CN115449514A

CN115449514A - 一种β-1,2-糖基转移酶及其应用

Info

Publication number: CN115449514A
Application number: CN202110637483.6A
Authority: CN
Inventors: 吴燕; 田振华; 王舒; 郑孝富
Original assignee: Ecolab Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Yikelai Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2041-06-08
Also published as: CN115449514B; WO2022257983A1

Abstract

本发明公开了一种β‑1,2‑糖基转移酶，其氨基酸序列与SEQIDNO:2相比包含选自以下一个或多个的残基位置处的氨基酸残基差异：(1)第96位氨基酸残基为A、C、G或N；(2)第181位氨基酸残基为L；(3)第185位氨基酸残基为L；(4)第188位氨基酸残基为A、F、M、T或I；(5)第196位氨基酸残基为V；(6)第201位氨基酸残基为P；(7)第324位氨基酸残基为K。本发明还公开了编码所述β‑1,2‑糖基转移酶的核酸，包含其的重组表达载体、转化体和组合物，制备其的方法，莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的制备方法及所述β‑1,2‑糖基转移酶的用途。本发明的β‑1,2‑糖基转移酶的酶活更高、稳定性更好，可应用于工业化大生产。

Description

一种β-1,2-糖基转移酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种β-1,2-糖基转移酶及其应用。

背景技术

甜菊糖苷(Steviol glycosides，又称甜菊醇糖苷)是从菊科草本植物甜叶菊叶中提取的天然甜味剂，是多种糖苷的混和物，不同甜菊糖苷在味质上存在较大的差异。甜菊糖苷具有纯天然(来自纯天然植物甜叶菊)、高甜度(蔗糖的250～450倍)、低热量(仅为白糖的1/300)、使用成本低(成本仅为蔗糖的三分之一)、稳定性好(耐热、耐酸、耐碱，不易出现分解现象)、安全性高(无毒副作用)等优点，以及抗高血糖、抗高血压、抗炎症、抗肿瘤、抗腹泻等潜在疗效。

甜菊糖苷(甜菊糖苷类化合物)的结构式如下：

上述甜菊糖苷，具有共同的糖苷配基：甜菊醇(Steviol)，区别在于C- 13和C-19位置连接的糖基的数量和类型，主要包括甜菊苷(Stevioside)、莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，Reb A)、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，Reb D)、莱鲍迪苷E、杜克苷、甜菊双糖苷等八种糖苷。甜菊的叶子能够累积多达10-20％(基于干重)甜菊醇糖苷。甜菊叶子中发现的主要糖苷是莱鲍迪苷A(2-10％)、甜菊苷(2-10％)和莱鲍迪苷C (1-2％)。其他糖苷，如莱鲍迪苷B、D、E和F，甜菊双糖苷和甜茶苷，以低得多的水平被发现(大约0-0.2％)。

虽然甜菊糖苷是一种高倍甜味剂，但存在后苦涩味这一缺点，严重限制了其在食品、饮料等对口感要求较高的领域中的应用。而引起甜菊糖苷后苦涩味的本质原因是其内在分子结构引起的，甜菊糖苷中的R₁和R₂基团上连接糖基数量越多口感越好。通常，发现甜菊苷比蔗糖甜110-270倍，莱鲍迪苷A为150至320倍，然而，即使在高度纯化的状态下，甜菊醇糖苷A仍然具有不合需要的味道属性，如苦味、甜的余味、甘草味等。

莱鲍迪苷D是其中最有应用潜力的甜菊糖苷，与其它甜菊糖苷相比，其甜度高，约为蔗糖的300-350倍，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，没有苦味和甘草异味，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。甜叶菊叶子中莱鲍迪苷D的含量极少(少于5％)，采用提取法生产莱鲍迪苷D需要大量的甜叶菊原料，另外富集莱鲍迪苷D的工艺繁琐，提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶，并在生产过程中产生大量的废水，其生产成本较高，不适合工业化大生产。

目前生物酶法合成莱鲍迪苷D的方法需要外加昂贵的UDP-葡萄糖为底物，通过UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，简称UGT)的作用，以甜菊苷或莱鲍迪苷A为底物，催化生成莱鲍迪苷D。但由于UDP-葡萄糖极高的售价，几乎完全限制了工业化制备莱鲍迪苷D的可行性，成本较高、缺乏市场竞争力。

莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，Reb M)具有更好的口感特性，但其占叶子干重的含量小于0.1％，导致分离成本高、价格昂贵。生物催化法获得高浓度的莱鲍迪苷M已引起了学者的关注。目前报道，来源甜叶菊的重组酶能催化莱鲍迪苷D生成莱鲍迪苷M，但产量较低。以莱鲍迪苷D为底物，通过微生物产酶催化法可获得莱鲍迪苷M，该方法较传统的提取法，不仅改善了生产流程，并且降低了对环境的污染，提高了目的产物莱鲍迪苷M的产率。但目前以生物酶催化法主要存在以下几个问题：(1)以生物酶催化莱鲍迪苷D生产莱鲍迪苷M的成本较高，并且酶产率有待进一步优化；(2) 用于催化的糖基转移酶不易与产物分离并回收利用，且易失活；(3)天然植物中莱鲍迪苷A含量很高，而莱鲍迪苷D含量非常低，以低成本由莱鲍迪苷A直接转化为莱鲍迪苷D也是亟待解决的难题。

葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶，该酶的作用机理是催化糖基供体的葡萄糖残基转移到糖基受体分子上，从而调节受体分子的活性。UDP-葡萄糖基转移酶是葡萄糖基转移酶中的一种，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，几乎存在于所有有机体中。

UDP-葡萄糖是二磷酸尿苷葡糖(uridine diphosphate glucose)的简称，又简称为UDP-葡糖或者UDPG，是由尿苷二磷酸和葡萄糖组成的维生素，可看作“活性葡萄糖”，广泛分布于植物、动物和微生物的细胞内，在蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖合成中作葡萄糖基的供体，是最常见的一种糖基供体。

