CN102191212A

CN102191212A - 一种产碱性果胶酸裂解酶基因工程菌及其构建和应用

Info

Publication number: CN102191212A
Application number: CN2011100755050A
Authority: CN
Inventors: 赵庆新; 沈敏; 吴生才; 葛月潭; 成秀梅
Original assignee: Yancheng Teachers University
Current assignee: Yancheng Teachers University
Priority date: 2011-03-29
Filing date: 2011-03-29
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2031-03-29
Also published as: CN102191212B

Abstract

本发明公开了一种产碱性果胶酸裂解酶基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。本发明以全人工合成的构巢曲霉pel基因，从工业化角度，构建了大肠杆菌高效率胞外分泌表达Pel果胶酶的工程菌，还提供了用工程菌生产果胶酶的方法。该工程菌发酵时间短，37℃条件下前期发酵4h，后期发酵2h，共发酵6h；酶活产量高，可达到400U/mL；此外，所产果胶酶可以直接分泌到胞外，杂蛋白少，容易提纯，该工程菌具有很好的工业应用前景。

Description

一种产碱性果胶酸裂解酶基因工程菌及其构建和应用

技术领域

本发明涉及一种产碱性果胶酸裂解酶基因工程菌及其构建和应用，特别是一种高效分泌表达碱性果胶酸裂解酶基因工程菌，属于遗传工程领域。

背景技术

果胶酶(pectinases)是指分解果胶物质的一类酶，细菌，真菌和放线菌等微生物都可以产生果胶酶。果胶酶酶系含降解果胶主链和侧链的所有酶，大约含40多种不同的酶；其中作用于主链的果胶酶主要为果胶酸裂解酶(pectate lyase, Pel，EC 4.2.2.2)，果胶酸水解酶(polygalacturonase, PG，EC 3.2.1.15)，果胶酸酯裂解酶(pectin lyase, Pec，EC 4.2.2.10)。

碱性果胶酸裂解酶（EC.4.2.2.2）是作用于非甲基化果胶区域的果胶酶，在工业纺织工业和造纸工业和部分药品工业的果胶处理工艺中，具有很好的应用价值，自上世纪70年代以来，果胶降解酶的工业化应用日趋普遍。在上述行业的相关工艺中，应用果胶酶对植物材料进行预处理或后续处理，可以充分有效的利用植物材料，提高产品得率和产品质量，可以避免许多化学工艺造成的环境污染。果胶酶不但在传统工业，而且在其它新的工业领域的应用价值不断得到拓展和日益受到重视。这些新价值包含：在新兴的淀粉类生物汽油生产方面有重要的应用价值，在处理淀粉类和糖类植物基质材料时，使用果胶酶预处理可以有助于高效快速地释放其它糖类物质，同时果胶本身的降解产物也可以作为生物汽油生产的的发酵基质；更有价值的发现是果胶酶还可以作为有效的工具使人们从果胶中提取能够抑制爱滋病毒和肿瘤细胞繁殖的活性成分；还有，作为许多植物药材的预处理酶，有助于很多部分植物来源的药物活性成分提取；利用原果胶酶法生产果胶，果胶分子量较大，质量稳定，果胶提取完全，可以作为是一种重要的工业产品，医药与化妆品中用途广泛。

目前，果胶酶的工业生产菌种主要是自然环境中筛选和经过实验室优化的黑曲霉（Aspergillus niger）和稻曲霉（Aspergillus oryaze），发酵方式有固体发酵和液体发酵。用曲霉真菌发酵生产果胶酶的存在的主要缺陷是，酶的产率较低，在液体发酵条件下，真菌需要在果胶酸或果胶酸酯等底物的诱导下，才能产生果胶酸酯裂解酶和其他果胶酶。在其他碳源如葡萄糖或蔗糖存在的条件下，果胶酶的表达会受到抑制，虽然固体发酵、启动子区域突变技术是解决葡萄糖或蔗糖等碳源抑制真菌果胶酶自然表达的有效方法，但是酶的产率仍然较低。前人为了提高酶的表达效率, 使用其它Aspergillus和酵母作为异源表达宿主进行重组表达真核生物Aspergillus niger和Aspergillus oryaze果胶酶基因，但是几种真菌果胶酶在真菌系统中的重组表达效果比较差,产酶量约40 U/mL左右，还是产量比较低，如何提高产量是目前急需解决的问题。

我国上20世纪90年代，开始果胶酶的研究，目前国内没有曲霉碱性果胶酸裂解酶基因工程菌的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产碱性果胶酸裂解酶基因工程菌。

所述基因工程菌含有外源碱性果胶酸裂解酶基因。

所述碱性果胶酸裂解酶基因来源于构巢曲霉（Aspergillus nidulans），核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述碱性果胶酸裂解酶基因克隆于分泌表达载体。

