CN103181298A - 一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法，其包括以下步骤：采用组织分离法，在无菌条件下取点柄粘盖牛肝菌的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，得到点柄粘盖牛肝菌菌丝，将所述点柄粘盖牛肝菌菌丝与PDA试管斜面培养基分离，得到纯净的点柄粘盖牛肝菌菌丝，将纯净的点柄粘盖牛肝菌菌丝与无菌水混合后用搅拌机搅碎得到点柄粘盖牛肝菌菌剂；将待栽培板栗无菌苗的根系沾满所述点柄粘盖牛肝菌菌剂后移栽在培养钵中，培养钵中填充有真菌与无菌土的混合物，7天-10天后向培养钵中浇灌所述点柄粘盖牛肝菌菌剂进行补接，然后以水浇灌，栽培三个月至一年，从板栗苗木的根系上得到所述点柄粘盖牛肝菌菌根。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌的制备方法，尤其涉及一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法。
背景技术
点柄粘盖牛肝菌（Suillus granulatus (L. : Fr.) O. Kuntce） ，别名栗壳牛肝菌。夏秋季松林及混交林地上散生、群生或丛生。 分布在河北、黑龙江、吉林、辽宁、山东、福建等地。可食用，味较好，东北地区曾大量加工出口。据报道该菌有抗癌作用，对小白鼠肉瘤的抑制率为80%，对艾氏癌的抑制率为70%。其与多种树木形成外生菌根，因为是外生菌根菌，室内栽培存在一定困难，目前野生资源的减少与消费者的需求逐年增高，资源破坏严重，为了解决此问题，一方面保护野生资源，合理开发利用；另一方面研究人工栽培新技术，这是解决供不应求最根本的办法，但是解决人工栽培技术首先必须解决菌根的人工合成技术。目前还没有报道关于点柄粘盖牛肝菌与板栗苗外生菌根人工合成的技术。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法，以人工合成的点柄粘盖牛肝菌菌根，方便菌根食用菌的人工栽培。
本发明的技术方案如下：
一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法，其包括以下步骤：
A、采用组织分离法，在无菌条件下取点柄粘盖牛肝菌的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，得到点柄粘盖牛肝菌菌丝，将所述点柄粘盖牛肝菌菌丝与PDA试管斜面培养基分离，得到纯净的点柄粘盖牛肝菌菌丝，将纯净的点柄粘盖牛肝菌菌丝与无菌水混合后用搅拌机搅碎得到点柄粘盖牛肝菌菌剂；
B、将待栽培板栗无菌苗的根系沾满所述点柄粘盖牛肝菌菌剂后移栽在培养钵中，培养钵中填充有真菌与无菌土的混合物，7天-10天后向培养钵中浇灌所述点柄粘盖牛肝菌菌剂进行补接，然后以水浇灌，栽培三个月至一年，从板栗苗木的根系上得到所述点柄粘盖牛肝菌菌根。
所述的方法，其中，所述步骤A具体的包括：将所述组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述组织上长出少量点柄粘盖牛肝菌菌丝后，将其转接到新的PDA试管斜面培养基上进行培养，对在所述新的PDA试管培养基上培养后的点柄粘盖牛肝菌菌丝与所述新的PDA试管培养基进行分离。
所述的方法，其中，所述步骤A中PDA试管斜面培养基由马铃薯、葡萄糖、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
马铃薯为100份-200份，葡萄糖10份-20份，琼脂粉15份-20份，水500份-1000份。
所述的方法，其中，所述步骤A中对在所述新的PDA试管培养基上培养后的点柄粘盖牛肝菌菌丝与所述新的PDA试管培养基进行分离的过程为：用无菌水对新的PDA试管培养基与点柄粘盖牛肝菌菌丝洗涤三次，然后按照一升无菌水中菌丝鲜重为40g的比例，用搅拌机搅碎30秒制成点柄粘盖牛肝菌菌剂待用。
所述的方法，其中，所述步骤B具体的包括：
B1、将板栗种子用1%的高锰酸钾浸泡4-5小时表面消毒，之后无菌水洗涤至水无色，盛放在铺满脱脂棉的培养盘中，然后将所述培养盘放置于25℃的培养箱内培养2天，每间隔10小时-14小时用无菌水对培养箱进行保湿。
