CN102367437A - 一种重组大肠杆菌发酵生产果胶酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种重组大肠杆菌发酵生产果胶酶的方法，属于发酵工程技术领域。以Escherichia coliBL21DE3)为出发菌株，按照一定比生长速率流加甘油培养基，本发明简单易行，大幅提高了碱性果胶酶的产量与生产强度以及分泌表达效率，有利于大规模工业化生产，同时对于指导其他大肠杆菌表达系统分泌表达外源蛋白量具有重要意义。

Description

一种重组大肠杆菌发酵生产果胶酶的方法

技术领域：

一种重组大肠杆菌发酵生产果胶酶的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术：

碱性果胶酶一般指聚半乳糖醛酸裂解酶(E.C.4.2.2.2，简称PGL)，其最适pH在8～10，可以在高pH条件下以反式消去作用断开果胶聚合物主链，产生Δ4:5不饱和的寡聚半乳糖醛酸。碱性果胶酶可用于纺织品前处理的精练工艺，从而取代传统的碱煮法，不但能够降低能耗和废水处理难度，同时还可以提高产品质量，提升产品的国际竞争力，是目前纺织生物技术领域的一个研究热点。

目的蛋白的产量和分泌效率取决于多个因素，其中适宜的流加策略和诱导策略对于发酵罐水平蛋白表达来说，是关键因素。然而，需要注意的是，在指数流加过程中，当诱导开始后，实际比生长速率(μ_exp)往往明显低于设定比生长速率(μ_set)，营养物质不断的积累，从而导致细胞生理和代谢的大幅变化，进而影响目的蛋白的合成。

发明内容：

本发明所解决的技术问题是：提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产碱性果胶酶的方法。

为解决上述问题提供如下技术方案：

以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株，其特征在于，步骤如下：

1)发酵培养基中初始甘油浓度为6-14g L-1，待甘油耗尽DO上升后，按照比生长速率为0.15-0.23h-1指数流加甘油；

2)直至菌体干重达到12-18g L-1，降低温度同时加入IPTG进行诱导，以6-18mL h-1的速率进行甘油培养基流加直至发酵结束。

具体而言步骤如下：

诱导前(菌体生长阶段)：控制重组大肠杆菌生长阶段温度为37℃，发酵培养基为MTB，初始甘油浓度为6-14g L-1，待发酵罐中甘油耗尽，DO陡然上升后，以指数方式流加甘油(μ_set＝0.2)，以通气量和搅拌转速控制DO为30％，直到菌体干重达到12-18g L-1；

诱导后(PGL高表达阶段)：将温度降低为26℃同时加入0.05mM IPTG，以6-18mL h-1的速率进行甘油培养基流加，维持DO为30％；

整个过程用25％氨水(v/v)控制pH为7.0，空气流量设为1.8(L min^-1)。

菌种：E.coli BL21DE3(pET-20b(+)PGL)，为胞外分泌表达，构建方法见Shuying Fang，JianChen，et al.Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in a recombinant Escherichia coli by a two-stageglycerol feeding approach.Bioresource Technology，doi：10.1016/j.biortech.2011.09.020.In Press。

培养基成分如下：

种子培养基(LB)：酵母粉5g L^-1，胰蛋白胨6-14g L-1，NaCl 6-14g L-1，氨苄青霉素0.1mM，pH 7.0

发酵培养基(MTB)：甘油6-14g L-1，酵母粉24g L^-1，蛋白胨12g L^-1，KH₂PO₄17mM，K₂HPO₄72mM，氨苄青霉素0.1mM

MTB培养基：甘油6-14g L-1，酵母粉24g L^-1，蛋白胨12g L^-1，KH₂PO₄17mM，K₂HPO₄72mM，氨苄青霉素0.1mM

固体平板培养基：LB培养基，1.5％琼脂

流加甘油培养基：甘油500g L^-1，酵母粉50g L^-1，蛋白胨50g L^-1

培养方法如下：

种子培养：将保藏的菌种接入装有25mL LB培养基的250mL三角瓶中，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8h。

发酵培养：将LB中菌液以5％接种量接种至全自动3L发酵罐(BioFlo 110，New BrunswickScientific Co.)

