CN110846305B - 一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷a生成莱鲍迪苷m的方法 - Google Patents

一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷a生成莱鲍迪苷m的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法,步骤：(1)将糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2交联在活化后的壳聚糖小球上，获得固定化糖基转移酶；(2)向容器中加入莱鲍迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，加入所述固定化糖基转移酶催化，得到莱鲍迪苷M；本发明固定化糖基转移酶易分离、可反复利用、热稳定性高、操作稳定性高，与游离酶相比，本发明的固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A直接生成莱鲍迪苷M收率较高；游离酶只能使用1次，而固定化糖基转移酶可重复使用，重复使用10次后，仍然保持第一次使用的50％以上的活性。本发明方法简单，易于实现。减少工艺流程，降低成本，提高生产效率。

Description

一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法。
背景技术
甜菊糖苷是一种从菊科草本植物甜菊叶中精提的新型天然低热量甜味剂甜菊糖苷类化合物,因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点，被美国食品药品监督管理局认证为安全，可应用于食品行业。莱鲍迪苷M,是一种新发现的糖苷,与其它糖苷相比,其甜度高,约为蔗糖的400倍,且甜味纯正,口感也更接近蔗糖,甘苦味和甘草异味低,稳定性好,是一种理想的天然甜味剂产品。2013年,美国FDA批准使用从甜叶菊叶子中提取的含有50％含量莱鲍迪苷M的甜菊糖产品,并承认它的一般安全性(GRAS)。2014年,美国通过从甜叶菊叶子中提取的含有95％含量的GRAS认可,批准在除婴幼儿食品以外的饮料和食品中使用。2015年,澳大利亚新西兰食品标准局批准莱鲍迪苷M作为甜味剂用于食品。
甜叶菊叶子中莱鲍迪苷M的含量极少,且只在甜菊Morita植株中检测的到。采用植物叶提取法生产需要大量的甜叶菊原料,另外富集的工艺繁琐,提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶,并在生产过程中产生大量的废水,其生产成本较高,不适合工业化大生产。以莱鲍迪苷D为底物，通过微生物产酶催化法可获得莱鲍迪苷M，该方法较传统的提取法，不仅改善了生产流程，并且降低了对环境的污染，提高了目的产物莱鲍迪苷M的产率。但目前以生物酶催化法主要存在以下几个问题：(1)以生物酶催化莱鲍迪苷D生产莱鲍迪苷M的成本较高，并且酶产率有待进一步优化；(2)用于催化的糖基转移酶不易与产物分离并回收利用，且易失活；(3)天然植物中莱鲍迪苷A含量很高，而莱鲍迪苷M含量非常低，以低成本由莱鲍迪苷A直接转化为莱鲍迪苷D也是亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：
(1)将糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2交联在活化后的壳聚糖小球上，获得固定化糖基转移酶；
(2)向容器中加入莱鲍迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，加入所述固定化糖基转移酶催化，得到莱鲍迪苷M；
所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述糖基转移酶UGT2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤(1)优选为：按1g:10-20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.025-0.1mg/mL的糖基转移酶UGT1水溶液混匀，在15-20℃条件下交联8-20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT1；按1g:10-20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.025-0.1mg/mL的糖基转移酶UGT2水溶液混匀，在15-20℃条件下交联8-20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT2；将所述固定化糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2混合，获得固定化糖基转移酶。
固定化糖基转移酶UGT1中的糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2中的糖基转移酶UGT2的质量比为1：1-12。
步骤(1)优选为：按1g:10-20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.025-0.1mg/mL的糖基转移酶的混合物水溶液混匀，在15-20℃条件下交联8-20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶；所述糖基转移酶的混合物由质量比为1：1-12的糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2组成。
活化后的壳聚糖小球用下述方法制成：
(1)用体积浓度1％-3％的醋酸水溶液溶解壳聚糖粉末，加热至40-60℃，超声至溶液均一透明，得到20-60g/L的壳聚糖溶液；
(2)将所述壳聚糖溶液滴入浓度为3-6mM NaOH水溶液中，静置，洗涤，得到直径为0.1-3.5mm的壳聚糖小球；
(3)按1g:20-40mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度为0.01％-0.5％的戊二醛水溶液混合，交联活化，得到活化后的壳聚糖小球。
步骤(2)优选为：
向容器中加入终浓度为0.4-20mM的莱鲍迪苷A中，加入相当于莱鲍迪苷A摩尔的3-4倍的尿苷二磷酸葡萄糖，再加入终浓度为200-300g/L所述固定化糖基转移酶，溶剂为水，在25-37℃催化反应20-72小时，得到莱鲍迪苷M。
本发明的优点：
本发明以活化后的壳聚糖小球作为载体，固定糖基转移酶，获得的固定化糖基转移酶具有易分离、可反复回收利用、热稳定性高、操作稳定性高等优点，并且壳聚糖作为载体稳定无毒且安全；与游离酶相比，本发明的固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A直接生成莱鲍迪苷M收率较高；游离酶只能使用1次，而固定化糖基转移酶可重复使用，在重复使用10次后，仍然保持第一次使用的50％以上的活性。本发明制备方法简单，易于实现。本发明固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A直接生成莱鲍迪苷M，减少工艺流程，降低成本，提高生产效率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
本实验中涉及的UGT2基因的来源是甜叶菊，UGT1基因的来源是水稻。序列识别号如表1所示。