所述的方法，其中，所述步骤B具体的包括：待所述步骤B1中70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。
所述的方法，其中，所述步骤B具体的还包括：所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
本发明提供的一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法，通过板栗根系制备点柄粘盖牛肝菌菌根，获得稳定的点柄粘盖牛肝菌菌根，为人工栽培点柄粘盖牛肝菌奠定了坚实的基础，方便了人工栽培。
附图说明
图1为本发明中合成点柄粘盖牛肝菌菌根方法的流程示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法，如图1所示的，其包括以下步骤：
步骤101：采用组织分离法，在无菌条件下取点柄粘盖牛肝菌的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，得到点柄粘盖牛肝菌菌丝，将所述点柄粘盖牛肝菌菌丝与PDA试管斜面培养基分离，得到纯净的点柄粘盖牛肝菌菌丝，将纯净的点柄粘盖牛肝菌菌丝与无菌水混合后用搅拌机搅碎得到点柄粘盖牛肝菌菌剂；
步骤102：将待栽培板栗无菌苗的根系沾满所述点柄粘盖牛肝菌菌剂后移栽在培养钵中，培养钵中填充有真菌与无菌土的混合物，7天-10天后向培养钵中浇灌所述点柄粘盖牛肝菌菌剂进行补接，然后以水浇灌，栽培三个月至一年，从板栗苗木的根系上得到所述点柄粘盖牛肝菌菌根。采用板栗根系制备点柄粘盖牛肝菌菌根，获得稳定的点柄粘盖牛肝菌菌根，使人工栽培点柄粘盖牛肝菌成为可能，彻底解决了点柄粘盖牛肝菌不能人工栽培的技术问题。
在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤101具体的包括：将所述组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述组织上长出少量点柄粘盖牛肝菌菌丝后，将其转接到新的PDA试管斜面培养基上进行培养，对在所述新的PDA试管培养基上培养后的点柄粘盖牛肝菌菌丝与所述新的PDA试管培养基进行分离。
更进一步的，上述的PDA试管斜面培养基由马铃薯、葡萄糖、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
马铃薯为100份-200份，葡萄糖10份-20份，琼脂粉15份-20份，水500份-1000份。
在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤102中对在所述新的PDA试管培养基上培养后的点柄粘盖牛肝菌菌丝与所述新的PDA试管培养基进行分离的过程为：用无菌水对新的PDA试管培养基与点柄粘盖牛肝菌菌丝洗涤三次，然后按照一升无菌水中菌丝鲜重为40g的比例，用搅拌机搅碎30秒制成点柄粘盖牛肝菌菌剂待用。
更进一步的，所述步骤102具体的包括：将板栗种子用1%的高锰酸钾浸泡4-5小时表面消毒，之后无菌水洗涤至水无色，盛放在铺满脱脂棉的培养盘中，然后将所述培养盘放置于25℃的培养箱内培养2天，每间隔10小时-14小时用无菌水对培养箱进行保湿。然后等待70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。并且所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
为了更进一步的描述本发明的方法，其更为详尽的描述为。
点柄粘盖牛肝菌子实体鉴别：点柄粘盖牛肝菌子实体中等大，菌盖直径为5.2cm-10cm，扁半球形或近扁平，淡黄色或黄褐色，很粘，干后有光泽。菌肉淡黄色。菌管直生或稍延生，菌管角形，菌柄长3cm-10cm, 粗0.8cm-1.6cm，淡黄褐色，顶端偶有约1cm长的网纹，腺点通常不超过柄长的一半或全柄有腺点，孢子长椭圆形，无色到淡黄色，6.5μm -9.1(10)μm×2.6μm -3.9μm。管缘囊体成束，淡黄色到黄褐色，多棒状，31.2μm -52μm×5.2μm -7.8μm。
点柄粘盖牛肝菌菌种分离、纯化：采用组织分离法，在无菌条件下，挑取菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述组织上长出菌丝，将其转接到新的PDA试管斜面培养基上。其中PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15-20g，水1000mL。