如今，随着天然甜味剂甜菊糖的广泛应用，以及生物催化技术的日益发展，UDP-葡萄糖基转移酶被越来越多地应用在甜菊糖苷的生物催化制备的领域中来。UDP-葡萄糖基转移酶的种类很多，其包括β-1,2-糖基转移酶和β- 1,3-糖基转移酶，目前甜菊糖苷的生物酶法制备领域中使用的酶往往存在酶活低、稳定性差等缺点，从而导致应用于工业化大生产制备甜菊糖苷的成本较高。因此，有必要对UDP-葡萄糖基转移酶进行改造，从而获得酶活更高、稳定性更好的改造酶，以便更好地服务于工业化大生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有的β-1,2-糖基转移酶被应用于甜菊醇糖苷的生物催化制备时酶活低、稳定性差，因而用于催化甜菊醇糖苷时转化率不高等缺陷，因此本发明提供一种β-1,2-糖基转移酶以及其在制备甜菊醇糖苷类化合物中的应用。本发明的β-1,2-糖基转移酶的酶活高、稳定性好；将其用于制备甜菊醇糖苷类化合物(例如莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M)时与β-1,2-糖基转移酶亲本(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)相比，在催化活性方面有了明显的提高，转化率显著提升，从而降低了反应的成本，利于工业化生产。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第一方面为：提供一种β-1,2- 糖基转移酶，其中，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比包含选自以下一个或多个的残基位置处的氨基酸残基差异：

第96位氨基酸残基为A、C、G或N；

第181位氨基酸残基为L；

第185位氨基酸残基为L；

第188位氨基酸残基为A、F、M、T或I；

第196位氨基酸残基为V；

第201位氨基酸残基为P；

第324位氨基酸残基为K。

在一些较佳的具体实施例中，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸残基差异为：

第96位氨基酸残基为A、C、G或N；或，

第181位氨基酸残基为L；或，

第185位氨基酸残基为L；或，

第188位氨基酸残基为A、F、M、T或I；或，

第196位氨基酸残基为V；或，

第201位氨基酸残基为P；或

第324位氨基酸残基为K。

换言之，所述β-1,2-糖基转移酶与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，具有K96A、K96C、K96G、K96N，或M181L，或F185L，或E188A、 E188F、E188M、E188T、E188I，或A196V，或G201P，或H324K改变。本发明中，所述改变不一定需要在SEQ ID NO:2的基础上进行突变，只要β- 1,2-糖基转移酶最终实现与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，具有 K96A、K96C、K96G、K96N，或M181L，或F185L，或E188A、E188F、 E188M、E188T、E188I，或A196V，或G201P，或H324K的氨基酸差异，则同样落入本发明保护的范围。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第二方面为：提供一种分离的核酸，其中，所述核酸编码如本发明技术方案的第一方面所述的β-1,2-糖基转移酶。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第三方面为：提供一种重组表达载体，其包含如本发明技术方案的第二方面所述的分离的核酸。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第四方面为：提供一种转化体，其包含如本发明技术方案的第二方面所述的分离的核酸或如本发明技术方案的第三方面所述的重组表达载体。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第五方面为：提供一种制备如本发明技术方案的第一方面所述的β-1,2-糖基转移酶的方法，其中，所述方法包括在适于表达所述β-1,2-糖基转移酶的条件下培养如本发明技术方案的第四方面所述的转化体。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第六方面为：提供一种组合物，其包含如本发明技术方案的第一方面所述的β-1,2-糖基转移酶。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第七方面为：提供一种用于底物的糖基化的方法，所述方法包括提供至少一种底物、如本发明技术方案的第一方面所述的β-1,2-糖基转移酶，并在使得所述底物被糖基化以产生至少一种糖基化产物的条件下使所述底物与所述β-1,2-糖基转移酶接触。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第八方面为：提供一种莱鲍迪苷D的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：在如本发明技术方案的第一方面所述的β-1,2-糖基转移酶的存在下，将莱鲍迪苷A和糖基供体进行反应，即得莱鲍迪苷D。

较佳地，所述β-1,2-糖基转移酶为粗酶液，粗酶液所用菌体与底物莱鲍迪苷A的质量比为1:10～2:1；

和/或，所述莱鲍迪苷A的终浓度为1-150g/L，优选50g/L；

和/或，所述糖基供体为UDP-葡萄糖；优选通过蔗糖和UDP在蔗糖合成酶的存在下制得，所述蔗糖的浓度为100-300g/L例如200g/L，所述UDP 的浓度为0.05-0.2g/L例如0.1g/L，所述蔗糖合成酶为粗酶液，粗酶液所用菌体与底物莱鲍迪苷A的质量比为1:20～1:2；

和/或，所述反应在50mM磷酸缓冲液中进行，pH为5-8，优选6；

和/或，所述反应时的转速为500-1000rpm，优选600rpm；

和/或，所述反应的温度为20-90℃，优选60℃；

和/或，所述反应的时间为10～120min，优选30min。

更佳地，所述β-1,2-糖基转移酶或所述蔗糖合成酶的粗酶液的制备包括以下步骤：

将含有β-1,2-糖基转移酶或所述蔗糖合成酶基因的工程菌在液体培养基例如LB中37℃培养至OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的 IPTG，20～30℃诱导培养16～24h后，将培养液8000～14000rpm离心5～30min 收集菌体；

将表达β-1,2-糖基转移酶或所述蔗糖合成酶的菌体与磷酸缓冲液按1:10 M/V进行悬浮后，550～600Mbar高压均质1～5min，经8000～14000rpm离心， 2～30min即得；所述磷酸缓冲液例如为50mM的磷酸缓冲液，pH6.0。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第九方面为：提供一种莱鲍迪苷M的制备方法，其包括根据如本发明技术方案的第八方面所述的制备方法制备莱鲍迪苷D的步骤。较佳地，所述制备方法还使用了β-1,3-糖基转移酶。更佳地，所述制备方法采用一锅法。

在一优选的实施例中，使用的β-1,2-糖基转移酶、β-1,3-糖基转移酶和蔗糖合成酶为粗酶液，粗酶液所用菌体与底物Reb A 60的质量比分别为1:5～2:1、 1:5～2:1、1:20～1:2；

和/或，底物Reb A 60的终浓度为1-50g/L，优选10g/L。

更优选地，所述β-1,3-糖基转移酶的粗酶液的制备包括以下步骤：

将含有β-1,3-糖基转移酶基因的工程菌在液体培养基例如LB中37℃培养至OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，20～30℃诱导培养16～24h后，将液体培养基8000～14000rpm离心5～30min收集菌体；

