CN111690630A

CN111690630A - 一种β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其表达和应用

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Publication number: CN111690630A
Application number: CN202010653370.0A
Authority: CN
Inventors: 解静聪; 蒋剑春; 张宁; 杨静; 徐浩; 赵剑
Original assignee: Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Current assignee: Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2020-09-22

Abstract

一种β‑葡萄糖苷酶、其编码基因及其表达和应用，属于基因工程技术及生物医药领域。所述β‑葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示。所述β‑葡萄糖苷酶的转化条件为pH 4‑8，温度30‑95℃，最适转化条件为pH 6.5，温度95℃。本发明所述耐高温β‑葡萄糖苷酶能够长时间耐受高温，热稳定性优异，具有较强的糖耐受能力，不被易被产物抑制；所述β‑葡萄糖苷酶具有水解多种糖苷的能力，所述β‑葡萄糖苷酶与异槲皮素、淫羊藿苷、淫羊藿次苷II、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb2等天然化合物在适宜条件下孵育后能够几乎实现完全转化，获得活性更强的槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿素和人参皂苷Rd。

Description

一种β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其表达和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其表达和应用。

背景技术

植物来源的天然药物，如黄酮和皂苷等，常与不同种类、不同数量的糖基连接，以糖苷形式存在于植物的叶、茎和根中。随着现代分离和分析技术的进步，多种植物原料中的活性物质被分离鉴定，它们的活性也被深入的进行了分析。根据糖苷种类、数量和连接位置的差异，这些天然药物的活性也具有显著的差异，特别是在抗肿瘤、抗炎和神经保护等活性方面。

研究表明杨树皮中富含芦丁等黄酮糖苷类化合物，其脱糖基产物槲皮素，其脂溶性强于另外两种母核结构一致的糖苷衍生物，相比芦丁在抗炎和抗氧化方面具有更强的活性。药用植物淫羊藿中富含多种异戊烯基黄酮糖苷类化合物，其苷元和单糖苷形式衍生物淫羊藿素和淫羊藿次苷II对多种肿瘤细胞具有抗转移以及较强抑制增殖作用，而其多糖苷衍生物不具备。药用植物人参中富含多种活性物质，其中人参皂苷是目前研究的热点。人参皂苷Rd具有独特的肾脏保护功能和特异性阻断受体依赖性钙离子通道功能是其它单体所不具备的，同时人参皂苷Rd还具有较强的促进神经干细胞分化和保护神经系统功能。因此，开发一种高效专一、低成本且绿色的天然化合物脱糖基生产工艺，实现多种天然产物的改性增效具有迫切的现实需要同时也具有重要的实际应用价值。

在植物提取物中苷元及单糖苷黄酮和皂苷的含量与高度糖基化的衍生物的相比显著偏低，有组分属于稀有组分，因而直接提取回收率低，无法应用于大规模生产；此外黄酮及皂苷类天然产物的母核结构复杂，使得化学合成更为困难。因此通过生物酶法转化母核结构相似而糖基化程度不同的衍生物具有更高的可行性，而相比反应条件剧烈的物理及化学方法，生物酶法所适用的反应条件相对温和且高效专一，几乎不产生废弃物因此无污染，绿色环保。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其表达和应用，具有较高半乳糖苷酶活力、木糖苷酶活力和阿拉伯吡喃糖苷酶活力，本发明通过基因工程技术获得催化性能稳定，成分单一的重组β-葡萄糖苷酶IAGBGL1，该重组酶IAGBGL1对异槲皮素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、淫羊藿苷和淫羊藿次苷II为例的黄酮糖苷和皂苷都具有较强的转化能力，同时该酶能耐受较高浓度的葡萄糖，因此可降低产物反馈抑制对酶活力的影响。