所述载体为pET系列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建产碱性果胶酸裂解酶基因工程菌的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

利用全人工合成的构巢曲霉（Aspergillus nidulans）碱性果胶酸裂解酶基因（pel）；克隆pel序列到pET-20b(+)，得到重组表达质粒pel/ pET-20b(+)；将pel/pET-20b(+)转化Escherichia coli BL 21 (DE3)，得到重组大肠杆菌pel/ pET-20b(+)/Escherichia coli BL 21 (DE3)，命名为Escherichia coli pel。

本发明还提供了一种利用所述基因工程菌生产果胶酸裂解酶的生产工艺，包括如下步骤：基因工程菌接种于种子培养基，培养温度37℃，摇床转速200 r/min，培养8 h后，转入发酵培养基，进行分段发酵，前期发酵条件为：37℃，摇床转速200 r/min，发酵4 h后（OD600 nm波长的光吸收值达到0.8），添加诱导剂，继续发酵2-4h。

所述种子培养基为：以g/1000 mL计，蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，青霉素0.05，pH为7.0。

所述发酵培养基为：以g/1000 mL计，蛋白胨10，酵母提取物5，葡萄糖5，氯化钠10，青霉素0.05。

所述诱导剂为：20 mM氯化钙，0.1%甘氨酸，0.1% triton-100, 1mM IPTG；或 5g乳糖。

本发明还提供了一种高效处理果品行业污水中果胶的方法。

本发明提供的产碱性果胶酶酸裂解酶基因工程菌Escherichia coli pel,以该菌产碱性果胶酶酸裂解酶的方法，发酵6小时后，碱性果胶酶酸裂解酶的产量高达到400 U/mL。本发明的特点在于该基因工程菌发酵时间短，产酶量高，目标蛋白胞外分泌而且蛋白种类少，容易提纯，提高了生产效率，为碱性果胶酶酸裂解酶工业化奠定了基础。用本发明构建的工程菌处理果品行业污水，果胶降解率可达到95%。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

实施例1 碱性果胶酶酸裂解酶工程菌Escherichia coli pel的构建

（1）人工全合成构巢曲霉pel基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1），测序标明合成正确，将pel基因序列克隆到载体pET-20b(+), 得到重组质粒pel/pET-20b(+)。

（2）基因工程菌构建：将得到重组质粒pel/pET-20b(+)电转化Escherichia coli BL 21 (DE3)，得到重组大肠杆菌pel/pET-20b(+)/Escherichia coli BL 21 (DE3)，命名为Escherichia coli pel。

实施例2 发酵生产碱性果胶酸裂解酶

将基因工程菌Escherichia colipel接种于种子培养基，250 mL 三角瓶，50 mL装液量，培养温度37℃，摇床转速200 r/min，培养8 h后，转入发酵培养基，进行分段发酵，前期发酵条件为：将培养后的种子接种发酵培养基，培养条件为37℃，200 r/min，培养到OD₆₀₀为0.8，时间4 h, 该阶段发酵培养基中不添加诱导和促进产酶的诱导剂，如氯化钙，甘氨酸，triton-100, IPTG。后期发酵条件为：后期培养温度37℃，摇床转速200 r/min，培养2 h，发酵培养基中添加20 mM氯化钙，0.1%甘氨酸，0.1% triton-100, 1mM IPTG。发酵结束后碱性果胶酶酸裂解酶酶活为400 U/mL。

碱性果胶酶酸裂解酶酶活测定方法：0.5 ml反应体系含有50 mM Tris/HCl (pH 8.5), 1 mM 氯化钙, 1 mg/ml果胶酸，适量的酶， 50 ℃ 条件下反应10 min,为了检测反应体系中产生的还原糖的量, 加0.5mL二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid， DNS) 试剂终止反应, 然后检测在520nm处的吸收值, 再根据标准曲线回归方程, 换算得到还原糖浓度, 然后计算裂解细胞上清的每毫升体积所含的总酶活, 再计算相对于每毫升菌体培养液体积的总酶活。一个酶活单位定义为每分钟释放的产物等同于1 μmol 半乳糖醛酸的酶量。

种子培养基为：以g/1000 mL计，蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，青霉素0.05，pH为7.0。

发酵培养基为：以g/1000 mL计，蛋白胨10，酵母提取物5，葡萄糖5，氯化钠10，青霉素0.05，发酵后期，OD600为0.8时，添加20 mM氯化钙，0.1%甘氨酸，0.1% triton-100, 1mM IPTG。