将所述菌体与磷酸缓冲液按1:10M/V进行悬浮后，550～600Mbar高压均质1～5min，经8000～14000rpm离心2～30min即得；所述磷酸缓冲液例如为50mM的磷酸缓冲液，pH6.0。

为解决上述技术问题，本发明技术方案的第十方面为：提供一种如本发明技术方案的第一方面所述的β-1,2-糖基转移酶在制备甜菊醇糖苷中的用途；所述甜菊醇糖苷优选为莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

提供了一种β-1,2-糖基转移酶，其可将莱鲍迪苷A直接转化为莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M。与UDP-葡萄糖基转移酶亲本相比，其酶活更高、稳定性更好，可应用于工业化大生产。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施方式的由甜菊醇糖苷制备莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M的路线示意图。

图2为底物莱鲍迪苷A对照品的图谱，保留时间14.186min。

图3为产物莱鲍迪苷D对照品的图谱，保留时间11.821min。

图4为产物莱鲍迪苷M对照品的图谱，保留时间12.316min。

图5显示了表5中初筛Enz.6催化合成RD活性的HPLC图。

图6显示了表6中复筛Enz.9催化合成RD活性的HPLC图。

图7显示了表7中Enz.6催化合成RM活性的HPLC图。

图8显示了表8中Enz.6过夜催化合成RM活性的HPLC图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。

表1

所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。

表2

KOD Mix酶购自TOYOBO CO.，LTD.；DpnI酶购买自英潍捷基(上海) 贸易有限公司；E.coli Trans10感受态细胞与E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；蔗糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司；RA60(甜菊苷，其中RA含量60％，晨光生物，产品规格TSG90/RA60)。Reb A购自麦克林。Reb D对照品和Reb M对照品购自青岛思远甜菊国际贸易有限公司。

转化率HPLC检测方法：色谱柱：ZORBAX Eclipse plus C18(4.6mm* 150mm，3.5um)。流动相：0.1％TFA水溶液为流动相A，0.1％TFA乙腈溶液为流动相B，按表3进行梯度洗脱。检测波长：210nm；流速：1ml/min；进样体积：20μl；柱温：35℃。如图2所示，Reb A出峰时间：14.816min；如图3所示，Reb D出峰时间：11.821min；如图4所示，Reb M出峰时间：12.316min。

表3

实施例1 GT011突变体文库的构建

全合成SEQ ID NO:1所示的编号为Enz.1的β-1,2-糖基转移酶(β-1,2- GT酶)酶基因，该基因已连接在pET28a质粒载体上，得到重组质粒pET28a- GT011。基因合成公司为生工生物工程(上海)股份有限公司。

以pET28a-GT011质粒为模板，采用表4所示的引物序列，分别以 GT20X-F/Km-R和Km-F/GT20X-R为引物(其中20X为：201、202、203、 204、205、206、207、208、209)，采用KOD酶进行PCR扩增目标DNA片段和载体片段。

表4

PCR扩增反应体系为：

试剂	用量(μL)
		KOD Mix酶	25
引物F	2
		引物R	2
模板	1
		去离子水	20

扩增程序如下：

对PCR产物进行DpnI消化并进行跑胶及胶回收得到目标DNA片段。采用购自诺唯赞的两片段同源重组酶(Exnase CE II)进行重组连接，连接后转化至E.coli Trans 10感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡纳霉素的LB培养基上，于37℃倒置培养过夜；挑取单菌落至LB试管(Km抗性)，培养8～10 h，提取质粒进行测序鉴定，得到含有目标突变体基因的重组质粒。

实施例2β-1,2-糖基转移酶突变体的制备

1.进行突变载体的蛋白表达：

将测序正确的上述突变体基因的重组质粒、pET28a-GT011质粒分别转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有点突变的基因工程菌株。挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养4h。按2v/v％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜TB 液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-thiogalactoside)至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养20h。培养结束后，将培养液4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体。-20℃保存备用。

2.粗酶液的获取：

配制50mM pH6.0的磷酸缓冲液(PBS)，将上述所得菌体按照(M/V) 1:10进行悬浮，之后，进行高压均质(550～600Mbar、1min)后，经12000rpm 下离心2min，取上清获得β-1,2-糖基转移酶突变体的粗酶液。

实施例3蔗糖合成酶SUS的制备

全合成SEQ ID NO:39所示的编号为Enz.2的蔗糖合成酶(SUS)基因，该基因已连接在pET28a质粒载体上得到重组质粒pET28a-SUS。基因合成公司为生工生物工程(上海)股份有限公司。

将质粒pET28a-SUS转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到 Enz.2基因工程菌株。挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养4h。按2v/v％接种量转接至50ml同样含50μg/ml 卡那霉素的新鲜TB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养20h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。-20℃保存备用。

配制50mM pH6.0的磷酸缓冲液(PBS)，将Enz.2菌体按照(M/V)1:10 进行悬浮，之后，进行高压均质(550～600Mbar、1min)后经12000rpm离心2min，取上清获得蔗糖合成酶SUS(酶编号Enz.2,氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示)的粗酶液。

实施例4第一轮突变体的筛选

1.初筛

将实施例2和实施例3中得到的粗酶液分别进行80℃恒温孵育15min，经12000rpm离心2min，取上清即分别获得β-1,2-糖基转移酶突变体反应酶液和蔗糖合成酶反应酶液。

以Reb A(含量96％)为底物，1mL反应体系中，加入β-1,2-糖基转移酶突变体的反应酶液150μL，Reb A终浓度为50g/L，UDP终浓度为0.1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，蔗糖合成酶反应酶液30μL，最后加入50mM pH6.0 磷酸缓冲液至终体积1mL。将配制好的反应体系置于金属浴中，60℃，600 rpm下反应30min，反应液稀释50倍，进行HPLC分析产物Reb D的浓度。本反应中，蔗糖合成酶用于将蔗糖上葡萄糖基转移至UDP上合成UDPG。初筛结果如表5所示。

