CN117646047A - 一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法。本发明通过构建一株共表达葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的重组大肠杆菌，该重组菌株具有较强的底物耐受性。当底物D‑葡萄糖的浓度分别为100、600和900g/L时，反应达到平衡，浓度比D‑葡萄糖：D‑果糖：D‑阿洛酮糖＝2.3:2.1:1.0或2.5:2.0:1.0或2.5:2.0:1.0，最终能够获得含有D‑阿洛酮糖浓度占比为18％以上的高果糖浆溶液。因此，本发明可用于含有D‑阿洛酮糖和D‑果糖糖浆的工业化生产，具有显著的工业应用潜力和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法。
背景技术
高果糖浆是一种同时含有游离果糖和游离葡萄糖的混合物，具有良好的风味、色泽、质地和稳定性。目前，高果糖浆作为一种人工合成甜味剂、蔗糖替代品已经融入到人们的日常生活中，广泛应用于碳酸饮料、烘焙食品、水果罐头、乳制品等行业。然而食糖过量导致患肥胖、糖尿病等慢性疾病的人群不断增加，消费者谈糖色变。稀有糖是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，具有低热量、低吸收、生理活性显著等特点，引起人们的广泛关注。稀有糖D-阿洛酮糖是近两年备受瞩目的天然功能性低热量甜味剂，是一种良好的蔗糖替代品，具有低热减脂、保健、抗龋齿、神经保护等生理功能，其安全性已经得到美国食品药品监督管理局认证。D-阿洛酮糖兼具口感和安全性优势，在膳食、医药、保健、减糖等领域具有重要应用。制备含有稀有糖D-阿洛酮糖和D-果糖的糖浆，对于提升两种甜味剂的价值，赋予糖浆保健功能具有重要意义，对于满足日益升级的消费市场需求具有重大研究价值。
高果糖浆的制备方法主要有酸转化法和酶转化法。其中，酸转化法需要用到大量酸和碱，操作繁琐复杂、成本高、产品质量把控困难，而且对环境不利。相比之下，酶转化法生产高果糖浆更加简单、高效、绿色清洁。D-阿洛酮糖的来源有天然原料提取法、化学合成法和生物转化法，相比前两种方法，生物转化法具有操作简单、成本低、得率高、环境友好等优点，成为工业化生产稀有糖的首选方法。D-阿洛酮糖的生物合成路径有异构酶和氧化还原酶催化路径。它们各有优缺点，但是异构酶催化反应路径因为不需要额外添加辅酶、成本低、产量高等优点更受工业化青睐。因此，探索一种操作简单、效率高且成本低的制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法非常迫切。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，包括以下步骤：
(1)合成葡萄糖异构酶基因gi和D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe；
(2)构建重组质粒pET28a-gi：将所述步骤(1)中的葡萄糖异构酶基因gi连接到载体质粒pET28a的限制性酶切位点Nde I和BamH I之间，构建得到重组质粒pET28a-gi；
(3)构建重组质粒pET28a-gi-dpe：将所述步骤(1)中的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe连接到所述步骤(2)中的重组质粒pET28a-gi的限制性酶切位点EcoR I和Xho I之间，得到重组质粒pET28a-gi-dpe；
(4)构建重组菌株：将所述步骤(3)中的重组质粒pET28a-gi-dpe以1:10的体积比加入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，冰浴30min，再在42℃水浴中热击45s，立即冰浴2min，而后加入LB液体培养基中37℃，200rpm复苏1h，再将菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃静置培养过夜；挑取单菌落转接至LB液体培养基中，并添加卡那霉素至浓度为100μg/ml，37℃、200rpm培养12h，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe；
(5)将所述步骤(4)中的重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe接种于含有100μg/ml卡那霉素的YP0液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.025mM，调整温度和转速为37℃和180rpm继续诱导培养6h；培养后的菌液10000rpm离心5min收集菌体；