表1序列识别号
名称 序列识别号 说明
糖基转移酶基因UGT2 SEQ ID NO.1 核酸
糖基转移酶UGT2 SEQ ID NO.2 氨基酸
糖基转移酶基因UGT1 SEQ ID NO.3 核酸
糖基转移酶UGT1 SEQ ID NO.4 氨基酸
一、含目的基因的工程菌的制备
利用质粒pET-28a(+)构建重组质粒pET-28a(+)-UGT2；以pET-28a(+)为载体，UGT2基因碱基序列(如SEQ ID NO.1所示)为目的片段，经过优化酶切、回收纯化和连接，构建表达质粒，将连接反应产物转化E.coli BL21，得到表达糖基转移酶UGT2的工程菌E.coliBL21-pET-28a(+)-UGT2。
利用质粒pET-28a(+)构建重组质粒pET-28a(+)-UGT1；以pET-28a(+)为载体，UGT1基因碱基序列(如SEQ ID NO.3所示)为目的片段，经过优化酶切、回收纯化和连接，构建表达质粒，将连接反应产物转化E.coli BL21，得到表达糖基转移酶UGT1的工程菌E.coliBL21-pET-28a(+)-UGT1。
质粒pET-28a(+)-UGT1和pET-28a(+)-UGT2由金斯瑞生物科技构建合成。
E.coli BL21细胞购买于金斯瑞生物科技。
二、糖基转移酶的分离与纯化
将工程菌E.coli BL21-pET-28a(+)-UGT2和工程菌E.coli BL21-pET-28a(+)-UGT1分别接种至含1mM Kanamycin Monosulfate的5ml LB培养基中，
在37℃、150rpm过夜培养，以2％的接种量接种到含有1mM KanamycinMonosulfate的LB培养基中，
在37℃、150rpm培养3h左右，
OD600达到0.6时，加入IPTG使终浓度为0.5mmol/L，在18℃、150rpm摇床中诱导培养过夜。
诱导培养结束后，在4℃、4000g的条件下离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀，菌体用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤两次；除尽培养基后，用原发酵液体积1/10的pH 7.4的PBS缓冲液重悬细胞，在冰浴中超声破胞30分钟，超声条件为150W下工作5s再间隙8s，在4℃、12000g的条件下，将破胞液离心30min，收集上清液，即得到含有糖基转移酶UGT2的粗酶液和含有糖基转移酶UGT1的粗酶液。
采用Ni-NTA亲和层析，对所得的粗酶液进行分离纯化，经上样、清洗(用清洗缓冲液)和洗脱(用洗脱缓冲液)，收集洗脱液，超滤然后脱盐除去咪唑后获得糖基转移酶UGT2和UGT1纯酶液，UGT2氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，UGT1氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，留待固定化用；
所用缓冲液的配制如下：
PBS缓冲液：
磷酸二氢钾2mmol/L；磷酸氢二钠10mmol/L；KCl 2.7mmol/L；NaCl 137mmol/L；
HCl调节pH 7.4；
清洗缓冲液：
Tris-HCl pH 7.8 20mmol/L；NaCl 300mmol/L；咪唑20mmol/L；
洗脱缓冲液：
Tris-HCl pH 7.8 20mmol/L；NaCl 300mmol/L；咪唑300mmol/L；
实施例2
活化后的壳聚糖小球用下述方法制成：
(1)用体积浓度2％的醋酸水溶液溶解壳聚糖粉末，加热至50℃，超声至溶液均一透明，得到40g/L的壳聚糖溶液；
(2)将所述壳聚糖溶液滴入浓度为4mM NaOH水溶液中，静置，洗涤，得到直径为0.1-3.5mm的壳聚糖小球；
(3)按1g:30mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度为0.1％的戊二醛水溶液混合，交联活化，得到活化后的壳聚糖小球。
实施例3
活化后的壳聚糖小球用下述方法制成：
(1)用体积浓度1％的醋酸水溶液溶解壳聚糖粉末，加热至40℃，超声至溶液均一透明，得到20g/L的壳聚糖溶液；
(2)将所述壳聚糖溶液滴入浓度为3mM NaOH水溶液中，静置，洗涤，得到直径为0.1-3.5mm的壳聚糖小球；
(3)按1g:20mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度为0.01％的戊二醛水溶液混合，交联活化，得到活化后的壳聚糖小球。
实施例4
活化后的壳聚糖小球用下述方法制成：
(1)用体积浓度3％的醋酸水溶液溶解壳聚糖粉末，加热至60℃，超声至溶液均一透明，得到60g/L的壳聚糖溶液；
(2)将所述壳聚糖溶液滴入浓度为6mM NaOH水溶液中，静置，洗涤，得到直径为0.1-3.5mm的壳聚糖小球；
(3)按1g:40mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度为0.5％的戊二醛水溶液混合，交联活化，得到活化后的壳聚糖小球。
实施例5
一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：
(1)按1g:15mL的比例，将活化后的壳聚糖小球(实施例2制备)与浓度为0.05mg/mL的糖基转移酶UGT1水溶液混匀，在18℃条件下交联15h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT1；按1g:15mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.05mg/mL的糖基转移酶UGT2水溶液混匀，在18℃条件下交联16h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT2；将所述固定化糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2混合，获得固定化糖基转移酶。
固定化糖基转移酶UGT1中的糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2中的糖基转移酶UGT2的质量比为1：6。
(2)向容器中加入终浓度为1mM的莱鲍迪苷A中，加入相当于莱鲍迪苷A摩尔的3.5倍的尿苷二磷酸葡萄糖，再加入终浓度为250g/L所述固定化糖基转移酶，溶剂为水，在30℃催化反应30小时，得到莱鲍迪苷M。
以实际催化获得的莱鲍迪苷M产量除以理论完全转化获得莱鲍迪苷M的量为莱鲍迪苷M的收率。通过该方法第一次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率26.0％，重复使用十次，第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率依然为12.5％。
实施例6
一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：
(1)按1g:10mL的比例，将活化后的壳聚糖小球(实施例3制备)与浓度为0.025mg/mL的糖基转移酶UGT1水溶液混匀，在15℃条件下交联8h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT1；按1g:10mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.025mg/mL的糖基转移酶UGT2水溶液混匀，在15℃条件下交联8h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT2；将所述固定化糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2混合，获得固定化糖基转移酶。