实施例3发酵生产碱性果胶酸裂解酶

将基因工程菌Escherichia colipel接种于种子培养基，500 mL 三角瓶，100 mL装液量，培养温度37℃，摇床转速200 r/min，培养8 h后，转入发酵培养基，进行分段发酵，前期发酵条件为：将培养后的种子接种发酵培养基，培养条件为37℃，200 r/min，培养到OD₆₀₀为0.8，时间4 h, 该阶段发酵培养基中不添加乳糖。后期发酵条件为：后期培养温度37℃，摇床转速200 r/min，培养4 h，发酵培养基中添加乳糖5 g，发酵结束后碱性果胶酶酸裂解酶酶活为385 U/mL。

发酵培养基为：以g/1000 mL计，蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，青霉素0.05，发酵后期加乳糖5 g/1000 mL。

实施例4利用构建的工程菌处理果品行业废水。

将基因工程菌Escherichia colipel接种于种子培养基，500 mL 三角瓶，100 mL装液量，培养温度37℃，摇床转速200 r/min，培养8 h后，转入废水，适当在废水中加入乳糖5 g/1000 mL，诱导果胶酶合成，处理24 -48 h，降解废水中残余的果胶（8-15%，质量百分比），果胶降解率可达95%。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

<110> 盐城师范学院

<120> 一种产碱性果胶酸裂解酶基因工程菌及其构建和应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

tcccctgcgc cggacctcaa cgcccgtcat gaattgaccc gccgccaggc ctcagaaagc 60

tgcccgatcg ggtactgcac acagaacggt ggcactaccg gtggtgcggc cggtgacacc 120

gtgaccgtga ccaatctggc cgacctgact gaagccgccg agagcgatgg gccgctgacg 180

atcatcgtgt ctgggtccat ctcgggcagt gccaagatcc gcgtggcctc agataagacg 240

atctttggag agtcgggtag ttctatcacc ggtatcggat tctacattcg ccgcgtcagc 300

aatgtcatca tgcggaactt gaagatcagc aaggtcgacg cagacaacgg cgatgccatt 360

ggcattgatg cctcctccaa tgtctgggtc gatcattgcg acctctctgg agacctcagc 420

ggtgggaagg atgacttgga cggactggtc gatatcagcc atggcgcgga atggatcacc 480

gtctcgaaca cttacttcca cgaccattgg aaaggttccc ttatcggcca ctccgacaac 540

aatgaagacg aggacctagg ccatctgcac gtcacctacg ctaacaacta ctggtacaac 600

gtgtacagcc gtacacccct gatccggttc gccacagtgc acatcatcaa caactattgg 660

gacagcctga tcgacacggg cgtgaactgc cgtatggatg cacaggtgct gatccagtcc 720

tccgcgttcc acaactgccc cgacagagcg atcttcttcg ccgactcaga ctacaccggg 780

tatgctgtcg tagacgatgt tgacctgggc ggctcgagta actcggtgcc cgagggaacc 840

ctgacgccta gctccttgcc ttatgcggcc attactgcgc tgggatctgg ccaggttgca 900

agcgtgattc cgggtacagc cggacagaaa ttgtaa 936

Claims

1.一种产碱性果胶酸裂解酶工程菌，其特征在于所述基因工程菌含有外源碱性果胶酸裂解酶基因的大肠杆菌（Escherichia coli pel）。

2.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述碱性果胶酸裂解酶基因来源于构巢曲霉（Aspergillus nidulans），核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述碱性果胶酸裂解酶基因克隆于分泌表达载体。

4.权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于所述载体为pET系列。

5.如权利要求书1所述产碱性果胶酸裂解酶工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

利用全人工合成的构巢曲霉碱性果胶酸裂解酶基因（pel），核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

将步骤（1）得到pel序列克隆到pET-20b(+)，得到重组表达质粒pel/ pET-20b(+)；

将步骤（2）得到的重组表达质粒pel/ pET-20b(+)转化Escherichia coli BL 21 (DE3)，得到重组大肠杆菌pel/ pET-20b(+)/Escherichia coli BL 21 (DE3)，命名为Escherichia coli pel。

6.权利要求1所述基因工程菌应用于果胶酸裂解酶的生产。

7.权利要求6所述的应用，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述基因工程菌接种于种子培养基，培养温度37℃，摇床转速200 r/min，培养8 h；

（2）将培养后的种子接种发酵培养基，培养条件为37℃，200 r/min，当菌体OD₆₀₀达到0.8后，向培养基中添加诱导剂，继续发酵2-4 h。

8.权利要求7所述的应用，其特征在于所述种子培养基为：以g/1000 mL计，蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，青霉素0.05，pH为7.0；所述发酵培养基为：以g/1000 mL计，蛋白胨10，酵母提取物5，葡萄糖5，氯化钠10，青霉素0.05。

9.权利要求7所述的应用，其特征在于所述诱导剂为：20 mM氯化钙，0.1%甘氨酸，0.1% triton-100, 1mM IPTG；或 5g乳糖。

10.权利要求1所述的基因工程菌应用于果品行业污水处理。