菌株鉴定：采用分子生物学的方法，将分离得到菌丝体进行rDNA ITS序列测定，与Genbank数据库比对，证明分离得到的菌丝体为点柄粘盖牛肝菌。
固体培养：将新的PDA试管斜面培养基培养后的菌丝移植到PDA固体培养基上，在温度为28℃，湿度为70%-75%的条件下，进行避光培养。
菌剂制备：将菌丝与PDA固体培养基分离，先用无菌水洗涤三次，最后加入无菌水，按照1L无菌水中菌丝鲜重为40g的比例，用搅拌机搅碎30秒制成点柄粘盖牛肝菌菌剂待用。
板栗种子处理：用清水对板栗种子进行清理洗涤，去除杂质，用1%的高锰酸钾浸泡4小时-5小时对其进行表面消毒，之后使用无菌水洗涤消毒后的板栗种子至无菌水无色，然后将洗涤后的板栗种子盛放在铺满脱脂棉的培养钵中，放置于25℃条件下的培养箱2天，约每间12小时用无菌水对板栗种子进行保湿。
无菌苗培养基质配比与处理：将珍珠岩、蛭石、草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合，然后在121℃条件下灭菌2小时。选用聚乙烯材质，体积为60×40×60cm的培养钵进行培养，使用之前用75%的乙醇对培养钵的表面擦拭消毒。
无菌苗培养：板栗种子处理后，待70%以上的板栗种子裂口，将板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，然后将培养钵放置在培养室内。使培养室内的湿度保持在60%-75%，温度保持在20℃-25℃，每间隔7天浇水一次，根据时节，调整供水量，以保证苗木正常生长，培养一年。
接种：采用点柄粘盖牛肝菌菌剂蘸根与补接相结合的方法。将栽培满一年后的待栽培板栗无菌苗的根系外围侧根简略处理，沾点柄粘盖牛肝菌菌剂后移植到填满真菌与无菌土混合的培养钵中，浇透水。约七天左右，补接菌剂，用点柄粘盖牛肝菌菌剂浇灌苗木，而后，以十天为一周期，以水浇灌苗木，栽培三月后，观察板栗无菌苗的根系，得到所述点柄粘盖牛肝菌菌根。
菌根形态观察：将天然点柄粘盖牛肝菌置于有水的培养皿中，用MOTIC SMZ-140解剖镜观察外延菌丝并测量并记录。取所述点柄粘盖牛肝菌菌根根尖20个，固定于FAA固定液中，制成菌根石蜡切片，用番红和固绿两种燃料复染。用MOTIC SMZ-140解剖镜和显微镜观察天然点柄粘盖牛肝菌与点柄粘盖牛肝菌菌根的细胞形态结构，并测量拍照，其结果表明完全一致。
验证菌根来源：采用分子手段，提取点柄粘盖牛肝菌菌根的DNA，验证板栗苗所形成的点柄粘盖牛肝菌菌根是接种的点柄粘盖牛肝菌形成的，其结果表明点柄粘盖牛肝菌菌根与天然点柄粘盖牛肝菌完全一致。
为了更进一步描述本发明的方法，以下列举几个实施例进行说明。
实施例1
点柄粘盖牛肝菌子实体鉴别：点柄粘盖牛肝菌子实体中等大，菌盖直径为5.2cm-10cm，扁半球形或近扁平，淡黄色或黄褐色，很粘，干后有光泽。菌肉淡黄色。菌管直生或稍延生，菌管角形，菌柄长3cm-10cm, 粗0.8cm-1.6cm，淡黄褐色，顶端偶有约1cm长的网纹，腺点通常不超过柄长的一半或全柄有腺点，孢子长椭圆形，无色到淡黄色，6.5μm -9.1(10)μm×2.6μm -3.9μm。管缘囊体成束，淡黄色到黄褐色，多棒状，31.2μm -52μm×5.2μm -7.8μm。
点柄粘盖牛肝菌菌种分离、纯化：采用组织分离法，在无菌条件下，挑取菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述组织上长出菌丝，将其转接到新的PDA试管斜面培养基上。其中PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15-20g，水1000mL。
菌株鉴定：采用分子生物学的方法，将分离得到菌丝体进行rDNA ITS序列测定，与Genbank数据库比对，证明分离得到的菌丝体为点柄粘盖牛肝菌。
固体培养：将新的PDA试管斜面培养基培养后的菌丝移植到PDA固体培养基上，在温度为28℃，湿度为70%-75%的条件下，进行摇床避光培养,其中摇床转数160转/分。
菌剂制备：将培养15天-20天的菌丝与PDA固体培养基分离，先用无菌水洗涤三次，最后加入无菌水，按照1L无菌水中菌丝鲜重为40g的比例，用搅拌机搅碎30秒制成点柄粘盖牛肝菌菌剂待用。