表5

由表5中的初筛结果可知：在反应初始的30mins内，Enz.4、Enz.5、Enz.6、Enz.8、Enz.9、Enz.11、Enz.13、Enz.14、Enz.15、Enz.16、Enz.17、 Enz.19、Enz.22、Enz.23的催化活性均优于对照Enz.1 10％以上，选择Enz.4、 Enz.5、Enz.6、Enz.9、Enz.11、Enz.13进行复筛。

2.复筛

复筛反应条件和初筛反应条件相同。复筛结果如表6所示。

表6

酶	Enz.1	Enz.4	Enz.5	Enz.6	Enz.9	Enz.11	Enz.13
								RD％	47.98	62.98	61.34	70.74	67.39	65.87	66.14

由表6中的复筛结果说明复筛结果与初筛结果基本相一致，确定Enz.6 最好，Enz.9次之。

实施例5β-1,3-糖基转移酶的制备

根据如核苷酸序列SEQ ID NO:41所示的β-1,3-糖基转移酶(酶编号Enz.26)的基因，全基因合成一套β-1,3-糖基转移酶基因，该基因已连接在 pET28a质粒载体上得到重组质粒pET28a-SUS。基因合成公司：生工生物工程(上海)股份有限公司。

将质粒pET28a-SUS转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有β-1,3-糖基转移酶基因的工程菌株。

将含有β-1,3-糖基转移酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2v/v％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至其终浓度为0.1 mM，24℃诱导培养22h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。

配制50mM pH6.0的磷酸缓冲液(PBS)，将收集的菌体按照(M/V) 1:10进行悬浮，之后，进行高压均质(550～600Mbar、1min)，经12000rpm 离心2min，取上清获得β-1,3-糖基转移酶的粗酶液。

本实施例制备的β-1,3-糖基转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。

实施例6 RM合成反应

将实施例2、实施例3和实施例5中得到的β-1,2-糖基转移酶、蔗糖合成酶和β-1,3-糖基转移酶的粗酶液分别进行80℃恒温孵育15min，经12000 rpm离心2min，取上清即分别获得UDP-葡萄糖基转移酶突变体反应酶液、蔗糖合成酶反应酶液和β-1,3-糖基转移酶的反应酶液。

以Reb A 60(Reb A含量为60％)为底物，1mL反应体系中，加入β- 1,2-糖基转移酶突变体的反应酶液150μL，β-1,3-糖基转移酶的反应酶液120 μL，RA60终浓度为10g/L，UDP终浓度为0.1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，蔗糖合成酶反应酶液30μL，最后加入50mM pH6.0磷酸缓冲液至终体积1 mL。将配制好的反应体系置于金属浴中，60℃，600rpm下反应60min，稀释50倍，进行HPLC分析Reb A、中间产物Reb D和产物Reb M的浓度，反应结果如表7所示(其中RA％、RD％和RM％分别指底物、中间产物和产物在反应后反应液中的含量)。Enz.6、Enz.9催化反应60min取样后继续反应至过夜，稀释50倍，进行HPLC分析Reb A、中间产物Reb D和产物Reb M的浓度，反应结果如表8所示。

表7

表8

	RM％
		Enz.6	91.30％
Enz.9	91.28％

由表7中结果可知，制备RM时，60min反应时间内，Enz.6催化活性最好，Enz.9次之，均优于对照Enz.1 25％以上。由表8中结果可知，Enz.6 和Enz.9进一步过夜反应之后，RM％含量可分别达91.30％和91.28％。图8 显示RA已全部反应完，剩余少量未反应完的RD。

SEQUENCE LISTING

<110> 弈柯莱生物科技（上海）股份有限公司

<120> 一种β-1,2-糖基转移酶及其应用

<130> P21014742C

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-1,2-糖基转移酶亲本基因

<400> 1

atgcaccatc atcatgaagg cgtgagcgac cagaccctga gagtaacgat gtttccgtgg 60

cttgggctgg gtcatgttaa cccgtttttg cgtatcgcta aacaactggc cgatcgtggt 120

ttcgttatct atttagttag taccgctatt aacctcgaaa tgatcaaaaa gagaatcccg 180

gagaaataca gtaatagcat ccatctggtt gagctgcgcc tgccagaatt accggaactg 240

ccaccacatt accatactac caacggttta ccaccgcatc tgaacaaaac cctgcacaag 300

gcactgaaga tgagcgctcc caactttagc aagatccttc aaaatattaa gccggacctg 360

gtcctttacg attttctggt tccgtgggca gaaaaagtcg cgcttgaaca gggcatcccg 420

gctgttccat tgctaaccag tggtgcggca ctgttcagct actttttcaa cttcctgaag 480

cgaccgggtg aagagtttcc gtttgaggca atccgcctgt cgaagcgaga acaggataag 540

atgcgcgaga tgtttggaac agagccgcct gaagaagatt ttttagcgcc ggcccaggcc 600

ggtatcatgc tgatgtgcac gagccgcgta attgaggcta agtacctgga ctattgtacc 660

gaactgacca atgtaaaagt tgttccggtt ggtccgccgt ttcaggatcc gctgaccgaa 720

gatattgacg accccgaact gatggattgg ttagatacca aacccgaaca tagtgttgtc 780

tatgtgtcgt ttggcagcga agcgttcctg agccgtgaag atatggaaga agtcgcgttc 840

ggcctggagc tgagcggcgt gaactttatc tgggttgcac gctttccgaa aggcgaagaa 900

cagcgtctgg aagacgttct gccaaaaggc ttcctggaac gcgttggtga tcgtggtcgc 960

gttctggacc atctggtgcc gcaggcccat attctgaacc atccgagcac gggtggcttc 1020

atctctcatt gcggttggaa cagcgtcatg gaaagcattg atttcggcgt tccgatcatt 1080

gcgatgccga tgcagtggga tcagccgatt aacgcgagac tgcttgtgga attaggcgtg 1140

gcagtggaga tcccgcgtga tgaagatggc cgggtccacc gcgccgaaat tgcccgtgtc 1200

ctgaaagatg tgatttcggg cccgactggt gagatactgc gcgcgaaagt acgcgacatt 1260

agcgcacgcc tgagagcgag acgcgaggag gaaatgaacg cagcggcgga agaactgata 1320

cagctgtgtc gcaaccgcaa cgcctacaag 1350

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-1,2-糖基转移酶亲本蛋白

<400> 2

Met His His His His Glu Gly Val Ser Asp Gln Thr Leu Arg Val Thr

1 5 10 15

Met Phe Pro Trp Leu Gly Leu Gly His Val Asn Pro Phe Leu Arg Ile

20 25 30

Ala Lys Gln Leu Ala Asp Arg Gly Phe Val Ile Tyr Leu Val Ser Thr

35 40 45

Ala Ile Asn Leu Glu Met Ile Lys Lys Arg Ile Pro Glu Lys Tyr Ser

50 55 60

Asn Ser Ile His Leu Val Glu Leu Arg Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu

