CN103146723B - 一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法 - Google Patents

一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103146723B
CN103146723B CN201210549479.5A CN201210549479A CN103146723B CN 103146723 B CN103146723 B CN 103146723B CN 201210549479 A CN201210549479 A CN 201210549479A CN 103146723 B CN103146723 B CN 103146723B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glycosidase
extremely
enzyme
ginsenoside
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201210549479.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103146723A (zh
Inventor
赵林果
裴建军
曹福亮
王飞
汪贵斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Forestry University
Original Assignee
Nanjing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Forestry University filed Critical Nanjing Forestry University
Priority to CN201210549479.5A priority Critical patent/CN103146723B/zh
Publication of CN103146723A publication Critical patent/CN103146723A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103146723B publication Critical patent/CN103146723B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种极耐热糖苷酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达与应用，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列SEQ NO：1通过密码子的替换和诱导条件的改变，实现了该酶在大肠杆菌中可溶性表达，酶活达到13U/mL，该糖苷酶具有极强的耐热性能和特异性降解人参皂苷Rb1为Rd的能力，该酶在90℃、pH4.8的条件下酶活最高，在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min可将99％人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd，该极耐热糖苷酶性质优异，可应用于苷元类物质的酶法转化。

Description

一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法
技术领域
本发明属于基因工程及生物质利用技术领域，尤其涉及一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法。
背景技术
人参Panax ginseng是亚洲传统的名贵中药材，具有生物活性广泛，药理作用独特等特点，但其化学成分复杂。随着分析技术的革新，人参主要的化学成分得到了进一步的明确。研究发现，人参皂苷是人参主要的生物活性物质，到目前为止，已经分离鉴定40余种人参皂苷单体，其中5种主要皂苷(人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rg1)占总皂苷的80％以上，其它的皂苷(Rd、Rg3、Rh2和Compound K等)含量很低，称为稀有皂苷(Applied Microbiology andBiotechnology，2012，94：673-682)。由于对单体进行生物活性研究，易于阐明其确切的药理作用，发现活性较强的化合物，因此越来越多的学者对人参皂苷单体进行了生理功能的研究。
人参皂苷Rd药理作用广泛，有些药理作用与其它人参皂苷类似，但是Rd具有许多独特的药理作用，如保护心脑血管、清楚自由基、促进T细胞增殖、提高天然杀伤细胞(NK)活性、保护神经系统等药理作用(中草药2009，40(5)：832-836)。但是，由于人参皂苷Rd在人参属植物中含量很低，而且结构复杂，化学合成至今还没有成功，目前只能通过从人参等药用植物中提取，但其成本太高，从而限制了Rd的进一步研究和应用。而主要皂苷Rb1和Rc与Rd的差别仅仅是多一个葡萄糖基或者阿拉伯糖基，因此通过对人参皂苷Rb1和Rc转化得到Rd是可行的方法。
对于人参皂苷Rb1的转化，有化学转化法和生物转化法。化学转化法因其反应剧烈、选择性差、副产物多等缺点而不被采用。生物转化具有反应条件温和，特异性好等特点，而受到青睐。目前人参皂苷Rb1生物转化生产Rd主要有微生物转化法和酶转化法，主要存在以下缺点：(1)大多数微生物或酶都来源于常温，温度稳定性差；(2)高浓度的底物对转化有抑制作用；(3)产物葡萄糖对转化的酶有抑制作用；(4)转化的专一性不强；(5)转化周期长；(6)生产成本过高。Kim等从70多株好氧菌中筛选到12株菌可以将人参皂苷Rb1转化成人参皂苷Rd，底物浓度为0.47g/L；而能将人参皂苷Rb1较完全转化的3株细菌，均有其它皂苷的副产物(The Journal of Micobiology，2005，43：456-462)。吕国忠等人发现一种人参内生灰绿梨头霉菌能专一性的转化Rb1成人参皂苷Rd，但转化周期较长，且转化率不高(中国发明专利，专利公开号：CN 102080048 A)。因此，寻找高效、低成本的生物酶转化人参皂苷Rb1生产人参皂苷Rd具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用，旨在解决目前无法提供用于人参皂苷Rb1生产人参皂苷Rd的高效、低成本生物酶的问题。
本发明的目的在于提供一种极耐热糖苷酶基因，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO：1所示。
进一步，该极耐热糖苷酶基因的获取过程为：
参照NCBI上已发表的T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶的基因序列设计引物，登录号：YP 004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得极耐热糖苷酶基因全序列。
