CN104651336B - α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶及其在制备人参皂苷Rd中的应用 - Google Patents

Abstract

α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶及其在制备人参皂苷Rd中的应用，属于基因工程技术及生物医药领域，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶对人参皂苷Rc的转化能力强，本发明所述α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶与人参皂苷Rc孵育一定时间后经检测，人参皂苷Rc几乎完全转化为人参皂苷Rd。本发明所述α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯糖具有较高的耐受能力，且不被葡萄糖反馈抑制。

Description

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其在制备人参皂苷Rd中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用，尤其是酶法转化多组分人参皂苷Rc制备人参皂苷Rd的应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种多年生草本植物，喜阴凉。野生人参的肉质根是我国传统名贵中草药，具有调节血压、保护心脏、抗神经衰弱、改善糖尿病症状等功效，现代医学研究证明人参皂苷是人参中的主要有效成本之一，同时部分人参皂苷的单体具有显著的抗癌功效，使得对人参皂苷的深入研究成为热点。

根据目前已有的报道，超过180种人参皂苷的单体被分离鉴定，但人参皂苷的各种单体在药理活性方面存在着较大的差异。其中，人参皂苷Rd因其独特的药理活性受到广泛关注。研究表明，人参皂苷Rd可以促进神经干细胞分化形成星形胶质细胞，该种细胞对记忆与认知能力具有显著的影响，同时可以降低神经毒素对海马体的毒性作用，从而起到保护记忆能力的作用，这使得人参皂苷Rd具有被开发成治疗阿尔兹海默症药物的潜力；人参皂苷Rd可以防止因局部缺血或再循环障碍引起的肾功能不全，同时具有可以减缓某些原因引起的主动脉环的剧烈收缩，从而起到保护心血管的作用。诸多生物活性使得人参皂苷Rd在医药领域显示出巨大的应用前景，因此，开发一种高效专一、低成本且绿色环保的人参皂苷Rd生产工艺具有重要的理论和实际应用价值。

根据国内外现有的研究报道，我们认为，与物理或化学法相比，通过酶转化多组分人参皂苷生成稀有人参皂苷制备具有明显的优势，酶法制备的条件温和且专一、高效。目前酶转化制备人参皂苷的研究大部分集中在通过酶处理或微生物酶处理将多组分人参皂苷Rb1转化成部分稀有人参皂苷，而对于其它两种多组分人参皂苷Rb2和Rc的生物转化却极少有报道。根据人参皂苷Rd与多组分人参皂苷Rc在结构方面的比较发现(图1)，它们都具有相同的达玛烷骨架，仅在碳20位相差一个糖基，如去除Rc20位的相应糖基即可得到Rd。

而目前所缺少的能够高效转化人参皂苷Rb2或Rc的水解酶，成为了酶转化制备稀有组分人参皂苷的技术瓶颈之一，因此发掘这类水解酶将为高效转化人参皂苷多组分制备人参皂苷稀有组分Rd提供了新技术。此外，有了大量的Rd，也为进一步将Rd转化生成人参皂苷Rg3，Rh2和CK等活性稀有组分提供了技术支撑。据此，本专利提供了一种耐高温α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf及与其相关的一种高效利用多组分人参皂苷Rc制备稀有人参皂苷Rd的方法。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对问题，本申请人提供了一种耐高温α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其在制备人参皂苷Rd中的应用，并通过基因工程技术获得催化性能稳定，成分单一的重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf，该重组酶TthArf对人参皂苷Rc具有较强的催化能力，同时能耐受较高浓度的阿拉伯糖，可降低产物反馈抑制对酶活力的影响。因此，通过TthArf转化制备人参皂苷Rd的方法是一种高效、便捷的方法。

技术方案：一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的制备方法，将SEQ ID NO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，经其诱导表达和目的蛋白纯化而得。

所述制备方法的具体步骤如下：

（1）、以提取的Thermotoga thermarum DSM 5069基因组DNA为模板，用具有SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，扩增得到SEQ ID NO.2所示的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA片段；

（2）、将得到的DNA片段和载体质粒pET-28a分别用Nco I和Xho I进行双酶切，连接得到含有α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因的重组表达质粒；

