CN105473607A - 细菌透明质酸酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及源自S.koganeiensis的透明质酸酶、其应用及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及来源于S.koganeiensis的透明质酸酶、其应用和制造方法。
背景技术
目前,临床领域中使用的透明质酸酶是动物来源的。尽管这种产品适合于被纯化,但其含有一些能够诱导免疫原性或过敏反应的污染物。
透明质酸是细胞外基质的重要组分并且以显著的数量构成组织间屏障。透明质酸酶是切割透明质酸成为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的水解酶,其使得间质基质的可渗透性增加。以可变的方式,其也能够消化结缔组织的其他酸性黏多糖。能够在例如蚂蟥的口器中,在蛇、蜜蜂、蝎子的毒液中,以及在致病菌例如肺炎双球菌(pneumococci)、溶血性链球菌(haemolyticstreptococci)和金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的孵育物上清中发现高浓度的透明质酸酶。在人体中,在角膜中、睫状体中、脾中、皮肤中和睾丸中发现了透明质酸酶。也在精子中发现了大量的透明质酸酶,使得该酶能逾越保护胚珠的透明质酸的屏障。
透明质酸酶在医学领域中被用于治疗水肿、局部炎症、痔疮和冻疮。
此外,其在制药领域被用于促进通过皮下注射局部给药的某些高分子量活性成分(抗体、药物载体纳米颗粒、用于基因治疗的DNA、重组蛋白)的运输并增加其分布和分散,以可相比于静脉给药的量增加其生物利用度。[1]之前的研究已经示出了当与透明质酸酶同时给药或序贯给药时,直径达200nm的纳米颗粒在其运输通过胞间隙中会经历强劲增加[1]。目前为止认为该研究示出了纳米颗粒如何能够离体表达其功能,由此显示出在治疗和诊断领域的巨大潜力。然而,由于在临床实践中所使用的给药类型(皮下或胃肠道给药或由于静脉给药的毒性)、其分布体积和其毒性,人们也应该考虑纳米颗粒在体内跨越屏障的能力。因此,使用纳米颗粒和透明质酸酶制剂能够代表治疗和诊断未来的优异的和创新的起始点,其具有通过局部皮下给药用于治疗例如肿瘤学、眼科学和骨关节炎以使药物载体纳米颗粒可最终被用于常见临床实践的前景。
一些类型的癌症,包括胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌已经显示出累积高水平的透明质酸(HA)。HA以异常方式的这种累积围绕某些类型的癌症产生保护网络并对其构成支持。HA与基质的其他组分的这种病理性累积还会使肿瘤的间质液的压力增加、肿瘤血管压缩,并且产生相比于正常细胞有利于癌细胞生长的独特微环境。这些机制对于药物的给予构成障碍,抑制了许多抗癌药的潜在效力。通过拆解确定肿瘤结构的HA组分,透明质酸酶通过开放之前受限制的血管以增加向肿瘤的血流来破坏肿瘤微环境。这使得抗癌治疗剂能够更有效地被运输至肿瘤靶标,增加其治疗效力。透明质酸酶还被用于化妆品中,以治疗由填充剂造成的肉芽肿性反应或透明质酸的不正确(即,不希望的)搭配,以及显著改善脂肪团中存在的纤维化病症。
透明质酸酶通过使脂肪团的纤维化组分片段化使其变软且减少橘皮效应,从而使接受治疗的皮肤部分获得更加天然的和悦目的外观。迄今为止,透明质酸酶是唯一能够以治疗的或非治疗的目的击破脂肪团并且具有令人满意的结果的真正治疗方案。
之前的研究已经显示出透明质酸酶在治疗心血管疾病例如动脉粥样硬化方面的效力[2],但透明质酸酶能够对于血压控制的潜力尚不清楚[3]。
临床研究已经证明了这些应用得到科学支持的心电图测试,其使得研究人血清在透明质酸酶(Wydase)活性方面的效力,牛睾丸透明质酸酶已经被广泛用于许多临床研究。
以下结论是从这些临床研究总结获得的:
-只有使用高度纯化的透明质酸酶才具有对于减少心肌梗死程度的较高临床价值[4]。
-许多研究小组已经证实了人血液含有牛透明质酸酶的不耐热抑制剂[5,6]。
尽管临床研究已经证实了透明质酸酶的效力,但这些结论还没有使得能够基于那些已经可从市场上获得的透明质酸酶能够确保用于控制心脑血管疾病静脉给药来开发透明质酸酶和/或新的治疗剂,由于较高的杂质水平,这限制了一些心血管治疗的应用。在兽医学领域,透明质酸酶被用于保护抗生素物质的溶液中,用于治疗动物疾病,例如牛乳腺炎。由于低生产率和酶在水溶液中变得不稳定且在纯化后丧失活性,迄今为止,以工业规模生产细菌或动物透明质酸酶还是困难的。
另外,许多工业上生产的来自于动物提取物(来自牛和绵羊睾丸)的透明质酸酶具有传播动物海绵状脑病(所谓的"疯牛病")的高风险。其他工业生产已经从哺乳动物细胞以可溶性重组形式生产了透明质酸酶(人PH20),改善了纯度并且减少病毒感染[7]。本发明的目的是提供具有高纯度的用于制药和/或化妆品应用的细菌重组透明质酸酶。
发明内容
本发明的一个目的是提供在水溶液中稳定的酶,其即使是长期以及在蛋白水解酶存在下也是稳定的,且完全避免了传播动物海绵状脑病的风险且在血流中具有高透明质酸酶活性而没有或病毒或细菌污染的可能性,从而其也可以静脉应用。本发明的另一个目的是提供用于以高产率制备有效的透明质酸酶的方法,并且其可在工业规模应用不存在困难。
根据本发明,这些目的和下文中会变得跟明显的其他目的,是通过如下制备透明质酸酶的方法实现的,该透明质酸酶分离自StreptomyceskoganeiensisATCC31394,且包含SEQ.ID.No.21中示出的氨基酸序列,所述方法包括以下步骤:
a)将细菌培养基与含有包含SEQIDNo.41所示的序列的至少一种载体的重组细胞的接种物一起接种到生物反应器中;
b)在存在营养液的条件下,使步骤a)的所述生物反应器的内容物在pH为6.7至7.1之间经历发酵;
c)向步骤b)的混合物中加入lac基因的诱导物;
d)使步骤c)的混合物经历8至24小时的诱导期;
e)将在步骤d)中获得的细菌细胞离心;
f)重悬浮在步骤e)中获得的沉淀物并使所得的悬液经历渗压震扰;
g)通过离心步骤f)的悬液来提取周质蛋白;
h)通过如下顺序来纯化在步骤g)中获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分:
i.强离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分;
ii.弱阳离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分;以及
iii.芳香疏水相互作用色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分。
本发明的这些目的也可以通过可通过所述方法获得的包含SEQ.ID.No.21的源自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的透明质酸酶来实现。
本发明的这些目的也已经通过来自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的纯化形式的且包含SEQ.ID.No.21中示出的氨基酸序列的透明质酸酶实现。
本发明的这些目的也已经通过包含SEQ.ID.No.17中示出的核苷酸序列的多核苷酸实现,其编码包含SEQ.ID.No.21中示出的氨基酸序列的细菌透明质酸酶。本发明的这些目的也已经通过包含所述多核苷酸的基因工程化重组载体实现。
本发明的这些目的已经通过包含所述基因工程化重组载体的宿主细胞实现。
本发明的这些目的也已经通过包含纯化形式并且包含SEQ.ID.No.21中示出的N-端氨基酸序列的来自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的所述透明质酸酶的适合用于制药或化妆品应用的组合物实现,所述透明质酸酶用于治疗和/或预防病症或疾病,可选地与至少另一种活性成分联用,所述透明质酸酶还用于化妆品应用和/或用于改善外形美观的非治疗应用。
在本发明的范围内,"适合用于制药或化妆品应用的组合物"意指固体、半固体或液体制剂,例如悬液或溶液,包含至少一种活性成分和至少一种本领域技术人员公知的赋形剂。
在本发明的范围内,"多肽序列"或"多核苷酸序列"的定义也包括与所提到的序列具有高度同源性的序列。作为非限制性实例,本发明的范围内包括与SEQ.ID.NO:21中所示出的序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性的多肽,与SEQ.ID.NO:17中示出的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性的多核苷酸,以及与SEQ.ID.NO:41中所示出的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的多核苷酸。
在本发明的范围内,"源自或来自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的透明质酸酶"意指与原始分离自StreptomyceskoganeiensisATCC31394生物体的透明质酸酶具有高度同源性的透明质酸酶,其能够通过生物技术从除StreptomyceskoganeiensisATCC31394之外的微生物(例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)产生。
如果没有另外指出,本发明范围内的百分比是指组分占组合物总重量的重量比。
附图说明
提供以下附图以更好地描述本发明,而不是意在限制本发明的范围。
图1:来自Streptomyceskoganeiensis孵育物上清的透明质酸酶相对于时间间隔(T)的生产率曲线。在1%琼脂糖凝胶中进行在生产步骤中提取自S.koganeiensis细胞的总RNA和DNA的分布的实验。
图2:约550bp的扩增子的序列,其用内引物MesFor2和MesRev2获得并且在获自蛋白序列的核苷酸序列的计算机模拟翻译中获得。
图3:用于鉴定在编码透明质酸酶的S.koganeiensis基因的固有区(internalregion)的5'和3'侧翼序列的反向聚合酶链反应(IPCR)方法的图示。
图4:编码S.koganeiensis的CDS透明质酸酶蛋白的基因的完整核苷酸序列的完全鉴定。
图5:编码核苷酸序列的CDS透明质酸酶的完整基因的序列,如在pCR-Bluntll-MOUSE载体(Invitrogen)中克隆的。
图6:(A)用于由S.koganeiensisATCC31394透明质酸酶确定的氨基酸序列与网络数据库中报告的氨基酸序列之间的序列同源性的BLAST测定。该序列由矩形突出显示,描述了细菌透明质酸酶家族的功能性结构域。(b)用于由S.koganeiensisATCC31394透明质酸酶确定的核苷酸序列与网络数据库中报告的核苷酸序列之间的序列同源性的BLAST测定。
图7:(a)来自S.koganeiensis的透明质酸酶的蛋白序列的功能特性。(b)来自放线菌属SE50/110的、始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)ATCC25486、筑波链霉菌(Streptomycestsukubaensis)NRRL18488的透明质酸酶的蛋白序列的功能特性。
图8:编码透明质酸酶的DNA片段及其用于克隆的表达质粒均用既定限制酶切割。所获得的片段在1%琼脂糖凝胶中进行分析,并用溴化乙锭染色。在染色之后,通过实验室图像捕获装置ImageQuant300TL(GEHealthcare)获得凝胶,同时利用图像分析软件ImageQuantTL(GEHealthcare)进行(定性和定量)实验。
图9:通过PCR筛选并用限制酶消化克隆到表达质粒中的编码透明质酸酶的DNA片段。所获得的片段在1%琼脂糖凝胶中进行分析,并在用溴化乙锭染色并收集之后用图像分析软件ImageQuantTL(GEHealthcare)进行分析。
图10:该图示出了用于克隆透明质酸酶的pHTsk_HYAL质粒的图谱:Pgrac启动子、lacl基因(lacl阻遏子)、耐氨苄西林的AmpR基因、耐氯霉素的CmR基因、大肠杆菌复制的ColEl起点、amyQ和编码S.koganeiensis透明质酸酶的透明质酸酶基因的SamyQ信号肽、用于克隆透明质酸酶的BamHI和Xbal唯一限制性位点。
图11:该图示出了pHyal_sk质粒的图谱:大肠杆菌复制的ori起点、氨苄西林抗性的Ap基因、T7启动子、lacl基因(lacl阻遏子)、pelB信号肽、编码S.koganeiensis透明质酸酶的透明质酸酶基因、用于克隆透明质酸酶的Ncol和EcoRI唯一限制性位点。