技术方案：一种β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

1 MGLKYPKEFI FGFSESGFQF EMGLPGSEDP NTDWWVWVHD PENIASTLVS GDFPENGPGY

61 WHLYRQDHDI AERLGMDGAR IGIEWSRIFS KPTFDVKVDV ARDERGNIVY IDVAEKALEE

121 LDRIANKDAV NHYREILSDW KNRGKKLIIN LYHWTLPLWL HDPIKVRKLG IDRAPAGWVD

181 ERTVIEFVKY VAYIAWKLGD LPDLWCTMNE PNVVYSIGYI NIKIGYPPGY LSFEAASKAM

241 KHLVEAHARA YEVLKRFTNK PVGIIYVTTY HEPLKESDRD VAEAAMYQAV FDFLDSITIG

301 RSMSIGERKD LEKHLDWLGI NYYSRLVVER YGNAWRVLPG YGFACIPGGT SLAGRPCNDA

361 GWETYPEGLY IMLKRCWERY RLPIIVTENG TADAIDRLRP RYLATHLYQV WKALSEGVDI

421 RGYLHWALVD NYEWSSGFRM RFGLVHVDFE TKKRYLRPSA LLFREIASSK EIPDEFMHMT

481 QPQILI*

一种β-葡萄糖苷酶基因，编码上述β-葡萄糖苷酶。

上述的β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

1 ATGGGCTTAA AATATCCGAA AGAATTTATT TTTGGCTTTT CAGAATCAGG TTTTCAGTTT

61 GAAATGGGTC TGCCGGGTAG CGAAGATCCG AATACCGATT GGTGGGTGTG GGTTCATGAT

121 CCGGAAAATA TTGCAAGTAC CTTAGTGAGC GGCGATTTTC CGGAAAATGG TCCCGGCTAT

181 TGGCATCTGT ATCGTCAGGA TCATGATATT GCAGAACGCT TAGGTATGGA TGGTGCACGC

241 ATTGGCATTG AATGGTCGCG CATTTTTAGC AAACCGACCT TTGATGTTAA AGTGGATGTT

301 GCACGCGATG AACGCGGTAA TATTGTGTAT ATTGATGTTG CAGAAAAAGC CTTAGAAGAA

361 CTGGATCGCA TTGCCAATAA AGATGCAGTT AATCATTATC GCGAAATTCT GAGCGATTGG

421 AAAAATCGCG GCAAAAAACT GATTATTAAT CTGTATCATT GGACCCTGCC GCTGTGGTTA

481 CATGATCCGA TTAAAGTGCG TAAACTGGGC ATTGATCGCG CCCCGGCAGG CTGGGTTGAT

541 GAACGTACCG TGATTGAATT TGTTAAATAT GTTGCCTATA TTGCCTGGAA ACTGGGCGAT

601 CTGCCGGATC TGTGGTGTAC CATGAATGAA CCGAATGTTG TGTATAGCAT TGGTTATATT

661 AATATTAAAA TTGGCTATCC GCCGGGTTAT CTGAGCTTTG AAGCAGCCAG CAAAGCTATG

721 AAGCACTTAG TGGAAGCCCA TGCGAGAGCC TATGAAGTGC TGAAACGTTT TACAAACAAG

781 CCTGTGGGCA TTATTTATGT GACCACCTAT CATGAACCGT TAAAAGAATC AGATCGTGAT

841 GTGGCCGAAG CCGCCATGTA TCAGGCCGTG TTTGATTTTC TGGATAGCAT TACCATTGGT

901 CGTTCAATGT CAATTGGCGA ACGCAAAGAT TTAGAAAAAC ATTTAGATTG GTTAGGCATT

961 AATTATTATA GTCGCTTAGT TGTGGAACGT TATGGTAATG CCTGGCGCGT GCTGCCGGGC

1021 TATGGCTTTG CCTGTATTCC GGGCGGTACC TCTTTAGCAG GTCGTCCGTG TAATGATGCA

1081 GGCTGGGAAA CCTATCCGGA AGGCCTGTAT ATTATGCTGA AACGTTGTTG GGAACGCTAT

1141 CGCTTACCGA TTATTGTGAC CGAAAATGGC ACCGCAGATG CAATTGATCG TCTGCGCCCG

1201 CGCTATCTGG CCACCCATCT GTATCAGGTG TGGAAAGCAC TGAGCGAAGG CGTTGATATT

1261 CGCGGCTATT TACATTGGGC CTTAGTGGAT AATTATGAAT GGAGTAGCGG CTTTCGTATG

1321 CGCTTTGGTT TAGTTCATGT GGATTTTGAA ACCAAAAAAC GCTATCTGCG TCCGAGCGCC

1381 CTGCTGTTTC GTGAAATTGC CTCTAGTAAA GAAATTCCGG ATGAATTTAT GCACATGACC