进一步，该极耐热糖苷酶基因克隆到pET-28a载体，可得到包含极耐热糖苷酶基因核苷酸序列的重组质粒pET-28a-bgl。
进一步，所述重组质粒pET-28a-bgl的制备方法为：
步骤一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到极耐热糖苷酶基因的PCR扩增产物，引物为：
P1：CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCTTCGGCGTGGC
GTAAGTTGAAATGGGATATG，下划线表示Nco I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；
P2：CCCCTCGAGCATCATCGTAGTTGGTAGTTGTG
AAAGCCGTTGTCCCTTCTTTG，下划线表示Xho I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；
步骤二，将步骤一所得PCR扩增产物和pET-28a分别用Nco I和Xho I双酶切，并分别割胶回收，16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-bgl。
进一步，极耐热糖苷酶的可溶性表达的实现方法为：
将重组质粒pET-28a-bgl转化大肠杆菌JM109(DE3)，挑单菌落到摇瓶培养基，培养和诱导的温度为37℃，不加入诱导剂IPTG，12h后收集细胞，超声波破细胞，并利用Ni亲和层析柱进行重组酶的纯化，最终得到极耐糖苷酶的纯酶。
进一步，极耐热糖苷酶的定性为：在95℃、pH 4.8的条件下酶活最高，该酶在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L。
进一步，极耐热糖苷酶在转化人参皂苷Rb1为Rd中的应用。
进一步，该极耐热糖苷酶应用于对人参皂苷Rb1的转化时，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min，可将99％人参皂苷Rb1转化为Rd。
本发明公开了一种极耐热糖苷酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达与应用，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO：1所示，通过密码子的替换和诱导条件的改变，实现了该酶在大肠杆菌中可溶性表达，酶活达到13U/mL，该糖苷酶具有极强的耐热性能和特异性降解人参皂苷Rb1为Rd的能力，该酶在90℃、pH 4.8的条件下酶活最高，在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min可将99％人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd，本发明提供的极耐热糖苷酶性质优异，可应用于人参皂苷酶法转化。
附图说明
图1是本发明实施例提供的极耐热糖苷酶可溶性表达的SDS-PAGE蛋白电泳图，1为蛋白marker；2，5，8，11，14，17为全细胞蛋白；3，6，9，12，15，18为沉淀蛋白；4，7，10，13，16，19为可溶性蛋白；
图2是本发明实施例提供的极耐糖苷酶纯蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图，1为蛋白marker；2为大肠杆菌JM109(DE3)的全细胞蛋白；3为大肠杆菌JM109(DE3)带重组质粒pET-28a-bgl的全细胞蛋白；4为极耐热糖苷酶的纯酶；
图3是本发明实施例提供的温度和pH对极耐热糖苷酶活性的影响；
图4是本发明实施例提供的极耐热糖苷酶对人参皂苷Rb1的转化薄层图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
本发明的目的在于提供一种极耐热糖苷酶基因，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列如SEQ N0：1所示。
在本发明实施例中，该极耐热糖苷酶基因的获取过程为：
参照NCBI上已发表的T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶的基因序列设计引物，登录号：YP 004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得极耐热糖苷酶基因全序列。
在本发明实施例中，该极耐热糖苷酶基因克隆到pET-28a载体，可得到包含极耐热糖苷酶基因核苷酸序列的重组质粒pET-28a-bgl。
在本发明实施例中，重组质粒pET-28a-bgl的制备方法为：
步骤一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到极耐热糖苷酶基因的PCR扩增产物，引物为：
P1：CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCTTCGGCGTGGC
GTAAGTTGAAATGGGATATG，下划线表示Nco I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；
P2：CCCCTCGAGCATCATCGTAGTTGGTAGTTGTG
AAAGCCGTTGTCCCTTCTTTG，下划线表示Xho I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；
步骤二，将步骤一所得PCR扩增产物和pET-28a分别用Nco I和Xho I双酶切，并分别割胶回收，16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-bgl。
在本发明实施例中，极耐热糖苷酶的可溶性表达的实现方法为：
将重组质粒pET-28a-bgl转化大肠杆菌JM109(DE3)，挑单菌落到摇瓶培养基，培养和诱导的温度为37℃，不加入诱导剂IPTG，12h后收集细胞，超声波破细胞，并利用Ni亲和层析柱进行重组酶的纯化，最终得到极耐糖苷酶的纯酶。
在本发明实施例中，极耐热糖苷酶的定性为：在95℃、pH 4.8的条件下酶活最高，该酶在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L。
在本发明实施例中，极耐热糖苷酶在转化人参皂苷Rb1为Rd中的应用。
在本发明实施例中，该极耐热糖苷酶应用于对人参皂苷Rb1的转化时，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min，可将99％人参皂苷Rb1转化为Rd。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1：重组质粒pET-28a-bgl的构建