板栗种子处理：用清水对板栗种子进行清理洗涤，去除杂质，用1%的高锰酸钾浸泡4小时-5小时对其进行表面消毒，之后使用无菌水洗涤消毒后的板栗种子至无菌水无色，然后将洗涤后的板栗种子盛放在铺满脱脂棉的培养钵中，放置于25℃条件下的培养箱2天，约每间12小时用无菌水对板栗种子进行保湿。
无菌苗培养基质配比与处理：将珍珠岩、蛭石、草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合，然后在121℃条件下灭菌2小时。选用聚乙烯材质，体积为60×40×60cm的培养钵进行培养，使用之前用75%的乙醇对培养钵的表面擦拭消毒。
无菌苗培养：板栗种子处理后，待70%以上的板栗种子裂口，将板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，然后将培养钵放置在培养室内。使培养室内的湿度保持在60%-75%，温度保持在20℃-25℃，每间隔7天浇水一次，根据时节，调整供水量，以保证苗木正常生长，培养一年。
接种：采用点柄粘盖牛肝菌菌剂蘸根与补接相结合的方法。将栽培满一年后的待栽培板栗无菌苗的根系外围侧根简略处理，沾点柄粘盖牛肝菌菌剂后移植到填满真菌与无菌土混合的培养钵中，浇透水。约七天左右，补接菌剂，用点柄粘盖牛肝菌菌剂浇灌苗木，而后，以十天为一周期，以水浇灌苗木，栽培三月后，观察板栗无菌苗的根系，得到所述点柄粘盖牛肝菌菌根。
菌根形态观察：将天然点柄粘盖牛肝菌置于有水的培养皿中，用MOTIC SMZ-140解剖镜观察外延菌丝并测量并记录。取所述点柄粘盖牛肝菌菌根根尖20个，固定于FAA固定液中，制成菌根石蜡切片，用番红和固绿两种燃料复染。用MOTIC SMZ-140解剖镜和显微镜观察天然点柄粘盖牛肝菌与点柄粘盖牛肝菌菌根的细胞形态结构，并测量拍照，其结果表明完全一致。
验证菌根来源：采用分子手段，提取点柄粘盖牛肝菌菌根的DNA，验证板栗苗所形成的点柄粘盖牛肝菌菌根是接种的点柄粘盖牛肝菌形成的，其结果表明点柄粘盖牛肝菌菌根与天然点柄粘盖牛肝菌完全一致。
实施例2
点柄粘盖牛肝菌子实体鉴别：点柄粘盖牛肝菌子实体中等大，菌盖直径为5.2cm-10cm，扁半球形或近扁平，淡黄色或黄褐色，很粘，干后有光泽。菌肉淡黄色。菌管直生或稍延生，菌管角形，菌柄长3cm-10cm, 粗0.8cm-1.6cm，淡黄褐色，顶端偶有约1cm长的网纹，腺点通常不超过柄长的一半或全柄有腺点，孢子长椭圆形，无色到淡黄色，6.5μm -9.1(10)μm×2.6μm -3.9μm。管缘囊体成束，淡黄色到黄褐色，多棒状，31.2μm -52μm×5.2μm -7.8μm。
点柄粘盖牛肝菌菌种分离、纯化：采用组织分离法，在无菌条件下，挑取菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述组织上长出菌丝，将其转接到新的PDA试管斜面培养基上。其中PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水1000mL。
菌株鉴定：采用分子生物学的方法，将分离得到菌丝体进行rDNA ITS序列测定，与Genbank数据库比对，证明分离得到的菌丝体为点柄粘盖牛肝菌。
固体培养：将新的PDA试管斜面培养基培养后的菌丝移植到PDA固体培养基上，在温度为28℃，湿度为70%-75%的条件下，进行避光培养。
菌剂制备：将菌丝与PDA固体培养基分离，先用无菌水洗涤三次，最后加入无菌水，按照1L无菌水中菌丝鲜重为40g的比例，用搅拌机搅碎30秒制成点柄粘盖牛肝菌菌剂待用。
板栗种子处理：用清水对板栗种子进行清理洗涤，去除杂质，用1%的高锰酸钾浸泡4小时-5小时对其进行表面消毒，之后使用无菌水洗涤消毒后的板栗种子至无菌水无色，然后将洗涤后的板栗种子盛放在铺满脱脂棉的培养钵中，放置于25℃条件下的培养箱2天，约每间12小时用无菌水对板栗种子进行保湿。
无菌苗培养基质配比与处理：将珍珠岩、蛭石、草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合，然后在121℃条件下灭菌2小时。选用聚乙烯材质，体积为60×40×60cm的培养钵进行培养，使用之前用75%的乙醇对培养钵的表面擦拭消毒。