1441 CAGCCGCAGA TTCTGATTTA A

一种携带上述基因的重组质粒。

作为优选，所述重组质粒的制作方法如下：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的编码基因和pET-20b质粒分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒。

一种表达上述β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤如下：将权利要求5所述的重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)，不加IPTG于37℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得。

上述β-葡萄糖苷酶在转化黄酮糖苷类化合物和皂苷用于制备稀有苷元及单糖苷化合物中的应用。

作为优选，所述β-葡萄糖苷酶的转化条件为pH 4-8，温度30-95℃。

作为优选，所述β-葡萄糖苷酶的转化条件为pH 6.5，温度95℃。

有益效果：（1）本发明所述耐高温β-葡萄糖苷酶能够长时间耐受高温，热稳定性优异；

（2）本发明所述β-葡萄糖苷酶具有水解多种糖苷的能力，对多种黄酮糖苷和人参皂苷的转化能力强，本发明所述β-葡萄糖苷酶具有较强的糖耐受能力，不被易被产物抑制；

(3) 本发明所述IAGBGL1的制备方法不需要诱导剂IPTG即可高效表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1和Rb2生成人参皂苷Rd的水解线路图。

图2为实施例2纯化的β-葡萄糖苷酶的纯度鉴定结果图；其中泳道M为蛋白Marker(购自Thermo scientific公司，货号2661)，泳道1为样品经分子筛分离，收集浓缩至1mg/mL的纯酶蛋白；泳道2为亲和层析纯化后的目的蛋白。

图3为实施例3本发明所述β-葡萄糖苷酶诱导表达结果图，其中a图为不同诱导剂浓度下酶活力表达的影响图，其中b图诱导温度对酶活力表达的影响图，在添加0mM和0.005mM诱导剂后于不同温度下诱导β-葡萄糖苷表达的情况。

图4为实施例4本发明所述β-葡萄糖苷酶的定性测定结果图，其中a为最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位%；b pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位%；c为最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度（℃），纵坐标为相对酶活力，单位%； d为温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位分钟（min），纵坐标为相对酶活力，单位%；e图为糖耐受性的测定结果图，横坐标为各种单糖的浓度，单位（mM），纵坐标为相对酶活力，单位%。

图5为实施例6本发明所述β-葡萄糖苷酶对多种糖苷类天然产物酶转化反应中底物与产物变化的历程图，其中横坐标为反应时间（min），纵坐标为底物与产物的含量，单位（g/L）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种具有多种糖苷酶活力的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，命名为IAGBGL1。

本发明也提供了编码本发明所述β-葡萄糖苷酶的DNA分子片段。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了可以编码所述的β-葡萄糖苷酶IAGBGL1的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种包含本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒，所述的重组质粒为pET- IAGBGL1。

本发明所述转化表达宿主菌为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21、JM109系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为BL21 (DE3)菌株。

本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备方法所述诱导表达分离纯化具体为不加IPTG于37℃下诱导培养含重组质粒的表达宿主菌，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白。

本发明还提供了一种转化糖苷类天然化合物制备高活性苷元或单糖苷衍生物的方法，具体为本发明所述β-葡萄糖苷酶在下pH 6.5，95℃条件下可酶解异槲皮素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、淫羊藿苷和淫羊藿次苷I制备得到槲皮素、人参皂苷Rd，淫羊藿次苷II和淫羊藿素等高附加值组分。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。

实施例1：重组质粒pET-IAGBGL1的构建

按照密码子优化后的Ignisphaera aggregans DSM 17230耐高温β-葡萄糖苷酶基因设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：

