CN116254279B - 一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成l-木糖的方法 - Google Patents

一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成l-木糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L‑木糖的方法，是合成木糖醇‑4‑脱氢酶基因和L‑海藻糖异构酶基因，构建重组质粒pET28a‑xdh/L‑fucI继而构建重组菌株、利用获得的重组菌株E.coliBL21(DE3)‑pET28a‑xdh/L‑fucI作为生物催化剂催化廉价底物木糖醇生产L‑木糖。本发明方法实现了在大肠杆菌中同时表达XDH和L‑FucI酶，通过离心的方式即可容易地得到细胞催化剂，不需要额外对酶进行纯化或是固定化等耗时耗力的操作，反应条件温和、操作简单、生产效率高且成本低，反应液中L‑木糖的浓度达到52.2g/L，L‑木糖的转化率为65％。本发明为木糖醇生产L‑木糖提供了一种替代方法，具有显著的工业应用潜力和应用前景。

Description

一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖 的方法
技术领域
本发明涉及一种生物合成L-木糖的方法，尤其涉及一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，属于生物技术领域。
背景技术
稀有糖是一类自然界中极少存在的单糖及其衍生物，在无热量甜味剂、抗病毒药物、抗癌或肿瘤治疗药物、药物构建前体和L-核苷类似物等方面具有巨大的应用潜力。近年来，人们对L-碳水化合物及其核苷类化合物的研究越来越多。
L-木糖是一种醛戊糖，已被用作合成许多药用分子的原始材料。据相关报道，新型L-木糖衍生物在体内对尿糖重吸收有抑制作用，提示其可能用于治疗糖尿病。L-木糖还可用作生产多羟基吡咯烷和相关类似物的前体，能够抑制肿瘤生长，作为α和β-葡萄糖苷酶抑制剂，用于生产抗HBV的核苷类药物。此外，L-木糖通过氧化还原反应可以得到L-核糖衍生物，L-核糖衍生物再经糖基化可得到L-核糖核酸苷，例如L-尿苷、L-胞苷、L-腺苷、L-鸟苷等。
通过化学方法，以D-葡萄糖或D-葡萄糖内酯为底物，经多步反应可以合成L-木糖。然而，该方法操作复杂，产量低，不适应于工业化生产。近年来，酶或全细胞形式的生物催化已经成为一种有价值的工具，用于开发简单而经济的稀有糖生产方法，以取代繁琐的化学合成方法。因此，L-木糖的生物合成因其反应条件温和、副产物少以及催化效率高而备受关注。
目前，L-木糖的生物合成主要以L-木酮糖为底物实现。例如，来自于Pseudomonasstutzeri的L-鼠李糖异构酶和来自于E.coli的L-海藻糖异构酶都能够催化L-木酮糖为L-木糖。然而，上述反应过程具有酶底物专一性差、催化活性低、生产效率低，而且底物L-木酮糖价格昂贵等缺点，不适合商业化生产L-木糖。因此，探索一种操作简单、效率高且成本低的规模化生产L-木糖的方法非常迫切。经检索，有关利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法。
本发明所述的利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，步骤是：
(1)合成木糖醇-4-脱氢酶基因和L-海藻糖异构酶基因
木糖醇-4-脱氢酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，或是与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；
L-海藻糖异构酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，或是与SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；
(2)构建重组质粒pET28a-xdh/L-fucI
将木糖醇-4-脱氢酶基因xdh连接到载体质粒pET28a的限制性酶切位点BamHI和Hind III之间，构建得到重组质粒pET28a-xdh；将L-海藻糖异构酶基因L-fucI连接到重组质粒pET28a-xdh的限制性酶切位点HindIII和Xho I之间，得到重组质粒pET28a-xdh/L-fucI；其中PCR克隆获得的L-海藻糖异构酶基因L-fucI所用上游引物含有核糖体结合位点AAGGAG；
(3)构建重组菌株
将重组质粒pET28a-xdh/L-fucI以1:10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴30min，再在42℃水浴中热击45s，立即冰浴2min，而后加入LB液体培养基中37℃，200rpm复苏1h，再将菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃静置培养过夜；挑取单菌落转接至LB液体培养基中，并添加卡那霉素至浓度为50μg/ml，37℃，200rpm培养12h，得到重组菌株；其中，所述感受态细胞是E.coli DH5α或E.coli BL21(DE3)，得到的重组菌株相应是E.coli DH5-pET28a-xdh/L-fucI或E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI；
(4)诱导培养收集菌体
将重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600为0.6，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，并将温度降低到25℃继续诱导培养12h；培养后的菌液10000rpm离心5min收集菌体；
(5)利用收集的菌体作为生物催化剂转化木糖醇生产L-木糖
