浸泡之前进行修剪。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每棵美国山核桃无菌幼苗施用0.25g~0.7g丽江块菌子实体制备得到的丽江块菌子实体菌悬液。

5.根据权利要求1或4所述方法，其特征在于，所述丽江块菌子实体菌悬液的制备方法包括：粉碎丽江块菌子实体得到浆液；将所述浆液与无菌水混合得到丽江块菌子实体菌悬液。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述移栽基质包括腐质土、蛭石和珍珠岩。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述移栽基质和水混合后应用，所述腐质土、蛭石、珍珠岩和水的体积比为2：2：（1~1.5）：2.5。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述浸泡的时间为2~6min。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养的温度为15~26℃、湿度为75%~85%；光照强度为30000~35000lux。

10.根据权利要求1~4任一项所述方法，其特征在于，所述美国山核桃无菌幼苗的培育方法包括：

将美国山核桃种子依次进行春化、刷洗、浸种、筛种和消毒后，将美国山核桃种子与催芽基质混合后进行催芽培养，得到无菌幼苗。