CN107164353A - 一种低温碱性果胶裂解酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种低温碱性果胶裂解酶及其编码基因和应用，该裂解酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或该裂解酶具有在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的衍生序列并且具有低温碱性果胶裂解酶活性。本发明所述的低温果胶裂解酶具有反应温度低、pH耐受性好等优点，最适天然底物为来源于橙皮的果胶，同时可以广泛应用于果胶的酶解。

Description

一种低温碱性果胶裂解酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种低温碱性果胶裂解酶及其编码基因与应用。

背景技术

果胶酶是催化水解果胶质的一类复杂的酶的总称。果胶酶来源非常广泛，如细菌，酵母菌，真菌和放线菌素。碱性蛋白主要来自芽孢杆菌属。

果胶酶的分类可以遵循以下四个标准：(1)果胶、果胶酸或低聚半乳糖醛酸是否为其优先底物；(2)这些底物是被反式消去作用还是水解；(3)切割方式是任意的还是发生在末端方向；(4)作用适宜pH(酸性或碱性果胶酶)。

以果胶为底物的酶可分为果胶酯酶和果胶解聚酶两大类。果胶酯酶随机切除甲酯化果胶中的甲酯，果胶解聚酶则降解果胶糖苷键。果胶解聚酶根据酶的作用机理又可分为果胶水解酶和果胶裂解酶。果胶水解酶专一性的水解果胶糖苷键，形成饱和低聚半乳糖醛酸；果胶裂解酶催化果胶半乳糖醛酸残基的C-4和C-5位上发生氢的反式消去完成糖苷键的裂解，产生不饱和低聚半乳糖醛酸，分子结构中的不饱和共轭体系可在A₂₃₅产生吸收峰。

果胶酶的潜在用途包括果汁和葡萄酒的提取和澄清，蔬菜的浸渍，棉织物的冲洗，亚麻的脱胶，植物纤维的脱胶，咖啡和茶发酵，家禽饲料，油提取和预处理含有果胶物质的废水。对于棉纤维的纺织加工和生物清洗，植物韧皮纤维的脱胶，植物纤维的浸渍，生物漂白和造纸，其中高温高pH过程是常见的。可以专门针对非纤维素材料，减少或消除使用苛性化学物质，降低环境负荷，同时保持原料的完整性和强度，并且与常规碱性工艺一样有效。因此，使用果胶酶的酶法是这一努力中潜在的有价值的候选者，因为它们可以减少目前使用的有毒化学物质的量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的低温碱性果胶裂解酶与其编码基因及其应用。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：

一种低温碱性果胶裂解酶，该裂解酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或该裂解酶是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的保守性变异体。

需要说明的是，本发明所提供的果胶裂解酶属于果胶裂解酶6超家族，是一种能以β-消除反应的方式，作用于以聚半乳糖醛酸、苹果来源果胶、橙皮来源果胶、或不同酯化程度果胶，完成糖苷键的裂解，产生不饱和低聚半乳糖醛酸的果胶酶。SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由330个氨基酸残基组成。

为了使上述果胶裂解酶蛋白质便于纯化，可在上述的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述果胶裂解酶蛋白质可以人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述中的果胶裂解酶蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中，缺失、置换、插入或添加一个至几个并保持原有酶活性，或者连上表1所示的标签的编码序列得到。

一种低温碱性果胶裂解酶的编码基因，该基因编码：

(a)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质；或

(b)具有衍生自缺失、替换、插入/和添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列并具有果胶酶活性的蛋白质。

进一步，所述低温碱性果胶裂解酶的编码基因为(i)、(ii)或(iii)的DNA分子：

(i)具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA分子；

(ii)在严格条件下与(i)所述的核苷酸序列杂交且编码具有果胶酶活性的蛋白质的DNA分子；

(iii)与(i)或(ii)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA分子。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列由993个核苷酸组成。

例如：在进行分子杂交的过程中，可以为在6×SSC、质量分数为0.5％的SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC，质量分数为0.1％的SDS和1×SSC、质量分数为0.1％的SDS各洗膜一次。其中SDS的中文名称为十二烷基硫酸钠，1×SSC包括0.15mol/L NaCl和0.015mol/L柠檬酸；SDS以及不同浓度倍数的SSC均为本领域的常用试剂。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明提供一种重组载体，该重组载体包含上述的低温碱性果胶裂解酶的编码基因。具体的，所述重组载体为将上述任一所述编码基因插入出发载体(例如：pET26b)的多克隆位点得到的重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