上游引物P1：CC CATATG GGCTTAAAATATCCGAAAGAA（SEQ ID NO.3），下划线表示Nde I位点。

下游引物P2： CCC CTCGAG AATCAGAATCTGCGGCTGGG（SEQ ID NO.4），下划线表示XhoI位点，并去除终止密码子。

进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5 min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；30次循环（ 94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1.5 min ）；72℃，10 min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化。得到β-葡萄糖苷酶IAGBGL1的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

将得到的β-葡萄糖苷酶IAGBGL1的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高温β-葡萄糖苷酶DNA分子的重组质粒pET-IAGBGL1。

实施例2：本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备

将重组质粒pET-IAGBGL1转化大肠杆菌BL21(DE3) 宿主菌（购自Novagen公司），在含有氨苄青霉素（50μg/mL）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5g/L，琼脂 15 g/L）上经过37℃培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50μg/mL 氨苄青霉素）37℃，200 rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30℃培养6 h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15 min，收集菌体。

由于重组质粒pET-IAGBGL1中含有His-tag标签，通过His•Bind PurificationKit（购自Novagen公司）进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：

A.样品的处理

（1）将洗涤过的菌体，用1×Binding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。

（2）破壁后，13,000 g离心30 min，取上清即为样品。

B.处理柱子

（1）取1 mL填料装柱。

（2）用3mL的无菌水洗柱子。

（3）用5mL的1×Charge Buffer洗柱子。

（4）用3mL的1×Binding Buffer洗柱子。

C.上样

（1）将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。

（2）用3 mL 1×Binding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。

（3）用4 mL含有20 mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。

（4）用80 mmol/L咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。

（5）用4 mL 1×Strip Buffer洗柱子。

通过分子筛纯化验证纯度，将亲合层析获得的目的蛋白浓缩至500μL，通过superdex 200 分子筛预装柱（GE公司）以25 mM 磷酸盐buffer为流动相对样品进行分析，并收集目的蛋白，进行浓缩。

通过此过程得到纯化的β-葡萄糖苷酶，通过SDS-PAGE电泳后染色鉴定β-葡萄糖苷酶的纯度，结果如图2所示。

由图2结果可见，目的蛋白通过HisTag标签纯化后，在170kDa处有细微条带，与其三聚体的分子量吻合，可能是由于热变性不充分导致未完全解离成单体，其洗脱液中β-葡萄糖苷酶IAGBGL1，在55kDa处有较为显著的条带，与单体的理论分子相符，同时表明其纯化效果达到预期。

实施例3：本发明所述β-葡萄糖苷酶优选制备方法

将重组质粒pET-IAGBGL1转化大肠杆菌BL21(DE3) 宿主菌（购自Novagen公司），在含有氨苄青霉素（50 μ g/mL）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl5 g/L，琼脂 15 g/L）上经过37℃培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50μg/mL 氨苄青霉素）37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度分别为0mM, 0.005 mM,0.01 mM，0.05 mM，0.1mM 和0.25mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，32℃培养7 h；为测定最适诱导温度，分别向培养至OD₆₀₀约0.6的摇瓶中添加0mM和0.005mM的诱导剂IPTG后，分别置于42℃、37℃、32℃和28℃下培养7h，用高速冷冻离心机分别去不同培养条件下的2mL培养液在4℃下，以13,000 rpm离心15 min，收集菌体。在菌体中加入一定体积缓冲溶液，重悬后，超声波破碎细胞，获得全细胞裂解液，去一定体积全细胞裂解液以13,000rpm离心15 min，获得上清液可溶性蛋白溶液，沉淀即为不溶性蛋白—包涵体。我们通过测定上清液中β-葡萄糖苷酶活力来评价不同表达条件的效果，结果如图3所示。

由图3a可见，在32℃下诱导产酶时， IPTG添加浓度越大，酶产率越低，不加IPTG时，重组酶表达量较高，由图3b可见，将诱导温度改变为37℃，不加IPTG时，表现出最高酶活力。由此可见，本发明所述表达β-葡萄糖苷酶的基因重组菌只需在最适生长条件(37℃)下培养无需诱导剂IPTG即可达到高效表达。