将收集的菌体用双蒸水洗涤菌体3±1次，离心收集菌体，用含有D-葡萄糖和20mM磷酸氢二钠的底物溶液(用磷酸二氢钠调整pH至7.0)重悬菌体至OD600为30构建生物合成D-阿洛酮糖的反应体系，置于70℃恒温水浴锅中反应12h，将反应后的反应液于14000rpm离心5min去除菌体，取上清液煮沸5min后再重复一次离心，取上清液经0.22μm孔径超滤膜滤器过滤，得到含D-阿洛酮糖的高果糖浆溶液。
进一步的，所述步骤(1)中的葡萄糖异构酶基因gi具有下列核苷酸序列之一：
(1)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步的，所述步骤(1)中的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe具有下列核苷酸序列之一：
(1)如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步的，所述步骤(3)中构建重组质粒p-gi-dpe过程中，所用的引物为：
DPE-pET28a-EcoRⅠ-U：
CCGGAATTCAAGGAGAAAATAATGAAGTACGGTATCTACTAC；
DPE-pET28a-XhoⅠ-D：
CCGCTCGAGTATCTTCGTCCTCATCTTCGTCCTCATCTTCGTCGTCAAC。
进一步的，所述步骤(5)中的底物溶液中D-葡萄糖的浓度为100g/L-900g/L。
进一步的，所述YP0液体培养基的组成为：15g/L葡萄糖，13.3g/L KH2PO4，4g/L(NH4)2HPO4，1.2g/L MgSO4·7H2O，1.7g/L柠檬酸，10g/L玉米浆。
进一步的，所述高果糖浆中D-阿洛酮糖的浓度不低于18％。
与现有技术相比，本发明的有益效果和优点是：
本发明开发了一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，具有巨大工业化生产潜力。当底物D-葡萄糖的浓度分别为100、600和900g/L时，反应达到平衡，所得D-阿洛酮糖的浓度分别为18.6、110.4和163.8g/L，对应于D-阿洛酮糖的转化率分别为18.6、18.4和18.2％。
本发明利用同时表达具有高底物耐受性的来自于Caldicellulosiruptor besciiDSM 6725的葡萄糖异构酶，和酶活稳定的来自于Ruminococcus sp.5_1_39BFAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组大肠杆菌作为生物催化剂，催化廉价底物D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖，该方法通过离心的方式即可容易地得到细胞催化剂，不需要额外对酶进行纯化或是固定化等耗时耗力的操作，反应条件温和、操作简单、生产效率高且成本低，反应液中底物D-葡萄糖的浓度可以高达900g/L，反应达到平衡浓度比D-葡萄糖：D-果糖：D-阿洛酮糖＝2.5:2.0:1:0。本发明可用于含有D-阿洛酮糖和D-果糖糖浆的工业化生产，具有显著的工业应用潜力和应用前景。
附图说明
图1：重组质粒pET28a-gi-dpe构建图。
图2：E.coli DH5α-pET28a-gi-dpe菌落PCR验证图(A)和重组质粒pET28a-gi-dpe双酶切验证图(B)；其中，M1，250bp-ⅠDNA Marker；C1，阳性对照；C2，阴性对照；1-10，以单菌落为模板的PCR产物；M2，1kbp-ⅠDNA Marker；11，双酶切产物。
图3：SDS-PAGE重组蛋白分析图；其中，M，M5 prestained protein ladder(10-180kDa)；1，E.coli BL21(DE3)-pET28a全蛋白；2，E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe全蛋白。
图4：当底物D-葡萄糖的浓度分别为100g/L(A)、600g/L(B)和900g/L(C)时，D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖浓度随时间的变化趋势。
图5：当底物D-葡萄糖的浓度分别为100g/L、600g/L和900g/L时，所需细胞用量的优化结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中，初始葡萄糖异构酶基因gi来源于Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；初始D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe来源于Ruminococcus sp.5_1_39BFAA，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
实施例1：一种制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，具体步骤如下：