本发明还提供一种转化体，该转化体包含上述的重组载体。转化体可以为重组菌，例如，将上述任一所述编码基因插入出发载体(例如：pET26b载体)的多克隆位点得到的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

本发明还提供一种引物对，用于扩增上述的低温碱性果胶裂解酶的编码基因全长及其任意片段。例如：引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

上述任一所述蛋白质、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在降解以聚半乳糖醛酸、苹果来源果胶、橙皮来源果胶、或不同程度酯化的果胶中的应用也属于本发明的保护范围。

一种上述的低温碱性果胶裂解酶在裂解果胶糖苷键中的应用。例如：用于裂解以聚半乳糖醛酸、苹果来源果胶、橙皮来源果胶、或不同程度酯化的果胶等。

在具体应用的过程中，可以采用下面的方法：以聚半乳糖醛酸、苹果来源果胶、橙皮来源果胶、或不同程度酯化的果胶为底物，在碱性pH条件，利用低温碱性果胶裂解酶对聚半乳糖醛酸、来源于苹果和橙皮的果胶或不同程度酯化的果胶进行酶解。

所述的酶解条件包括：反应体系的温度0-60℃，优选为30℃，反应体系的pH值为7.0-11.0，优选为10.0。

本发明还提供一种生产低温碱性果胶裂解酶的方法，该方法包括：首先培养上述的转化体，该转化体经培养后能分泌表达低温碱性果胶裂解酶至胞外，然后在培养产物中收集低温碱性果胶裂解酶即可。

本发明的果胶裂解酶对聚半乳糖醛酸(pGA)有很好的酶活，实验表明：本发明提供的低温碱性果胶裂解酶，以pGA为底物，在30℃、pH为10.0的条件下具有最高的酶活性，为78.75U/mg蛋白；该酶在20-35℃温度范围内，酶活均较高；在pH 9.0至pH 10.5的pH值范围内，酶活均较高。该酶在pH9.0-10.5的条件下保持24h，依然有60％以上的酶活性，具有很好的pH耐受性。

与现有技术相比，本发明提供的果胶酶属于果胶裂解酶，能以β-消除反应的方式，作用于以聚半乳糖醛酸、苹果来源果胶、橙皮来源果胶、或不同程度酯化果胶，完成糖苷键的裂解，产生不饱和低聚半乳糖醛酸的果胶酶。并且该果胶裂解酶与其他已表征的果胶裂解酶的氨基酸序列相比，相似性不大于66.29％。本发明所述低温碱性果胶裂解酶最适天然底物为来源于橙皮的果胶，且具有在碱性pH条件下活性高的特性。

附图说明

图1为Pel1蛋白纯化前后的SDS-PAGE电泳图。

图2为实施例1制备的低温碱性果胶裂解酶的活性随温度变化的结果。

图3为实施例1制备的低温碱性果胶裂解酶的活性随pH变化的结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、蛋白及基因的制备与功能

1、兼性嗜冷菌Massilia eurypsychrophila(保藏于“中国典型培养物保藏中心China Center for Type Culture Collection，其保藏号为CCTCC S2016709)。总DNA的提取：采用兼性嗜冷菌M.eurypsychrophila，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mM EDTA(pH8.0)，混匀后37℃放置20min；之后加入2毫升质量分数为10％的SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次；取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA沉淀，分别用70％乙醇洗两次后，沉淀真空干燥，溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA)。

2、合成SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列

根据SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列设计引物对如下：

正向引物：5′-CTGCCATGGATGGGCCGGTGG-3′，如SEQ ID NO.3所示；

反向引物：

5′-GTGCTCGAGTTACTGGGCCAGGTTGG-3′，如SEQ ID NO.4所示；

正向引物的下划线部分为Nco I的酶切位点，反向引物的下划线部分为Xho I酶切位点。

以兼性嗜冷菌M.eurypsychrophila的总DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系：

PCR反应条件：98℃预变性30s，然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，25个循环，最后72℃延伸5s。

PCR产物用质量分数为0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明PCR产物的序列包括SEQ ID NO.2所示1-993位，并将其命名为pel1DNA片段。

3、重组表达载体的构建

1)将上述测序正确的PCR产物或人工合成的片段用Nco I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2)将质粒pET26b(Cat.N0 69864-3,Novogen)用Nco I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3)将步骤1)的酶切产物和步骤2)的酶切产物进行连接，连接产物电击转化大肠杆菌DH5α后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述的正向引物和反向引物进行菌落PCR，筛选到含有pel1基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证，结果表明，在pET26b的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了pel1DNA片段，该片段包括SEQ ID NO.2的自5′端起第1至993位的核苷酸，插入方向正确，将该重组质粒命名为pET26b-pel1。