实施例4：本发明所述β-葡萄糖苷酶的定性测定

1、酶活的测定方法

反应体系100 μL，5 μL 20 mmol/L 对硝基苯β-D葡萄糖苷（pNPG）中加入85 μL 100mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.0），先在90^oC孵育3 min，再加入10 μL酶液（稀释到合适的倍数）反应10 min，显色后再加入1 mol/L的碳酸钠溶液600 μL终止反应。在405nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1 μmol p-硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活力单位。

2、最适反应pH的测定

在不同的pH（3.0-8.0，100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液; 8.0-9.0，100 mmol/LTris-盐酸缓冲溶液）条件下，95℃分别测定酶活，结果如图4a所示。

由图4a结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶IAGBGL1的最适反应pH为6.5。

3、pH稳定性的测定

将纯化的重组酶IAGBGL1在不同的pH（3.0-8.0，100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液; 8.0-9, 100 mmol/L Tris-盐酸缓冲溶液）下70℃处理1 h，与不保温酶的酶相比，结果如图4b所示。

由图4b结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶在pH4.5－8.0条件下75℃保温1h后仍能具有80%以上的残余酶活力。

3、最适反应温度的测定

在50-100℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.5，结果如图4c所示。

由图4c结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为95℃。

5、温度稳定性的测定

在pH 6.5下，使酶在70℃，80℃，90℃温度下分别保温180 min时间，间断取样测定相对酶活，以未保温（4℃保存）的酶活性为100%，结果如图4d所示：由图4d结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶在90℃下保温3h残余酶活力高于50%，于70℃下保温3h残余酶活力高于90%。

6、β-葡萄糖苷酶对葡萄糖耐受能力测定方法：在相同的反应体系(100 μL, 10mMpNPG, 50mM pH6.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液; )中加入葡萄糖至不同浓度，在最适反应条件下测定本发明所述β-葡萄糖苷酶活力，结果如图4e所示。

由图4e可知本专利所述β-葡萄糖苷酶IAGBGL1在葡萄糖终浓度1600 mM的反应体系中，仍具有超过50%的残余酶活力，其Ki系数为1600mM，且该β-葡萄糖苷酶在反应体系中葡萄糖终浓度为0-800mM之间时，具有明显的激活作用，即在催化反应开始后酶活力逐渐提高，同时，在葡萄糖添加量150mM时达到最高，其酶活力为对照组(0 mM葡萄糖)提高了150%。

实施例6：本发明所述β-葡萄糖苷酶转化多种糖苷类天然产物制备高附加值苷元和单糖苷化合物

本发明所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1和Rb2生成人参皂苷Rd的水解线路图参见图1。

异槲皮素、槲皮素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II和淫羊藿苷等标准品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。

异槲皮素和槲皮素的HPLC检测条件为:Agilent 1260 Infinity；DAD检测器检测波长为360nm，柱温为40℃，流动相流速为1.0mL/min (A:水，B:甲醇； A:B为54:46；检测时间10min)。

人参皂苷Rb1、Rb2和Rd 的HPLC检测条件为: Agilent 1260 Infinity；DAD检测器检测波长为203nm，柱温为30℃，流动相流速为1.2mL/min (A:水，B:乙腈；0min，A:B为70:30；10min，A:B为55:45；15min，A:B为40:60；18min，A:B为40:60；20min A:B为70:30；23minA:B为70:30)。

淫羊藿黄酮的HPLC检测条件为: Agilent 1260 Infinity；DAD检测器检测波长为269nm，柱温为30℃，流动相流速为1.0mL/min (A:水，B:乙腈；0min，A:B为70:30；10min，A:B为40:60；15min，A:B为10:90；20min A:B为10:90；25min A:B为70:30)。

酶转化体系：反应体系为50μL，其中异槲皮素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、淫羊藿苷和淫羊藿次苷I浓度为10g/L，酶添加量为5U/mL，反应在pH 6.5，95℃下进行，分别对不同反应时间（0-160min）的样品利用HPLC进行成分检测，后分析原料和产物含量变化。