图12:该图示出了pHyal_sk_SL质粒的图谱:大肠杆菌复制的ori起点、氨苄西林抗性的Ap基因、T7启动子、lacl基因(lacl阻遏子)、编码S.koganeiensis透明质酸酶的透明质酸酶基因、用于克隆透明质酸酶的Ndel和EcoRI唯一限制性位点。
图13:(a)该图示出了克隆到载体pHT43(MOBITEC)中的编码S.koganeiensis的透明质酸酶蛋白开放阅读框(ORF)的核苷酸序列。(b)该图示出了克隆到载体pET22b(+)(Novagen)中的编码S.koganeiensis的透明质酸酶蛋白的ORF的核苷酸序列。(c)该图示出了编码克隆到载体pET21b(+)(Novagen)中的S.koganeiensis的透明质酸酶蛋白的ORF的核苷酸序列。
图14:相比于预诱导样品的蛋白质图谱,在用1mMIPTG诱导后,在12%SDS-PAGE中评价透明质酸酶的重组(大肠杆菌BL21(DE3),含有质粒pHyal_sk)表达。
图15:相比于预诱导样品的蛋白质图谱,在用1mMIPTG诱导后,在12%SDS-PAGE中评价透明质酸酶的重组(大肠杆菌BL21(DE3),含有质粒pHyal_sk_SL)表达。
图16:在根据本发明的每一纯化步骤之后获得的馏分在12%的SDS-PAGE中的蛋白质图谱。
图17:(a)自体同源和重组透明质酸酶的圆二色谱中的图谱的比较。(b)示出了了纯化的重组体的各自UV图谱。在对该UV图谱进行分析之后(上划线)和之前(下划线)进行离心以除去存在的任何聚集体。
图18:通过质谱确定根据本发明获得的重组透明质酸酶的分子量。
图19:根据本发明获得的重组透明质酸酶的等电点的确定。
图20:根据本发明的纯化的重组透明质酸酶样品的毛细管电泳的电泳图谱。具有100%纯度时的计算浓度为大约1mg/ml。
图21:通过(a)在凝胶过滤柱Bio-SilSEC上的HPLC、b)在疏水相(反向)柱上RP-HPLC分析根据纯化的本发明的重组透明质酸酶的纯度。
图22:SDS-PAGE12%-使根据本发明所产生和纯化的重组透明质酸酶以1000、500、250、100和50单位/泳道装载,并且与50、25和10单位/泳道的来自牛睾丸的透明质酸酶进行比较。在25单位的牛透明质酸酶的制备中利用抗-透明质酸酶多克隆抗体(Abnova)进行蛋白质印迹分析,其揭示出单一免疫反应性透明质酸酶条带。
图23:在指示范围5分钟至24小时的时间内,在1%琼脂糖凝胶中的电泳示出了用1单位根据本发明产生的重组透明质酸酶纯化的透明质酸的解聚作用。
图24:根据本发明产生的重组透明质酸酶和来自牛睾丸的透明质酸酶针对蛋白水解酶的稳定性。
图25:人和动物血清对透明质酸酶(根据本发明产生的重组和牛透明质酸酶)酶活性的抑制作用的离体评价。
具体实施方式
在一种实施方式中,本发明涉及用于制备分离自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的包含SEQ.ID.No.21中所示出的氨基酸序列的透明质酸酶的方法,该方法包括以下步骤:
a)将细菌培养基与含有SEQIDNo.41所示的序列的至少一种载体的重组细胞的接种物一起接种到生物反应器中;
b)在存在营养液的条件下,使步骤a)的所述生物反应器的内容物在pH为6.7至7.1之间经历发酵;
c)向步骤b)的混合物中加入lac基因的诱导物;
d)使步骤c)的混合物经历8至24小时的诱导期;
e)将在步骤d)中获得的细菌细胞离心;
f)重悬浮在步骤e)中获得的沉淀物并使所得的悬液经历渗压震扰;
g)通过离心步骤f)的悬液来提取周质蛋白;
h)通过如下顺序来纯化在步骤g)中获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分:
i.强离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分;
ii.弱阳离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分;以及
iii.芳香疏水相互作用色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分。
为了完全消除传播动物海绵状脑病的风险,并且由于微生物来源的透明质酸酶的有限来源可获得,在之前的研究中选择和分离了能够产生高透明质酸酶酶活性的细菌菌株[8]。
相同的细菌菌株被成功用于([9])制造具有所有特有酶促特征的透明质酸酶,但最重要的是所有纯度(>98%)都比[8]中所述高得多。事实上,比较研究已经显示出从[8]获得的产物实际上是68种不同流分的混合物,其中只有一种具有透明质酸酶活性。[9]的较高纯度伴有更大的酶促活性,其是在相同浓度以及T和pH值下评价的。
而且,另外的比较研究已经显示出,与在[8]中所述的不同,在[9]中所述的透明质酸酶在长达24个月的时间,甚至在不同温度(5℃和-20℃)下保持了其稳定性,并且其几乎没有受到在给药后会与其发生接触蛋白水解酶活性的影响。
为了确保这种细菌酶在制药应用中使用具有更好的安全性,如GenerallyRegardedasSafe(GRAS)所定义的利用非病源性细菌菌株作为宿主细胞以重组形式产生来自[9]中的原始细菌菌株的分离和表征的透明质酸酶。来自"GRAS"微生物的细菌重组形式的生产保持了比得上自体同源透明质酸酶的效力,但具有更高产量/升并且具有实质上更好的纯度和安全性,包括完全没有病毒传播的风险。
本发明的方法使得能够获得大量高质量的用于制药应用的重组细菌透明质酸酶。在非病源性微生物中的重组透明质酸酶的高生产率与传统透明质酸酶具有相同的效力,但具有显著更好的安全性和性质(profile),包括完全不具有转播动物海绵状脑病的风险。
本发明描述了编码来自革兰氏阳性细菌Streptomyceskoganeiensis的透明质酸酶的完整基因的分离,以及CDS片段(编码序列,SEQIDNO:22)的随后克隆和表达。此外,本发明提供了在发酵罐中制备的方法,编码的和在周质细胞蛋白中以可溶形式分泌的重组透明质酸酶的纯化和表征。
因此,该重组蛋白具有高透明质酸酶活性并且针对蛋白水解酶具有高稳定性,其能够在血流中以其最大生物利用度实现总活性,而不具有抑制以及细菌和病毒污染的可能性。以这种重组可溶形式,其证明了不仅在促进活性成分或可注射流体的皮下给药的药物组合物的制备的应用中使用是有效的,而且在治疗应用中也是有效的例如在病理学治疗中,例如高血压、心肌梗死、血栓事件、心血管和脑血管事件和肿瘤,因为其相比于迄今为止可获得的所有其他透明质酸酶具有本发明中所描述的独特特征。
已知来源于动物来源的透明质酸酶的生产具有较高的传播动物海绵状脑病的风险;由于这种风险,并且由于动物来源的透明质酸酶的较高不稳定性,对选择和分离能够产生具有高酶活性的透明质酸酶的细菌菌株进行了研究。
在一个方面,本发明涉及来自革兰氏阳性细菌S.koganeiensis的编码具有氨基酸序列SEQIDNO:21的细菌透明质酸酶的完整基因(SEQIDNO:17)的分离,编码具有序列SEQIDNO:21的成熟蛋白的核苷酸序列SEQIDNO:22在具体的细菌宿主(例如,大肠杆菌)中的随后克隆和表达,其被认为是选择用于在治疗、诊断或工业应用中使用的表达重组蛋白的生物体。本发明描述了在发酵罐中利用分批补料方法来生产蛋白质,以获得可溶形式的在周质细胞蛋白中分泌的大量重组透明质酸酶。因此,所产生的该重组透明质酸酶利用三个可再生色谱步骤(两次离子交换和一次疏水交换)经历纯化。该酶是适合于被创新地纯化的可溶性重组细菌酶,其具有通过安全细菌的发酵而不具有动物-来源的细胞和原料而产生的高透明质酸酶活性。此外,根据本发明的酶的特征在于具有217个氨基酸的序列,等电点(pi)为5.2±0.5,对于蛋白水解酶的高稳定性,针对动物和人血液的离体稳定性,高纯度和安全性,以及通过完全不存在病毒污染的可能性。
根据本发明的透明质酸酶能够如下获得:最初,使S.koganeiensis的菌株经历发酵并如前文所述从细菌细胞获得胞外材料[9]。在发酵过程中,每3-4小时收集细胞流分以评价通过标准方法产生的DNA和RNA水平(图1),同时在分析之后将流分的其他部分在-80℃下储存在RNAprotectTMBacteriaReagent(Qiagen)中。在发酵完成时,使含有透明质酸酶的上清澄清,浓缩,透析,纯化,并且然后用如前文所述的专有(sole)透明质酸酶组分富集[9]。
用蛋白水解酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C)消化如此分离的来自S.koganeiensis的透明质酸酶,并且通过HPLC分离消化后获得的片段。以这种方式,通过对酶促消化后的片段的N-端部分进行测序来获得关于分离的透明质酸酶的一级结构的信息。
从所实施的N-端测序获得了以下的氨基酸序列:
-AGENGATTTFDGPVA(SEQIDNO:l)
-RFSADTTIEAAFIKTTSETIHAATIYK(SEQIDNO:2)
-GYADGSDKDAAALSLDLR(SEQIDNO:3)
-AQVHIVQR(SEQIDNO:4)
-IGNAATVPTSVDSSGGG(SEQIDNO:5)
从数据库中进行的研究来看,确定了来自S.koganeiensisATCC31394的透明质酸酶与始旋链霉菌ATCC25486的前述蛋白(蛋白_id=ZP_06911952.1)的同源性。基于获自根据本发明的分离蛋白的肽的N-端序列,能够给合成相应的寡核苷酸,其可分离编码来自S.koganeiensis的基因组的透明质酸酶基因。
在透明质酸酶的指数生产期(图1),用DNA和RNA提取和纯化来处理来自发酵[9]的细菌细胞的沉淀物。利用分光光度计对由此获得的产物进行定量分析并通过在琼脂糖凝胶中的电泳对其进行定性分析[12]。所鉴定出的以及S.koganeiensis和始旋链霉菌之间相同的氨基酸区域用以设计用于分离编码来自用作模板的基因组DNA透明质酸酶的基因的固有区的寡核苷酸,产生具有大约550bp的单一特异性条带的PCR产物。图2中示出了序列(SEQIDNO:8)提供的片段的核苷酸测序结果。
开发和实施了反向PCR技术(IPCR)来鉴定如此鉴定出的基因序列的侧翼核苷酸区域(图3)。该IPCR方法利用能够获得PCR产物的引物对SEQIDNO:11和SEQIDNO:12(测序后分别为约700和1400bp)来提供编码S.koganeiensis的透明质酸酶的完整基因的准确信息。利用该步骤,完成了(图4)中示出的感兴趣核苷酸序列(SEQIDNO:13)的鉴定。
在非编码序列(SEQIDNO:14和SEQIDNO:15)和编码透明质酸酶的完整基因的侧翼上设计的引物对用于该完整基因(SEQIDNO:16)的扩增,并且PCR产物(图5)被直接克隆到大肠杆菌细胞中的-Bluntll-(Invitrogen)载体中。根据从生物信息学分析获得的结果,观察到编码来自S.koganeiensis的透明质酸酶的基因的完整长度为744bp(SEQIDNO:17)并且肽序列的长度估计为247个氨基酸(SEQIDNO:18)。该基因含有属于透明质酸酶家族的蛋白(透明质酸酶_1)的假定结构域(SEQIDNO:19),如通过在数据库中的同源性检索证实的。而且,利用具体工具的序列(SEQIDNO:18)的分析指出了30个氨基酸(氨基酸1至30(SEQIDNO:47),在氨基酸30和31之间具有切割位点)的信号序列(信号肽)的存在。因此,成熟蛋白(SEQIDNO:21)的长度为217个氨基酸(对应的核苷酸序列651bp(SEQIDNO:22))并且其预期分子量(http://web.expasy.org/compute_pi/)为21679.96Da。
最后,针对序列同源性的BLAST分析示出了来自S.koganeiensisATCC31394的透明质酸酶所确定的氨基酸序列(SEQIDNO:18)与属于网络数据库中报告的放线菌门的假定蛋白的一些氨基酸序列具有部分同源性。
来自S.koganeiensis的透明质酸酶(根据本发明)的序列(SEQIDNO:27和SEQIDNO:52)区域和结合该透明质酸的鼠CD44的氨基酸结构域中存在的组件(modules)之一之间存在同源性(图7(a))。
在根据本发明的不同质粒中,通过PCR来扩增编码根据本发明的来自S.koganeiensis的透明质酸酶的cDNA(SEQIDNO:41),从质粒pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL]开始并且在用限制酶消化后连接,例如:
在大肠杆菌菌株DH5a的细胞中克隆和扩增之后,提取并纯化基因工程化载体以将其分离地转化到细菌表达细胞中。将载体pHTsk_HYAL转化到已制成感受态的枯草芽胞杆菌(WB800N-MOBITEC)细胞中,而将载体pHyal_sk,pHyal_sk_SL和pRH_sk转化到已制成感受态的大肠杆菌菌株BL21(DE3)和/或MG1655细胞中。所有的转化都是通过化学过程来进行的[13]。发现枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的克隆对于含有遗传上准确克隆的序列(SEQIDNO:41)的透明质酸酶的核苷酸片段的载体的存在呈阳性,对其进行测试以确定其在500ml培养物中表达重组透明质酸酶的能力(实施例:10.11)。
优选地,在根据本发明的方法中,步骤a)的重组细胞选自大肠杆菌的细胞和枯草芽胞杆菌的细胞。
对于生产者(producer)重组菌株开发了主细胞库和工作细胞库,并立即将这种2ml克隆的等分式样与15%甘油引入到冻存管中在-80℃下储存。
根据本发明的透明质酸酶能够利用如本发明所述的分批(Batch)(实施例13)和分批补料(Fed-Batch)(实施例14)培养方法从小发酵罐起始大量生产(表1)。
表1:本发明中使用的质粒和克隆策略
然而,发现利用分批补料方法的发酵具有生产率、稳定性和可靠性的最好结果。根据具体载体的特征,可以使用氨苄西林、新霉素、卡那霉素或氯霉素作为抗生素。
例如,在含有50g/ml氨苄西林的新鲜LBMiller培养基(相对于发酵体积1/20的比率)中由小瓶(来自在-80℃储存的工作细胞库)孵育大肠杆菌"BL21(DE3)-pHyal_sk_SL"的克隆,并在37℃下以150rpm孵育16-18小时。使来自于该接种物的克隆在pH6.8下在发酵罐中在最小培养基上生长。
优选给予甘油溶液作为进料。在发酵过程中,大肠杆菌产生乙酸(乙酸盐),其是不希望的副产物并且对重组蛋白的生产具有大量负面影响。在发酵阶段中形成的乙酸盐的量与大肠杆菌细胞生长所消耗的葡萄糖的量直接相关[15]。在本发明中,发现通过利用甘油作为碳源(非发酵性低成本碳源)来代替葡萄糖,在用于重组透明质酸酶的分批进料生产工艺中可获得大约3-倍增加。作为一个非限制性实例,能够在孵育后6小时至长达19小时(诱导时间)以指数添加比率提供该进料。在用异丙基β-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)孵育之后,1mM最终溶液,能够每小时向培养物给予进料并且以与最后一次添加相同的量持续5小时。诱导发生在孵育之后24小时并持续8-24小时,通常为12小时。在诱导期之后通过离心收集细菌细胞,并在-80℃下储存。用载体pHyal_sk_SL转化的大肠杆菌BL21(DE3)的细胞在细胞周质中产生重组形式,其最大浓度可达到约2g/升培养物,且在用1mMIPTG在37℃诱导12小时后可获得的酶促活性高于87000U/ml培养物(7.5×107-8.7×107IU/l的孵育物)(表2)。
表2:本发明进行的克隆rHyal_Sk的发酵批次的结果
根据本发明生产的透明质酸酶的量比之前的专利中所描述的在发酵罐中产生的自体同源透明质酸酶的高约670-750倍[9]。
在用考马斯亮蓝G-250(BIO-RAD,161-0406)染色之后,通过在SDS-PAGE(12%)中进行电泳来分析以不同的发酵参数由大肠杆菌表达的重组蛋白,分子量为24kDa,同时通过浊度测定来分析酶促活性[16]。
通过分批补料方法在发酵罐中产生的重组透明质酸酶能够通过包括至少三个层析步骤来进行纯化。
在第一纯化的制备中,将在-80℃(用载体pHyal_sk_SL转化的来自分配发酵发酵的大肠杆菌BL21(DE3))下储存的沉淀物放置在等同于0.6升发酵产物(大约等于80-90g范围的细胞沉淀物反映大约1-1.2g/L重组透明质酸酶的生产率)的量以在室温下平衡45分钟。
平衡之后,用新鲜溶液(5℃)处理沉淀物以分散该沉淀物。用用于渗压震扰的溶液处理重悬浮的沉淀物以有助于提取周质蛋白。在渗压震扰步骤之后,将所获得的产物进行离心并且在均质化之后将所得上清调至pH8,并通过0.65μm过滤器的重力过滤器进行过滤。在SDS-PAGE中评价所提取的透明质酸酶的浓度,结果为约750-900mg/总(16-22%的总周质蛋白)。所提取的重组透明质酸酶的活性代替通过Dorfman's浊度测定法的评价。
使由此获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分经历强阴离子交换色谱(实例:Q琼脂糖XL)。
利用具有截留5kDa的聚醚砜(PES)过滤器将由此获得的具有的透明质酸酶酶促活性蛋白流分浓缩至100ml,并用50mM醋酸钠缓冲液在pH4稀释10倍。
使由此获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分经历弱阳离子交换色谱(实例:CM-FastFlow)。
利用具有截留5kDa的聚醚砜(PES)过滤器将由此获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分浓缩至100ml,并并用具有1.5mM硫酸铵的50mM磷酸钠缓冲液在pH7稀释10倍。
使由此获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分经历芳香疏水相互作用色谱(实例:苯基琼脂糖凝胶HP)并在体积约为730ml的单一流分中收集从该最后色谱步骤洗脱的蛋白并使其经历透明质酸酶活性测定。在酶促活性分析之后,使洗脱的流分经历超滤并用10体积的PBSlx(Sigma-P4417)透析使其浓度为大约1mg/ml并用0.2μm过滤器进行过滤,通过BCA蛋白测定试剂盒(PIERCE)来确定蛋白质浓度。
在应用于大约1L发酵产物的纯化过程结束时,获得了大约600-650mg重组透明质酸酶且酶促活性大于2.6×107U/升来自发酵的纯化产物(表3)。
表3:根据本发明的纯化的重组透明质酸酶的结果
在所具有透明质酸酶活性的所有流分中,在约24kDa处具有标记的蛋白条带(图16),使该条带在12%凝胶上经历SDS-PAGE电泳,并且然后在聚偏氟乙烯膜(BIO-RAD)上进行蛋白质印迹分析并根据供应商提供的说明书进行染色。用解剖刀切割该透明质酸酶条带并装载到测序仪的反应室中。
因此,在N-末端进行的测序使得能够根据其中明显存在信号N-端氨基酸序列的本发明提供的色谱图由用载体pHyal_sk_SL转化的大肠杆菌的样品构建根据本发明产生的重组透明质酸酶,这使得能够重新构建实验序列如下:AGENGA(SEQIDNO:42)。
通过利用[9]所述的酶促测定比较自体同源透明质酸酶[9]的酶活性来评价根据本发明产生的透明质酸酶(用载体pHyal_sk_SL转化的大肠杆菌)酶促潜力,并且在两种情况下报告的活性值菌大于4×104IU/mg蛋白。
另外,在通过圆二色谱(CD)进行的分析中,整个文件中黑色线(自体同源透明质酸酶[9])和灰色线(根据本发明的异源透明质酸酶)具有相当的性质,这证实了两种样品具有相同的蛋白质结构(图17-a)。
相比于现有技技术[9],根据本发明的方法能够:
-从特征在于安全的来源于大肠杆菌E.coli的菌株而不是Streptomyceskoganeiensis获得透明质酸酶,并且通过重组技术(代替通过提取的方式)生产,从而适合于工业规模生产,并且目的蛋白在周质(而不是在胞外基质中)中产生;
--达到出人意料地高的最大透明质酸酶活性,高于80000U/ml培养物,相比之下在[9]的方法中为例如130U/ml培养物上清,并且在任何情况下,比那些可用其他已知方法获得的产物更加澄清;
--仅通过三个层析步骤(而不是5个)获得高纯度(>99%)的透明质酸酶,具有显著经济效益且减少工艺时间。
在另一个方面,本发明涉及源自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的包含SEQ.ID.No.21所示的氨基酸序列的透明质酸酶。
本发明的蛋白能够由Streptomyceskoganeiensis分离或生产或重组生产,例如,由大肠杆菌或枯草芽胞杆菌的培养物生产。
出人意料地发现,相比于来自Streptomyceskoganeiensis[9]的已知蛋白,本发明的酶具有:
·更高水平的纯度(99%对比98%)
·更低水平的内毒素(<0.5U/mg代替>0.5U/mg);
·存在完整肽序列(以及相关的核苷酸序列),其不具有半胱氨酸(因此减少了产生聚集物的可能性);
·在5℃下在溶液中的更高稳定性(在24个月时100%稳定性对比蛋白[9]的在24个月时94%稳定性);
·在20℃下的优异稳定性(在24个月时100%)在pH3-11.5下(测试长达24小时);
·在生理pH(约7)下和体温(约37℃)下的最大活性;
·在血液中的稳定性大于90%。
根据本发明的透明质酸酶是来源于基因工程的产物;迄今为止,尚不能获得完整的蛋白-编码基因,因为没有S.koganeiensis菌株的基因组或蛋白库。只有通过本发明中发明人所开发的方法才能够鉴定和分离编码该蛋白的核苷酸序列。这种核苷酸片段是首次被分离并且从这种细菌菌株记载DNA序列。在工业水平,能够获得编码具有高酶促活性的这种透明质酸酶的基因的完整序列的可能性使得允许其使用不同的系统例如:载体、基因组整合以及在细胞中的系统,有利于在制药工业中生产和使用该酶。
本发明的进一步出人意料的结果是所要求保护的方法具有非常高的产率,其通过用不同的表达载体、将不同类型的编码蛋白的核苷酸片段插入到表达载体中(即,相对于其他位点,以相同的限制性位点来插入该片段)以及在不同细胞系中筛选生产的复杂筛选活动来进行。因为编码该蛋白的核苷酸序列不可获得,因此不能应用本领域技术人员已知的方法,使得这些筛选活动更加复杂,这些复杂筛选活动允许用于获得生产的大多数适合类型的克隆、载体和表达细胞类型的鉴定如此出人意料地高。该用于根据本发明的重组蛋白的表达和生产模型使得在纯化过程结束时仅利用三个层析步骤而不是已知方法中的5个步骤(内毒素s>0.5U/mg蛋白)[9]就能够获得纯的蛋白,并且其内毒素水平<0.5U/mg蛋白。
通过表4中列出的结果来表征适当地纯化的酶。
表4.根据本发明由克隆rHyalSk生产的重组透明质酸酶的表征测试的结果
根据本发明的透明质酸酶具有为了其工业、诊断和治疗应用所必需的那些活性和高纯度特征。此外,相比于迄今为止已知的其他透明质酸酶,根据本发明产生的透明质酸酶已被证实能够水解存在于间质基质中的透明质酸,增加结缔组织的可渗透性并促进皮下局部给药药物以极度稳定性向周围组织的扩散和分散,而没有被存在于该结缔组织中的蛋白水解酶消化的可能性,其中当药物注射后该蛋白水解酶能够容易地消化它从而抑制其作用(图24)。
在本发明中,由于在之前的临床研究中已经出现的利用浊度测定法的离体实验模型的规定已经得到证实,也就是说,牛透明质酸酶(牛PH20)的酶促活性被人和/或动物血液抑制,然而也发现人和/或动物血液并不抑制来自重组S.koganeiensis的透明质酸酶(图25)。
因此,根据本发明的研究发现,本发明的重组透明质酸酶(根据上述方法产生或来自S.koganeiensis)具有高透明质酸酶活性、具有对于蛋白水解酶的高稳定性并且能够以最大生物利用度实现在血流中的总活性而不会造成细菌和病毒感染。因此,发现在用于治疗疾病的药物组合物和兽医学组合物中其可单独使用,或与其他有效成分联用,其中有必要或有利于降解受到病变影响的器官或组织中的透明质酸。
由于其在水溶液中的高稳定性,本发明的透明质酸酶也能够被配制成水基组合物的形式,例如溶液、亲水性药膏、水凝胶,以及亲脂性产品,例如油膏或油性霜剂。
在一个方面,本发明涉及包含SEQ.ID.No.17中示出的核苷酸序列的多核苷酸,其中SEQ.ID.No.17编码来自StreptomyceskoganeiensisATCC31394且包含SEQ.ID.No.21的氨基酸序列的细菌透明质酸酶。
在另一种实施方式中,本发明涉及包含所述多核苷酸基因工程化重组载体,所述多核苷酸包含SEQ.ID.No.17中示出的核苷酸序列。
优选地,所述载体为质粒。
在另一种实施方式中,本发明提供了包含所述载体的宿主细胞。
在另一个方面,本发明涉及适合用于药物或化妆品应用的组合物,其包含纯化形式的来自StreptomyceskoganeiensisATCC31394且包含SEQ.ID.No.21中示出的氨基酸序列的透明质酸酶,该透明质酸酶可通过上述方法获得或通过从Streptomyceskoganeiensis提取获得。
在进一步的实施方式中,本发明涉及纯化形式的来自StreptomyceskoganeiensisATCC31394并且包含SEQ.ID.No.21中示出的氨基酸序列的透明质酸酶,其可通过上述方法获得或通过从Streptomyceskoganeiensis提取获得,其用于治疗和/或预防疾病或病症,可选地与至少另一种有效成分组合。