指数流加按照如下公式进行：

$F\left(t\right)=\frac{{\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}{X}_0{V}_0\exp \left({\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}t\right)}{S_f{Y}_{X/S}}$

F(t)：流加速率，X₀：细胞密度，V₀：初始体积，S_f：补料液中甘油浓度，μ_set：比生长速率为0.2，Y_X/S：对底物细胞得率。

乙酸是好氧发酵的胞外副产物，当其浓度超过2.0g L^-1，将影响细胞生长和外源蛋白合成，乙酸的生成的抑制可以通过控制比生长速率来实现，对于Escherichia coli BL21(DE3)，控制比生长速率0.15-0.23h-1以下时乙酸浓度不超过2.0g L^-1。

碱性果胶酶测定方法：

取一定量发酵液于10000r min^-1离心10min，上清液作为碱性果胶酶活性测定的样品。反应体系中包括粗酶稀释液20μl，2mL含0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2molL^-1，pH 9.4，含有0.44mmol L^-1的CaCl2)，以无活性的酶液(即提前加入终止液的酶液)作为空白对照，以含底物的缓冲溶液的加入起动酶促反应；反应条件为45℃反应15min，用3mL0.03mol L^-1的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。

一个标准酶活单位定义为：每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。

酶活计算： $\frac{\mathrm{OD}235\×106\×\mathrm{dilutionfactor}\×\mathrm{volumeofmixture}}{103\×t\×4600\×b\×\mathrm{volumeofenzymepreparation}}$

4600(L/mol/cm)不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数

t(min)        酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)

b(cm)        比色杯厚度

本发明方法简单易行，大幅提高了碱性果胶酶的产量与生产强度以及分泌表达效率，有利于大规模工业化生产。同时对于指导其他大肠杆菌表达系统分泌表达外源蛋白量的提高有重要意义。

具体实施方式：

实施例1：

菌种：E.coli BL21DE3(pET-20b(+)PGL)，为胞外分泌表达。

培养基：

1)种子培养基(LB)：酵母粉5g L^-1，胰蛋白胨6-14g L-1，NaCl 6-14g L-1，氨苄青霉素1mM，pH 7.0

2)发酵培养基(MTB)：甘油6-14g L-1，酵母粉24g L^-1，蛋白胨12g L^-1，KH₂PO₄17mM，K₂HPO₄72mM，氨苄青霉素0.1mM

3)固体平板培养基：LB培养基，1.5％琼脂

4)甘油流加培养基：甘油500g L^-1，酵母粉50g L^-1，蛋白胨50g L^-1

培养方法：

1)种子培养：将保藏的菌种接入装有25mL LB培养基的250mL三角瓶中，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8h。

2)发酵培养：将LB中菌液以5％接种量接种至全自动3L发酵罐(BioFlo 110，New BrunswickScientific Co.)。

采用MTB培养基(包含100μg mL^-1氨苄青霉素)为发酵培养基，整个过程可以分为三个阶段：

1)初始甘油浓度为6g L-1，培养温度为37℃，当DO反弹甘油耗尽后，开始第二阶段；

2)按照如下公式进行指数流加甘油培养基，比生长速率为0.15h^-1

$F\left(t\right)=\frac{{\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}{X}_0{V}_0\exp \left({\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}t\right)}{S_f{Y}_{X/S}}---\left(1\right)$

F(t)为流加速率(L h^-l)，X₀为细胞密度(gcell L^-1)，V₀为初始体积(L)，S_f代表补料液中甘油浓度(g L^-1)，μ_set为设定的比生长速率(h^-1)，Y_X/S对底物细胞得率(g_cell gg_lycerol ^-1)，依据计算公式，每小时调整一次流加速率，当细胞干重达到12g L-1，加入0.05mM IPTG，同时将培养温度降至26℃，开始诱导果胶酶(PGL)表达；