固定化糖基转移酶UGT1中的糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2中的糖基转移酶UGT2的质量比为1：1。
(2)向容器中加入终浓度为0.4mM的莱鲍迪苷A中，加入相当于莱鲍迪苷A摩尔的3倍的尿苷二磷酸葡萄糖，再加入终浓度为200g/L所述固定化糖基转移酶，溶剂为水，在25℃催化反应20小时，得到莱鲍迪苷M。
检测方法同实施例5，通过该方法第一次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率23.9％，重复使用十次，第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率依然10.8％。
实施例7
一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：
(1)按1g:20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球(实施例4制备)与浓度为0.1mg/mL的糖基转移酶UGT1水溶液混匀，在20℃条件下交联20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT1；按1g:20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.1mg/mL的糖基转移酶UGT2水溶液混匀，在20℃条件下交联20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT2；将所述固定化糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2混合，获得固定化糖基转移酶。
固定化糖基转移酶UGT1中的糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2中的糖基转移酶UGT2的质量比为1：12。
(2)向容器中加入终浓度为20mM的莱鲍迪苷A中，加入相当于莱鲍迪苷A摩尔的4倍的尿苷二磷酸葡萄糖，再加入终浓度为300g/L所述固定化糖基转移酶，溶剂为水，在37℃催化反应72小时，得到莱鲍迪苷M。
检测方法同实施例5，通过该方法第一次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率30.1％，
重复使用十次，第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率15.4％。
实施例8
一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：
(1)按1g:15mL的比例，将活化后的壳聚糖小球(实施例2制备)与浓度为0.05mg/mL的糖基转移酶的混合物水溶液混匀，在18℃条件下交联15h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶；所述糖基转移酶的混合物由质量比为1：6的糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2组成。
(2)向容器中加入终浓度为1mM的莱鲍迪苷A中，加入相当于莱鲍迪苷A摩尔的3.5倍的尿苷二磷酸葡萄糖，再加入终浓度为250g/L所述固定化糖基转移酶，溶剂为水，在30℃催化反应30小时，得到莱鲍迪苷M。
检测方法同实施例5，通过该方法第一次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率40.0％，重复使用十次，第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率20.3％。
实施例9
一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：
(1)按1g:10mL的比例，将活化后的壳聚糖小球(实施例3制备)与浓度为0.025mg/mL的糖基转移酶的混合物水溶液混匀，在15℃条件下交联8h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶；所述糖基转移酶的混合物由质量比为1：1的糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2组成。
(2)向容器中加入终浓度为0.4mM的莱鲍迪苷A中，加入相当于莱鲍迪苷A摩尔的3倍的尿苷二磷酸葡萄糖，再加入终浓度为200g/L所述固定化糖基转移酶，溶剂为水，在25℃催化反应20小时，得到莱鲍迪苷M。
检测方法同实施例5，通过该方法第一次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率33.5％，重复使用十次，第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率16.6％。
实施例10
一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：
(1)按1g:20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球(实施例4制备)与浓度为0.1mg/mL的糖基转移酶的混合物水溶液混匀，在20℃条件下交联20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶；所述糖基转移酶的混合物由质量比为1：12的糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2组成。
(2)向容器中加入终浓度为20mM的莱鲍迪苷A中，加入相当于莱鲍迪苷A摩尔的4倍的尿苷二磷酸葡萄糖，再加入终浓度为300g/L所述固定化糖基转移酶，溶剂为水，在37℃催化反应72小时，得到莱鲍迪苷M。
检测方法同实施例5，通过该方法第一次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率43.2％，重复使用十次，第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷M的收率依然22.1％。
序列表
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天津大学
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cagccgctga acgcgcgtta catgagcgat gttctgaaag tgggcgttta tctggagaac 1200
ggctgggagc gtggtgaaat cgcgaacgcg attcgtcgtg tgatggttga cgaggaaggt 1260
gagtacatcc gtcagaacgc gcgtgtgctg aagcaaaaag cggatgttag cctgatgaaa 1320
ggtggcagca gctacgagag cctggaaagc ctggttagct atattagcag cctgtaa 1377
<210> 2
<211> 458
<212> PRT