本发明的透明质酸酶能够被应用于医学领域和兽医学领域。优选地,根据本发明的透明质酸酶用于治疗和/或预防水肿、炎性病症、冻疮、实体肿瘤、IgE-介导的过敏、口腔的疾病、自发性玻璃体出血、动脉硬化、血压病症、心脑血管病症例如脑动脉狭窄或中风或牛乳腺炎中的至少一种。
对于人类应用,并不是意在对其进行限制,本发明的透明质酸酶能够用于制备意在用于治疗水中的药物组合物,尤其是创伤性基底上的水肿,或炎性病症上(例如痔疮综合征)上的水肿;而且,其可被用于制备意在用于治疗冻疮的组合物。本发明的透明质酸酶也能够被用于与必要或有利于增加生物利用度的其他药物联用。
例如,用于治疗创伤性基底上的水中,根据本发明的透明质酸酶与抗凝血和/或溶纤维蛋白药联用是尤其有利的。这样的联用也可以含有一种或多种甾体或非甾体抗炎剂。而且,这些组合物可以有利地与硫酸盐化透明质酸组合,已知其除了具有抗-炎性质之外还具有抗血栓形成和抗凝血性质。根据本发明的透明质酸酶与其他有效成分的组合在通常静脉内给药的含有具有特别高分子量的有效成分(例如单克隆抗体、细胞因子、酶、DNA和药物载体纳米颗粒)的可注射制剂的情况下也是有利的;这种透明质酸酶使得能够根据所谓的EASI(Enzymatically-AugmentedSubcutaneousInfusion)程序皮下给药,其尤其用于代替临终患者中的体液,从而限制或避免护理。根据本发明的透明质酸酶也能够用于制备意在用于治疗顽固性实体肿瘤的药物组合物。事实上,通过降解透明质酸,其降低了间质液进入肿瘤肿块的压力,从而使流向肿瘤的血流增加,并且因此使治疗剂朝向其靶标的运输效率增加,其以一种更加有效的方式减慢或抑制了肿瘤的生长。由于相同的原因,其还使可能预期相关的抗癌活性成分的效力增加。因此,本发明的又一个方面设计含有透明质酸酶以及一种或多种抗癌活性成分例如长春碱类(长春碱、长春新碱、长春瑞滨)和紫杉烷类(紫杉醇)的药物组合物。
根据本发明的透明质酸酶的进一步治疗应用涉及在用EPD(酶脱敏治疗)治疗IgE-介导的过敏形式中的应用,其包括给予非常低剂量的变应原以使对其敏感的个体脱敏。通过透明质酸酶与变应原的组合,其能够增加治疗的有效性,因为该变应原更容易达到作用位点。因此,本发明的进一步目的包括含有透明质酸酶和诱导IgE-介导的变态反应的一种或多种变应原的药物组合物。透明质酸酶还可在口腔疾病的治疗中被用作用于牙科应用的药物扩散因子,例如局部麻醉剂和抗生素;因此,根据又一个方面,本发明涉及含有根据本发明的透明质酸酶和一种或多种局部麻醉剂或抗生素的药物组合物。
在眼科学中,透明质酸酶使得能够显著加快自发性玻璃体出血的治疗,并且在制备用于眼科应用的意在用于治疗这种出血的药物形式(例如溶液、悬液、凝胶、霜剂和油膏剂)中能够单独使用或与其他活性成分联用。
之前的研究已经示出了透明质酸酶在治疗心血管疾病例如动脉粥样硬化[2]和控制血压[3]中的效力。而且,由于根据本发明生产的透明质酸酶能够在血流中具有总活性而不会被抑制,因此其也能够用于心脑血管治疗。
另一方面,对于兽医学应用,能够用本发明的透明质酸酶有效治疗的疾病是牛乳腺炎;在这种情况下,该透明质酸酶能够与抗生素,例如青霉素G、I-IV代头孢菌素类和增强的氨基青霉素(amminopenicilline)联合给药。由于其在水溶液中的稳定性,根据本发明的透明质酸酶能够被配制成水基产品,本领域技术人员能够基于组合物中的其他成分,基于制药技术领域的常规知识在水基制剂和油基制剂之间进行选择。
在一种实施方式中,本发明涉及源自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的包含SEQ.ID.No.21所示的氨基酸序列的透明质酸酶或可由StreptomyceskoganeiensisATCC31394获得的透明质酸酶的非治疗的应用或通过上述方法的化妆品应用和/或用于改善外形美观。
透明质酸酶也可被用于化妆品中以用于治疗肉芽肿性反应或由于填充导致的不正确的不希望的透明质酸排列。
而且,现今,在研究和调查之后,已经开发了基于透明质酸酶的可注射产品,其能够显著改善脂肪团中存在的纤维化病症。透明质酸酶通过使脂肪团的纤维化组分片段化能够使其变软并减少,从而使所治疗皮肤的部分获得更加天然和悦目的外观。在这种情况下,透明质酸酶适合用于具有脂肪团或具有少量脂肪量的所有人。而且迄今为止,在美容和/或治疗的方面,仅有真正的治疗能够抵抗脂肪团并且具有令人满意的结果。
本发明包括如上文所述的用于治疗的和非治疗的目的的用于治疗和/或预防脂肪团的透明质酸酶。
最后,根据本发明的透明质酸酶能够被用作用于定性/定量确定透明质酸的生物化学测试的试剂。在以下实施例中描述的本发明的实施方式仅是以举例说明的方式给出,而不是出于限制性的目的。
实施例1:细菌菌株和孵育条件
S.koganeiensis菌株获自美国典型孵育物保藏中心(ATCC31394)。细胞外材料获自前述[9]中所述的细菌的细胞。简言之,从ISPMedium2琼脂平板转移微生物的菌落并在500ml培养基[(20g/1酵母提取物(Organotechnie)和5g/1大豆蛋白胨(Solabia),pH6.9)]中在30℃下生长,以150rpm搅拌约16小时。生长后,培养物用于在含有10升特殊土(specialsoil)[(10g/1的酵母提取物(Organotechnie)、5g/1的大豆蛋白胨(Solabia)、3g/1的麦芽提取物(Constantine)、3g/1的I型糊精(Sigma)、0.2g/1的防沫剂(Sigma)]的20升发酵罐(BiostatU,B.BRAUN)中孵育。在孵育之前,用NaOH将pH调至7.0;在发酵过程中,监测但不控制pH,并且在整个发酵过程中使温度保持在30℃,同时使搅拌保持在300rpm,通气量为1.6VVM(升空气/升发酵培养基/min)。发酵时间为48h,该时间与在培养物上清中透明质酸酶酶活性的最大生产相一致。每天取样该培养物并评价生长、存活力并以Dorfman'smethod通过确定酶促活性来评价在培养物上清中产生的透明质酸酶浓度[10]。在不同的步骤中,通过在显微镜下计数,在600nm下测量光密度以及通过在ISPMedium2琼脂平板(Difco)上的菌落计数来确定细胞密度。
每3-4小时收集细胞流分,其中一部分用于利用分光光度计T60UV-Vis(PGInstruments)通过标准方法来评价RNA和DNA的水平(图1),将流分的其他部分在-80℃下储存在RNAprotectBacteriaReagent(Qiagen)中。在发酵结束时,在4℃将培养物以5000rpm离心30分钟(SorvallEvolutionRC)并用0.2μm截留流聚醚砜过滤器过滤,从而除去Streptomyceskoganeiensis(其为1-4mm直径的圆形菌丝聚集形式)的生物质并且获得含有透明质酸酶的澄清化上清。随后,如前述的[9]所述浓缩上清并通过截留过滤进行透析。
实施例2:自体同源透明质酸酶在FPLC中的分离
对浓缩和透析的上清进行纯化并如前述[9]所述仅用透明质酸酶富集。简言之,蛋白的分离和表征是利用蛋白质组方法进行的,其基于以如下顺序使用离子交换色谱柱(GEHealthcare)的组合的方法:CM-琼脂糖FFHiTrapQXL和HiTrapSPFF,ResourceQ。利用酶促剂量对从色谱柱洗脱的单个流分测试其最高透明质酸酶活性,并通过SDS-PAGE平行分析其蛋白质含量。
透明质酸酶活性的确定。用改进的Dorfman'smethod[10]来测量透明质酸酶活性。简言之,在0.03M磷酸盐缓冲液,0.82%NaCl,pH6.3中稀释通过色谱方法获得的产物,并且将1ml由此获得的溶液与1ml含有0.5mg透明质酸的底物缓冲液(0.03M磷酸盐缓冲液,NaCl10.82%,pH6.3)混合。在37℃下酶促消化30分钟,并且在孵育过程结束时,通过添加4ml马血清基酸性溶液(SIGMA)来产生浊度(turbidity)。在加入马血清酸性溶液之后的30分钟测量在640nm处的光密度。含有328IU/mg的来自哺乳动物睾丸(EDQM,FIP透明质酸酶,H1115000)的透明质酸酶标准物用于构建标准曲线,并且利用该续签来计算样品的活性(以单位计)。进行电泳并在SDS-PAGE中进行分析。
根据制造商的说明书,利用Mini-PROTEAN3(BIO-RAD),利用Laemmli's方法[11]在12%聚丙烯酰胺凝胶上在十二烷基硫酸钠(SDS-PAGE)存在下在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳实验。通过与标准低分子量蛋白(BIO-RAD)进行比较来评价纯化蛋白的分子量。在电泳运行后用SilverStainPlus(BIO_RAD)或考马斯亮蓝(BIO-RAD)对聚丙烯酰胺凝胶进行适当染色,通过实验室图像捕获装置ImageQuant300TL(GEHealthcare)获得图像,同时利用图像分析软件ImageQuantTL(GEHealthcare)进行(定性和定量)测定。
实施例3:间隔蛋白片段的N-端测序
根据Edman's降解方法利用自动化蛋白质测序仪在脉冲液相中进行N-端氨基酸测序(ABI-PerkinElmerMod.'477A)。利用BLAST软件(位于NationalLibraryofMedicine的NationalCenterforBiotechnologyInformation(Bethesda,MD)[28],thesearchserverBroadInstitute(http://www.broadinstitute.org/)和ClustalW软件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行同源性的研究。ThesignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)和Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)分别被用于进行信号肽切割位点的分析和用于进行蛋白质结构域的分析。
通过对完整蛋白和用胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C消化后的片段以及通过HPLC产生的片段的分离物的N-端部分进行测序来确定关于分离的透明质酸酶的一级结构的信息。
根据所进行的N-端测序,鉴定了该间隔片段的N-端氨基酸序列和氨基酸序列,并且以如下顺序示出:
-AGENGATTTFDGPVA(SEQIDNO:1)
-RFSADTTIEAAFIKTTSETIHAATIYK(SEQIDNO:2)
-GYADGSDKDAAALSLDLR(SEQIDNO:3)
-AQVHIVQR(SEQIDNO:4)
-IGNAATVPTSVDSSGGG(SEQIDNO:5)
用所鉴定的序列在数据库中进行检索并确定来自S.koganeiensis的透明质酸酶ATCC31394与始旋链霉菌ATCC25486的预测蛋白(蛋白_id=ZP_06911952.1)的同源性。基于获自根据本发明的分离蛋白的肽的N-端序列,可以合成相应的寡核苷酸,其用于分离编码来自S.koganeiensis的透明质酸酶基因组的基因。
实施例4:新型透明质酸酶基因的鉴定
从Streptomyceskoganeiensis的细菌细胞的DNA分离编码透明质酸酶的基因。简言之,利用DNeasyTissueKit(Qiagen)对来自透明质酸酶的指数生产期发酵的细菌细胞的沉淀物(图1)进行基因组DNA的提取和纯化,同时用RNeasyMiniKit(Qiagen)提取RNA。根据制造商的说明书,利用MICROBExpresskit和Poly(A)Tailingkit(AppliedBiosystems)和SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech)由总RNA开始获得cDNA文库,以从总RNA分离mRNA(信使RNA)。利用分光光度计T60UV-Vis(PGInstruments)对由此获得的产物进行定量反洗并利用琼脂糖凝胶中的电泳对其进行定性分析[12]。如在上一段中所述的,鉴定出S.koganeiensis和始旋链霉菌之间的相同氨基酸区域;通过利用线上工具和细菌属应用的密码子将以下的寡核苷酸设计成编码这些相同氨基酸残基的核苷酸区域:MesFor2(5'-GGAGAACGGGGCGACGACGACGTTCG-31(SEQIDNO:6)),对应于N-端区(ENGATTTF)中存在的肽,反义MesRev2(5'-GTCGGCACCGTCGCCGCGTTCCCGAT-3'(SEQIDNO:7),对应于C-端区(IGNAATVP)中存在的肽)。