将收集的菌体用50mM、pH 10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体3±1次，离心收集菌体，用底物溶液重悬菌体至OD600为77-82构建生物合成L-木糖的反应体系，置于38-42℃恒温水浴锅中反应27-32h；其中，所述底物溶液由78-83g/L木糖醇、7.3-7.8mM Zn2+、50mM pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制；将反应后的反应液于14000rpm离心5min去除菌体，取上清液煮沸5min后再重复一次离心，取上清液经0.22μm孔径超滤膜滤器过滤，滤液即为含L-木糖溶液。
上述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法中：步骤(1)所述木糖醇-4-脱氢酶基因xdh优选的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述L-海藻糖异构酶基因L-fucI优选的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法中：步骤(5)所述生物合成L-木糖的反应体系中木糖醇的浓度优选为79-81g/L，Zn2+的浓度优选为7.4-7.6mM，重组菌浊度OD600优选为79-81，溶液为50mMpH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
进一步优选的实施方式是：步骤(5)所述生物合成L-木糖的反应体系中木糖醇的浓度为80g/L，Zn2+的浓度为7.5mM，重组菌浊度OD600为80，溶液为50mM pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
上述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法中：步骤(5)所述Zn2+的盐是ZnCl2、ZnSO4、Zn(NO3)2、Zn(ClO4)2或Zn(BF4)2。优先选择的Zn2+盐是ZnCl2、ZnSO4或Zn(NO3)2。
上述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法中：步骤(5)所述反应体系优选置于39-41℃恒温水浴锅中反应27-30h。
进一步优选的实施方式是：步骤(5)所述反应体系置于40℃恒温水浴锅中反应28h。
与现有技术相比，本发明体现的有益效果是：本发明首次利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖，L-木糖转化率高达65％，为工业化生产L-木糖提供了一种有前景的替代方法，具有显著的应用潜力。
本发明利用同时表达木糖醇-4-脱氢酶和L-海藻糖异构酶的重组大肠杆菌作为生物催化剂催化廉价底物木糖醇生产L-木糖，该方法通过离心的方式即可容易地得到细胞催化剂，不需要额外对酶进行纯化或是固定化等耗时耗力的操作，反应条件温和、操作简单、生产效率高且成本低，反应液中L-木糖的浓度达到52.2g/L，L-木糖的转化率为65％。本发明方法不仅有效的拓展了L-木糖的生产方法，还可用于L-木糖的工业化生产，具有显著的工业应用潜力和应用前景。
附图说明
图1：E.coli DH5α-pET28a-xdh菌落PCR验证图(A)和重组质粒pET28a-xdh双酶切验证图(B)。
其中，M1：250bp-I DNAmarker；M2：1kb-IV DNAmarker；C+：以pETDuet-1-xdh为模板PCR扩增所得产物作为阳性对照；以无菌双蒸水为模板PCR扩增所得产物作为阴性对照；1-8：菌落PCR扩增产物；9：BamHI和Hind III双酶切重组质粒pET28a-xdh/L-fucI的产物。
图2：重组质粒pET28a-xdh/L-fucI构建图(A)，E.coli DH5α-pET28a-xdh/L-fucI菌落PCR验证图(B)和重组质粒pET28a-xdh/L-fucI双酶切验证图(C)。
其中，M1：250bp-I DNAmarker；M2：1kb-IV DNAmarker；C+：以Escherichia coli W基因组为模板PCR扩增所得产物作为阳性对照；以无菌双蒸水为模板PCR扩增所得产物作为阴性对照；1-8,菌落PCR扩增产物；9，Hind III和Xho I双酶切重组质粒pET28a-xdh/L-fucI的产物。
图3：SDS-PAGE重组蛋白分析图。
其中，M：protein marker；1：重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a全蛋白；2：重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI全蛋白。
图4：重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI催化木糖醇产生L-木糖的高效液相色谱图。
其中。1：L-木糖标准品；2：L-木酮糖标准品；3：木糖醇标准品；4，5，6：反应混合液。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
其中，木糖醇-4-脱氢酶来源于Pantoea ananatis ATCC 43072，GenBank号为AY894680.1，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；L-海藻糖异构酶来源于Escherichia coliW，GenBank号为ADT76410.1，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。载体质粒pET28a购自湖南科爱医疗器械有限公司旗下网站优宝生物。
实施例1利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖，具体步骤如下：
(1)合成木糖醇-4-脱氢酶基因和L-海藻糖异构酶基因
