CN102080048B - 人参内生灰绿犁头霉菌及利用其制备人参皂苷Rd的方法 - Google Patents
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Abstract
一种人参内生灰绿犁头霉菌(CGMCC No.4316),该菌具有转化底物人参皂苷Rb1制备Rd的能力,并且具有很高的底物单一性和产物单一性。利用该菌制备人参皂苷Rd可以采用原位转化,将其点种至含有人参皂苷Rb1的PDA培养基上,于25℃静置培养5~7天。或者采用微生物酶法,活化后将其接种于产酶培养基上,于28℃培养5~7天;收集酶液并将其与人参皂苷Rb1混合后,于40℃下反应24h。采用本发明的技术方案生产人参皂苷Rd,具有专一性强、简单方便、安全可靠、成本低且无副产物的特点。发酵产物Rd的纯度在90%以上,转化率可达到60%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一株人参内生真菌,灰绿犁头霉菌Absidia glauca(CGMCCNo.4316),以及利用该菌专一性转化底物人参皂苷Rb1为人参皂苷Rd的方法。
背景技术
人参皂苷Rd是一种很有应用前景的候选药物,它具有特异性阻断受体依赖性钙离子通道的功能,在肾功能保护、调节免疫、抑制HeLa细胞生长、诱导COX22产生、防辐射方面具有其他单体人参皂苷所没有的独特作用;在镇痛、神经保护作用方面,Rd相对于其他单体人参皂苷也较强。因此,人参皂苷Rd可开发成防辐射,治疗心血管疾病、炎症、创伤以及由损伤引起的体内外出血等方面的药物。然而,由于人参皂苷Rd在人参属植物中含量较低,而且结构复杂,化学合成至今尚未成功,目前只能通过从人参等药用植物的根、茎、叶中提取,但其效率低,成本高,从而限制了Rd的深入研究和应用。因此,获得大量、高纯度的人参皂苷Rd具有特别重要的科学研究意义和实际应用价值。
对于人参皂苷的转化,若采用传统的化学转化法,其选择性低,副产物多,而且容易对环境造成污染。相比较而言,生物转化法具有高度专一性和无污染性等优势,因此,具有很好的应用前景。Rd与Rb1具有相同的糖苷配基,其结构差异仅在于C3和C20位上的糖基,而Rb1在人参中的含量较高,因此,可以通过水解Rb1去除其C-20位上的糖基而获得,转化途径如附图1所示。目前,很多研究者都在寻找能够将Rb1转化成Rd的微生物或者是酶,然而,大多数微生物或酶都缺少高度的专一性,甚至会将Rd进一步转化成F2、Rg3或Rh2,而生成Rd的效率很低。
利用微生物来源的酶转化主要人参皂苷生产人参皂苷Rd普遍存在的问题有:转化过程中转化产物不专一;作为转化底物的主要人参皂苷浓度不能过高;底物对酶有抑制作用等。Kim等从70多株好气菌中筛选到12株产生的酶均可将人参皂苷Rb1转化成人参皂苷Rd,底物质量浓度为0.47mg/mL;而能将人参皂苷Rb1较完全转化的3株细菌,均有Compound K等副产物产生(Kim M K等,The Journal of Microbiology,2005,43:456-462)。Son等利用Thermus caldophilus产生的β-葡萄糖苷酶,将人参皂苷Rb1转化成Rd,底物质量浓度为1mg/mL,温度为75℃。但由于人参皂苷的抑制作用,该反应底物用人参总提取物替代时,反应时间比用纯Rb1延长30倍;当人参总提取物质量浓度达到4.2mg/mL时,人参皂苷Rd的产率从80%降低到12%(Son J W等Biotechnology Letters,2008,30:713-716)。本发明人即试图寻找新的方案,来实现人参皂苷Rd的工业化生产,满足临床需要,同时可解决人参、三七等常用中药材的资源紧缺的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于生物转化生产稀有人参皂苷Rd的微生物,以及使用该菌专一性转化底物人参皂苷Rb1生产Rd的方法。
本发明的人参内生菌是发明人从人参中分离得到的一株真菌,经传统方法鉴定为灰绿犁头霉菌Absidia glauca。
上述本发明的灰绿犁头霉菌已于2010年11月8日提交保藏,具体保藏信息如下:
保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Center,CGMCC);
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所;
保藏日期:2010年11月08日;
保藏编号:CGMCC No.4316。
本发明的所述的灰绿犁头霉菌(CGMCC No.4316)具有如下的特征:
PDA上25℃菌落生长迅速,5天直径达5cm,最适生长温度25℃~31℃;菌落初呈白色,后变为灰绿色或蓝绿色,最后呈暗橄榄色;孢囊梗单生或2~4轮生;囊托与孢囊梗间存在一个隔膜,孢囊孢子平滑,呈球形,直径2.5~5μm(3μm)。
发明人进一步发现,该菌在转化人参皂苷Rb1制备Rd的反应中,能专一地作用于底物人参皂苷Rb1,将其转化为人参皂苷Rd;并且产物只有Rd,无副产物生成。基于上述研究结果,本发明进一步提供一种利用所述的灰绿犁头霉菌(CGMCC No.4316)转化底物人参皂苷Rb1生产人参皂苷Rd的方法。