(1)合成葡萄糖异构酶基因和D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因
葡萄糖异构酶基因gi是根据初始葡萄糖异构酶基因如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始核苷酸序列SEQ ID No.2进行密码子优化后合成的，优化后的葡萄糖异构酶基因gi的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。优化后的密码子适应指数(Codon Adaption Index,CAI)为0.97(CAI值越接近1说明异源表达水平越高)，说明mRNA稳定性良好，密码子偏好性强，有利于蛋白的异源高效表达。葡萄糖异构酶基因gi密码子优化及合成是由北京擎科生物科技有限公司完成的，优化得到重组质粒pET28a-gi。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe是根据初始D-阿洛酮糖3-差向异构酶的如SEQID No.4所示的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子分析用表进行密码子优化后合成的，优化后的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，密码子优化及合成是由北京擎科生物科技有限公司完成的，得到重组质粒pET22(b)-dpe。
(2)构建重组质粒pET28a-gi-dpe
a.PCR扩增dpe基因片段
以公司合成的pET22(b)-dpe为模板，以DPE-pET28a-EcoRⅠ-U和DPE-pET28a-XhoⅠ-D为引物，按照表1所示的反应体系和表2所示的反应程序进行PCR扩增dpe基因片段。PCR扩增反应结束后，利用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因产物。
所用引物：
DPE-pET28a-EcoRⅠ-U：
CCGGAATTCAAGGAGAAAATAATGAAGTACGGTATCTACTAC(SEQ IDNo.6，斜体为酶切位点EcoRⅠ)；
DPE-pET28a-XhoⅠ-D：
CCGCTCGAGTATCTTCGTCCTCATCTTCGTCCTCATCTTCGTCGTCAAC(SEQ ID No.7，斜体为酶切位点XhoⅠ)。
表1.PCR扩增反应体系
表2.PCR扩增反应程序
b.双酶切pET28a-gi重组质粒和dpe基因片段
按照表3所示的反应体系双酶切pET28a-gi重组质粒和PCR扩增并回收得到的dpe基因片段，37℃水浴酶切pET28a-gi重组质粒4h，37℃水浴酶切dpe基因片段4h，双酶切产物利用DNA纯化回收试剂盒进行回收。
表3.双酶切反应体系
c.连接双酶切后的pET28a-gi重组质粒和dpe基因片段
利用T4 DNA连接酶连接双酶切回收后的pET28a-gi重组质粒和dpe基因片段，按照表4所示反应体系配制连接反应溶液，充分混匀后置于22℃低温恒温槽中连接2h。
表4.连接反应体系
d.转化克隆感受态细胞E.coli DH5a
取5μL连接液加入到50μL克隆感受态细胞E.coli DH5α中，放入冰水浴中保持30min，然后放入42℃恒温水浴中热击45s，热击后立即放入冰水浴中保持2min，而后加入500μL无菌无抗生素的LB液体培养基；放入37℃、200rpm摇床中复苏1h，然后取100μL转化液涂布于含有100μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，37℃静置培养过夜。次日，从LB固体平板上挑取单菌落转接至含有10mL LB培养基的50mL锥形瓶中，并添加卡那霉素至终浓度为100μg/ml，37℃，200rpm培养12h，获得重组菌株E.coli DH5-pET28a-gi-dpe，此重组菌可以实现重组质粒pET28a-gi-dpe的多克隆拷贝，甘油管保菌备用。其中，经菌落PCR验证(图2A)、双酶切验证(图2B)以及公司测序验证，证实重组质粒pET28a-gi-dpe构建成功(图1)，菌落PCR验证和双酶切验证参考上述a和b的方法，公司测序验证为北京擎科生物科技有限公司。
(3)转化表达感受态细胞E.coli BL21(DE3)及蛋白表达验证
取5μL重组质粒pET28a-gi-dpe加入到50μL表达感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，放入冰水浴中保持30min，然后放入42℃恒温水浴中热击45s，热击后立即放入冰水浴中保持2min，而后加入500μL无菌无抗生素的LB液体培养基；放入37℃、200rpm摇床中复苏1h，然后取100μL转化液涂布于含有100μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，37℃静置培养过夜。次日，从LB固体平板上挑取单菌落转接至含有10mL LB培养基的50mL锥形瓶中，并添加卡那霉素至终浓度为100μg/ml，37℃、200rpm培养12h，获得重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe。同样的方法构建重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a作为对照菌株。