木糖醇-4-脱氢酶基因xdh是根据木糖醇-4-脱氢酶的原始基因序列(GenBank:AY894680.1)，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化后合成的，优化后的木糖醇-4-脱氢酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，密码子优化及合成是由北京擎科生物科技有限公司完成的；L-海藻糖异构酶基因L-fucI是以Escherichia coliW基因组为模板经PCR扩增得到的，L-海藻糖异构酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。(2)构建重组质粒pET28a-xdh
a.PCR扩增xdh基因片段
以公司合成的pETDuet-1-xdh为模板，以P1和P2为引物，按照以下反应体系和程序进行xdh的PCR扩增。PCR扩增反应结束后，利用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因产物。
P1:CGCGGATCCATGAGTGGTGAATATG(下划线为酶切位点BamHI)
P2:CCGAAGCTTTTACCAAATGGTAAAGCC(下划线为酶切位点HindIII)
反应体系：
反应程序：
b.双酶切pET28a质粒和xdh基因片段
按照以下反应体系双酶切pET28a质粒和PCR扩增并回收得到的xdh基因片段，37℃水浴酶切4h，双酶切产物利用DNA纯化回收试剂盒进行回收。
c.连接双酶切后的xdh基因片段和pET28a质粒
利用T4 DNA连接酶连接双酶切回收后的pET28a质粒和xdh基因片段，按照以下反应体系配制连接反应溶液，充分混匀后置于22℃低温恒温槽中连接2h。
d.转化克隆感受态细胞E.coli DH5a
取50μL克隆感受态细胞E.coli DH5α，加入5μL上述得到的连接液，冰浴30min，然后在42℃水浴中热击45s，再立即冰浴2min，而后加入500μL无菌无抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm复苏1h后取100L转化液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃静置培养过夜。次日，从LB固体平板上挑取单菌落转接至含有10mL LB培养基的50mL锥形瓶中，并添加卡纳霉素至浓度为50μg/ml，37℃，200rpm培养12h，获得重组菌株E.coli DH5-pET28a-xdh，此重组菌可以实现重组质粒pET28a-xdh的多克隆拷贝，甘油管保菌备用。其中，经菌落PCR验证(图1A)、双酶切验证(图1B)以及公司测序验证，证实重组质粒pET28a-xdh构建成功，菌落PCR验证和双酶切验证参考上述a和b的方法，公司测序验证公司为北京擎科生物科技有限公司。
(3)构建重组质粒pET28a-xdh/L-fucI
a.PCR扩增L-fucI基因片段
以Escherichia coli W基因组为模板，P3和P4为引物，按照以下反应体系和程序进行L-fucI的PCR扩增。PCR扩增反应结束后，利用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因产物。
P3:CCGAAGCTTAAGGAGAAAATAATGAAAAAAATCAGCTTACCG(下划线为酶切位点HindIII，斜体为核糖体结合位点)
P4:CCGCTCGAGACGCTTATACAACGGACCGTA(下划线为酶切位点XhoI)
反应体系：
反应程序：
b.双酶切pET28a-xdh质粒和L-fucI基因片段
按照以下反应体系双酶切pET28a-xdh质粒和PCR扩增并回收得到的L-fucI基因片段，37℃水浴酶切4h，双酶切产物利用DNA纯化回收试剂盒进行回收。
c.连接双酶切后的pET28a-xdh质粒和L-fucI基因片段
利用T4 DNA连接酶连接双酶切回收后的pET28a-xdh质粒和L-fucI基因片段，按照以下反应体系配制连接反应溶液，充分混匀后置于22℃低温恒温槽中连接2h可得重组质粒pET28a-xdh/L-fucI，构建图可见图2A。
d.转化克隆感受态细胞E.coli DH5a
同样地，取50μL克隆感受态细胞E.coli DH5α，加入5μL上述得到的连接液，冰浴30min，然后在42℃水浴中热击45s，再立即冰浴2min，而后加入500μL无菌无抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm复苏1h后取100L转化液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃静置培养过夜。次日，从LB固体平板上挑取单菌落转接至含有10mL LB培养基的50mL锥形瓶中，并添加卡纳霉素至浓度为50μg/ml，37℃，200rpm培养12h，获得重组菌株E.coliDH5α-pET28a-xdh/L-fucI，此重组菌可以实现重组质粒pET28a-xdh/L-fucI的多克隆拷贝，甘油管保菌备用。其中，经菌落PCR验证(图2B)、双酶切验证(图2C)以及公司测序验证，证实重组质粒pET28a-xdh/L-fucI构建成功。菌落PCR验证和双酶切验证参考上述a和b的方法，公司测序验证公司为北京擎科生物科技有限公司。
(4)构建重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI
取50μL表达感受态细胞E.coli BL21(DE3)，加入5μL重组质粒pET28a-xdh/L-fucI，冰浴30min，然后在42℃水浴中热击45s，再立即冰浴2min，而后加入500μL无菌无抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm复苏1h后取100L转化液涂布于含有卡纳霉素抗性的LB固体平板上，37℃静置培养过夜。次日，从LB固体平板上挑取单菌落转接至含有10mL LB培养基的50mL锥形瓶中，并添加卡纳霉素至浓度为50μg/ml，37℃，200rpm培养12h，获得重组菌株E.coliBL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI，甘油管保菌备用。
另外采用与上述相同的步骤，利用空白质粒pET28a构建重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a作为对照菌株。