利用这两种寡核苷酸,并且仅在作为模板的基因组DNA上用KOD聚合酶(Toyobo)进行若干次PCR反应,实验使用不同的温度条件并且利用或不利用4%DMSO。在各处理步骤结束时,获得特异性PCR产物(条件:初始变性95℃,5min;96℃,40秒;55℃,30秒退火;72℃,1min延伸,持续40次循环以及72℃,10分钟),事实上,该PCR仅扩增了大约550bp的具体条带。连续进行两次片段的测序程序得到图2中所示的序列(SEQIDNO:8)。通过在琼脂糖凝胶中电泳来分析PCR产物。根据给定的S.koganeiensis和始旋链霉菌的核苷酸序列之间的同源性,关注了所分析的侧翼基因的非编码区。
根据线上资源,http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/streptomyces_group/GenomeDescriptions.html,鉴定了始旋链霉菌基因的侧翼区,在其上设计有在S.koganeiensis的基因组DNA模板上的PCR中使用两个寡核苷酸(MesExrF:5'-cgggagaagggtgaacgc-3'(SEQIDNO:9)和MesExtR:5'-ctccgcgaccagttcttcg-3'(SEQIDNO:10))。根据之前的步骤定义PCR条件,由于细菌基因组的高GC含量,保持较高的变性温度(96℃)。
根据非特异性结果,决定尝试使用这些寡核苷酸联合之前使用给出了预期PCR产物的MesFor2(SEQIDNO:6)和MesRev2(SEQIDNO:7)。发现只有用oligoMesFor2和MesExtR的扩增给出了具有预期尺寸的澄清产物;通过用在扩增中使用的两种引物对其进行测序,鉴定出所分析的基因的区域3'。开发并实施了反向PCR技术(IPCR),以鉴定迄今闻之所鉴定的基因序列的核苷酸区域上游(图3)。通过以下处理步骤来实施该IPCR方法:
a)用限制酶消化基因组DNA。用大约100ng的S.koganeiensis的基因组DNA的酶KpnI、NARI和NotI来进行酶促消化的三个不同反应。
b)连接该消化的DNA。
c)利用连接反应用在迄今为止已知编码S.koganeiensis透明质酸酶的区域中退火的寡核苷酸作为模板利用连接反应通过PCR来进行扩增。
所使用的寡核苷酸如下:
MesINTf(5'-GGCATCTACGTCACGGCGACGAAC-3'(SEQIDNO:11))和反义MesINTr(5'-CGTACCCGCGGTGGGTGATCTTCAG-3'(SEQIDNO:12))。
用Kpnl和NarI消化的制剂分别得到约700bp和1400bp的PCR产物,该序列提供提供了S.koganeiensis的透明质酸酶的5'侧翼区的精确信息。利用该步骤,完成了示于(图4)的感兴趣的核苷酸序列(SEQIDNO:13)的鉴定。
在非编码序列(正向:5'-accattcggagttgatcgttg-3'(SEQIDNO:14)反向:5'-gtcaactgcactgttctctcc-3'(SEQIDNO:15))编码透明质酸酶的完整基因的侧翼上设计的引物对被用于完整基因的扩增。在电泳运行之后,从凝胶上切割具有(图5)中所示的在测序后获得的序列(SEQIDNO:16)的PCR产物,利用WizardSVGel和PCRClean-Up系统(Promega)进行纯化并将其直接克隆到大肠杆菌细胞中的载体-BluntII-(Invitrogen)中。随后通过测序来分析该克隆,嘎县其对于含有透明质酸酶基因的质粒的存在在PCR中是阳性的(pCR-Bluntll-TOPO[skJHYAL])。
推断蛋白序列的分析。
利用BLAST软件在GenBank数据库上进行同源性检索。而可在网上获得的软件ExPASyTranslateTool被用于能够在计算机上翻译蛋白质序列中的编码来自S.koganeiensis的透明质酸酶的分离基因的核苷酸序列。最后,通过可在网站(http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)上获得的InterProScan软件来核实透明质酸酶活性的保守结构域(图7(a))。根据所获得的结果,可以观察到编码来自S.koganeiensis的透明质酸酶的基因的完整长度为744bp(SEQIDNO:17)并且肽序列的长度估计为247个氨基酸(SEQIDNO:18)。该基因含有属于透明质酸酶家族(透明质酸酶_l)的蛋白的假定结构域(SEQIDNO:19),如通过在Pfam数据库上进行同源性检索所证明的。而且,利用具体工具http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-1.1/进行的序列(SEQIDNO:18)分析表示存在30个氨基酸(氨基酸1至30(SEQIDNO:47),具有在氨基酸30和31之间的切割位点)的信号序列(信号肽)。成熟蛋白(SEQIDNO:21)的长度为217个氨基酸(对应于核苷酸序列651bp(SEQIDNO:22))并且预测其分子量为(利用可在网站http://web.expasy.org/compute_pi/上获得的工具)21679.96Da。最后,针对序列同源性的BLAST分析示出了针对透明质酸酶S.koganeiensisATCC31394(SEQIDNO:18)确定的氨基酸序列和网站上的数据库中记录的氨基酸序列:与示出了示出了68%同一性/78%相似性的来自放线菌属的蛋白透明质酸氨基葡糖苷酶氨基酸序列(根据从网站上描述的基因组位点(具有编码YP_006266806.1)开始的开放阅读框的分析来预测)的同源性,与具有66%同一性/77%相似性的始旋链霉菌ATCC25486的预测蛋白ZP_06911952.1的氨基酸序列(根据从网站上描述的基因组位点(具有编码ZP_06911952.1)开始的开放阅读框的分析来预测)的同源性(SEQIDNO:23和SEQIDNO:48)以及具有66%同一性/80%相似性的筑波链霉菌NRRL18488(SEQIDNO:24和SEQIDNO:49)的假定蛋白STSU_30255(根据从网站上描述的基因组位点(具有编码ZP_10072726.1)开始的开放阅读框的分析来预测)的氨基酸序列的同源性(图6a,图6b)。由于根据本发明描述的透明质酸酶(SEQIDNO:19)观察到的功能性结构域(SEQIDNO:25和SEQIDNO:50,SEQIDNO:26和SEQIDNO:51)的显著相似性,从原始基因组位点分离并表征编码这些蛋白质的完整CDS核苷酸序列(其在网站上被定义为专业术语"假定的"或"预测的")允许在本发明中首次鉴定为透明质酸酶(图7(b))。然而,这些分析均未发现根据文献报道的专利分离的透明质酸酶的完整准确核苷酸序列和氨基酸序列。
根据本发明的来自S.koganeiensis的透明质酸酶的序列(SEQIDNO:27和SEQIDNO:52)的区域与结合透明质酸的鼠Cd44的氨基酸结构域中存在的模块之一之间存在序列同源性(图7(a))。
实施例5:在pHT43(+)中编码透明质酸酶的基因的克隆
通过PCR从提取并纯化自大肠杆菌细胞的质粒pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL]开始来扩增编码来自S.koganeiensis的透明质酸酶的cDNA(SEQIDNO:41),该大肠杆菌细胞用DNA纯化系统WizardPlusSVMinipreps纯化并利用如下引物扩增:正义(5'-gtaGGATCCGCCGGGGAGAACGGCGCGACGACGA-3'SEQIDNO:28);反义(5'-gacTCTAGATCACGCCGGTGCGATCGTCGTGACC-3'SEQIDNO:29)。用于扩增的PCR循环为:在96℃最初变性,持续5分钟;退火55℃持续30秒,30次循环;在72℃延伸1分钟,以及在96℃后续变性,持续40秒。用于扩增的TaqDNA聚合酶为DyNAzymeIIDNA聚合酶(Finnzymes)(图8)。利用KitWizardSVGel和PCRClean-Up系统(Promega)来纯化扩增的产物(672bp),用BamHI(BioLabs)和Xbal(BioLabs)消化,并利用T4连接酶(Ambion)与之前用BamHI和Xbal消化的载体pHT43(+)连接(图8)。在连接酶起作用之后,通过化学过程将载体转化到大肠杆菌菌株DH5a细胞(Invitrogencode12297-016)内部。在转化之后,将细胞铺板于含有氨苄西林(50μg/m1)的LB琼脂并在37℃下孵育16h。由于载体特异性引物(正向:5'-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3'(SEQIDNO:30),反向:5'-TTTCAACCATTTGTTCCAGGT-3'(SEQ.IDNO:31))的辅助,对所获得的菌落进行分析以确认在透明质酸酶基因片段和载体之间通过PCR(在94℃最初变性,持续5分钟,30次循环:在55℃退火持续30秒,在72℃延伸持续秒,以及在94℃后续变性持续1分钟)发生了正确的连接。利用分子量的参比标准物(ΦΧ174DNA和ADNA/HindlllofFermentas),对所获得的该PCR产物(927bp)与通过用限制酶(BamHI,XbaI)消化的载体pHTsk_HYAL[具有插入的载体]获得的产物(图10)一起在1%琼脂糖凝胶中通过电泳进行分析(图9)。对于在与载体连接之后的编码透明质酸酶的基因的正确框架的分析,对PCR产物的序列进行测序。利用生物信息学工具例如ClustalW,Traslate(ExPASy)和Chromaslife来分析在测序后获得核苷酸序列(SEQIDNO:38)(图13,a)。
实施例6:在pET22b(+)中编码透明质酸酶的基因的克隆
通过PCR从提取并纯化自大肠杆菌细胞的质粒pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL]开始来扩增编码来自S.koganeiensis的透明质酸酶的cDNA(SEQIDNO:41),该大肠杆菌细胞用DNA纯化系统WizardPlusSVMinipreps纯化并利用如下引物扩增:正义(5'-tggCCATGGCCGGGGAGAACGGCGCGACGACGA-3'(SEQIDNO:32));反义(5'-ctcGAATTCtcaCGCCGGTGCGATCGTCGTGACC-3'(SEQIDNO:33))。用于扩增的PCR循环为:在96℃最初变性,持续5分钟;退火55℃持续30秒,30次循环;在72℃延伸1分钟,以及在96℃后续变性,持续40秒。用于扩增的TaqDNA聚合酶为DyNAzymeIIDNA聚合酶(Finnzymes)(图8)。利用KitWizardSVGel和PCRClean-Up系统(Promega)来纯化扩增的产物(671bp),用Ncol(BioLabs)和EcoRI(BioLabs)消化,并利用T4连接酶(Ambion)与之前用Ncol和EcoRI消化的载体pET22b(+)连接(图8)。在连接酶起作用之后,通过化学过程将载体转化到大肠杆菌菌株DH5a细胞(Invitrogen编码12297-016)内部。在转化之后,将细胞铺板于含有氨苄西林(50μg/m1)的LB琼脂并在37℃下孵育16h。由于载体特异性引物(T7-启动子:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQIDNO:34),T7-终止子:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'(SEQIDNO:35))的辅助,对所获得的菌落进行分析以确认在透明质酸酶基因片段和载体之间通过PCR(在94℃最初变性,持续5分钟,30次循环:在55℃退火持续30秒,在72℃延伸持续秒,以及在94℃后续变性持续1分钟)发生了正确的连接。利用分子量的参比标准物(ΦΧ174DNA和ADNA/HindlllofFermentas),对所获得的该PCR产物(940bp)与通过用限制酶(NcoI,EcoRI)消化的载体pHyal_sk[具有插入的载体]获得的产物(图11)一起在1%琼脂糖凝胶中通过电泳进行分析(图9)。对于在与载体连接之后的编码透明质酸酶的基因的正确框架的分析,对PCR产物的序列进行测序。利用生物信息学工具例如ClustalW,Traslate(ExPASy)和Chromaslife来分析在测序后获得核苷酸序列(SEQIDNO:39)(图13,b)。
实施例7:在pET21b+中编码透明质酸酶的基因的克隆