3)甘油流加速率为恒定的6mLh-1，在整个过程中，用25％(v/v)的氨水控制pH为7.0，维持DO为30％，空气流量为1.8Lmin^-1。

碱性果胶酶总产量与胞外产量分别为303.0U mL^-1和219.3U mL^-1，生产强度为6.4U mL^-lh^-1。

实施例2：

发酵过程参数略有不同，其余材料和方法同实施例1，采用MTB培养基(包含100μg mL^-1氨苄青霉素)为发酵培养基，整个发酵过程可以分为三个阶段：

1)初始甘油浓度为10g L-1，培养温度为37℃，当DO反弹甘油耗尽后，开始第二阶段；

2)按照如下公式进行指数流加甘油培养基，比生长速率为0.2h^-1

$F\left(t\right)=\frac{{\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}{X}_0{V}_0\exp \left({\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}t\right)}{S_f{Y}_{X/S}}$

F(t)为流加速率(L h^-1)，X₀为细胞密度(g_cell L^-1)，V₀为初始体积(L)，S_f代表补料液中甘油浓度(g L^-1)，μ_set为设定的比生长速率(h^-1)，Y_X/S对底物细胞得率(g_cell g_glycerol ^-1)，依据计算公式，每小时调整一次流加速率，当细胞干重达到16g L-1，加入0.05mM IPTG，同时将培养温度降至26℃，开始诱导果胶酶(PGL)表达；

3)甘油流加速率为恒定的12mL h-1，在整个过程中，用25％(v/v)的氨水控制pH为7.0，维持DO为30％，空气流量为1.8Lmin^-1。

碱性果胶酶总产量与胞外产量分别为371.8U mL^-1和257.8U mL^-1，生产强度为7.1U mL^-lh^-1。

实施例3：

发酵过程参数略有不同，其余材料和方法同实施例1，采用MTB培养基(包含100μg mL^-1氨苄青霉素)为发酵培养基，整个发酵过程可以分为三个阶段：

1)初始甘油浓度为14g L-1，培养温度为37℃，当DO反弹甘油耗尽后，开始第二阶段；

2)按照如下公式进行指数流加甘油培养基，比生长速率为0.23h^-1

$F\left(t\right)=\frac{{\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}{X}_0{V}_0\exp \left({\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}t\right)}{S_f{Y}_{X/S}}$

F(t)为流加速率(L h^-l)，X₀为细胞密度(g_cell L^-1)，V₀为初始体积(L)，S_f代表补料液中甘油浓度(g L^-1)，μ_set为设定的比生长速率(h^-1)，Y_X/S对底物细胞得率(g_cell g_glycerol ^-1)，依据计算公式，每小时调整一次流加速率，当细胞干重达到18g L-1，加入0.05mM IPTG，同时将培养温度降至26℃，开始诱导果胶酶(PGL)表达；

3)甘油流加速率为恒定的18mL h-1，在整个过程中，用25％(v/v)的氨水控制pH为7.0，维持DO为30％，空气流量为1.8Lmin^-1。

碱性果胶酶总产量与胞外产量分别为330.5U mL^-1和193.8U mL^-1，生产强度为5.1U mL^-1h^-1。

Claims (8)

1.一种重组大肠杆菌发酵生产果胶酶的方法，以E.coli BL21DE3(pET-20b(+)PGL)为出发菌株，其特征在于，步骤如下：

1)发酵培养基中初始甘油浓度为6-14g L^-1，待甘油耗尽DO上升后，按照比生长速率为0.15-0.23h^-1指数流加甘油培养基；

2)直至菌体干重达到12-18g L^-1，降低温度同时加入IPTG进行诱导，以6-18mL h^-1的速率进行甘油培养基流加直至发酵结束。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)每小时调整一次甘油流加速率，流加速率按照如下方式计算：

$F\left(t\right)=\frac{{\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}{X}_0{V}_0\exp \left({\mathrm{\μ}}_{\mathrm{set}}t\right)}{S_f{Y}_{X/S}}$

F(t)：流加速率，X₀：细胞密度，V₀：初始体积，S_f：补料液中甘油浓度，μ_set：比生长速率为02，YX/S：对底物细胞得率。

3.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中指数流加控制DO为30％。

4.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中温度为37℃。

5.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中温度降为26℃。

6.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中加入0.05mM IPTG。

7.权利要求1所述方法，其特征在于，发酵过程中用25％的氨水控制pH为7.0。

8.权利要求1所述方法，其特征在于，所述甘油培养基：甘油500g L^-1，酵母粉50g L^-1，蛋白胨50g L^-1。