1.1Thermotoga thermarum DSM 5069的培养
T.thermarum DSM 5069购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为5069。其培养基配方为：5g/L可溶性淀粉，1g/L酵母粉，1.5g/L KH2PO4，4.2g/L Na2HPO4x 12H2O，3.4g/L NaCl，1g/L MgSO4x 7H2O，0.76g/L EDTA，1mL/L微量元素，0.5g/L Na2S·9H2O，0.5g/L Cysteine HCl，1mg/L刃天青，调pH为7.0，煮沸冲氮气，除去氧气后，培养基在无氧条件下装入厌氧瓶灭菌。微量元素(1000×)配方：FeCl32.0g/L；H3BO30.05g/L；ZnCl20.05g/L；CuCl2·2H2O 0.03g/L；MnCl2·4H2O 0.05g/L；(NH4)2MoO40.05g/L；AlKSO4·2H2O0.05g/L。)用注射器按照0.5％接种量接种，82℃静止培养24h，收集细胞。
1.2基因组DNA的提取
(1)静置培养T.thermarum DSM 5069 24h，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。
(2)用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。
(3)加入1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。
(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。
(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。
(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。
(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗。
(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。
(9)室温下风干，加500μL TE缓冲液溶解。
(10)取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。
1.3重组质粒pET-28a-bgl的构建
按照已知的T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶基因(登录号：YP_004660190.1)设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。P1：CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCTGTTCGGCGCGAGCATGGCCGGCTTCCAAGTTGAAATGGGATATG，下划线表示Nco I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；P2：CCCCTCGAGCATGCGCCAGATTTCGTATGGGCTTTTCA
GGTAGTTGTGAAAGCGTGCCGTTGTCCCTTCTTTG，下划线表示Xho I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点，密码子的替换按照大肠杆菌优势密码子进行替换原有的非优势密码子；以提取的T.thermarum DSM 5069的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1.5min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶基因。
得到T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶基因和pET-28a分别用Nco I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-bgl。
实施例2：重组极耐热糖苷酶的可溶性表达及纯化
2.1重组极耐热糖苷酶的可溶性表达
将重组质粒pET-28a-bgl转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL卡那霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度分别为0-0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，37℃、30℃或者25℃诱导培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，离心分别收集上清和沉淀，上清为可溶性蛋白，沉淀为不溶性蛋白(包涵体)。结果如图1所示，带有重组质粒pET-28a-bgl的大肠杆菌表达极耐热糖苷酶的最佳诱导条件是37℃，不加入任何诱导剂，在此条件下产生的可溶性蛋白最多，酶活达到13U/mL。而加入IPTG诱导，产生的重组极耐热糖苷酶几乎都是包涵体(图1)。
2.2重组极耐热糖苷酶的纯化
将重组质粒pET-28a-bgl转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL卡那霉素)37℃，200rpm振荡培养12h，收集细胞。由于重组质粒pET-28a-bgl中含有His-tag标签，通过His·BindPurification Kit(Novagen)进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：
A.样品的处理
(1)将洗涤过的菌体，用1×Binding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。
(2)破壁后，13,000g离心30min，取上清即为样品。
B.处理柱子
(1)取1mL填料装柱。
(2)用3mL的无菌水洗柱子。
(3)用5mL的1×Charge Buffer洗柱子。
(4)用3mL的1×Binding Buffer洗柱子。
C.上样
(1)将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。
(2)用3mL 1×Binding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。
(3)用4mL含有20mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。
(4)用80mmol/L咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。