<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni Hemsl)
<400> 2
Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile
1 5 10 15
Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu
20 25 30
Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr
35 40 45
Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg
50 55 60
Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro
65 70 75 80
Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His
85 90 95
Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser
100 105 110
Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr
115 120 125
Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu
130 135 140
Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln
145 150 155 160
Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu
165 170 175
Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser
180 185 190
Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile
195 200 205
Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu
210 215 220
Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser
245 250 255
Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro
260 265 270
Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp
275 280 285
Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln
290 295 300
Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp
305 310 315 320
Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val
325 330 335
Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala
340 345 350
Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu
355 360 365
Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn
370 375 380
Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn
385 390 395 400
Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val
405 410 415
Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln
420 425 430
Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu
435 440 445
Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu
450 455
<210> 3
<211> 1386
<212> DNA
<213> 日本水稻(Oryza sativa Japonica)
<400> 3
atggacagcg gttacagcag cagctacgcg gcggcggcgg gtatgcacgt ggttatctgc 60
ccgtggctgg cgtttggtca cctgctgccg tgcctggatc tggcgcagcg tctggcgagc 120
cgtggccacc gtgttagctt cgtgagcacc ccgcgtaaca ttagccgtct gccgccggtt 180
cgtccggcgc tggcgccgct ggttgcgttc gtggcgctgc cgctgccgcg tgtggagggt 240
ctgccggatg gtgcggaaag caccaacgat gttccgcacg accgtccgga tatggtggag 300
ctgcatcgtc gtgcgtttga tggtctggcg gcgccgttca gcgaatttct gggtaccgcg 360
tgcgcggact gggtgatcgt tgatgtgttt catcactggg ctgcggcggc ggcgctggag 420
cacaaggttc cgtgcgcgat gatgctgctg ggtagcgcgc acatgatcgc gagcattgcg 480
gatcgtcgtc tggaacgtgc ggaaaccgag agcccggcgg cggcgggtca aggtcgtccg 540
gctgcggcgc cgacctttga ggtggcgcgt atgaagctga tccgtaccaa aggtagcagc 600
ggcatgagcc tggcggaacg tttcagcctg accctgagcc gtagcagcct ggtggttggt 660
cgtagctgcg ttgaatttga gccggaaacc gtgccgctgc tgagcaccct gcgtggcaag 720
ccgattacct tcctgggtct gatgccgccg ctgcatgagg gtcgtcgtga ggacggcgaa 780
gatgcgaccg ttcgttggct ggatgcgcag ccggcgaaga gcgtggttta tgttgcgctg 840
ggtagcgagg tgccgctggg cgttgagaaa gtgcacgaac tggcgctggg tctggaactg 900
gcgggtaccc gttttctgtg ggcgctgcgt aaaccgaccg gtgtgagcga tgcggatctg 960
ctgccggcgg gtttcgagga acgtacccgt ggtcgtggcg tggttgcgac ccgttgggtt 1020
ccgcaaatga gcattctggc gcatgcggcg gtgggtgcgt ttctgaccca ctgcggctgg 1080