将重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a和E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe分别接种于含有100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.025mM，调整温度和转速为37℃和180rpm诱导培养12h；取1mL诱导培养结束后的菌液，14000rpm离心5min，除去培养基上清，得到菌体；用无菌双蒸水重悬洗涤菌体两次，14000rpm离心5min，去除上清，得到菌体；最后加入400μL无菌双蒸水重悬菌体，分别取30μL样品用于检测全蛋白。在上述30μL样品中加入6μL 5×Loadingbuffer，充分混匀后利用PCR仪100℃裂解10min变性，而后进行SDS-PAGE蛋白电泳检测全蛋白，验证目的蛋白是否表达。经SDS-PAGE蛋白电泳分析(图3)，与对照重组菌株相比，葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶成功表达。
(4)重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe的诱导培养
按照1％接种量将重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe接种到含有100μg/ml卡那霉素的YP0液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.025mM，调整温度和转速为37℃和180rpm诱导培养6h。
其中，YP0液体培养基的组成为：15g/L葡萄糖，13.3g/L KH2PO4，4g/L(NH4)2HPO4，1.2g/L MgSO4·7H2O，1.7g/L柠檬酸，10g/L玉米浆。除葡萄糖和MgSO4·7H2O外，其它成分溶解混匀后用5M氢氧化钠溶液调节pH 7.0，然后115℃灭菌30min；葡萄糖(500g/L)和MgSO4·7H2O(120g/L)母液单独灭菌后再按照相应的需求浓度添加到培养基中。
(5)含D-阿洛酮糖和D-果糖的阿洛酮糖、果糖浆的制备
收集(4)诱导培养得到的菌体，利用双蒸水洗涤3次，10000rpm离心5min收集菌体；用含有100g/L D-葡萄糖和20mM磷酸氢二钠的底物溶液(用磷酸二氢钠调整pH至7.0)重悬菌体至OD600为30，置于70℃恒温水浴锅中反应12h。反应结束后，将反应液于14000rpm离心5min去除菌体，所得到的上清液煮沸5min后再离心，得到的上清液经稀释后用0.22μm孔径的水系小滤器过滤，经高效液相色谱法(HPLC)对反应液进行分析，HPLC条件详见表5。如图4A所示，当D-葡萄糖的浓度为100g/L时，反应3h达到转化反应平衡，此时反应液中D-葡萄糖的浓度为43.2g/L、D-果糖的浓度为38.2g/L、D-阿洛酮糖的浓度为18.6g/L，浓度比D-葡萄糖：D-果糖：D-阿洛酮糖＝2.3:2.1:1.0。
表5.HPLC检测条件
实施例2：细胞用量优化
重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe的构建、培养和收集同实施例1中的步骤(1)-(5)。
利用双蒸水洗涤菌体3次，10000rpm离心5min收集菌体；用含有100g/L(或600g/L或900g/L)D-葡萄糖和20mM磷酸氢二钠的底物溶液(用磷酸二氢钠调整pH至7.0)重悬菌体至OD600为5、10、15、20、25、30、35和40，置于70℃恒温水浴锅中反应12h。反应结束后，将反应液于14000rpm离心5min去除菌体，所得到的上清液煮沸5min后再离心，得到的上清液经稀释后用0.22μm孔径的水系小滤器过滤，经高效液相色谱法(HPLC)对反应液进行分析，HPLC条件详见表5。如图5所示，当D-葡萄糖的浓度为100、600和900g/L时，最佳细胞用量皆为30。
实施例3：含阿洛酮糖的高果糖浆的制备
重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe的构建、培养和收集同实施例1中的步骤(1)-(5)。