（3）、将步骤（2）得到的重组表达质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，加入诱导剂于30℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。

包含编码所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA片段的重组质粒。

所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在pH 4-8，温度40℃-95℃，酶解人参皂苷Rc制备得到人参皂苷Rd。

上述pH优选为5.5，温度优选为95℃。

所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用，包含α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在与β-葡萄糖苷酶协同作用于Rb1、Rb2、Rc多组分人参皂苷制备稀有人参皂苷中的应用。

有益效果：（1）本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对人参皂苷Rc的转化能力强，本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与人参皂苷Rc孵育一定时间后经检测，人参皂苷Rc几乎完全转化为人参皂苷Rd。

（2）本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯糖具有较高的耐受能力，且不被葡萄糖反馈抑制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶转化人参皂苷Rc生成人参皂苷Rd的水解线路图。

图2为实施例2纯化的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的纯度鉴定结果图；其中泳道M为蛋白Marker(购自Thermo scientific公司，货号2661)，依次为PET-28a转化宿主菌空白对照的全细胞裂解液，诱导表达后全细胞裂解液以及α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶纯酶蛋白。

图3为实施例3本发明所述述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的定性测定结果图，其中a为最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位%；b为最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度（℃），纵坐标为相对酶活力，单位%； c为pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位%； d为温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时（min），纵坐标为相对酶活力，单位%。

图4所示为实施例4本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的单糖抑制系数Ki测定结果图。横坐标为反应体系中葡萄糖及阿拉伯糖添加量，单位mM，纵坐标为相对酶活力，单位%。

图5为人参皂苷Rc经α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶制TthArf备生成人参皂苷Rd的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种耐高温α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为TthArf。

本发明也提供了编码本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的基因片段。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了所述的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为了制备本发明所述酶蛋白，还提供了本发明所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的制备方法

在一些实施方案中，本发明所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的制备方法：获得本发明所述的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因片段，将该DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化表达宿主菌，在适宜诱导剂浓度下于30℃下诱导表达，分离纯化即得。

本发明同时还提供了一种包含本发明所述的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因片段的重组质粒，所述的重组质粒为pET-TthArf。

本发明所述转化表达宿主菌为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21、JM109系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为JM109(DE3)菌株。

本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的制备方法所述诱导表达分离纯化具体为于适宜诱导剂(IPTG)浓度下30℃诱导培养含重组质粒的表达宿主菌，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白。

本发明还提供了一种制备人参皂苷Rd的方法，具体为本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在pH 4-8，温度40℃-95℃，酶解人参皂苷Rc制备得到人参皂苷Rd。pH优选为5.5，温度优选为95℃。

本发明所述的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf可以高效水解人参皂苷Rc第20位C上α-1,6-阿拉伯呋喃糖苷酶苷键，制备得到人参皂苷Rd。在反应10min后即可检测人参皂苷Rd生成，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应40min后，人参皂苷Rc几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为93%。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南 第三版》。

实施例1：本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因的获得及重组质粒pET-TthArf的构建

1.1 Thermotoga thermarum DSM 5069的培养

Thermotoga thermarum DSM 5069购于DSMZ菌种保藏中心（www.dsmz.de）编号为5069，其培养基配方为：10 g/L淀粉、5 g/L胰蛋白胨、3 g/L酵母提取物、5 g/L肉浸液、10g/L 2-马啉乙磺酸、10 mg/L 七水合硫酸铁、1 mg/L 刃天青, 调整pH为7.2。用注射器按照0.5%接种量接种，85℃静止培养24 h，收集细胞。

1.2 基因组DNA的提取

（1）静置培养Thermotoga thermarum DSM 5069约24小时，取30 mL菌液4,000 g离心10 min收集细胞。

（2）用9.5 mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5 mL 10％十二烷基硫酸钠（SDS）和50 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混合均匀，37℃保温1 h。

（3）加入1.8 mL 5 mol/L NaCl，1.5 mL 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）/NaCl，混匀，65℃温育20 min。