将重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a和E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI分别接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600为0.6，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，并将温度降低到25℃诱导培养12h；取1mL诱导培养结束后的菌液，14000rpm离心5min，除去培养基上清，得到菌体；用无菌双蒸水重悬洗涤菌体两次，14000rpm离心5min，去除上清，得到菌体；最后加入400μL无菌双蒸水重悬菌体，分别取30μL样品用于检测全蛋白。
在上述30μL样品中加入6μL 5×Loading buffer，充分混匀后利用PCR仪100℃裂解10min变性，而后进行SDS-PAGE蛋白电泳检测全蛋白，验证目的蛋白是否表达。
经SDS-PAGE蛋白电泳分析(图3)，与对照重组菌株相比，木糖醇-4-脱氢酶和L-海藻糖异构酶成功表达。
(5)重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI的诱导培养
将重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600为0.6，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，并将温度降低到25℃继续培养12h；培养后的菌液10000rpm离心5min收集菌体，并用pH10.0、50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体3±1次，离心收集菌体备用。
(6)利用收集的菌体作为生物催化剂转化木糖醇生产L-木糖
将收集的菌体(重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI)用50mM、pH10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体3±1次，离心收集菌体，用底物溶液重悬菌体至OD600为80构建生物合成L-木糖的反应体系，置于40℃恒温水浴锅中反应28h；其中，所述底物溶液由80g/L木糖醇、7.5mM Zn2+、50mM pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制，Zn2+的盐是ZnCl2、ZnSO4或Zn(NO3)2；将反应后的反应液于14000rpm离心5min去除菌体，取上清液煮沸5min后再重复一次离心，取上清液经0.22μm孔径超滤膜滤器过滤，滤液即为含L-木糖溶液。反应液经分离纯化分析(具体方法详见步骤(7))，L-木糖的浓度为52.2g/L，L-木糖的转化率为65％。
(7)反应液的分离纯化分析方法
反应液于14000rpm离心5min去除菌体，所得的上清液煮沸5min后再离心，得到的上清液经0.22μm孔径的水系小滤器过滤，经高效液相色谱法对反应液进行分析，具体条件如下所示：
实施例2无Zn2+存在和有Zn2+存在时，利用收集的菌体(重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI)作为生物催化剂转化木糖醇制备L-木糖的比较
菌体(重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI)的制备及收集同实施例1中步骤(1)至(5)。
无Zn2+存在时，利用收集的菌体转化木糖醇制备L-木糖：
利用底物溶液，含有80g/L木糖醇和50mM，pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，重悬菌体至OD600为80构建生物合成L-木糖的反应体系，置于40℃恒温水浴锅中反应28h。反应液经分离纯化分析(具体方法详见实施例1中步骤(7))，得到L-木糖的转化率为43.3％。
Zn2+存在时，利用收集的菌体转化木糖醇制备L-木糖：
利用底物溶液，含有80g/L木糖醇、7.5mM Zn2+和50mM，pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，重悬菌体至OD600为80构建生物合成L-木糖的反应体系，置于40℃恒温水浴锅中反应28h。反应液经分离纯化分析(具体方法详见步骤(8))，添加Zn2+(Zn2+的盐是ZnCl2、ZnSO4或Zn(NO3)2)，L-木糖的浓度为52.2g/L，L-木糖的转化率为65％，转化率是不添加Zn2+时的1.5倍。
实施例3利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖
菌体(重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI)的制备及收集同实施例1中步骤(1)至(5)。
将收集的菌体(重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI)用50mM、pH10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体3±1次，离心收集菌体，用底物溶液重悬菌体至OD600为77构建生物合成L-木糖的反应体系，置于42℃恒温水浴锅中反应27h；其中，所述底物溶液由78g/L木糖醇、7.3mM Zn2+、50mM pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制，Zn2+的盐是ZnCl2、ZnSO4或Zn(NO3)2；将反应后的反应液于14000rpm离心5min去除菌体，取上清液煮沸5min后再重复一次离心，取上清液经0.22μm孔径超滤膜滤器过滤，滤液即为含L-木糖溶液。反应液经分离纯化分析(具体方法详见实施例1中步骤(7))，L-木糖的转化率为63％。
实施例4利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖
