CN112458107B

CN112458107B - 一种利用含有nad(p)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产d-阿洛酮糖的方法

Info

Publication number: CN112458107B
Application number: CN202011591904.8A
Authority: CN
Inventors: 林建强; 温鑫; 宋欣; 任一林; 林建群
Original assignee: Qingdao Longding Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Longding Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112458107A

Abstract

本发明公开了一种利用含有NAD(P)‑依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D‑阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：对NAD(P)‑依赖型醇脱氢酶基因adh进行优化合成，构建重组质粒pETDuet_‑1‑MCSⅡadh、构建重组菌株、利用重组菌株作为生物催化剂催化阿洛醇生产D‑阿洛酮糖。本发明方法简单、条件温和、转化效率高，且是首次证实含有NAD(P)‑依赖型醇脱氢酶的菌株能够用于催化阿洛醇生产D‑阿洛酮糖，因此本发明方法不仅有效的拓展了D‑阿洛酮糖的生产方法，还可用于D‑阿洛酮糖的大规模生产。

Description

一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法

技术领域

本发明属于稀有糖生物转化技术领域，具体涉及一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

随着经济的蓬勃发展，人民的生活水平得到极大地改善，但是与此同时亚健康人员增多，高血压、糖尿病、肥胖人群与日俱增，具有低热量、低吸收等特点的稀有糖引起人们的广泛关注。稀有糖被国际稀有糖协会（International Society of Rare Sugars，ISRS）定义为自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。

D-阿洛酮糖是一种超低热量稀有糖，虽具有糖的甜味，但甜度是蔗糖的70%，不会被人体代谢利用，是蔗糖和高果糖浆的理想替代品。D-阿洛酮糖可以改善食品质地，减少食品加工过程中的氧化，增加食品保水能力，从而提供食品愉悦口感。另外，D-阿洛酮糖还是一种有效的抗肥胖和抗糖尿病的甜味剂，它能抑制血糖升高，提高胰岛素敏感性，降低餐后血糖反应，抑制肝脏脂肪生成酶活性，减少腹部脂肪堆积，清除活性氧等。D-阿洛酮糖被美国食品和药物管理局(FDA)批准为“一般认为是安全的”(GRAS，GRN No. 400)，并被允许用作食品和膳食补充剂的成分。

自然界的D-阿洛酮糖主要存在于甘蔗、小麦和鼠刺等植物中，含量微少，不利于大量生产D-阿洛酮糖。虽然利用化学合成法可以实现D-阿洛酮糖的生产，但是该方法操作复杂，副产物多，不利于后期D-阿洛酮糖的分离纯化，且对环境不友好。

目前，D-阿洛酮糖主要通过差向异构酶（如D-阿洛酮糖 3-差向异构酶或D-塔格糖3-差向异构酶）催化D-果糖的方式得到，但反应平衡点不利于D-阿洛酮糖的生成，转化率较低，仅在30%左右，因此造成分离纯化困难，不利于高效率、低成本地大规模工业化生产D-阿洛酮糖。

另外，根据稀有糖生物转化策略（Izumoring策略），D-阿洛酮糖也可以通过生物氧化反应，由阿洛醇生物转化得到。菌株Bacillus pallidus Y25和Enterobacter aerogenesIK7的静息细胞反应可以实现由阿洛醇直接生产D-阿洛酮糖，该微生物转化法制备D-阿洛酮糖，虽不涉及热力学平衡问题，且工艺步骤简单，但微生物的存在底物浓度低、催化时间长、生产周期长、反应条件各异，产物提取工艺复杂等问题，也会导致总成本偏高，不适合工业化生产。因此，探索一种操作简单，成本低，可以实现D-阿洛酮糖的规模化生产的方法就显得非常重要。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，该方法首次通过含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株实现了由阿洛醇生产D-阿洛酮糖，且方法简单、转化率高。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明提供了一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：

（1）构建重组质粒pETDuet_-1-MCSⅡadh：将NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因连接到载体质粒pETDuet_-1的限制性酶切位点NdeⅠ和 Xho Ⅰ之间，得到重组质粒 pETDuet_-1-MCSⅡadh；

（2）构建重组菌株：将重组质粒以1：10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴后热击，再立即冰浴，而后加入无菌无抗生素的LB液体培养基中复苏，再将菌液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，静置培养过夜；从平板挑取单菌落转接至LB培养基中，并添加氨苄青霉素至浓度为100 μg/ml，摇床培养后得到重组菌株；