（4）加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000 g离心10 min。

（5）为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000 g离心10 min。

（6）另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。

（7）用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗。

（8）用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5 mL离心管中。

（9）室温下风干，加500 μL TE 缓冲液溶解。

（10）取50 μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。

1.3 重组质粒pET-TthArf的构建

按照已知的Thermotoga thermarum DSM 5069全基因组序列（登录号：CP002351.1）筛选得到本发明所述编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的基因片段并设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：

P1：ATG CCATGG CTTACG AAATCAGTGTGAATC，下划线表示Nco I 位点（SEQ ID NO.3）。

P2：CCG CTCGAG TGATCTTTCTACTTCTATCAC，下划线表示Xho I 位点，并去除终止密码子（SEQ ID NO.4）。

以提取的Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5 min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40 μL石蜡油密封；28次循环（ 94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，2 min ）；72℃，10 min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化。得到编码本专利所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的基因片段。

将得到的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的基因片段和pET-28a分别用Nco I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高温α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf基因片段的重组质粒pET-TthArf，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的制备

将重组质粒pET-TthArf转化大肠杆菌JM109(DE3) 宿主菌（购自Novagen公司），在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl5 g/L，琼脂 15 g/L）上经过37℃培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50 μg/mL 卡那霉素）37℃，200 rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30℃培养8 h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15 min，收集菌体。

由于重组质粒pET-TthArf中含有His-tag标签，通过His•Bind Purification Kit（购自Novagen公司）进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：

A.样品的处理

（1）将洗涤过的菌体，用1×Binding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。

（2）破壁后，13,000 g离心30 min，取上清即为样品。

B.处理柱子

（1）取1 mL填料装柱。

（2）用3mL的无菌水洗柱子。

（3）用5mL的1×Charge Buffer洗柱子。

（4）用3mL的1×Binding Buffer洗柱子。

C.上样

（1）将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。

（2）用3 mL 1×Binding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。

（3）用4 mL含有20 mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。

（4）用80 mmol/L咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。

（5）用4 mL 1×Strip Buffer洗柱子。

通过此过程得到纯化的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，通过SDS-PAGE电泳后染色鉴定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的纯度，结果如图2所示。

由图2结果可见，TthArf基因在宿主菌JM109(DE3)中表达量较高，目的蛋白通过HisTag标签纯化后，其洗脱液中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf纯度较高，在55kDa处有单一的条带，达到电泳纯级别。

实施例3：本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf的定性测定

1、酶活的测定方法

反应体系100 μL，5 μL 20 mmol/L 对硝基苯α-D-阿拉伯呋喃糖苷（pNPArf）中加入85 μL 100 mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.0），先在90^oC孵育3 min，再加入10μL酶液（稀释到适宜浓度）反应10 min，显色后再加入1 mol/L的碳酸钠溶液600 μL终止反应。在405 nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1 μmol p-硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活力单位。

2、最适反应pH的测定

在不同的pH（3.0-7.5，100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）条件下，90℃分别测定酶活，结果如图3a所示。

由图3a结果可见，本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH为5.5。

3、最适反应温度的测定

在60-100℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 5.5，结果如图3b所示。

由图3b结果可见，本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应温度为95℃。

4、pH稳定性的测定

将纯化的重组酶TthArf在不同的pH（3.0-7，100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）下70℃处理1 h，与不保温酶的酶相比，结果如图3c所示。

5、温度稳定性的测定

在pH 6.0下，使酶在70℃，80℃，90℃温度下分别保温不同的时间（0，10，30，60，90，120 min），再测定相对酶活，以未保温（4℃保存）的酶活性为100%，结果如图3d所示。

实施例4：本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯糖及葡萄糖耐受能力测定。

测定方法：在相同的反应体系(100 μL, 10mM pNPG, 50mM pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液; )中加入葡萄糖或阿拉伯糖至不同终浓度,在最适反应条件下测定本发明所述阿拉伯呋喃糖苷酶活力，结果如图4所示。

由图4可知本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf在阿拉伯糖终浓度500mM的反应体系中，有近50%的残余酶活力，其Ki系数为500mM，且该α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在反应体系中葡萄糖终浓度为0-2000mM之间时，同样具有80%以上的酶活力，即该种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也可以应用于人参皂苷粗提物的水解，而其酶活力不被其它人参皂苷水解产生的葡萄糖所影响。