(5)用4mL 1×Strip Buffer洗柱子。
通过此过程得到纯化的重组极耐热糖苷酶，纯酶的纯度鉴定采用SDS-PAGE方法进行，结果如图2所示。
实施例3：重组极耐热糖苷酶的定性
3.1酶活测定
反应体系200μL，20μL 10mmol/L人参皂苷Rb1中加入100μL 100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)和适量的水，先在90℃孵育5min，再加入10μL酶液(稀释到合适的倍数)反应10min。反应结束后立刻蒸干并加入甲醇，用TLC或者HPLC测定Rd的量。TLC和HPLC的条件按照文献进行(The Journal ofMicobiology，2005，43：456-462)。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmol人参皂苷Rd所用的酶量为1个酶活力单位。
3.2最适反应温度的测定
在50-100℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 4.8，发现极耐热糖苷酶的最适反应温度为90℃(图3b)，较高的反应温度可以使底物皂苷Rb1在水中的溶解度增加。
3.3最适反应pH的测定
在不同的pH(4.0-8.0，50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)条件下，90℃分别测定酶活，发现极耐热糖苷酶的最适反应pH为4.8(图3a)。
3.4温度稳定性的测定
在pH 6.0下，使酶在85℃，90℃，95℃温度下分别保温不同的时间(0，20，40，60，90，120min)，再测定相对酶活，以未保温(4℃保存)的酶样活性为100％，发现极耐热糖苷酶在90℃保温2h，残存酶活还有50％(图3d)，热稳定性越好，酶的有效催化时间就越长。
3.5pH稳定性的测定
将纯化的极耐热糖苷酶在不同的pH(4.0-8.0，50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)下80℃处理1h，与不保温酶的酶活相比，发现极耐热糖苷酶在4.4-8.0都很稳定(图3c)。
3.6葡萄糖和甲醇对极耐热糖苷酶的活性的影响
在反应体系中，加入不同浓度的葡萄糖浓度(0mmol/L，200mmol/L，400mmol/L，600mmol/L，800mmol/L，1000mmol/L，1500mmol/L，2000mmol/L)，发现葡萄糖浓度不大于400mmol/L，对极耐热糖苷酶活性有激活作用，随着这葡萄糖浓度的提高，缓慢抑制该酶的活性，但是即使葡萄糖浓度达到1500mmol/L时，极耐热糖苷酶仍保持50％的活力，耐糖系数Ki的定义为：糖苷酶活性被葡萄糖抑制50％时，反应体系中葡萄糖的浓度。
在反应体系中，加入不同浓度的乙醇或甲醇(0％，5％，10％，20％，30％v/v)，发现甲醇对极耐热糖苷酶有激活作用，而乙醇浓度不大于10％时对酶活没有影响(表-1)。
表-1.有机溶剂对酶活的影响
实施例4：人参皂苷Rb1转化生产人参皂苷Rd
人参皂苷Rb1的浓度为36g/L，转化条件为90℃，pH 5.250mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，5％甲醇，不同的时间点(10，20，30，40，50，60min)分别取样，通过TLC和HPLC进行检测。结果发现极耐热糖苷酶(1.2U/mL)在30min内可以将99％人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd(图-4)。
本发明实施例公开了一种极耐热糖苷酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达与应用，该极耐热糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO：1所示，通过密码子的替换和诱导条件的改变，实现了该酶在大肠杆菌中可溶性表达，酶活达到13U/mL，该糖苷酶具有极强的耐热性能和特异性降解人参皂苷Rb1为Rd的能力，该酶在90℃、pH 4.8的条件下酶活最高，在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min可将99％人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd，本发明提供的极耐热糖苷酶性质优异，可应用于人参皂苷酶法转化，具有较强的推广与应用价值。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种极耐热糖苷酶在转化人参皂苷Rb1为Rd中的应用，其特征在于，该极耐热糖苷酶基因的获取过程为：参照NCBI上已发表的T.thermarum DSM 5069极耐热糖苷酶的基因序列设计引物，登录号：YP_004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得极耐热糖苷酶基因全序列；
该极耐热糖苷酶基因克隆到pET-28a载体，可得到包含极耐热糖苷酶基因核苷酸序列的重组质粒pET-28a-bg1；
所述重组质粒pET-28a-bg1的制备方法为：
步骤一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到极耐热糖苷酶基因的PCR扩增产物，引物为：
P1：CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCTTCGGCGTGGC
GTAAGTTGAAATGGGATATG，下划线表示Nco I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；
P2：CCCCTCGAGCATCATCGTAGTTGGTAGTTGTG
AAAGCCGTTGTCCCTTCTTTG，下划线表示Xho I，斜体加粗表示优势密码子替换的位点；
步骤二，将步骤一所得PCR扩增产物和pET-28a分别用Nco I和Xho I双酶切，并分别割胶回收，16℃过夜连接；
将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；
挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-bg1；
极耐热糖苷酶的可溶性表达的实现方法为：
将重组质粒pET-28a-bg1转化大肠杆菌JM109(DE3)，挑单菌落到摇瓶培养基，培养和诱导的温度为37℃，不加入诱导剂IPTG，12h后收集细胞，超声波破细胞，并利用Ni亲和层析柱进行重组酶的纯化，最终得到极耐糖苷酶的纯酶；
极耐热糖苷酶的定性为：在95℃、pH 4.8的条件下酶活最高，该酶在温度70-100℃、pH 4.8-8.0的范围内，均保持较高的酶活，该酶对葡萄糖的耐糖系数Ki为1.5mol/L；