（3）制备D-阿洛酮糖：将重组菌株按照1%的接种量接种到含有氨苄青霉素的LBG培养基中，37 ℃摇床培养，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM，再将温度降低到20 ℃，继续摇床诱导培养；诱导培养后的菌液离心收集菌体，并用pH为10.0、浓度为20 mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体三次后，离心收集菌体；然后用100 g/L的阿洛醇溶液重悬菌体至细胞用量OD₆₀₀为80，置于50 ℃的摇床中反应12 h；将反应液14000 rpm离心去除菌体取上清液，上清液煮沸后再离心，或经0.22 μm孔径超滤膜滤器过滤，得到的清液中即含有D-阿洛酮糖。

进一步的，所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶来源于Gluconobacter frateurii。

进一步的，所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因是根据NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的原始序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化后合成获得的。

进一步的，所述步骤（1）中的NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因具有下列核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

（2）与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。

进一步的，所述步骤（3）中的阿洛醇溶液是由pH为10.0、浓度为20 mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制得到的。

进一步的，所述LBG液体培养基包括10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L氯化钠和5 g/L葡萄糖。

进一步的，所述清液中D-阿洛酮糖的浓度高于50 g/L。

进一步的，所述D-阿洛酮糖的转化率高于50%。

与现有技术相比，本发明的具有以下优点：

本发明是首次利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）的重组菌株作为生物催化剂，催化阿洛醇转化生产D-阿洛酮糖。本发明方法简单、快速，通过离心的方式即可容易地得到细胞催化剂，不需要额外对酶进行纯化或是固定化等耗时耗力的操作，并且反应条件温和、产物浓度高、转化率高、转化时间短、副产物少，产物易分离，成本低，不仅有效的拓展了D-阿洛酮糖的生产方法，还可用于D-阿洛酮糖的大规模生产。

附图说明

图1：重组质粒pETDuet_-1-MCSⅡadh构建图。

图2：SDS-PAGE重组蛋白分析图；其中M：protein marker；1：重组对照菌株E.coliBL21 star (DE3)-pETDuet_-1；2：重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh。

图3：重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh催化阿洛醇产生D-阿洛酮糖的高效液相色谱图；其中①：阿洛醇标准品；②：D-阿洛酮糖标准品；③：反应液。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）来源于Gluconobacter frateurii NBRC 3264（NZ_BEWN01000006.1），该酶的ID号码为WP_099183078.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，具体如下：

步骤1：NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因adh的优化合成

NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因adh是根据NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）的原始序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化后合成的，优化后的NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因adh的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤2：构建重组质粒pETDuet_-1-MCSⅡadh

将优化后的adh目的基因连接到pETDuet_-1的限制性酶切位点NdeⅠ和 Xho Ⅰ之间，构建得到重组质粒 pETDuet_-1-MCSⅡadh（图1）。

步骤3：构建重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh

取50 μL表达感受态细胞 E.coliBL21 star (DE3)，加入5 μL重组质粒pETDuet_-1-MCSⅡadh，冰浴30 min，然后在42 ℃水浴中热击45 s，再立即冰浴2 min，而后加入500 μL无菌无抗生素的LB液体培养基，37 ℃，200 rpm复苏1 h后取100 μL转化液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，37 ℃静置培养过夜。次日，从LB固体平板上挑取单菌落转接至含有10 mL LB培养基的50 mL锥形瓶中，并添加氨苄青霉素至浓度为100 μg/ml，37 ℃，200 rpm培养12 h，甘油管保菌备用。

另外采用与上述相同的步骤，利用空白质粒pETDuet_-1构建重组菌株E. coli BL21star (DE3)-pETDuet_-1作为对照菌株。

按照1%的接种量将重组菌株E. coli BL21 star (DE3)-pETDuet_-1和E. coliBL21 star (DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh分别接种于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃，200 rpm培养3 h，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM，并将温度降低到20 ℃，转速降低至100 rpm，诱导培养12 h；取1mL诱导培养结束后的菌液，14000 rpm离心1min，除去培养基上清，得到菌体；用无菌双蒸水重悬洗涤菌体两次，14000 rpm离心1 min，去除上清，得到菌体；最后加入400 μL 无菌双蒸水重悬菌体，分别取30 μL样品用于检测全蛋白。

在上述30 μL样品中加入6 μL 5×Loading buffer，充分混匀后利用PCR仪100 ℃裂解10 min变性，而后进行SDS-PAGE蛋白电泳检测全蛋白，验证目的蛋白是否表达。经SDS-PAGE蛋白电泳分析（图2），与对照重组菌株相比，NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）成功表达。

步骤4：重组菌株E. coli BL21 star (DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh转化阿洛醇为D-阿洛酮糖