实施例5：本发明所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶TthArf转化人参皂苷Rc制备人参皂苷Rd

人参皂苷Rc标准品和人参皂苷Rd标准品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。

HPLC检测条件为:Agilent 1260 Infinity；DAD检测器检测波长为203nm，柱温为30℃，流动相流速为1.2mL/min (A:水，B:乙腈；0min，A:B为70:30；10min，A:B为55:45；15min，A:B为40:60；18min，A:B为40:60；20min A:B为70:30；23min A:B为70:30)。

酶转化人参皂苷Rc生成人参皂苷Rd。

酶转化反应体系为100μL，其中Rc浓度为27g/L，酶添加量约为1.5U/mL，反应在pH5.5，95℃下进行，分别对不同反应时间（0，10，20，30，40，50。60 min）的样品利用HPLC进行成分检测不同时间段内人参皂苷组分变化情况，在反应60min后，人参皂苷Rc几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为93%。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其在制备人参皂苷Rd中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Tyr Glu Ile Ser Val Asn Pro Ser Lys Thr Val Lys Pro Val

1 5 10 15

Ser Lys Tyr Ile Tyr Gly His Phe Thr Glu His Leu Gly Arg Cys Ile

20 25 30

Tyr Gly Gly Ile Tyr Glu Glu Gly Ser Pro Leu Ser Asp His Arg Gly

35 40 45

Phe Arg Lys Asp Val Leu Glu Ala Ile Lys Lys Ile Lys Val Pro Ile

50 55 60

Leu Arg Trp Pro Gly Gly Asn Phe Val Ser Asn Tyr His Trp Glu Asp

65 70 75 80

Gly Ile Gly Pro Lys Asp Gln Arg Pro Val Arg Phe Asp Leu Ala Trp

85 90 95

Gln Gln Glu Glu Thr Asn Arg Phe Gly Thr Asp Glu Phe Ile Glu Tyr

100 105 110

Cys Arg Glu Ile Lys Ala Glu Pro Tyr Ile Cys Val Asn Leu Gly Thr

115 120 125

Gly Thr Leu Asp Glu Ala Leu His Trp Leu Glu Tyr Cys Asn Gly Lys

130 135 140

Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Tyr Gly His Pro Glu

145 150 155 160

Pro Tyr Asn Val Lys Phe Trp Gly Ile Gly Asn Glu Met Tyr Gly Glu

165 170 175

Trp Gln Val Gly His Met Thr Ala Asp Glu Tyr Ala Arg Val Ala Lys

180 185 190

Glu Tyr Ala Lys Trp Met Lys Val Phe Asp Pro Ser Ile Lys Thr Ile

195 200 205

Ala Val Gly Cys Asp Asp His Glu Trp Asn Leu Lys Val Leu Asn Gln

210 215 220

Ala Gly Asp Val Phe Asp Tyr Ile Ser Tyr His Phe Tyr Thr Gly Ser

225 230 235 240

Glu Asn Tyr Tyr Glu Thr Val Ser Thr Val Tyr Leu Leu Glu Gln Arg

245 250 255

Leu Ile Gly Leu Lys Arg Leu Ile Glu Thr Ser Arg Thr Lys Arg Arg

260 265 270

Asn Glu Ile Lys Ile Ala Leu Asp Glu Trp Asn Val Trp Tyr Arg Val

275 280 285

Met Asp Asn Lys Leu Glu Glu Pro Tyr Asp Leu Thr Asp Gly Ile Phe

290 295 300

Ala Cys Gly Val Leu Ile Met Leu Gln Arg Ile Ser Asp Ile Val Pro

305 310 315 320

Ile Ala Asn Leu Ala Gln Leu Val Asn Ala Leu Gly Ala Ile His Thr

325 330 335

Glu Lys Asn Gly Ile Ile Leu Thr Pro Val Tyr Lys Ala Phe Glu Leu

340 345 350

Ile Val Asn His Ser Gly Glu Lys Leu Val Glu Thr Ile Val Glu Thr

355 360 365

Glu Thr Tyr Asp Ile Glu Gly Lys Met Phe Tyr Phe Lys Thr Pro Phe

370 375 380

Lys Val Tyr Asp Ala Lys Leu Leu Asp Ala Thr Ala Thr Ile Ser Glu

385 390 395 400