65 70 75 80

Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Pro His Leu Asn Lys

85 90 95

Thr Leu His Lys Ala Leu Lys Met Ser Ala Pro Asn Phe Ser Lys Ile

100 105 110

Leu Gln Asn Ile Lys Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asp Phe Leu Val Pro

115 120 125

Trp Ala Glu Lys Val Ala Leu Glu Gln Gly Ile Pro Ala Val Pro Leu

130 135 140

Leu Thr Ser Gly Ala Ala Leu Phe Ser Tyr Phe Phe Asn Phe Leu Lys

145 150 155 160

Arg Pro Gly Glu Glu Phe Pro Phe Glu Ala Ile Arg Leu Ser Lys Arg

165 170 175

Glu Gln Asp Lys Met Arg Glu Met Phe Gly Thr Glu Pro Pro Glu Glu

180 185 190

Asp Phe Leu Ala Pro Ala Gln Ala Gly Ile Met Leu Met Cys Thr Ser

195 200 205

Arg Val Ile Glu Ala Lys Tyr Leu Asp Tyr Cys Thr Glu Leu Thr Asn

210 215 220

Val Lys Val Val Pro Val Gly Pro Pro Phe Gln Asp Pro Leu Thr Glu

225 230 235 240

Asp Ile Asp Asp Pro Glu Leu Met Asp Trp Leu Asp Thr Lys Pro Glu

245 250 255

His Ser Val Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser Glu Ala Phe Leu Ser Arg

260 265 270

Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Phe Gly Leu Glu Leu Ser Gly Val Asn

275 280 285

Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro Lys Gly Glu Glu Gln Arg Leu Glu

290 295 300

Asp Val Leu Pro Lys Gly Phe Leu Glu Arg Val Gly Asp Arg Gly Arg

305 310 315 320

Val Leu Asp His Leu Val Pro Gln Ala His Ile Leu Asn His Pro Ser

325 330 335

Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Val Met Glu Ser

340 345 350

Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile Ala Met Pro Met Gln Trp Asp Gln

355 360 365

Pro Ile Asn Ala Arg Leu Leu Val Glu Leu Gly Val Ala Val Glu Ile

370 375 380

Pro Arg Asp Glu Asp Gly Arg Val His Arg Ala Glu Ile Ala Arg Val

385 390 395 400

Leu Lys Asp Val Ile Ser Gly Pro Thr Gly Glu Ile Leu Arg Ala Lys

405 410 415

Val Arg Asp Ile Ser Ala Arg Leu Arg Ala Arg Arg Glu Glu Glu Met

420 425 430

Asn Ala Ala Ala Glu Glu Leu Ile Gln Leu Cys Arg Asn Arg Asn Ala

435 440 445

Tyr Lys

450

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S147F引物GT201-F

<400> 3

cattgctaac ctttggtgcg gcactgttca gc 32

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S147F引物Km-R

<400> 4

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S147F引物Km-F

<400> 5

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S147F引物GT201-R

<400> 6

ccgcaccaaa ggttagcaat ggaacagcc 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F185L引物GT202-F

<400> 7

gcgagatgct tggaacagag ccgcctgaag 30

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F185L引物Km-R

<400> 8

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F185L引物Km-F

<400> 9

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F185L引物GT202-R

<400> 10

ctgttccaag catctcgcgc atcttatcc 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> M181L引物GT203-F

<400> 11

caggataagc tgcgcgagat gtttggaac 29

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> M181L引物Km-R

<400> 12

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> M181L引物Km-F

<400> 13

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> M181L引物GT203-R

<400> 14

ctcgcgcagc ttatcctgtt ctcgcttc 28

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A196V引物GT204-F

<400> 15

gattttttag tgccggccca ggccggtatc 30

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A196V引物Km-R

<400> 16

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A196V引物Km-F

<400> 17

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A196V引物GT204-R

<400> 18

gggccggcac taaaaaatct tcttcagg 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q198F引物GT205-F

<400> 19

agcgccgttc caggccggta tcatgctg 28

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q198F引物Km-R

<400> 20

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q198F引物Km-F

<400> 21

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q198F引物GT205-R

<400> 22

ccggcctgga acggcgctaa aaaatcttct tc 32

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G201P引物GT206-F

<400> 23

gcccaggccc ctatcatgct gatgtgcacg 30

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G201P引物Km-R

<400> 24

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G201P引物Km-F

<400> 25

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G201P引物GT206-R

<400> 26

gcatgatagg ggcctgggcc ggcgctaaa 29

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H324K引物GT207-F

<400> 27

gttctggaca agctggtgcc gcaggcccat a 31

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H324K引物Km-R

<400> 28

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H324K引物Km-F

<400> 29

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H324K引物GT207-R

<400> 30

ggcaccagct tgtccagaac gcgaccacg 29

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 96位饱和突变引物GT208-F

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 31

gcatctgaac nnkaccctgc acaaggcact g 31

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 96位饱和突变引物Km-R

<400> 32

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 96位饱和突变引物Km-F

<400> 33

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 96位饱和突变引物GT208-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 34

cttgtgcagg gtmnngttca gatgcggtgg taaac 35

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 188位饱和突变引物GT209-F

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 35

gtttggaaca nnkccgcctg aagaagattt tttag 35

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 188位饱和突变引物Km-R

<400> 36

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 188位饱和突变引物Km-F

<400> 37

gcccgacatt atcgcgagc 19

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 188位饱和突变引物GT209-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 38