菌体(重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI)的制备及收集同实施例1中步骤(1)至(5)。
将收集的菌体(重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI)用50mM、pH10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体3±1次，离心收集菌体，用底物溶液重悬菌体至OD600为82构建生物合成L-木糖的反应体系，置于38℃恒温水浴锅中反应32h；其中，所述底物溶液由83g/L木糖醇、7.8mM Zn2+、50mM pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制，Zn2+的盐是ZnCl2、ZnSO4或Zn(NO3)2；将反应后的反应液于14000rpm离心5min去除菌体，取上清液煮沸5min后再重复一次离心，取上清液经0.22μm孔径超滤膜滤器过滤，滤液即为含L-木糖溶液。反应液经分离纯化分析(具体方法详见实施例1中步骤(7))，L-木糖的转化率为64.5％。

Claims (6)

1.一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，步骤是：
（1）合成木糖醇-4-脱氢酶基因和L-海藻糖异构酶基因
木糖醇-4-脱氢酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
L-海藻糖异构酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
（2）构建重组质粒pET28a-xdh/L-fucI
将木糖醇-4-脱氢酶基因xdh连接到载体质粒pET28a的限制性酶切位点BamH I和 HindIII之间，构建得到重组质粒pET28a-xdh；将L-海藻糖异构酶基因L-fucI连接到重组质粒pET28a-xdh的限制性酶切位点Hind III和Xho I之间，得到重组质粒pET28a-xdh/L-fucI；其中PCR克隆获得的L-海藻糖异构酶基因L-fucI所用上游引物含有核糖体结合位点AAGGAG；
（3）构建重组菌株
将重组质粒pET28a-xdh/L-fucI以1:10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴30 min，再在42 ℃水浴中热击45 s，立即冰浴2 min，而后加入LB液体培养基中37 ℃，200 rpm复苏1 h，再将菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，37 ℃静置培养过夜；挑取单菌落转接至LB液体培养基中，并添加卡那霉素至浓度为50 μg/ml，37 ℃，200 rpm培养12 h，得到重组菌株；其中，所述感受态细胞是E. coli DH5α或E.coli BL21 (DE3)，得到的重组菌株相应是E. coli DH5-pET28a-xdh/L-fucI或E.coli BL21 (DE3)-pET28a-xdh/L-fucI；
（4）诱导培养收集菌体
将重组菌株E.coli BL21 (DE3)-pET28a-xdh/L-fucI接种于含有50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃，200 rpm培养至OD600为0.6，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，并将温度降低到25 ℃继续诱导培养12 h；培养后的菌液10000 rpm离心5 min收集菌体；
（5）利用收集的菌体作为生物催化剂转化木糖醇生产L-木糖
将收集的菌体用50 mM、pH 10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体3±1次，离心收集菌体，用底物溶液重悬菌体至OD600为77-82构建生物合成L-木糖的反应体系，置于38-42 ℃恒温水浴锅中反应27-32 h；其中，所述底物溶液由78-83 g/L木糖醇、7.3-7.8 mM Zn2+、50mM pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制；将反应后的反应液于14000 rpm离心5 min去除菌体，取上清液煮沸5 min后再重复一次离心，取上清液经0.22 μm孔径超滤膜滤器过滤，滤液即为含L-木糖溶液。
2. 根据权利要求1所述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步骤（5）所述生物合成L-木糖的反应体系中木糖醇的浓度为79-81 g/L，Zn2+的浓度为7.4-7.6 mM ，重组菌浊度OD600为79-81，溶液为50 mM pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
3. 根据权利要求2所述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步骤（5）所述生物合成L-木糖的反应体系中木糖醇的浓度为80 g/L，Zn2+的浓度为7.5 mM ，重组菌浊度OD600为80，溶液为50 mM pH为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
4.根据权利要求1、2或3所述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步骤（5）所述Zn2+的盐是ZnCl2、ZnSO4或Zn(NO3)2。
5. 根据权利要求1所述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步骤（5）所述反应体系置于39-41℃恒温水浴锅中反应27-30 h。
6.根据权利要求5所述利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步骤（5）所述反应体系置于40℃恒温水浴锅中反应28 h。
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