Asp Gly Lys Lys Leu Tyr Leu Ala Val Val Asn Tyr Asn Lys Asp Ser

405 410 415

Glu Ile Arg Cys Pro Ile Lys Ile Lys Gly Cys Gly Lys Lys Gln Ala

420 425 430

Lys Val Tyr Val Leu Asn Gly Pro Asp Ile Lys Ala Arg Asn Thr Leu

435 440 445

Glu Lys Pro Asn Val Val Asp Ile Val Glu Lys Thr Thr Ile Val Asp

450 455 460

Glu Glu Phe Glu Phe Thr Phe Glu Pro His Ser Cys Thr Val Ile Glu

465 470 475 480

Val Glu Arg Ser

<210> 2

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcttacg aaatcagtgt gaatccgagc aagactgtga aaccagttag caagtacatc 60

tacgggcatt tcactgagca tcttggaaga tgtatttacg gtgggattta cgaagaaggt 120

tcaccgctgt cggatcatcg tgggtttaga aaagacgtgc ttgaggcgat aaagaagatc 180

aaagttccaa ttctacgatg gccaggtgga aactttgtgt cgaattatca ttgggaagat 240

ggaattggtc caaaggatca aagacccgtg aggtttgatc ttgcttggca acaagaggaa 300

acgaacagat ttggtacaga tgaattcatc gaatactgtc gtgaaatcaa agcagaacca 360

tatatctgtg ttaaccttgg aactggtacc ttggacgagg cacttcattg gttggaatac 420

tgtaatggaa aaggtaacac atattatgct caacttagga gaaaatatgg tcatccagag 480

ccatataacg tcaaattctg gggtatagga aatgagatgt atggtgaatg gcaagttggg 540

catatgacag ccgatgaata tgcaagagtt gccaaagaat acgcaaaatg gatgaaagtt 600

ttcgatcctt cgataaaaac aatagcagtt ggatgtgatg accatgaatg gaatctaaag 660

gttttaaacc aagccggaga tgtttttgac tacatttctt accactttta cacgggatct 720

gaaaactact acgaaacggt gtccacagtt tatttgctag aacaaaggct tataggtctt 780

aaaaggctga tagaaacaag cagaacaaag cgaaggaatg aaataaaaat cgcgctcgat 840

gaatggaatg tttggtacag agtaatggat aacaaacttg aagaacctta cgatctaacc 900

gatggtattt tcgcctgcgg agttttgata atgcttcaaa gaatcagcga cattgttcca 960

atagcaaatc tcgctcagct tgtcaacgca cttggagcaa tacacacgga gaaaaacgga 1020

ataattttga cgcccgttta taaagctttc gagttaatag ttaatcacag cggagaaaaa 1080

ctcgttgaaa caattgttga aacagaaact tacgatatag aaggaaaaat gttctacttc 1140

aaaacgccgt ttaaagtcta cgatgcaaag cttttggacg caactgcaac gatttcagaa 1200

gatgggaaaa agttgtatct ggcagttgta aactacaaca aagattcaga aatacgttgt 1260

ccaatcaaaa tcaaaggttg tggaaagaag caagcaaaag tttacgtact caacggtcca 1320

gatatcaaag caagaaatac tttggaaaaa ccgaatgttg tagatattgt tgaaaagaca 1380

acaatagttg atgaggaatt tgaatttacc ttcgaaccac actcttgcac tgtgatagaa 1440

gtagaaagat cataa 1455

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgccatggc ttacgaaatc agtgtgaatc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt gatctttcta cttctatcac 30

Claims (2)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用，pH优选为5.5，温度优选为95℃。

2.根据权利要求1所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用，其特征在于包含α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在与β-葡萄糖苷酶协同作用于Rb1、Rb2、Rc多组分人参皂苷制备稀有人参皂苷中的应用。