通过PCR从提取并纯化自大肠杆菌细胞的质粒pCR-BluntII-TOPO[sk_HYAL]开始来扩增编码来自S.koganeiensis的透明质酸酶的cDNA(SEQIDNO:41),该大肠杆菌细胞用DNA纯化系统WizardPlusSVMinipreps纯化并利用如下引物扩增:正义(5'-ataCATATGGCCGGGGAGAACGGCGCGACGACGA-3'(SEQIDNO:36));反义(5'-ctcGAATTCtcaCGCCGGTGCGATCGTCGTGACC-3'(SEQIDNO:37))。用于扩增的PCR循环为:在96℃最初变性,持续5分钟;退火55℃持续30秒,30次循环;在72℃延伸1分钟,以及在96℃后续变性,持续40秒。用于扩增的TaqDNA聚合酶为DyNAzymeIIDNA聚合酶(FINNZYME)(图8)。利用KitWizardSVGel和PCRClean-Up系统(Promega)来纯化扩增的产物(672bp),用NdeI(BioLabs)和EcoRI(BioLabs)消化,并利用T4连接酶(Ambion)与之前用NdeI和EcoRI消化的载体pET21b(+)(Novagen)连接(图8)。在连接酶起作用之后,通过化学过程将载体转化到大肠杆菌菌株DH5a细胞(Invitrogencode12297-016)内部。在转化之后,将细胞铺板于含有氨苄西林(50μg/m1)的LB琼脂并在37℃下孵育16h。由于载体特异性引物(T7-启动子:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQIDNO:34);T7-终止子:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'(SEQIDNO:35))的辅助,对所获得的菌落进行分析以确认在透明质酸酶基因片段和载体之间通过PCR(在94℃最初变性,持续5分钟,30次循环:在55℃退火持续30秒,在72℃延伸持续秒,以及在94℃后续变性持续1分钟)发生了正确的连接。利用分子量的参比标准物(ΦΧ174DNA和ADNA/HindlllofFermentas),对所获得的该PCR产物(874bp)与通过用限制酶(NdeI,EcoRI)消化的载体pHyal_sk_SL[具有插入的载体]获得的产物(图12)一起在1%琼脂糖凝胶中通过电泳进行分析(图9)。对于在与载体连接之后的编码透明质酸酶的基因的正确框架的分析,对PCR产物的序列进行测序。利用生物信息学工具例如ClustalW,Traslate(ExPASy)和Chromaslife来分析在测序后获得核苷酸序列(SEQIDNO:40)(图13,c)。
实施例8:用于来自S.koganeiensis的透明质酸酶基因的克隆和表达的宿主细菌菌株
大肠杆菌菌株DH5a(Invitrogen,基因型:F-cp801acZAM15Δ(lacZYA-argF)U169recAlendAlhsdRl7(rk-,mk+)phoAsupE44thi-1gyrA96relAltonA(赋予对噬菌体T1的抗性)[22]被用作用于克隆系统的质粒扩增的宿主。该菌株由Invitrogen(OneShotMaxEfficiencyDH5a-T1R化学感受态大肠杆菌,12297-016)提供。在含有10mMMgSO4的固体培养基LB琼脂(10g/1来自酪蛋白的蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/1NaCl,15g/l细菌琼脂)中解冻并培养该细胞,并使其在37℃生长18小时。从所得的培养物挑取单个菌落并在TYM肉汤(胰蛋白胨20g/l,酵母提取物5g/l,20ml5MNaCl,1mMMgSO4)中在37℃生长。对从该培养物所得的细胞进行化学处理,以获得化学感受态细胞。将所获得的该细胞分份并在-80℃储存于含有15%甘油的适合储存缓冲液中。在该等分式样的贮液上进行转化。
枯草芽胞杆菌WB800N(Genotype:nprEaprEeprbprmpr::blenprB::bsr.vprwprA::hygcm::neo;NeoR[23])由MOBITEC提供,其是特征为缺少8中蛋白酶的革兰氏阳性细菌菌株,因此其是用于生产分泌的异源蛋白所使用的细菌菌株。还在该基因中插入了新霉素抗性基因,系统命名法为WB800N。在适当的生产后使该细菌菌株的细胞成为感受态,分份并在-80℃储存于含有15%甘油的适合储存缓冲液中。在该等分式样的贮液上进行转化。
大肠杆菌菌株MG1655(ATCC编号:12297-016,基因型:F-λ-[24,25])在来自S.koganeiensis的透明质酸酶基因的表达系统中被用作宿主。该细菌菌株由美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供。冻干的细胞首先在几ml的液体培养基中培养,然后在含有10mMMgSO4的固体培养基LB琼脂(10g/1来自酪蛋白的蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/1NaCl)中培养,并在37℃下生长18小时。从所得的培养物挑取单个菌落并在TYM肉汤中在37℃生长。对从该培养物所得的细胞进行化学处理,以获得化学感受态细胞。将所获得的该细胞分份并在-80℃储存于含有15%甘油的适合储存缓冲液中。在该等分式样的贮液上进行转化。
大肠杆菌菌株BL21(DE3)(大肠杆菌BF-dcmompTHSDS(rB-mB-)galλ(DE3)[26,27])在来自S.koganeiensis的透明质酸酶基因的表达系统中被用作宿主。该细菌菌株由Novagen提供,编码为69450-3。该细胞首先在几ml的液体培养基中培养,然后在含有10mMMgSO4的固体培养基LB琼脂(10g/1来自酪蛋白的蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/1NaCl)中培养,并在37℃下生长18小时。从所得的培养物挑取单个菌落并在TYM肉汤中在37℃生长。对从该培养物所得的细胞进行化学处理,以获得化学感受态细胞。将所获得的该细胞分份并在-80℃储存于含有15%甘油的适合储存缓冲液中。在该等分式样的贮液上进行转化。
实施例9:质粒pHTsk_HYAL,pHyal_sk和pHyal_sk_SL在表达细胞中的转化
将分别含有载体pHTsk_HYAL、pHyal_sk和pHyal_sk_SL的DH5a细胞置于培养物中于具有氨苄西林(50μg/ml)的约6ml的LB肉汤中,并使其生长16-18h。在工程化细胞生长后以大约5000g将各培养物离心10分钟。利用试剂盒WizardPlusSVminiprepsDNA纯化系统(Promega)从获得的沉淀物中提取和纯化各个质粒pHTsk_HYAL、pHyal_sk和pHyal_sk_SL。在表达细胞中单独转化该纯化的载体pHTsk_HYAL、pHyal_sk和pHyal_sk_SL。第一载体被转化至枯草芽胞杆菌(WB800N-OBITEC)的细胞中使其成为感受态,而另外两种载体被转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)和/或MG1655中并使其成为感受态。所有的转化都是通过化学程序进行的[13]。将转化后的枯草芽胞杆菌和大肠杆菌细胞分别铺板于含有氯霉素(10μΜ)加新霉素(10μΜ)的LB琼脂中以及含有氨苄西林(50μg/ml)的LB琼脂中以产生对抗生素的抗性,并在37℃下孵育16h。由于用于分析成功转化到枯草芽胞杆菌中的物种特异性引物(正向:5'-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3'(SEQIDNO:30),反向:5'TTTCAACCATTTGTTCCAGGT-3'(SEQIDNO:31))和用于确认成功转化到大肠杆菌中的物种特异性引物(T7-启动子:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQIDNO:34),T7-终止子:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'(SEQIDNO:35))的辅助,对在各转化后获得的菌落进行分析以通过PCR来确认在表达细胞中存在正确的质粒(在94℃最初变性,持续5分钟,30次循环:在55℃退火持续30秒,在72℃延伸持续秒,以及在94℃后续变性持续1分钟)。利用分子量的参比标准物(ΦΧ174DNA和ADNA/HindlllofFermentas),,通过电泳在1%琼脂糖凝胶中对针对用pHTsk_HYAL(927bp)、pHyal_sk(940bp)和pHyal_sk_SL(874bp)转化的细胞所获得的PCR产物进行分析。对于在与载体连接之后的编码透明质酸酶的基因的正确框架的分析,对PCR产物的序列进行测序。利用生物信息学工具例如载体NTIAdvance9(Invitrogen)、ClustalW、Traslate(ExPASy)和Chromaslife来分析在测序后获得核苷酸序列(SEQIDNO:39)(图13a,b,c)。
实施例10:重组透明质酸酶表达水平的评价
对含有用框架序列(SEQIDNO:41)基因工程化以用于正确表达的透明质酸酶的核苷酸片段的载体的存在呈阳性的枯草芽胞杆菌的克隆进行测试其表达水平,并且然后将由此工程化的细胞在具有氯霉素(10μΜ,Sigma)和新霉素(10μΜ,Sigma)的含有500mlLB肉汤的烧瓶中孵育,并且以250rpm在37℃下孵育。当细胞生长值达到OD600nm0.8时,用IPTG(Sigma,16758)促使其最终浓度为1mM。诱导12小时后,以7500rpm将细菌培养物离心10分钟并收集培养物上清以评价在枯草芽孢杆菌中的表达。
随后,将来自枯草芽胞杆菌表达测试的上清浓缩(20倍)并在磷酸盐缓冲液1x中在具有5kD截留的专用聚醚砜过滤器上通过超滤进行透析。
在SDS-PAGE中,表达的重组的分子量为约24kDa,其在37℃下在OD600nm0.8在用1mMIPTG诱导12小时之后具有最大表达。
通过在用考马斯蓝亮蓝G-250(BIO-RAD,161-0406)染色后在SDS-PAGE(12%)中进行电泳并用适合的酶测定(例如Dorfman's测定)来确定在所分析的不同克隆中的枯草芽胞杆菌细胞中透明质酸酶(SEQIDNO:21)的表达和表达的定位。
实施例11:重组透明质酸酶在大肠杆菌中表达水平的评价
对含有用框架序列(SEQIDNO:41)基因工程化以用于正确表达(SEQIDNO:21)的透明质酸酶的核苷酸片段的载体的存在呈阳性的大肠杆菌的克隆进行测试其表达水平,并且然后将由此工程化的细胞在具有氨苄西林(50g/ml,Sigma)的含有500mlLB肉汤的烧瓶中孵育,并且以250rpm在37℃下孵育。当细胞生长值达到OD600nm0.8时,用IPTG(Sigma,16758)促使其最终浓度为1mM。在诱导3-4小时后收获细菌细胞,以7500rpm离心10分钟。离心后,收集细菌沉淀物以用于评价在大肠杆菌的工程化细胞中的表达并确认在细胞的哪个部分发生重组。
随后,根据供应商提供的说明书用B-PER细菌蛋白(PIERCE)处理来自用IPTG诱导的大肠杆菌细胞的沉淀,以评价透明质酸酶在周质和/或细胞质部分中的表达和/或形成包涵体。分别含有质粒spHyal_sk和pHyal_sk_SL的两种大肠杆菌克隆以可溶形式在周质部分中表达该重组:
含有pHyal_sk的大肠杆菌BL21(DE3)。在SDS-PAGE中,表达的重组的分子量为约24kDa,其在OD600nm0.8下用1mMIPTG于37℃诱导3-4小时后含有约40%的总细菌蛋白。然而,周质中以可溶形式表达的重组体的量仅为18%(总体仅7.2%),其余82%具有包涵体(总体仅32.8%)。周质可溶部分证明是以最大浓度52μg/ml培养物存在,其具有的酶促活性等于约2100U/ml培养物。
含有pHyal_sk_SL的大肠杆菌BL21(DE3)。在SDS-PAGE中,表达的重组体的分子量为约24kDa,其在OD600nm0.8下用1mMIPTG于37℃诱导3-4小时后含有约15%的总细菌蛋白。而且,所有表达的蛋白在周质中均以可溶形式存在。周质可溶部分证明是以浓度约125pg/ml培养物存在,其具有的酶促活性大于于约5000U/ml培养物。
通过在用考马斯亮蓝G-250(BIO-RAD,161-0406)染色后在SDS-PAGE(12%)中进行电泳并用适合的酶测定(例如Dorfman's测定)来确定在所分析的不同克隆中的大肠杆菌细胞中透明质酸酶(SEQIDNO:21)的表达和表达的定位。
实施例12:重组菌株的主细胞库和工作细胞库的开发
主细胞库(MCB)