由图5a可见，在反应10min后即检出有异槲皮素转化为槲皮素，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应80min后，异槲皮素几乎完全转化为槲皮素，摩尔得率约为99.1%。

由图5b可见，在反应10min后即检出有人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应40min后，人参皂苷Rb1几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为99.62%。

由图5c可见，在反应10min后即检出有人参皂苷Rb2转化为人参皂苷Rd，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应120min后，人参皂苷Rb2几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为99.73%。

由图5d可见，在反应10min后即检出有淫羊藿苷转化为淫羊藿次苷II，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应80min后，淫羊藿苷几乎完全转化为淫羊藿次苷II，淫羊藿次苷II得率约为99.68%。

由图5e可见，在反应10min后即检出有人参皂苷Rb2转化为人参皂苷Rd，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应100min后，人参皂苷Rb2几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为99.36%。

序列表

<110> 中国林业科学研究院林产化学工业研究所

<120> 一种β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其表达和应用

<150> 2019106139326

<151> 2019-07-09

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Leu Lys Tyr Pro Lys Glu Phe Ile Phe Gly Phe Ser Glu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Gln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn Thr

20 25 30

Asp Trp Trp Val Trp Val His Asp Pro Glu Asn Ile Ala Ser Thr Leu

35 40 45

Val Ser Gly Asp Phe Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp His Leu Tyr

50 55 60

Arg Gln Asp His Asp Ile Ala Glu Arg Leu Gly Met Asp Gly Ala Arg

65 70 75 80

Ile Gly Ile Glu Trp Ser Arg Ile Phe Ser Lys Pro Thr Phe Asp Val

85 90 95

Lys Val Asp Val Ala Arg Asp Glu Arg Gly Asn Ile Val Tyr Ile Asp

100 105 110

Val Ala Glu Lys Ala Leu Glu Glu Leu Asp Arg Ile Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Ala Val Asn His Tyr Arg Glu Ile Leu Ser Asp Trp Lys Asn Arg Gly

130 135 140

Lys Lys Leu Ile Ile Asn Leu Tyr His Trp Thr Leu Pro Leu Trp Leu

145 150 155 160

His Asp Pro Ile Lys Val Arg Lys Leu Gly Ile Asp Arg Ala Pro Ala

165 170 175

Gly Trp Val Asp Glu Arg Thr Val Ile Glu Phe Val Lys Tyr Val Ala

180 185 190

Tyr Ile Ala Trp Lys Leu Gly Asp Leu Pro Asp Leu Trp Cys Thr Met

195 200 205

Asn Glu Pro Asn Val Val Tyr Ser Ile Gly Tyr Ile Asn Ile Lys Ile

210 215 220

Gly Tyr Pro Pro Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Ser Lys Ala Met

225 230 235 240

Lys His Leu Val Glu Ala His Ala Arg Ala Tyr Glu Val Leu Lys Arg

245 250 255

Phe Thr Asn Lys Pro Val Gly Ile Ile Tyr Val Thr Thr Tyr His Glu

260 265 270

Pro Leu Lys Glu Ser Asp Arg Asp Val Ala Glu Ala Ala Met Tyr Gln

275 280 285

Ala Val Phe Asp Phe Leu Asp Ser Ile Thr Ile Gly Arg Ser Met Ser

290 295 300

Ile Gly Glu Arg Lys Asp Leu Glu Lys His Leu Asp Trp Leu Gly Ile

305 310 315 320

Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Val Glu Arg Tyr Gly Asn Ala Trp Arg

325 330 335

Val Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Ala Cys Ile Pro Gly Gly Thr Ser Leu

340 345 350

Ala Gly Arg Pro Cys Asn Asp Ala Gly Trp Glu Thr Tyr Pro Glu Gly

355 360 365

Leu Tyr Ile Met Leu Lys Arg Cys Trp Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Ile