无菌苗培养：板栗种子处理后，待70%以上的板栗种子裂口，将板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，然后将培养钵放置在培养室内。使培养室内的湿度保持在60%-75%，温度保持在20℃-25℃，每间隔7天浇水一次，根据时节，调整供水量，以保证苗木正常生长，培养一年。
接种：采用点柄粘盖牛肝菌菌剂蘸根与补接相结合的方法。将栽培满一年后的待栽培板栗无菌苗的根系外围侧根简略处理，沾点柄粘盖牛肝菌菌剂后移植到填满真菌与无菌土混合的培养钵中，浇透水。约七天左右，补接菌剂，用点柄粘盖牛肝菌菌剂浇灌苗木，而后，以十天为一周期，以水浇灌苗木，栽培三月后，观察板栗无菌苗的根系，得到所述点柄粘盖牛肝菌菌根。
菌根形态观察：将天然点柄粘盖牛肝菌置于有水的培养皿中，用MOTIC SMZ-140解剖镜观察外延菌丝并测量并记录。取所述点柄粘盖牛肝菌菌根根尖20个，固定于FAA固定液中，制成菌根石蜡切片，用番红和固绿两种燃料复染。用MOTIC SMZ-140解剖镜和显微镜观察天然点柄粘盖牛肝菌与点柄粘盖牛肝菌菌根的细胞形态结构，并测量拍照，其结果表明完全一致。
验证菌根来源：采用分子手段，提取点柄粘盖牛肝菌菌根的DNA，验证板栗苗所形成的点柄粘盖牛肝菌菌根是接种的点柄粘盖牛肝菌形成的，其结果表明点柄粘盖牛肝菌菌根与天然点柄粘盖牛肝菌完全一致。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种合成点柄粘盖牛肝菌菌根的方法，其包括以下步骤：
A、采用组织分离法，在无菌条件下取点柄粘盖牛肝菌的菌柄与菌盖之间的组织接种于PDA试管斜面培养基上，得到点柄粘盖牛肝菌菌丝，将所述点柄粘盖牛肝菌菌丝与PDA试管斜面培养基分离，得到纯净的点柄粘盖牛肝菌菌丝，将纯净的点柄粘盖牛肝菌菌丝与无菌水混合后用搅拌机搅碎得到点柄粘盖牛肝菌菌剂；
B、将待栽培板栗无菌苗的根系沾满所述点柄粘盖牛肝菌菌剂后移栽在培养钵中，培养钵中填充有真菌与无菌土的混合物，7天-10天后向培养钵中浇灌所述点柄粘盖牛肝菌菌剂进行补接，然后以水浇灌，栽培三个月至一年，从板栗苗木的根系上得到所述点柄粘盖牛肝菌菌根。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A具体的包括：将所述组织接种于PDA试管斜面培养基上，待所述组织上长出少量点柄粘盖牛肝菌菌丝后，将其转接到新的PDA试管斜面培养基上进行培养，对在所述新的PDA试管培养基上培养后的点柄粘盖牛肝菌菌丝与所述新的PDA试管培养基进行分离。
3.根据权利要2所述的方法，其特征在于，所述步骤A中PDA试管斜面培养基由马铃薯、葡萄糖、琼脂粉与水组成，其重量份分别为：
马铃薯为100份-200份，葡萄糖10份-20份，琼脂粉15份-20份，水500份-1000份。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤A中对在所述新的PDA试管培养基上培养后的点柄粘盖牛肝菌菌丝与所述新的PDA试管培养基进行分离的过程为：用无菌水对新的PDA试管培养基与点柄粘盖牛肝菌菌丝洗涤三次，然后按照一升无菌水中菌丝鲜重为40g的比例，用搅拌机搅碎30秒制成点柄粘盖牛肝菌菌剂待用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括：
B1、将板栗种子用1%的高锰酸钾浸泡4-5小时表面消毒，之后无菌水洗涤至水无色，盛放在铺满脱脂棉的培养盘中，然后将所述培养盘放置于25℃的培养箱内培养2天，每间隔10小时-14小时用无菌水对培养箱进行保湿。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括：待所述步骤B1中70%以上的板栗种子裂口后，将所有板栗种子播种于装填有无菌培养基质的培养钵中，将培养钵放置于培养室内，所述培养室湿度为60%-75%，温度为20℃-25℃，并且每间隔5天-8天对培养钵浇水一次，培养一年得到所述待栽培板栗无菌苗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤B具体的还包括：所述无菌培养基质由珍珠岩、蛭石与草炭土组成，珍珠岩、蛭石与草炭土按照体积比为1:4:5的比例混合。
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