cttcaggcgg mnntgttcca aacatctcgc gc 32

<210> 39

<211> 2412

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 蔗糖合成酶SUS基因

<400> 39

atgcaccatc atcatcatca tggcggtagc ggcatgattg aagtactgcg ccaacagctg 60

ctggatagcc cgcgttcatg gcgtgcattc ctgcgtcatt tagtcgcatc tcagcgtgac 120

tcatggctac ataccgattt acagcacgcg tgcaagacgt ttcgtgaaca gcctccggaa 180

ggctatcctg aagatattgg ttggctggca gattttattg cgcattgcca ggaagcgatc 240

ttccgggatc cgtggatggt ttttgcgtgg cgtctacgtc caggtgtttg ggagtatgtg 300

cgcatacatg tagaacagct ggcggtggag gagctgagca ctgatgaata tctgcaagcc 360

aaagaacaac ttgttggctt aggtgcagaa ggtgaagctg ttctgacggt ggatttcgaa 420

gattttcgtc cggtgagcca gcgtttaaaa gacgagagca ccattggtga tggtcttacc 480

catctgaatc gtcatttagc aggtcgcatc tggactgatt tagcagcagg tcgtagtgct 540

attctggaat ttctgggcct gcatcgtctg gataaccaga atctgatgct gagcaacggc 600

aataccgatt ttgactcttt acgtcaaacc gtacaatatc tgggcacctt accaagagaa 660

actccgtggg cagagtttcg tgaagacatg cgtcgtcgtg gttttgaacc cggttggggc 720

aacaccgcgg gccgtgttcg cgaaaccatg cgtctgctga tggatctgct tgactctccg 780

agcccagctg ccctggagag cttcctggat cgcatcccga tgattagcaa cgttctgatc 840

gtgagcattc acggatggtt tgcgcaggac aaggttctgg gtcgtccgga cactggtggt 900

caggtcgtgt atattctgga tcaggcccgt gcactggaac gcgaaatgcg taaccgcctg 960

cgccaacagg gtgttgatgt ggagccgcgc attttgattg cgacccgttt aatcccggaa 1020

agtgatggca cgacttgtga ccagcgtctg gagcctgtcc atggtgccga gaatgtgcag 1080

attctgcgcg ttccgtttcg ctatgaggat ggtcgtattc acccgcattg gatctcacgc 1140

ttcaaggttt ggccgtatct tgaacgctat gcaagggatc tggaacgcga agttaaggcc 1200

gaattaggta gtcgtccaga tctgatcatc ggcaactata gcgacggtgg gctggttgca 1260

accatcctgt cagaaaaatt aggtgttacg cagtgcaaca ttgcacatgc cctggagaaa 1320

agcaagtacc cggggtccga tctgcattgg ccgctgtatg aacaggacca tcactttgcg 1380

tgtcagttta ccgcggatct gatcgcgatg aatgcagcag acatcatcgt gacgagcaca 1440

taccaggaaa ttgcaggtaa tgaccgcgag gttggtcaat atgaatctca ccaggactat 1500

actttaccgg gcttgtatcg tgtcgagaat ggtattgacg tgttcgatag caagtttaac 1560

attgtgagtc cgggcgcaga tccgagtacg tattttagct atgcccgtca tgaagaacgc 1620

ttctcgtcgc tgtggccaga aatcgaaagt ctgctgtttg gccgcgaacc aggtccggat 1680

attcgtggtg ttctcgaaga tcctcagaaa ccgattattc tgtcggtggc ccgtatggat 1740

cgcatcaaga acctgagcgg tctggccgaa ctgtatggtc ggagtgcgcg cttacgtagc 1800

ctggccaatt tggtgatcat cggtggtcat gttgatgtac aggccagtat ggatgcagaa 1860

gaacgcgaag aaatccgtcg tatgcacgag atcatggacc gctaccagct ggatggtcag 1920

atgcgttggg tgggatcgca tctggataaa cgcgtcgtgg gcgaattgta tcgtgtagtg 1980

gcggatggac gtggcgtttt tgtgcaacca gccctgtttg aggcgttcgg cctgaccgtg 2040

attgaggcaa tgagcagtgg cctgccagtg tttgcgaccc gccacggtgg tccgctggaa 2100

atcatcgaag acggcgttag cggcttccat attgatccca acgaccctga agcggtagca 2160

gaaaaactgg ccgacttcct ggaagcagcg cgtgaacgtc cgaagtattg ggaggaaatt 2220

agccaggcgg ctcttgcgcg cgtcagcgaa cgttacacgt gggagcgcta tgcggaacgc 2280

ttgatgacca tcgcgcgttg cttcggcttt tggcgcttcg ttctgtcacg cgaatcacag 2340

gtcatggaac gctatctgca aatgttccgc cacctgcaat ggcgcccgct ggctcatgcc 2400

gtaccgatgg ag 2412

<210> 40

<211> 804

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 蔗糖合成酶SUS

<400> 40

Met His His His His His His Gly Gly Ser Gly Met Ile Glu Val Leu

1 5 10 15

Arg Gln Gln Leu Leu Asp Ser Pro Arg Ser Trp Arg Ala Phe Leu Arg

20 25 30

His Leu Val Ala Ser Gln Arg Asp Ser Trp Leu His Thr Asp Leu Gln

35 40 45

His Ala Cys Lys Thr Phe Arg Glu Gln Pro Pro Glu Gly Tyr Pro Glu

50 55 60

Asp Ile Gly Trp Leu Ala Asp Phe Ile Ala His Cys Gln Glu Ala Ile

65 70 75 80

Phe Arg Asp Pro Trp Met Val Phe Ala Trp Arg Leu Arg Pro Gly Val

85 90 95