（1）先提前利用重组菌株E. coli BL21 star (DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh进行转化阿洛醇为D-阿洛酮糖的有效性验证：按照1%的接种量将重组菌株E. coli BL21 star(DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh接种于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LBG液体培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L氯化钠和5 g/L葡萄糖）中，37 ℃，200 rpm培养3 h，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM，并将温度降低到20 ℃，转速降低至100 rpm，继续培养12 h；培养结束后，菌液10000 rpm离心5 min收集菌体，并用pH 10.0，20 mM 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体三次，离心收集菌体；然后用10 g/L阿洛醇溶液（pH 8.0，20 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ 缓冲液配制）重悬菌体至细胞用量OD₆₀₀为40，置于45 ℃，100 rpm摇床中反应1 h。将反应后的转化液14000 rpm离心3 min除去菌体，上清液煮沸5 min后再离心，得到的上清液经0.22 μm孔径超滤膜滤器过滤，最后用高效液相色谱法对反应液进行分析，所用仪器为日本岛津液相色谱仪，检测器为示差折光检测器（RID），色谱柱为赛分科技有限公司的Carbomix Pb-NP 10: 8% (7.8×300 mm，10 μm）分析柱，流动相为双蒸水，柱温78 ℃，流速0.5 ml/min，进样量为10 μl。

结果（图3）发现重组菌株E. coli BL21 star (DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh能够催化阿洛醇生产出D-阿洛酮糖。

（2）正式转化：按照1%的接种量将重组菌株E. coli BL21 star (DE3)-pETDuet_-1-MCSⅡadh接种于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LBG液体培养基中，37 ℃，200 rpm培养3 h，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM，并将温度降低到20 ℃，转速降低至100 rpm，继续培养12 h；培养后的菌液10000 rpm离心5 min收集菌体，并用pH 10.0，20 mM 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体三次，离心收集菌体；然后用100 g/L阿洛醇溶液（pH 10.0，20 mM 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制）重悬菌体至细胞用量OD₆₀₀为80，置于50 ℃，200 rpm摇床中反应12 h；将反应液于14000 rpm离心3 min去除菌体，所得的上清液煮沸5 min后再离心，得到的上清液经0.22 μm孔径超滤膜滤器过滤，得到的上清液（滤液）中即含有D-阿洛酮糖。

用高效液相色谱法对反应液进行分析，结果发现过滤液中D-阿洛酮糖的浓度为51.2 g/L，D-阿洛酮糖的转化率（D-阿洛酮糖与阿洛醇的摩尔比）高达52%，远高于由差向异构酶催化生产d-阿洛酮糖的转化率。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛龙鼎生物技术有限公司

<120> 一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> NAD(P-依赖型醇脱氢酶Gluconobacter frateurii )

<400> 1

Met Ala Gln Ala Leu Val Leu Glu Lys Lys Gly Glu Leu Ser Leu Arg

1 5 10 15

Glu Ile Ala Leu Pro Ser Glu Leu Gly Pro Asn Asp Val Arg Ile Ala

20 25 30

Ile His Thr Val Gly Ile Cys Gly Ser Asp Val His Tyr Tyr Thr His

35 40 45

Gly Ala Ile Gly Pro Phe Val Val Arg Glu Pro Met Val Leu Gly His

50 55 60

Glu Ala Ser Gly Thr Ile Thr Glu Ile Gly Ser Asn Val Arg Ser Leu

65 70 75 80

Lys Val Gly Asp Arg Val Cys Met Glu Pro Gly Ile Pro Asp Pro Gln

85 90 95

Ser Arg Ala Thr Leu Met Gly Gln Tyr Asn Val Asp Pro Ala Val Arg

100 105 110

Phe Trp Ala Thr Pro Pro Ile His Gly Cys Leu Thr Pro Ser Val Val

115 120 125

His Pro Ala Ala Phe Thr Phe Lys Leu Pro Asp Asn Val Ser Phe Ala

130 135 140

Glu Gly Ala Met Ile Glu Pro Leu Ala Val Gly Val His Ala Ser Val

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ile Lys Pro Gly Asp Ile Cys Leu Val Thr Gly Cys Gly