在无菌操作下,从属于生产者菌株的菌落挑取单个菌落并将其重悬浮于含有10ml液体培养基(LB肉汤,含有氯霉素(10μΜ,Sigma)和新霉素(10μΜ,Sigma)对于枯草芽胞杆菌的重组细胞,以及LB肉汤,含有氨苄西林(50μg/ml,Sigma),对于大肠杆菌的重组细胞)的无菌烧瓶中,并以200rpm在37℃下孵育约16小时。在孵育期后以及适当检查培养物的无菌情况后,分别将10ml的每一培养物转移至100ml液体培养基中(LB肉汤,含有氯霉素(10μΜ,Sigma)和新霉素(10μΜ,Sigma)对于枯草芽胞杆菌的重组细胞,以及LB肉汤,含有氨苄西林(50μg/ml,Sigma),对于大肠杆菌的重组细胞)并以200rpm在37℃下孵育5-6小时。接着,在孵育期后以及适当检查培养物的无菌情况后,加入一定量的无菌甘油冷却每一培养物直至达到甘油的最终浓度为15%。搅拌该混合物并将2ml等分式样引入到(CORNING,430659)中,并立即将其置于-80℃。
在无菌条件下针对以下菌株进行主细胞库的开发:含有用pHTsk_HYAL(克隆105)工程化的质粒的枯草芽孢杆菌菌株(WB800N-MoBitec)、含有用pHTsk_HYAL(克隆105)工程化的质粒的大肠杆菌菌株(DH5a)、含有用pHyal_sk(克隆413)工程化的质粒的大肠杆菌菌株(DH5)和大肠杆菌(BL21(DE3))、含有用pHyal_sk_SL(克隆225)工程化的质粒的大肠杆菌菌株(DH5a)和大肠杆菌(BL21(DE3))和含有用pRH_sk(克隆600)工程化的质粒的大肠杆菌菌株(DH5a)和大肠杆菌(BL21(DE3))。
工作细胞库(WCB)
在无菌操作下,从来自主细胞库的小瓶取得等分试样并在固体培养基(LB肉汤,含有氯霉素(10μΜ,Sigma)和新霉素(10μΜ,Sigma)对于枯草芽胞杆菌的重组细胞,以及LB肉汤,含有氨苄西林(50μg/ml,Sigma),对于大肠杆菌的重组细胞)中进行测试,并以200rpm在37℃下孵育约18小时。在无菌橱内,从属于生产者菌株的菌落挑取单个菌落并将其重悬浮于含有10ml液体培养基(LB肉汤,含有氯霉素(10μΜ,Sigma)和新霉素(10μΜ,Sigma)对于枯草芽胞杆菌的重组细胞,以及LB肉汤,含有氨苄西林(50μg/ml,Sigma)或卡那霉素(30μg/ml,SIGMA),对于大肠杆菌的重组细胞)的无菌烧瓶中,并以200rpm在37℃下孵育约16小时。在孵育期后以及适当检查培养物的无菌情况后,分别将10ml的每一培养物转移至100ml液体培养基中(LB肉汤,含有氯霉素(10μΜ,Sigma)和新霉素(10μΜ,Sigma)对于枯草芽胞杆菌的重组细胞,以及LB肉汤,含有氨苄西林(50μg/ml,Sigma)或卡那霉素(30μg/ml,SIGMA),对于大肠杆菌的重组细胞)并以200rpm在37℃下孵育5-6小时。接着,在孵育期后以及适当检查培养物的无菌情况后,加入一定量的无菌甘油冷却每一培养物直至达到甘油的最终浓度为15%。搅拌该混合物并将2ml等分式样引入到(CORNING,430659)中,并立即将其置于-80℃。
在最大无菌条件下针对以下菌株进行工作细胞库的开发:含有用pHTsk_HYAL(透明质酸酶克隆105)工程化的质粒的枯草芽孢杆菌菌株(WB800N-MoBitec)、含有用pHyal_sk(透明质酸酶克隆413)工程化的质粒的大肠杆菌菌株(BL21(DE3))、含有用pHyal_sk_SL(克隆rHyal_Sk)工程化的质粒的大肠杆菌菌株(BL21(DE3)和含有用withpRH_sk(克隆rH_sk)工程化的质粒的大肠杆菌菌株(BL21(DE3))。
在MCB和WCB上进行以下测试以评价它们的纯度:评价来自MCB和WCB的细胞的质粒的多个拷贝,通过限制酶对质粒进行分析并通过1%琼脂糖凝胶分离消化的片段,评价MCB和WCB中含有表达质粒的细胞中甘油的保存,评价MCB和WCB中含有表达质粒的细胞的稳定性,重组细胞在LB平板中的存活力,大肠杆菌株的鉴定、培养物的春醋,大肠杆菌噬菌体测试,SDS-PAGE中表达产物的评价,编码该重组蛋白的区域的测序。
实施例13:重组透明质酸酶的分批发酵。
通过分批培养在发酵罐中生长来评价大肠杆菌BL21(DE3)-pHyal_sk和BL21(DE3)-pHyal_sk_SL的克隆生产重组透明质酸酶的能力。
通过在小瓶(来自工作细胞库,储存于-80℃)中在含有50μg/ml氨苄西林的400ml新鲜LB培养基中(比率1/20,相对于发酵体积)并以150rpm在37℃下孵育16-18小时孵育来制备接种物。来自各接种体(大肠杆菌BL21(DE3)-pHyal_sk和BL21(DE3)-pHyal_sk_SL)的克隆分别在发酵罐中在最小培养基上生长,其组合物/升是如下提供的:2gNa2HPO4·2H2O、2gKH2PO4、4gK2HPO4、3.8g柠檬酸、3.3g(NH4)2SO4、40ml甘油、0.6mlPPG2000防沫剂(FlukaCode81380)。在121℃灭菌后用25%氢氧化铵溶液(SIGMA)将pH校至6.8,并且仅添加如下组分/升培养基,通过0.2pm过滤器通过过滤进行灭菌:0.49gMgSO4·7H2O,0.0147gCaCl2,1mlFeC12(0.2M)、2ml痕量元素(痕量元素/升:0.96g柠檬酸、0.25gCoC12·6H2O、1.5gMnCl2·4H2O、0.15gCuCl2·2H2O、1.5gH3BO3、0.25gNa2MoO4·2H2O、1.3gZn(CH3COO)2·2H2O)、0.01g维生素B1、5g葡萄糖、3g酵母提取物。
用异丙基β-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导在接种后进行4-6小时并持续进行约16-18小时。所采用的发酵参数如下:温度37℃,搅拌600rpm,空气流5-10升空气/分钟以及压头为约0.8巴。
在约16小时的诱导期之后通过7500rpm离心25分钟来收获细菌细胞。收集细胞之后,将细菌细胞在-80℃储存备用以用于重组透明质酸酶的提取和纯化。在用考马斯亮蓝G-250(BIO-RAD,161-0406)染色之后,在SDS-PAGE(12%)中通过电泳运行来分析以不同发酵参数由大肠杆菌表达的重组蛋白,而通过浊度测试来分析酶活性[16]。用载体pHyal_sk转化的大肠杆菌BL21(DE3)的细胞在装有8L培养基的发酵罐中被诱导以在周质中表达可溶性异源蛋白。在SDS-PAGE中,该表达的重组体的分子量为约24kDa并且在细胞周质中表达的蛋白的量为约0.1-0.15g/L培养物,在用1mMIPTG于37℃诱导16小时后达到最大量。
用载体pHyal_sk_SL转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在装有8L培养基的发酵罐中被诱导以在周质中表达可溶性异源蛋白。周质可溶性部分的结果是以约0.35-0.5g/L培养物的浓度存在,其酶促活性大于15050-21495U/ml培养物。在SDS-PAGE中,在37℃下用1mMIPTG诱导16小时后,所表达的该重组体的分子量为约24kDa,构成约18%的总细菌蛋白。
对于两种克隆,发酵过程中质粒的稳定性为100%(表2)。通过影印接种技术(replicaplatingtechnique)筛选来监测质粒的稳定性直至发酵结束[29],这使得能够在含有抗生素的平板上复制菌落。
实施例14:重组透明质酸酶的分批补料发酵
通过分批培养在发酵罐中生长来评价大肠杆菌大肠杆菌BL21(DE3)-pHyal_sk和BL21(DE3)-pHyal_sk_SL的克隆生产重组透明质酸酶的能力。
通过在小瓶(来自工作细胞库,储存于-80℃)中在含有50μg/ml氨苄西林的500ml新鲜LB培养基中(比率1/20,相对于发酵体积)并以150rpm在37℃下孵育16-18小时孵育来制备接种物。来自各接种体(大肠杆菌BL21(DE3)-pHyal_skandBL21(DE3)-pHyal_sk_SL)的克隆分别在发酵罐中在最小培养基上生长,其组合物/升是如下提供的:2gNa2HPO4·2H2O、2gKH2PO4、4gK2HPO4、3.8g柠檬酸、3.3g(NH4)2SO4、0.6mlPPG2000防沫剂(FlukaCode81380)。在121℃灭菌后用25%氢氧化铵溶液(SIGMA)将pH校至6.8,并且仅添加如下组分/升培养基,通过0.2pm过滤器通过过滤进行灭菌:0.49gMgSO4·7H2O、0.0147gCaCl2、1mlFeCl2(0.2M)、2ml痕量元素(痕量元素/升:0.96g柠檬酸、0.25gCoCl2·6H2O、1.5gMnCl2·4H2O、0.15gCuCl2·2H2O、1.5gH3BO3、0.25gNa2MoO4·2H2O、1.3gZn(CH3COO)2·2H2O)、0.01g维生素B1、5g葡萄糖、3g酵母提取物。
在高压釜中灭菌的之前用0.2μm过滤器过滤的甘油溶液(~1.2kg/1.0L发酵)作为进料和后续组分,然后将其加入每升进料:2gNa2HPO4·2H2O、3gKH2PO4、5.4gK2HPO4、3.8g柠檬酸、4g(NH4)2SO4、9gMgSO4·7H2O、0.047gCaCl2、1mlFeCl2(溶液0.2M)、2ml痕量元素(痕量元素/升:0.96g柠檬酸、0.25gCoCl26H2O、1.5gMnCl2·4H2O、0.15gCuCl2·2H2O、1.5gH3BO3、0.25gNa2MoO4·2H2O、1.3gZn(CH3COO)2·2H2O)和0.01g维生素B1。在接种后以添加的指数比率给予进料6小时直至19小时。选择使用甘油作为碳源是因为所使用的大肠杆菌表达细胞产生作为不希望的副产物的乙酸(乙酸盐),其对重组蛋白的生产具有非常大的不利影响[14]。尤其是,大肠杆菌的细胞产生作为需氧发酵的细胞外副产品的乙酸,乙酸盐的形成速率与细胞生长时的速率或其消耗作为碳源的固体底物(葡萄糖)时的速率直接相关。在常用的分批给料发酵系统中,培养物的生长速率是通过进料导致细胞生长高于阈值的"葡萄糖"受限营养物的速率来确定的,其会导致随后产生乙酸盐并因此降低重组蛋白的表达。
在本发明中,已经开发了各种策略来限制乙酸盐的累积,以减小负面影响并增加重组蛋白的生产率。一种已使我们获得了优异结果的策略是使用甘油作为碳源。甘油与葡萄糖不同,其不会发酵产生乙酸。所获得的结果显示,在本发明开发的分批给料发酵过程中使用甘油而不使用葡萄糖具有2-3倍的改善可溶性重组蛋白透明质酸酶产量[15]。而且,与对于调控本发明的重组蛋白合成的启动子具有抑制作用的葡萄糖不同,甘油即使是在用IPTG诱导之后也能够进行发酵,这使得不仅减少了乙酸盐的形成而且还增加了可溶性重组透明质酸酶的形成。此外,甘油相比于葡萄糖的低成本使其在工业领域中优选作为大肠杆菌发酵的碳源。
在用异丙基β-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之,每个小时向培养物给予1mM最终溶液的进料并且同样的用量持续加入5小时。在接种后24小时开始诱导并继续进行12小时。所使用的发酵参数如下:温度37℃,搅拌600rpm,空气流5-10升空气/分钟且压头为约0.8巴。
在约12小时的诱导期之后通过7500rpm离心25分钟来收获细菌细胞。收集细胞之后,将细菌细胞在-80℃储存备用以用于重组透明质酸酶的提取和纯化。在用考马斯亮蓝G-250(BIO-RAD,161-0406)染色之后,在SDS-PAGE(12%)中通过电泳运行来分析以不同发酵参数由大肠杆菌表达的重组蛋白,而通过浊度测试来分析酶活性[16]。
用载体pHyal_sk转化的大肠杆菌BL21(DE3)的细胞在装有10L培养基的发酵罐中被诱导以在周质中表达可溶性异源蛋白。在SDS-PAGE中,该表达的重组体的分子量为约24kDa并且在细胞周质中表达的蛋白的量为约0.4g/L培养物,在用1mMIPTG于37℃诱导6小时后达到最大量(图14)。
用载体pHyal_sk_SL转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在装有10L培养基的发酵罐中被诱导以在周质中表达可溶性异源蛋白。周质可溶性部分的结果是以约1.2g/L培养物的浓度存在,其酶促活性大于48000U/ml培养物。在SDS-PAGE中,在37℃下用1mMIPTG诱导12小时后,所表达的该重组体的分子量为约24kDa,构成约16-18%的总细菌蛋白(图15)。
实施例15:在20L培养基上用载体pHyal_sk_SL转化的大肠杆菌BL21(DE3)的分批进料发酵。简言之,在装有20L培养基的发酵罐中诱导用载体pHyal_sk_SL转化的大肠杆菌BL21(DE3)的细胞以在周质中表达可溶性异源蛋白。发现该周质可溶性蛋白存在的浓度为约2g/L培养物(表2),其酶促活性大于87000U/ml培养物(7.5×107-8.7×107IU/1培养物),比在上述专利中所述的[9]在发酵罐中生产的自体同源透明质酸酶高大约670-750倍。在SDS-PAGE中,在37℃下用1mMIPTG诱导12小时后,该表达的重组体的分子量为约24kDa,构成约16-18%的总细菌蛋白。