4、工程菌的制备

将质粒pET26b-pel1电击转化大肠杆菌BL21(DE3)(Cat.N0CD601,全式金公司)后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有质粒pET26b-pel1的工程菌，记作BL21/pET26b-pel1。

用pET26b代替pET26b-pel1，转化大肠杆菌BL21(DE3)，步骤同上，得到含有pET26b的重组菌，作为对照菌。将转入pET26b的阳性重组菌记作BL21/pET26b。

5、低温碱性果胶裂解酶的制备和纯化

GE HiTrap Desalting、GE HiTrap SP FF纯化柱购自GE Healthcare公司，产品目录号分别为17-1408-01、17-5053-01。

将上述步骤4制备的阳性重组菌BL21/pET26b-pel1培养于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至其在LB培养基中的终浓度0.5mM，转至18℃继续培养16h。

在3800rpm、15min条件下离心收集上清液，将上清液用脱盐柱GE HiTrapDesalting进行脱盐处理，用溶液C(50mM Tris-HCl，pH 7.0)进行洗脱，得到的洗脱液再过阴离子交换柱GE HiTrap SP FF，先用溶液D(20mM Tris-HCl，pH7.5)洗脱杂蛋白，再用溶液E(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.5)洗脱目的蛋白，最后再用脱盐柱GE HiTrapDesalting进行脱盐处理，用溶液F(50mM glycine-NaOH，pH 10.0)进行洗脱,得到Pel1纯酶液。

将步骤4制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。

SDS-PAGE电泳显示纯化的Pel1蛋白的分子量约为35kDa，符合理论推断的34.7kDa。结果如图1所示，图1中，泳道M表示蛋白分子量标准(250,150,100,75,50,37,25,20,15kDa)；泳道1表示大肠杆菌BL21/pET26b-pel1发酵上清液；泳道2表示GE Desalting脱盐柱纯化后的Pel1蛋白；泳道3表示阳离子交换柱GE HiTrap SP FF纯化后的Pel1蛋白；泳道4表示再次经过GE Desalting脱盐柱纯化后的Pel1蛋白。可以看出已经获得了纯化的Pel1蛋白。同时进行了对照组的实验，但对照组并没有得到目的蛋白。

实施例2、以聚半乳糖醛酸为底物验证蛋白功能

酶活单位定义为1min内催化产生1μmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量。

(一)最适温度

用pH10.0的50mM glycine-NaOH缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Pel1纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。

溶液A组成：由50mM，pH10.0glycine-NaOH缓冲液和聚半乳糖醛酸溶液组成；聚半乳糖醛酸在溶液A中的浓度为0.2g/100mL。

实验组：活性测定反应体系为2.02mL，由2mL溶液A和0.02mL稀释酶液；反应体系的pH值为10.0；反应体系在特定温度范围(0-60℃)内温育15min后，加入3mL 0.03mol/L磷酸缓冲液终止反应，测定OD₂₃₅。

结果如图2所示。图2表明，低温碱性果胶裂解酶具有果胶裂解酶活性。在30℃条件下，低温碱性果胶裂解酶具有最高的酶活性，为78.75U/mg蛋白；将此温度下的酶活反应体系的吸光值作为相对活性100％，其他温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活体系的吸光值的比值作为相对活性。在10-40℃条件下均具有60％以上的活性。

对照组：以对照菌BL21/pET26b获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个温度条件下，对照酶液都没有降解聚半乳糖醛酸的活性。

实验设3次重复，结果一致。

(二)最适pH

如下各组中的稀释酶液均是用各组中的缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Pel1纯酶液得到的。

实验组：活性测定反应体系为2.02mL，分别由2mL溶液B(B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9或B10)和0.02mL稀释酶液组成；

溶液B1的组成：50mM Tris-HCl缓冲液和聚半乳糖醛酸(Polygalacturonic acid)组成；聚半乳糖醛酸在溶液B1中的浓度为0.2g/100mL；溶液B1的pH值为7.0。