利用双蒸水洗涤菌体3次，10000rpm离心5min收集菌体；用含有600g/LD-葡萄糖和20mM磷酸氢二钠的底物溶液(用磷酸二氢钠调整pH至7.0)重悬菌体至OD600为30，置于70℃恒温水浴锅中反应12h。反应结束后，将反应液于14000rpm离心5min去除菌体，所得到的上清液煮沸5min后再离心，得到的上清液经稀释后用0.22μm孔径的水系小滤器过滤，经高效液相色谱法(HPLC)对反应液进行分析，HPLC条件详见表5。如图4B所示，当D-葡萄糖的浓度为600g/L时，反应10h达到转化反应平衡，此时反应液中D-葡萄糖的浓度为271.8g/L、D-果糖的浓度为217.8g/L、D-阿洛酮糖的浓度为110.4g/L，质量比D-葡萄糖：D-果糖：D-阿洛酮糖＝2.5:2.0:1.0。
实施例4：含阿洛酮糖的高果糖浆的制备
重组菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a-gi-dpe的构建、培养和收集同实施例1中的步骤(1)-(5)。
利用双蒸水洗涤菌体3次，10000rpm离心5min收集菌体；用含有900g/LD-葡萄糖和20mM磷酸氢二钠的底物溶液(用磷酸二氢钠调整pH至7.0)重悬菌体至OD600为30，置于70℃恒温水浴锅中反应12h。反应结束后，将反应液于14000rpm离心5min去除菌体，所得到的上清液煮沸5min后再离心，得到的上清液经稀释后用0.22μm孔径的水系小滤器过滤，经高效液相色谱法(HPLC)对反应液进行分析，HPLC条件详见表5。如图4C所示，当D-葡萄糖的浓度为900g/L时，反应12h达到转化反应平衡，此时反应液中D-葡萄糖的浓度为409.2g/L、D-果糖的浓度为327.0g/L、D-阿洛酮糖的浓度为163.8g/L，质量比D-葡萄糖：D-果糖：D-阿洛酮糖＝2.5:2.0:1.0。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成葡萄糖异构酶基因gi和D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe；
(2)将所述步骤(1)中的葡萄糖异构酶基因gi连接到载体质粒上，得到重组质粒p-gi；
(3)将所述步骤(1)中的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe连接到所述步骤(2)中的重组质粒p-gi上，得到重组质粒p-gi-dpe；
(4)将所述步骤(3)中的重组质粒p-gi-dpe转化感受态细胞，培养筛选后得到重组菌株；
(5)将所述步骤(4)中的重组菌株进行诱导培养，收集得到的菌体利用含有D-葡萄糖的底物溶液重悬，并经恒温反应、离心，取上清液经过滤得到含D-阿洛酮糖的高果糖浆溶液。
2.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的葡萄糖异构酶基因gi具有下列核苷酸序列之一：
(1)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe具有下列核苷酸序列之一：
(1)如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(3)中构建重组质粒p-gi-dpe过程中，所用的引物为：
DPE-pET28a-EcoRⅠ-U：
CCGGAATTCAAGGAGAAAATAATGAAGTACGGTATCTACTAC；
DPE-pET28a-XhoⅠ-D：
CCGCTCGAGTATCTTCGTCCTCATCTTCGTCCTCATCTTCGTCGTCAAC。
5.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的底物溶液中D-葡萄糖的浓度为100g/L-900g/L。
6.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的底物溶液中还含有浓度为20mM的磷酸氢二钠，其pH值为7.0。
7.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的利用含有D-葡萄糖的底物溶液重悬菌体至OD600为28-32。
8.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(5)中恒温反应的温度为69℃-71℃，反应时间为10h-14h。
9.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(5)中诱导培养使用的是含有100μg/ml卡那霉素的YP0液体培养基；所述YP0液体培养基的组成为：15g/L葡萄糖，13.3g/L KH2PO4，4g/L(NH4)2HPO4，1.2g/L MgSO4·7H2O，1.7g/L柠檬酸，10g/L玉米浆。
10.根据权利要求1所述的一种简单高效制备含阿洛酮糖的高果糖浆的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的载体质粒为pET28a，所述步骤(4)中的感受态细胞为E.coli DH5α或E.coli BL21(DE3)。
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