370 375 380

Ile Val Thr Glu Asn Gly Thr Ala Asp Ala Ile Asp Arg Leu Arg Pro

385 390 395 400

Arg Tyr Leu Ala Thr His Leu Tyr Gln Val Trp Lys Ala Leu Ser Glu

405 410 415

Gly Val Asp Ile Arg Gly Tyr Leu His Trp Ala Leu Val Asp Asn Tyr

420 425 430

Glu Trp Ser Ser Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val His Val Asp

435 440 445

Phe Glu Thr Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Leu Phe Arg

450 455 460

Glu Ile Ala Ser Ser Lys Glu Ile Pro Asp Glu Phe Met His Met Thr

465 470 475 480

Gln Pro Gln Ile Leu Ile

485

<210> 2

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggcttaa aatatccgaa agaatttatt tttggctttt cagaatcagg ttttcagttt 60

gaaatgggtc tgccgggtag cgaagatccg aataccgatt ggtgggtgtg ggttcatgat 120

ccggaaaata ttgcaagtac cttagtgagc ggcgattttc cggaaaatgg tcccggctat 180

tggcatctgt atcgtcagga tcatgatatt gcagaacgct taggtatgga tggtgcacgc 240

attggcattg aatggtcgcg catttttagc aaaccgacct ttgatgttaa agtggatgtt 300

gcacgcgatg aacgcggtaa tattgtgtat attgatgttg cagaaaaagc cttagaagaa 360

ctggatcgca ttgccaataa agatgcagtt aatcattatc gcgaaattct gagcgattgg 420

aaaaatcgcg gcaaaaaact gattattaat ctgtatcatt ggaccctgcc gctgtggtta 480

catgatccga ttaaagtgcg taaactgggc attgatcgcg ccccggcagg ctgggttgat 540

gaacgtaccg tgattgaatt tgttaaatat gttgcctata ttgcctggaa actgggcgat 600

ctgccggatc tgtggtgtac catgaatgaa ccgaatgttg tgtatagcat tggttatatt 660

aatattaaaa ttggctatcc gccgggttat ctgagctttg aagcagccag caaagctatg 720

aagcacttag tggaagccca tgcgagagcc tatgaagtgc tgaaacgttt tacaaacaag 780

cctgtgggca ttatttatgt gaccacctat catgaaccgt taaaagaatc agatcgtgat 840

gtggccgaag ccgccatgta tcaggccgtg tttgattttc tggatagcat taccattggt 900

cgttcaatgt caattggcga acgcaaagat ttagaaaaac atttagattg gttaggcatt 960

aattattata gtcgcttagt tgtggaacgt tatggtaatg cctggcgcgt gctgccgggc 1020

tatggctttg cctgtattcc gggcggtacc tctttagcag gtcgtccgtg taatgatgca 1080

ggctgggaaa cctatccgga aggcctgtat attatgctga aacgttgttg ggaacgctat 1140

cgcttaccga ttattgtgac cgaaaatggc accgcagatg caattgatcg tctgcgcccg 1200

cgctatctgg ccacccatct gtatcaggtg tggaaagcac tgagcgaagg cgttgatatt 1260

cgcggctatt tacattgggc cttagtggat aattatgaat ggagtagcgg ctttcgtatg 1320

cgctttggtt tagttcatgt ggattttgaa accaaaaaac gctatctgcg tccgagcgcc 1380

ctgctgtttc gtgaaattgc ctctagtaaa gaaattccgg atgaatttat gcacatgacc 1440

cagccgcaga ttctgattta a 1461

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccatatggg cttaaaatat ccgaaagaa 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccctcgaga atcagaatct gcggctggg 29

Claims

1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。

3.如权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种携带如权利要求2或3所述的基因的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的制作方法如下：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的编码基因和pET-20b质粒分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒。

6.一种表达如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤如下：将权利要求5所述的重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)，不加IPTG于37℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得。

7.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在转化黄酮糖苷类化合物和皂苷用于制备稀有苷元及单糖苷化合物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的转化条件为pH 4-8，温度30-95℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的转化条件为pH 6.5，温度95℃。