该极耐热糖苷酶应用于对人参皂苷Rb1的转化时，该酶1U/mL在90℃、pH 5.2、5％甲醇条件下30min，可将99％人参皂苷Rb1转化为Rd。
CN201210549479.5A 2012-12-18 2012-12-18 一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法 Expired - Fee Related CN103146723B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210549479.5A CN103146723B (zh) 2012-12-18 2012-12-18 一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210549479.5A CN103146723B (zh) 2012-12-18 2012-12-18 一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103146723A CN103146723A (zh) 2013-06-12
CN103146723B true CN103146723B (zh) 2015-04-08

Family

ID=48545041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210549479.5A Expired - Fee Related CN103146723B (zh) 2012-12-18 2012-12-18 一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103146723B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104611313B (zh) * 2015-01-19 2017-11-17 南京林业大学 一种β‑葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN111117988B (zh) * 2020-01-18 2022-10-14 南京林业大学 嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102080048B (zh) * 2010-12-03 2013-03-06 大连民族学院 人参内生灰绿犁头霉菌及利用其制备人参皂苷Rd的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103146723A (zh) 2013-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104611313B (zh) 一种β‑葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN104762281B (zh) 一种α‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
Lin et al. Molecular cloning, expression, and immobilization of glutamate decarboxylase from Lactobacillus fermentum YS2
CN109593750B (zh) 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用
CN102367432B (zh) 一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用
CN104328098A (zh) 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN109609530B (zh) 一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用
CN107641621A (zh) 一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法
CN104774813B (zh) 一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用
KR101079293B1 (ko) 고온성 베타-글리코시다아제를 이용한 희귀 진세노사이드의제조방법
CN111690630A (zh) 一种β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其表达和应用
Yuan et al. Overexpression and characterization of a glycoside hydrolase family 1 enzyme from Cellulosimicrobium cellulans sp. 21 and its application for minor ginsenosides production
CN103146723B (zh) 一种极耐热糖苷酶基因及其可溶性表达与应用方法
CN113862290B (zh) 一种来源于甘草的异黄酮4′-o-甲基转移酶及其应用
WO2021103234A1 (zh) 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用
CN104651336B (zh) α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶及其在制备人参皂苷Rd中的应用
CN113337495B (zh) 一种提高唾液酸产量的方法与应用
CN113801240B (zh) 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用
CN105695553A (zh) 一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法
CN105695552A (zh) 一种酶法制备稀有人参皂苷Rh1的方法
CN110656077A (zh) 一种生产蔗糖磷酸化酶的方法及其应用
CN105543128A (zh) 一种极地适冷耐盐褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用
CN116445519B (zh) 一种糖基转移酶及其在生物合成丁香脂素葡萄糖苷中的应用
CN104962508A (zh) 基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法
CN108004225A (zh) 一种成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150408