Trp Glu Tyr Val Arg Ile His Val Glu Gln Leu Ala Val Glu Glu Leu

100 105 110

Ser Thr Asp Glu Tyr Leu Gln Ala Lys Glu Gln Leu Val Gly Leu Gly

115 120 125

Ala Glu Gly Glu Ala Val Leu Thr Val Asp Phe Glu Asp Phe Arg Pro

130 135 140

Val Ser Gln Arg Leu Lys Asp Glu Ser Thr Ile Gly Asp Gly Leu Thr

145 150 155 160

His Leu Asn Arg His Leu Ala Gly Arg Ile Trp Thr Asp Leu Ala Ala

165 170 175

Gly Arg Ser Ala Ile Leu Glu Phe Leu Gly Leu His Arg Leu Asp Asn

180 185 190

Gln Asn Leu Met Leu Ser Asn Gly Asn Thr Asp Phe Asp Ser Leu Arg

195 200 205

Gln Thr Val Gln Tyr Leu Gly Thr Leu Pro Arg Glu Thr Pro Trp Ala

210 215 220

Glu Phe Arg Glu Asp Met Arg Arg Arg Gly Phe Glu Pro Gly Trp Gly

225 230 235 240

Asn Thr Ala Gly Arg Val Arg Glu Thr Met Arg Leu Leu Met Asp Leu

245 250 255

Leu Asp Ser Pro Ser Pro Ala Ala Leu Glu Ser Phe Leu Asp Arg Ile

260 265 270

Pro Met Ile Ser Asn Val Leu Ile Val Ser Ile His Gly Trp Phe Ala

275 280 285

Gln Asp Lys Val Leu Gly Arg Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val Tyr

290 295 300

Ile Leu Asp Gln Ala Arg Ala Leu Glu Arg Glu Met Arg Asn Arg Leu

305 310 315 320

Arg Gln Gln Gly Val Asp Val Glu Pro Arg Ile Leu Ile Ala Thr Arg

325 330 335

Leu Ile Pro Glu Ser Asp Gly Thr Thr Cys Asp Gln Arg Leu Glu Pro

340 345 350

Val His Gly Ala Glu Asn Val Gln Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg Tyr

355 360 365

Glu Asp Gly Arg Ile His Pro His Trp Ile Ser Arg Phe Lys Val Trp

370 375 380

Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Ala Arg Asp Leu Glu Arg Glu Val Lys Ala

385 390 395 400

Glu Leu Gly Ser Arg Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Asp Gly

405 410 415

Gly Leu Val Ala Thr Ile Leu Ser Glu Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys

420 425 430

Asn Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Ser Lys Tyr Pro Gly Ser Asp Leu

435 440 445

His Trp Pro Leu Tyr Glu Gln Asp His His Phe Ala Cys Gln Phe Thr

450 455 460

Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Ala Ala Asp Ile Ile Val Thr Ser Thr

465 470 475 480

Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Asn Asp Arg Glu Val Gly Gln Tyr Glu Ser

485 490 495

His Gln Asp Tyr Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Glu Asn Gly Ile

500 505 510

Asp Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Pro

515 520 525

Ser Thr Tyr Phe Ser Tyr Ala Arg His Glu Glu Arg Phe Ser Ser Leu

530 535 540

Trp Pro Glu Ile Glu Ser Leu Leu Phe Gly Arg Glu Pro Gly Pro Asp

545 550 555 560

Ile Arg Gly Val Leu Glu Asp Pro Gln Lys Pro Ile Ile Leu Ser Val

565 570 575

Ala Arg Met Asp Arg Ile Lys Asn Leu Ser Gly Leu Ala Glu Leu Tyr

580 585 590

Gly Arg Ser Ala Arg Leu Arg Ser Leu Ala Asn Leu Val Ile Ile Gly

595 600 605

Gly His Val Asp Val Gln Ala Ser Met Asp Ala Glu Glu Arg Glu Glu

610 615 620

Ile Arg Arg Met His Glu Ile Met Asp Arg Tyr Gln Leu Asp Gly Gln

625 630 635 640

Met Arg Trp Val Gly Ser His Leu Asp Lys Arg Val Val Gly Glu Leu

645 650 655

Tyr Arg Val Val Ala Asp Gly Arg Gly Val Phe Val Gln Pro Ala Leu

660 665 670

Phe Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Met Ser Ser Gly Leu

675 680 685

Pro Val Phe Ala Thr Arg His Gly Gly Pro Leu Glu Ile Ile Glu Asp

690 695 700

Gly Val Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Asn Asp Pro Glu Ala Val Ala

705 710 715 720

Glu Lys Leu Ala Asp Phe Leu Glu Ala Ala Arg Glu Arg Pro Lys Tyr

725 730 735

Trp Glu Glu Ile Ser Gln Ala Ala Leu Ala Arg Val Ser Glu Arg Tyr

740 745 750

Thr Trp Glu Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Met Thr Ile Ala Arg Cys Phe