溶液B2的组成：与溶液B1的组成相同，不同的是溶液B2的pH值为7.5。

溶液B3的组成：与溶液B1的组成相同，不同的是溶液B3的pH值为8。

溶液B4的组成：与溶液B1的组成相同，不同的是溶液B4的pH值为8.5。

溶液B5的组成：与溶液B1的组成相同，不同的是溶液B5的pH值为9。

溶液B6的组成：与溶液B1的组成相同，不同的是将50mM Tris-HCl缓冲液替换为50mM glycine-NaOH缓冲液。溶液B6的pH值为9.0。

溶液B7的组成：与溶液B1的组成相同，不同的是将50mM Tris-HCl缓冲液替换为50mM glycine-NaOH缓冲液。溶液B6的pH值为9.5。

溶液B8的组成：与溶液B1的组成相同，不同的是将50mM Tris-HCl缓冲液替换为50mM glycine-NaOH缓冲液。溶液B6的pH值为10.0。

溶液B9的组成：与溶液B1的组成相同，不同的是将50mM Tris-HCl缓冲液替换为50mM glycine-NaOH缓冲液。溶液B6的pH值为10.5。

溶液B10的组成：不同的是将50mM Tris-HCl缓冲液替换为50mM glycine-NaOH缓冲液。溶液B6的pH值为11。

将反应体系在30℃，温育15min后，加入3mL 0.03mol/L磷酸缓冲液终止反应，测定OD₂₃₅。实验设三次重复。

结果如图3所示。

低温碱性果胶裂解酶Pel1在pH为7至11.0之间的条件下均具有低温碱性果胶裂解酶的活性，即可以降解聚半乳糖醛酸。

表明低温碱性果胶裂解酶在pH10.0条件下具有最高酶活性，为78.75U/mg蛋白。以此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性100％，其它反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为各自的相对活性。

对照组：以对照菌BL21/pET26b获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个pH条件下，对照酶液都没有降解聚半乳糖醛酸的活性。

实验设3次重复，结果一致。

(三)酶热稳定性

用pH10.0的50mM glycine-NaOH缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Pel1纯酶液，用稀释后的酶液以聚半乳糖醛酸为底物进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。

将稀释酶液在30℃水浴放置30分钟，每隔5min取样测定酶的残余活性。结果显示，酶在30℃处理15分钟丧失15％活性，30分钟后丧失了30％活性。本发明所述的低温碱性果胶裂解酶的酶解温度为0-60℃，优选为10-40℃。

(四)pH耐受性

将稀释酶液分别在pH 8、9、9.5、10、10.5和11条件下放置24h后，以聚半乳糖醛酸为底物测定残余酶活。结果显示pH 9-11条件下仍然具有60％以上的相对酶活。说明该酶具有良好的pH耐受性。

(五)底物特异性

将稀释酶液分别在相同浓度(质量分数为0.2％)的不同底物条件下进行酶活测定，底物分别为以聚半乳糖醛酸、苹果来源果胶、橙皮来源果胶、或不同酯化程度的果胶、木聚糖、可溶性淀粉。

以聚半乳糖醛酸为底物测得酶活为参比(100％)，对木聚糖和可溶性淀粉都没有酶活性。对于天然底物，该酶对橙皮来源的果胶酶活比较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北大学

<120> 一种低温碱性果胶裂解酶及其编码基因和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 兼性嗜冷菌（Massilia eurypsychrophila）

<400> 1

Met Asp Gly Pro Val Gly Tyr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Gly Asn

1 5 10 15

Lys Ala Ala Val Asn Val Ser Ser Leu Ala Asp Met Ala Ala Lys Ile

20 25 30

Lys Ala Tyr Ser Gly Ser Gly Gly Leu Val Leu Asn Tyr Thr Gly Lys

35 40 45

Phe Asp Phe Ala Ser Ile Lys Asp Val Cys Ala Gln Trp Lys Lys Pro

50 55 60

Ala Gln Thr Leu Glu Ile Lys Gly Lys Asn Asp Ile Thr Ile Arg Gly

65 70 75 80

Ala Ala Asp Ser Ser Ala Asn Phe Gly Ile Arg Ile Val Gly Asp Ser

85 90 95

Ser Asn Val Ile Val Gln Asn Met Thr Ile Gly Leu Leu Gln Gly Gly

100 105 110

Glu Asp Ala Asp Ser Ile Ser Ile Glu Gly Thr Ser Ser Gly Lys Pro

115 120 125

Ser Lys Val Trp Ile Asp His Asn Thr Ile Phe Ala Ser Ile Lys Ser

130 135 140

Cys Pro Gly Ala Gly Asp Ala Ser Phe Asp Gly Gly Ile Asp Met Lys

145 150 155 160

Lys Gly Ala Asn His Ile Thr Val Ser Tyr Asn Tyr Val Tyr Asn Tyr

165 170 175

Gln Lys Val Ala Leu Asn Gly Tyr Ser Glu Lys Asp Thr Leu Asn Ala

180 185 190

Gly Ser Leu Thr Thr Tyr His Asn Asn Arg Phe Glu Asn Val Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Pro Leu Leu Arg Tyr Gly Lys Ala His Ile Phe Asn Asn Tyr