所述的制备人参皂苷Rd的方法,其一是原位转化法,即将活化的灰绿犁头霉菌(CGMCC No.4316)点种至含有人参皂苷Rb1的PDA培养基上,于25℃静置培养5~7天。搜集培养基中的转化产物即可。该方法适用于小量生产人参皂苷Rd。
所述的制备人参皂苷Rd的方法之二是微生物酶转化法,是将活化的灰绿犁头霉菌(CGMCC No.4316)接种于产酶培养基上,于28℃培养5~7天;收集酶液并将其与人参皂苷Rb1混合后,于40℃下反应24h;所述的产酶培养基是:每20mL去离子水中加入麦麸15g和豆粕5g,经121℃,1.0kPa高压灭菌30min。其中所述的酶液收集方法是:加入与产酶培养基等体积的pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液,搅拌1~2h;纱布过滤,滤液在8000r/min下离心10min;取离心上清液,加入3倍产酶培养基体积的95%乙醇,优选0~4℃乙醇,4℃沉淀4h;8000r/min下离心10min,去掉上清液,沉淀溶于pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液并在该缓冲液中透析,离心收集上清液即可。
采用本发明的技术方案生产人参皂苷Rd,具有专一性强、简单方便、安全可靠、成本低且无副产物的特点。发酵产物Rd的纯度在90%以上,转化率可达到60%以上。
附图说明
本发明附图3幅,
图1是人参皂苷Rb1转化为Rd的转化途径示意图;
图2是本发明的灰绿犁头霉菌形态照片,其中:A是孢囊孢子;B、C是孢囊梗及孢囊;D是囊轴;
图3是本发明的灰绿犁头霉菌转化不同底物单一性及产物单一性试验的TLC结果。
具体实施方式
下面以具体实施例的方式对本发明的技术方案作进一步的说明,但本发明不以任何形式受限于实施例的内容。无特殊说明,本发明所用的仪器和试剂包括:人参总皂苷、各种人参单体皂苷对照品,购自吉林大学基础医学院;薄层层析板Silica Gel-60F254,德国MERCK公司产品;高效液相色谱分析仪(岛沣LC-20AD),色谱柱为C18kromasil ODS2250mm×4.6mm,5μm,中科院大连化学物理研究所提供;其他试剂均为分析纯试剂。
如无特殊说明,本部分产物检测所采用的TLC及HPLC条件为:
TLC检测:薄层层析板Silica Gel-60F254;展开剂V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5;10%H2SO4水溶液,于110℃下烘干显色。
HPLC检测:
(1)样品处理:将萃取液在10000r/min,离心1min,用直径为0.22μm的微孔滤膜过滤。
(2)HPLC条件:流速:0.6mL/min;检测波长:203nm;柱温35℃;流动相:A为乙腈,B为高纯水;梯度洗脱流动相的比例:0min,A为20%,B为80%;18min,A为40%,B为60%;38min,A为80%,B为20%;48min,A为100%,B为0%;58min,A为80%,B为20%;78min,A为40%,B为60%;78~90min,A为20%,B为80%。
在该HPLC条件下,底物Rb1,出峰时间为23.139min;转化产物出峰时间为25.237min;Rd标准品出峰时间为25.506min,可以进一步确定转化产物为Rd。
实施例1:菌株的分离筛选
1、分离人参内生菌:选取新鲜健康的人参,用自来水冲洗干净,经滤纸吸干水分后,先用0.1%升汞浸泡1~1.5min,经无菌水冲洗4~5次;再用75%酒精浸泡1~1.5min,经无菌水冲洗3~4次。在无菌条件下,采用经灭菌的手术剪将人参根系剪成小块(2mm×2mm),分别置于直径9cm的PDA平板上。5~7d后观察组织块周围有无菌落形成,并挑取内生真菌菌丝接种到PDA斜面培养基上纯化和保存。
培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基):马铃薯200g,葡萄糖18g,琼脂18g,1000mL。
本实施例所采用的人参(Panax ginseng C.A.Mey)通过自行采集的方式获得,由发明人于是2009年8月采自辽宁省桓仁县。
2、菌株筛选:
所述固体转化培养基是:每100mL培养基中含马铃薯20g,葡萄糖1.8g,琼脂1.8g,人参总皂苷20g;去离子水配制,121℃,1.0kPa高压灭菌30min。
(2)复筛:将已初步筛选出来的活性菌种接种于产酶培养基上,28℃培养5~7d。加入100mL pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液,搅拌1~2h。用纱布过滤,滤液在8000r/min下离心10min,取上清液加入300mL 95%冰乙醇,4℃沉淀4h,8000r/min下离心10min,倒掉上清液,沉淀溶于10mL缓冲液中。在该缓冲液中透析,离心收集上清液即为酶液。取0.1mL与等体积的单体皂苷溶液(溶剂是上述醋酸-醋酸钠缓冲液,浓度10mg/ml)混合,40℃下反应24h,加入0.2mL正丁醇萃取1h,取上清液进行TLC检测。
所述产酶培养基是:麦麸15g,豆粕5g,20mL去离子水,经121℃,1.0kPa高压灭菌30min。