165 170 175

Pro Ile Gly Ile Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gly

180 185 190

Gln Val Phe Ile Thr Asp Leu Ala Pro Ala Lys Leu Ala Ile Ala Gly

195 200 205

Gln Tyr Asp Gly Ile Arg Pro Ile Asn Val Arg Asp Glu Lys Pro Arg

210 215 220

Asp Val Val Asp Ala Thr Cys Gly Ser Asp Trp Gly Val Asp Val Val

225 230 235 240

Phe Glu Ala Ser Gly Phe Ala Gly Ala Tyr Asp Asp Ala Leu Ala Cys

245 250 255

Val Arg Pro Gly Gly Thr Ile Val Phe Val Gly Met Pro Ile Gln Lys

260 265 270

Val Pro Phe Asp Ile Val Ala Ala Gln Ala Lys Glu Ile Arg Met Glu

275 280 285

Thr Val Phe Arg Tyr Ala Asn Val Tyr Asp Arg Ala Ile Arg Leu Ile

290 295 300

Ser Ala Gly Lys Ile Asp Leu Lys Pro Leu Val Ser Glu Thr Phe Pro

305 310 315 320

Phe Asp Gln Gly Ile Ala Ala Phe Glu Arg Ala Ala Glu Ala Arg Pro

325 330 335

Ser Asp Val Lys Leu Gln Ile Val Leu

340 345

<210> 3

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcccagg ccctggtgct ggaaaagaaa ggcgaactga gtctgcgcga aattgccctg 60

ccgagcgaac tgggtccgaa tgatgttcgt attgcaattc ataccgtggg catttgtggc 120

agcgatgtgc attattatac ccatggtgcc attggtccgt ttgttgttcg cgaaccgatg 180

gttctgggcc atgaagcaag tggcaccatt accgaaattg gtagtaatgt gcgcagtctg 240

aaagttggcg atcgtgtttg catggaaccg ggcattccgg atccgcagag tcgcgcaacc 300

ctgatgggtc agtataatgt ggatccggcc gtgcgctttt gggcaacccc gcctattcat 360

ggttgcctga ccccgagtgt ggtgcatccg gcagcattca cttttaaact gccggataat 420

gttagttttg ccgaaggcgc catgattgaa ccgctggcag tgggtgtgca tgcaagcgtg 480

aaagcagcca ttaagccggg tgacatttgt ctggtgaccg gctgcggtcc gattggtatt 540

atgaccgccc tggcagccct ggccagtggc gcaggtcagg tgtttattac cgatctggcc 600

ccggcaaaac tggcaattgc aggtcagtat gatggtattc gcccgattaa tgttcgtgat 660

gaaaaaccgc gtgatgtggt tgatgcaacc tgtggcagcg actggggtgt ggatgttgtg 720

tttgaagcaa gcggttttgc cggcgcatac gatgatgccc tggcctgcgt gcgtccgggc 780

ggtaccattg tgtttgtggg tatgccgatt cagaaagtgc cgtttgatat tgtggccgcc 840

caggcaaaag aaattcgtat ggaaaccgtg tttcgctatg ccaatgttta tgatcgtgca 900

attcgcctga ttagtgcagg caaaattgat ctgaaaccgc tggtgagcga aacctttccg 960

tttgatcagg gtattgccgc atttgaacgt gccgcagaag cacgcccgag cgatgttaaa 1020

ctgcagattg ttctgtaa 1038

Claims

1.一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因连接到载体质粒上，得到重组质粒；所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶来源于Gluconobacter frateurii NBRC 3264；所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到重组菌株；

（3）将重组菌株接种到含有氨苄青霉素的培养基中培养后，在诱导剂的作用下，于低温诱导培养；培养结束后离心收集菌体，菌体经缓冲液重复洗涤后，使用阿洛醇溶液重悬菌体，重悬的菌体再经摇床培养后离心取上清液，上清液煮沸后经超高速离心或超滤，所得的清液中即含有D-阿洛酮糖。

2.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的转化条件为：将重组质粒以1：10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴后热击，再立即冰浴，而后加入LB液体培养基中复苏，再将菌液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，静置培养过夜；再挑取单菌落转接至LB液体培养基中，并添加氨苄青霉素，37℃摇床培养后得到重组菌株。

3.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的诱导培养的条件为：将重组菌株以1%的接种量接种到含有氨苄青霉素的LBG培养基中，37 ℃培养，然后加入诱导剂IPTG，并降低温度至20 ℃，继续摇床诱导培养。

4.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，其浓度为20 mM，pH为10.0。

5.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中阿洛醇溶液浓度为100 g/L，是由pH为10.0、浓度为20 mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制得到的。

6.根据权利要求5所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中摇床培养的条件为：重悬的菌体用阿洛醇溶液重悬至细胞用量OD₆₀₀为40-80，置于45-50 ℃的摇床中反应10-12 h，得到反应液。

7.根据权利要求6所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）中超高速离心或超滤的条件为：将反应液14000rpm离心取上清液，上清液煮沸后再离心，或经0.22 μm孔径超滤膜滤器过滤，得到的清液中即含有D-阿洛酮糖。

8.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述清液中D-阿洛酮糖的浓度高于50 g/L。