aacagcacca ttgaaggtct gatgttcggc cacccgctga tcatgctgcc gatttttggt 1140
gaccagggcc cgaacgcgcg tctgattgag gcgaagaacg cgggtctgca agttgcgcgt 1200
aacgacggtg atggcagctt tgatcgtgaa ggcgtggctg cggcgatccg tgcggttgcg 1260
gtggaggaag agagcagcaa ggttttccag gcgaaagcga agaaactgca agagattgtg 1320
gcggacatgg cgtgccacga acgttacatc gatggtttca ttcagcaact gcgtagctat 1380
aaagat 1386
<210> 4
<211> 462
<212> PRT
<213> 日本水稻(Oryza sativa Japonica)
<400> 4
Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His
1 5 10 15
Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu
20 25 30
Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val
35 40 45
Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu
50 55 60
Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly
65 70 75 80
Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro
85 90 95
Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp
115 120 125
Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro
130 135 140
Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala
145 150 155 160
Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly
165 170 175
Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys
180 185 190
Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe
195 200 205
Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val
210 215 220
Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys
225 230 235 240
Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg
245 250 255
Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala
260 265 270
Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val
275 280 285
Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg
290 295 300
Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu
305 310 315 320
Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala
325 330 335
Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly
340 345 350
Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met
355 360 365
Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro
370 375 380
Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg
385 390 395 400
Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile
405 410 415
Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys
420 425 430
Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg
435 440 445
Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp
450 455 460

Claims (3)

1.一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）按1g:10-20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.025-0.1mg/mL的糖基转移酶的混合物水溶液混匀，在15-20 ℃条件下交联8-20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶；所述糖基转移酶的混合物由质量比为1：1-12的糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2组成；
（2）向容器中加入莱鲍迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，加入所述固定化糖基转移酶催化，得到莱鲍迪苷M；
所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述糖基转移酶UGT2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征是所述活化后的壳聚糖小球用下述方法制成：
（1）用体积浓度1%-3%的醋酸水溶液溶解壳聚糖粉末，加热至40-60℃，超声至溶液均一透明，得到20-60g/L的壳聚糖溶液；
（2）将所述壳聚糖溶液滴入浓度为3-6mM NaOH水溶液中，静置，洗涤，得到直径为0.1-3.5mm的壳聚糖小球；
（3）按1g:20-40mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度为0.01%-0.5%的戊二醛水溶液混合，交联活化，得到活化后的壳聚糖小球。
3.根据权利要求1所述方法，其特征是步骤（2）为：
向容器中加入终浓度为0.4-20mM的莱鲍迪苷A，加入相当于莱鲍迪苷A摩尔的3-4倍的尿苷二磷酸葡萄糖，再加入终浓度为200-300g/L所述固定化糖基转移酶，溶剂为水，在25-37℃催化反应20-72小时，得到莱鲍迪苷M。
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