3、菌株保存及活化培养:
筛选出的菌株接种于PDA斜面培养基,4℃冰箱内短期保存。
需长期保存的菌株采用低温冷冻干燥法保存,使用前活化:SMA培养基:Dextrose10g,Asparagine 2g,KH2PO40.5g,MgSO4·7H2O 0.25g,Thiamine chloride0.5mg,琼脂15g,蒸馏水1000ml;温度:20℃。
经过鉴定,分离筛选到的真菌(CGMCC No.4316)是灰绿犁头霉菌,拉丁名Absidia glauca,其形态学特征如附图2所示。
实施例2:转化单一性试验
采用实施例1步骤2(2)的方法,试验筛选得到的灰绿犁头霉菌(CGMCCNo.4316)对人参皂苷底物及产物的转化选择性,经TLC检测,结果如附图3所示:
可以看出,对原二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd为底物的转化反应中,本发明筛得的灰绿犁头霉菌(CGMCC No.4316)仅对底物Rb1发生反应,且转化产物仅为一种,根据Rf值可以初步判断该产物为Rd。具有很好的底物选择性及产物单一性。
实施例3:固体转化法制备Rd
①配制固体转化培养基(PDA):每100mL培养基中含马铃薯20g,葡萄糖1.8g,琼脂1.8g,人参皂苷Rb120g;去离子水配制,121℃,1.0kPa高压灭菌30min。
②将活化的灰绿犁头霉菌(CGMCC No.4316)点种至上述含有人参皂苷的PDA培养基上,于25℃静置培养5~7天。
③产物提取分离:以正丁醇浸泡培养物,充分提取;提取液在10000r/min,离心1min,用直径为0.22μm的微孔滤膜过滤后,HPLC分离目标产物,
HPLC条件:流速:0.6mL/min;检测波长:203nm;柱温35℃;流动相:A为乙腈,B为高纯水;
梯度洗脱流动相的比例:
0min,A为20%,B为80%;
18min,A为40%,B为60%;
38min,A为80%,B为20%;
48min,A为100%,B为0%;
58min,A为80%,B为20%;
78min,A为40%,B为60%;
78~90min,A为20%,B为80%。
收集24~27min洗脱液,脱除溶剂即可得产物Rd。经检测,产物Rd的纯度92%,底物转化率67%。
实施例4:微生物酶法制备Rd
①配制产酶培养基:麦麸15g,豆粕5g,20mL去离子水,经121℃,1.0kPa高压灭菌30min。
②将活化的灰绿犁头霉菌(CGMCC No.4316)接种于产酶培养基上,于28℃培养5~7天;
③收集酶液:加入与产酶培养基等体积的pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液,搅拌1~2h;纱布过滤,滤液在8000r/min下离心10min;取离心上清液,加入3倍产酶培养基体积的95%冰乙醇(0~4℃),4℃沉淀4h;8000r/min下离心10min,去掉上清液,沉淀溶于pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液并在该缓冲液中透析,离心收集上清液即得酶液;
④将所得酶液与等体积人参皂苷Rb1溶液混合,于40℃下反应24h,该人参皂苷Rb1溶液溶剂为步骤③所述及的醋酸-醋酸钠缓冲液,浓度10mg/ml;
⑤以正丁醇为溶剂萃取反应液中的产物,按照实施例3步骤③的操作提取分离产物。经检测,产物Rd的纯度94%,底物转化率75%。
Claims (6)
1.灰绿犁头霉菌(Absidia glauca),其保藏编号为CGMCC No.4316,其特征在于该菌具有转化底物人参皂苷Rb1制备Rd的能力。
2.制备人参皂苷Rd的方法,其特征在于利用权利要求1所述的灰绿犁头霉菌CGMCC No.4316。
3.权利要求2所述的制备人参皂苷Rd的方法,其特征在于是将活化的灰绿犁头霉菌CGMCC No.4316点种至含有人参皂苷Rb1的PDA培养基上,于25℃静置培养5~7天。
4.权利要求2所述的制备人参皂苷Rd的方法,其特征在于是将活化的灰绿犁头霉菌CGMCC No.4316接种于产酶培养基上,于28℃培养5~7天;收集酶液并将其与人参皂苷Rb1混合后,于40℃下反应24h;
其中所述的产酶培养基是:每20mL去离子水中加入麦麸15g和豆粕5g,经121℃,1.0kPa高压灭菌30min。
5.权利要求4所述的制备人参皂苷Rd的方法,其特征在于所述的酶液收集方法是:加入与产酶培养基等体积的pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液,搅拌1~2h;纱布过滤,滤液在8000r/min下离心10min;取离心上清液,加入3倍产酶培养基体积的95%乙醇,4℃沉淀4h;8000r/min下离心10min,去掉上清液,沉淀溶于pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液并在该缓冲液中透析,离心收集上清液即可。
6.权利要求5所述的制备人参皂苷Rd的方法,其特征在于所述的乙醇温度0~4℃。
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