755 760 765

Gly Phe Trp Arg Phe Val Leu Ser Arg Glu Ser Gln Val Met Glu Arg

770 775 780

Tyr Leu Gln Met Phe Arg His Leu Gln Trp Arg Pro Leu Ala His Ala

785 790 795 800

Val Pro Met Glu

<210> 41

<211> 1371

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-1,3-糖基转移酶

<400> 41

atgccgaaca ctaacccaac taccgtgcgt cgtcgtcgtg ttattatgtt tccggttccg 60

ttcccgggcc acttaaaccc gatgctgcaa ctggcgaacg tgctgtaccg tagaggtttt 120

gaaatcacca ttctgcacac caacttcaac gccccgaaaa ccagccttta tccgcacttc 180

cagtttcgtt ttatcttgga caacgatccg caaccggagt ggttacgcaa cctgccgacg 240

actggtccgg gcgtgggtgc aagaatcccg gtaattaaca aacacggcgc ggatgaattc 300

cgtaaggagc tggaaatctg catgcgggat actccgagtg acgaggaagt tgcttgcgtg 360

attaccgatg cgctgtggta cttcgcgcaa ccggtggcgg acagcctgaa tctgaaacgt 420

ctggttctgc agaccgggag cctgtttaac ttccactgcc tggtgtgtct gccgaaattt 480

ctggagttgg gctacctgga tccggaaact aaacatcgtc cggatgaacc ggtggtaggt 540

ttcccgatgc tgaaggttaa agatatccgt cgcgcgtatt cgcacattca agaatcgaaa 600

ccaattctga tgaagatggt tgaagaaacc cgtgccagca gcggtgtgat ttggaacagc 660

gctaaagagc tggaggaaag cgagctggaa accattcagc gtgaaattcc ggcgccgagc 720

ttcctgcttc cgctgccgaa gcattatagg gcttcgagca ctagcctgct ggatactgat 780

ccgagcaccg cccaatggct ggaccagcag ccgccgagca gcgtgctgta cgttggcttt 840

ggcagccaga gctcgctgga ccccgcagat ttcctggaga ttgcgcgtgg tctggttgcg 900

agcaaacaaa gctttctgtg gaacgttcgt ccgggcttcg tgaagggtta tgagtggatt 960

gagctgctgc cggatggttt tctgggtgaa aaaggtcgta tcgtgaagtc tgctccgcaa 1020

caagaagtgc tggcgcacaa ggcgattggt gcgttctgga cccacggcgg ttggaacggc 1080

accatggagg ccgtgtgcga aggcgtgccg atgatcttta gcgatttcgg tctggatcag 1140

ccgctgaacg cgcgttacat gagcgaggtt ctgcatgtgg gcgtttatct ggagaacggc 1200

ttcatccgtg gtgagatcat taatgcggtt aggcgtgtga tggttgaccc tgagggtgag 1260

gttatgcgcc aaaacgcgcg taaattgaag gataagttgg atcgaagcat tgctcccggt 1320

ggcagcagct acgagagcct ggaacgcctg cagagctata ttagcagcct g 1371

<210> 42

<211> 457

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-1,3-糖基转移酶

<400> 42

Met Pro Asn Thr Asn Pro Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Val Ile Met

1 5 10 15

Phe Pro Val Pro Phe Pro Gly His Leu Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala

20 25 30

Asn Val Leu Tyr Arg Arg Gly Phe Glu Ile Thr Ile Leu His Thr Asn

35 40 45

Phe Asn Ala Pro Lys Thr Ser Leu Tyr Pro His Phe Gln Phe Arg Phe

50 55 60

Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Pro Glu Trp Leu Arg Asn Leu Pro Thr

65 70 75 80

Thr Gly Pro Gly Val Gly Ala Arg Ile Pro Val Ile Asn Lys His Gly

85 90 95

Ala Asp Glu Phe Arg Lys Glu Leu Glu Ile Cys Met Arg Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Asp Glu Glu Val Ala Cys Val Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe

115 120 125

Ala Gln Pro Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Lys Arg Leu Val Leu Gln

130 135 140

Thr Gly Ser Leu Phe Asn Phe His Cys Leu Val Cys Leu Pro Lys Phe

145 150 155 160

Leu Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Thr Lys His Arg Pro Asp Glu

165 170 175

Pro Val Val Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Arg Arg Ala

180 185 190

Tyr Ser His Ile Gln Glu Ser Lys Pro Ile Leu Met Lys Met Val Glu

195 200 205

Glu Thr Arg Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Ala Lys Glu Leu

210 215 220

Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Ile Gln Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser

225 230 235 240

Phe Leu Leu Pro Leu Pro Lys His Tyr Arg Ala Ser Ser Thr Ser Leu

245 250 255

Leu Asp Thr Asp Pro Ser Thr Ala Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro

260 265 270

Ser Ser Val Leu Tyr Val Gly Phe Gly Ser Gln Ser Ser Leu Asp Pro

275 280 285

Ala Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Ala Ser Lys Gln Ser

290 295 300

Phe Leu Trp Asn Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Tyr Glu Trp Ile

305 310 315 320

Glu Leu Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Lys Gly Arg Ile Val Lys

325 330 335

Ser Ala Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Lys Ala Ile Gly Ala Phe

340 345 350

Trp Thr His Gly Gly Trp Asn Gly Thr Met Glu Ala Val Cys Glu Gly

355 360 365

Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ala

370 375 380

Arg Tyr Met Ser Glu Val Leu His Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn Gly

385 390 395 400

Phe Ile Arg Gly Glu Ile Ile Asn Ala Val Arg Arg Val Met Val Asp

405 410 415

Pro Glu Gly Glu Val Met Arg Gln Asn Ala Arg Lys Leu Lys Asp Lys

420 425 430

Leu Asp Arg Ser Ile Ala Pro Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu Glu

435 440 445

Arg Leu Gln Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

Claims

1.一种β-1,2-糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比包含选自以下一个或多个的残基位置处的氨基酸残基差异：

第96位氨基酸残基为A、C、G或N；

第181位氨基酸残基为L；

第185位氨基酸残基为L；

第188位氨基酸残基为A、F、M、T或I；

第196位氨基酸残基为V；

第201位氨基酸残基为P；

第324位氨基酸残基为K。

2.如权利要求1所述的β-1,2-糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比的氨基酸残基差异为：

第96位氨基酸残基为A、C、G或N；或，

第181位氨基酸残基为L；或，

第185位氨基酸残基为L；或，

第188位氨基酸残基为A、F、M、T或I；或，

第196位氨基酸残基为V；或，

第201位氨基酸残基为P；或，

第324位氨基酸残基为K。

3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1或2所述的β-1,2-糖基转移酶。

4.一种重组表达载体，其包含如权利要求3所述的分离的核酸。

5.一种转化体，其包含如权利要求3所述的分离的核酸或如权利要求4所述的重组表达载体。

6.一种制备如权利要求1或2所述的β-1,2-糖基转移酶的方法，其特征在于，所述方法包括在适于表达所述β-1,2-糖基转移酶的条件下培养如权利要求5所述的转化体。

7.一种组合物，其包含如权利要求1或2所述的β-1,2-糖基转移酶。

8.一种用于底物的糖基化的方法，所述方法包括提供至少一种底物、如权利要求1或2所述的β-1,2-糖基转移酶，并在使得所述底物被糖基化以产生至少一种糖基化产物的条件下使所述底物与所述β-1,2-糖基转移酶接触。

9.一种莱鲍迪苷D的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：在如权利要求1或2所述的β-1,2-糖基转移酶的存在下，将莱鲍迪苷A和糖基供体进行反应，即得莱鲍迪苷D。

10.一种莱鲍迪苷M的制备方法，其特征在于，其包括根据如权利要求9所述的制备方法制备莱鲍迪苷D的步骤；较佳地，所述制备方法还使用β-1,3-糖基转移酶；更佳地，所述制备方法采用一锅法。

11.一种如权利要求1或2所述的β-1,2-糖基转移酶在制备甜菊醇糖苷中的用途；所述甜菊醇糖苷优选为莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M。