210 215 220

Phe Gly Asn Val Asp Thr Ser Gly Ile Asn Val Arg Met Gly Ala Met

225 230 235 240

Ala Leu Val Glu Ser Asn Tyr Phe Glu Asn Val Arg Asn Pro Val Thr

245 250 255

Ser Arg Asp Ser Ala Lys Leu Gly Tyr Trp Asp Leu Arg Ser Asn Phe

260 265 270

Val Gly Ser Gly Ile Thr Trp Gly Ala Pro Glu Asp Gly Ile Tyr Ala

275 280 285

Asn Ala Thr Asp Trp Lys Thr Thr Lys Ala Tyr Gly Pro Thr Gly Tyr

290 295 300

Asn Tyr Thr Ala Ser Ala Ala Ala Gly Val Lys Ala Lys Ala Ile Ala

305 310 315 320

Thr Ala Gly Ala Arg Thr Asn Leu Ala Gln

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 兼性嗜冷菌（Massilia eurypsychrophila）

<400> 2

atggatgggc cggtgggcta cggcgccgcc accacgggcg gtggcaacaa ggccgccgtg 60

aacgtatctt cgctggccga catggccgcc aagatcaagg cgtattcggg tagcggcggc 120

ctggtactga actacaccgg caagttcgac ttcgccagca tcaaggatgt ctgcgcacag 180

tggaagaagc cggcccagac cctggaaatc aagggcaaga acgacatcac gatccgcggc 240

gcggccgatt cgtccgccaa cttcggcatc cgtatcgtgg gcgattcgag caacgtgatc 300

gtgcagaaca tgaccatcgg cctgctgcag ggtggcgaag acgccgactc gatctcgatc 360

gaaggcacgt cgagcggcaa gccaagcaag gtctggatcg accacaacac cattttcgct 420

tcgatcaagt cgtgccctgg cgcgggcgat gcctcgttcg acggcggcat cgacatgaag 480

aagggcgcca accacatcac cgtgtcgtac aactacgtgt acaactacca gaaggtggcg 540

ctcaatggtt acagcgaaaa ggacaccctc aatgccggat cgctgaccac ctaccacaac 600

aaccgcttcg agaacgtcaa gtcgcgcctg ccgctgctgc gttacggtaa agcccacatc 660

ttcaacaact acttcggcaa cgtggacacc tcgggcatca atgtgcgcat gggcgcgatg 720

gcgctggtcg aatcgaacta cttcgagaac gtcaggaacc cggtcacctc gcgcgacagc 780

gccaaactcg ggtactggga cctgcgcagc aacttcgtcg gcagcggcat tacctggggc 840

gcgccggaag acggcattta cgccaatgcc accgactgga agaccaccaa ggcctacggc 900

ccgaccggct acaactacac cgccagcgcg gctgcgggcg tgaaagcgaa agccatcgcc 960

accgccggtg cgcgcaccaa cctggcccag taa 993

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgccatgga tgggccggtg g 36

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagctcgagt tactgggcca ggttgg 43

Claims (9)

1.一种低温碱性果胶裂解酶，其特征在于，该裂解酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或该裂解酶是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的保守性变异体。

2.一种低温碱性果胶裂解酶的编码基因，其特征在于，该基因编码：(a)具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)具有衍生自缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列并具有果胶裂解酶活性的蛋白质。

3.根据权利要求2所述一种低温碱性果胶裂解酶的编码基因，其特征在于，所述基因为(i)、(ii)或(iii)的DNA分子：

(i)具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA分子；

(ii)在严格条件下与(i)所述的核苷酸序列杂交且编码具有果胶裂解酶活性的蛋白质的DNA分子；

(iii)与(i)或(ii)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA分子。

4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的低温碱性果胶裂解酶的编码基因。

5.一种转化体，其特征在于，包括权利要求4所述的重组载体。

6.一种引物对，其特征在于，用于扩增权利要求2或3所述的低温碱性果胶裂解酶的编码基因全长及其任意片段。

7.根据权利要求6所述的引物对，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

8.一种如权利要求1所述的低温碱性果胶裂解酶在酶解果胶中的应用。

9.一种生产低温碱性果胶裂解酶的方法，该方法包括：首先培养权利要求5所述的转化体，该转化体经培养后能分泌表达低温碱性果胶裂解酶至胞外，然后在培养产物中收集低温碱性果胶裂解酶。