对于用分批补料方法进行测试的所有克隆,发酵阶段中质粒的稳定性为100%(表2)。通过影印接种技术(replicaplatingtechnique)筛选来监测质粒的稳定性直至发酵结束[29],这使得能够在含有抗生素的平板上复制菌落。
最后,针对以不同方式基因工程化的克隆测试了由根据本发明分离的基因编码的重组透明质酸酶在发酵罐中的生产能力。表1中总结了结果。
实施例16:发酵肉汤中重组透明质酸酶活性在的分析
在以7500RPM离心(Eppendorfcentrifuge5402,转子F-45-18-11)10分钟后从具体诱导时间或最终产物由0.1ml培养物获得沉淀物。将细胞沉淀物重悬浮于500μ1B-PER细菌蛋白提取试剂(PIERCE)中并以最大速度通过涡旋(HeidolphReaxtop)混合约1分钟或直至完成沉淀物的重悬浮。将适合的重悬浮沉淀物以13000RPM离心10分钟以将可溶性蛋白与不溶性蛋白分离。利用DiFerrante描述的浊度测定法[16]来测试所收集的上清(可溶性蛋白)中透明质酸酶活性的存在,该方法被改进以用于在96孔板上进行分析。简言之,对于单个孔,用1xPBS(Sigma-P4417)将31μ1孵育缓冲液[17]、8μ1BSA(0.2mg/ml)、8μ1透明质酸(2mg/ml)、13μ1H2O和10μl上清(可溶性蛋白)稀释10、100和1000倍备用。将板在37℃孵育一小时。在孵育一小时后,向每个孔中加入200μ1的CTAB碱性溶液(2.5%(w/v)在0.5MNaOH中)以使未消化的透明质酸沉淀并将板在室温下孵育20分钟。在的光密度下测量沉淀的程度。
随后,利用以下计算方法来获得培养物肉汤的每ml重组蛋白的活性:活性ofml获自测试的ml的活性/2×稀释因子×10=来自发酵的产物上的活性。
透明质酸酶标准物(FIP)被用于构建标准曲线,并利用该曲线来计算周质部分中的重组透明质酸酶的活性。
实施例17:可溶流分的大规模提取
在室温下将储存在-80℃的沉淀物(来源于用pHyal_sk_SL载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)的发酵)其量等于0.6升发酵产物(大约等于80-90g范围的细胞沉淀,反映了重组透明质酸酶的产量为大约1-1.2g/L)静止直至达到平衡持续45分钟。
第一种方法:在达到平衡态之后,用210ml新鲜溶液处理沉淀物(5℃)以用于分散沉淀物(205.2g/L葡萄糖,5.6g/LEDTA)。用分散溶液重悬浮该沉淀物,利用磁力搅拌器Heidolph型MR2002以500rpm的速度在室温下磁力搅拌15分钟,之后在5℃搅拌约1小时。约1小时后,将重悬浮的沉淀物加入到冷的4.5L溶液中用于渗压震扰(1.2g/LTRIS、4ml/LHC12N、0.1g/LMgC12)以提取周质蛋白。利用磁力搅拌器Heidolph型MR2002以500rpm的速度将所获得的混合物在4℃下搅拌4小时。
在渗压震扰步骤之后,利用具有SLC-6000转子的SorvalEvolutionRc离心机以7500rpm的转速所获得的含有分散的大肠杆菌细胞的产物在5℃下离心45分钟。离心之后,收集上清同时除去沉淀物。在此时,利用"UltraTurrax"系统以2挡速度将上清均质化15秒。
在用"UltraTurrax"处理之后,将上清调至pH8并利用0.65μm过滤器通过重力进行过滤。在过滤后,用3MTris-HCl溶液将滤液中的Tris浓度从10mM调至50mM并且最后调至pH8。在SDS-PAGE中评价所提取的透明质酸酶的浓度并且发现其为约750-850mg/总(22-24%的总周质蛋白)。通过Dorfman's浊度测定法来评价所提取的重组透明质酸酶的活性。
第二种方法:平衡后,用500mlB-PER细菌蛋白提取试剂(PIERCE)溶液处理沉淀物以释放培养基中的周质蛋白。用B-PER溶液重悬浮该沉淀物,利用磁力搅拌器Heidolph型MR2002以1000rpm的速度在室温下磁力搅拌30分钟,并且随后在5℃再搅拌30分钟。在约1小时后,利用具有Sorvall转子的SorvalRc-5B以11,000rpm的速度理性该重悬浮的沉淀物。离心后,将所得上清加入到冷的5L50mMTris-HCl溶液中,pH8。用于渗压震扰(1.2g/LTRIS、4ml/LHC12N、0.1g/LMgC12)以提取周质蛋白。利用磁力搅拌器Heidolph型MR2002以200rpm的转速将所获得的溶液在4℃搅拌10分钟。搅拌后,利用利用"UltraTurrax"系统以2挡速度将上清均质化15秒。在用"UltraTurrax"处理之后,将上清调至pH8并利用0.65μm过滤器通过重力进行过滤。在SDS-PAGE中评价所提取的透明质酸酶的浓度并且发现其为约0.9-1.1g/总(16%-18%的总周质蛋白)。通过Dorfman's浊度测定法来评价所提取的重组透明质酸酶的活性。
实施例18:重组纯化
树脂和色谱柱购自GEHealthcareLifeSciences并根据制造商的说明书进行保养。对于全部三次色谱,利用快速液相色谱(FPLC;AKTAexplorer100,GEHealthcare)系统以40-50ml/min的流速进行平衡和洗脱步骤。在每一色谱步骤结束时,用[9]所述的改进的Dorfman's测定来控制透明质酸酶活性。在从周质部分提取可溶性流分之,将其上样至第一强离子交换色谱。强离子交换色谱(Q琼脂糖XL):
将过滤的提取物加入50mMTris-HCl并调至pH8,将其上样至封装在XK-50(GEHealthcare)柱中的500ml-600mlQ琼脂糖XL树脂(GEHealthcare)并用8倍床体积(BVs)的Tris-HCl缓冲液在pH8使其平衡。在上样后,洗涤该柱,首先用3BV的相同缓冲液洗涤,并且随后用具有用40mMNaCl的8BV的Tris-HCl缓冲液在pH8洗涤,然后用具有110mMNaCl的5BV的Tris-HCl缓冲溶液在pH8洗脱该结合的蛋白。在体积为约950ml的单个流分中收集该洗脱的蛋白,并使其经历透明质酸酶活性测定。
渗滤和弱离子交换色谱(CM-FastFlow):
利用截留超滤实验室规模TFF系统(Millipore)并利用具有3至8kDA之间优选5kDa截留的聚醚砜(PES)过滤器将所获得的流分浓缩至100ml。在浓缩之后,用50mM醋酸钠缓冲液在pH4将样品稀释10倍。将由此获得的流分上样至封装在XK-50(GEHealthcare)柱中的300ml-400mlCM-FastFlow树脂(GEHealthcare),并用6倍床体积(BV)的醋酸钠缓冲液在pH4.0使其平衡。在上样后(优选温度为4-5℃),用3BVs的相同缓冲液洗涤该柱,然后用8BV的50mM醋酸钠缓冲液在pH4.5洗脱该结合的蛋白。在体积为约380ml的单个流分中收集该洗脱的蛋白,并使其经历透明质酸酶活性测定。
芳香疏水相互作用色谱(苯基-琼脂糖HP)。
利用截留超滤实验室规模TFF系统(Millipore)并利用具有3至8kDA之间优选5kDa截留的聚醚砜(PES)过滤器将所获得的且对于酶促剂量呈阳性的流分浓缩至100ml。在浓缩之后,用具有1.5M硫酸铵的50mM磷酸钠缓冲液在pH7将样品稀释10倍。将由此获得的流分上样至封装在XK-50(GEHealthcare)柱中的300ml-400ml苯基-琼脂糖HP树脂(GEHealthcare),并用8倍床体积(BV)的用具有1.5M硫酸铵的50mM磷酸钠缓冲液在pH7使其平衡。在上样后,用3BVs的相同缓冲液洗涤该柱,然后用5BV的有1.5M硫酸铵的50mM磷酸钠缓冲液在pH7洗脱该结合的蛋白。在体积为约730ml的单个流分中收集该洗脱的蛋白,并使其经历透明质酸酶活性测定。在酶促活性测定后,使洗脱的流分经历超滤,并利用具有3至8kDA之间优选5kDa截留的聚醚砜(PES)过滤器用10体积1xPBS(SIGMA-P4417)渗析,使其达到约1mg/ml的浓度并用0.2μm过滤器(蛋白质浓度通过BCA蛋白AssayReagentKit,PIERCE来确定)过滤。在为了获得良好回收的纯化产物的纯化步骤中,将该重组部分上样至具有最大比率为1.5mg透明质酸酶/ml树脂的色谱柱。然后通过SDS-PAGE以12%分析所有洗脱的蛋白流分(具有酶活性的,以及安些失活的或者活性较差的),并根据制造商的说明书用银染色来进行染色;在具有透明质酸酶活性的所有流分中,存在约24kDa的标记的蛋白条带(图16)。在纯化的不同步骤中,如在之前SDS-PAGE(12%)中所述估计重组部分的蛋白质浓度,并且发现其在第一次色谱(Q琼脂糖XL)中为总0.45-0.5g/L,在第二次色谱(CM-FastFlow)为总0.45-0.50g/L,在第三次色谱(苯基-琼脂糖HP)中为总0.4-0.45g/L,并且在DIA-过滤后为总0.35-0.4g/L。在约1L发酵产物上进行的纯化过程结束时,获得了约600-650mg(酶促活性大于2.6×107U/L纯化的发酵产物)的重组透明质酸酶(表3)。
实施例19:分析和表征
透明质酸酶活性的确定
用改进的Dorfman's方法[10]来测量透明质酸酶活性。简言之,通过该方法的不同步骤获得的产物在0.03M磷酸盐缓冲液,0.82%NaCl,pH6.3中稀释,并且将1ml由此获得的溶液与1ml含有0.5mg透明质酸的底物缓冲液(0.03M磷酸盐缓冲液,NaCl10.82%,pH6.3)混合。在37℃下酶促消化30分钟,并且在孵育过程结束时,通过加入4ml马血清基酸性溶液(SIGMA)产生浊度(turbidity)。在加入马血清酸性溶液后的恰好30分钟后测量在640nm处的光密度。来自哺乳动物睾丸(EDQM、FIP透明质酸酶、H1115000)的含有328IU/mg的透明质酸酶标准物被用于构建标准曲线并且利用该曲线来计算样品的活性(以单位计)。
SDS-PAGE电泳
根据制造商的说明书利用Mini-PROTEAN3(BIO-RAD),利用Laemmli's方法[11]在12%聚丙烯酰胺凝胶上进行在十二烷基硫酸钠(SDS-PAGE)存在下在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳实验。通过与低分子量蛋白(GEHealthcare)进行比较来估计发酵产物中以及不同纯化步骤中的透明质酸酶的浓度和分子量。
通过实验室图像捕获装置ImageQuantTM300TL(GEHealthcare)来获得在电泳运行之后适合于用考马斯蓝(BIO_RAD)的聚丙烯酰胺凝胶,同时利用图像分析软件ImageQuantTL(GEHealthcare)来进行(定性和定量)测定。
N-端测序
根据Edman's降解方法利用自动蛋白质序列脉冲液相(ABI-PerkinElmerMod.477A)来进行N-端氨基酸测序。BLAST软件[18]被用于在GenBank数据库中进行同源性检索,并且其中链霉菌属的人基因组项目可从网上获得。如上文所述,使根据本发明通过用pHyal_sk载体转化大肠杆菌菌株和用pHyal_sk_SL载体转化的大肠杆菌菌株的纯化获得的流分在12%凝胶上经历SDS-PAGE电泳,然后在聚偏氟乙烯膜(BIO-RAD)上进行印迹分析并根据制造商的说明书进行染色。用解剖刀分离与两种生产相关的透明质酸酶的条带,试图获得一片尽可能小的(3mmx10mm)凝胶并将其装载至测序仪的反应室中。
如上文所述进行的N-端的测序使得能够确定所制造的和来自于所使用的两种基因工程化和表达系统两种重组透明质酸酶在N-端氨基酸序列中有所不同。在根据本发明用pHyal_sk_SL载体转化的大肠杆菌样品的情形下,该测定提供了这样的色谱图,其中明显存在单个N-端氨基酸序列,这使得能够如下重新构造所报告的测试序列:AGENGA(SEQIDNO:42)。上文提到的实验确定的序列对应于[9]所述的自体同源形式的分离的蛋白的N-端,其在位置1处不含有甲硫氨酸。
在根据本发明用pHyal_sk载体转化的大肠杆菌样品的情形下,该测定反而检测出存在至少两个N-端氨基酸序列,下文中所报告的是通过测序检测到的N-端氨基酸的列表:最具代表性的序列MAGENGA(SEQIDNO:43),其对应于在位置1处具有甲硫氨酸的成熟蛋白的N-端,以及较小代表性的序列AQPAMAMAGENGA(SEQIDNO:44),其对应于部分成熟蛋白(含有序列AQPAMAM(SEQIDNO:45),其属于似乎并不由于该细胞系统而完全丧失该蛋白的信号肽)。
异源和自体同源形式之间透明质酸酶活性的比较。
利用[9]所述的酶促测定通过与自体同源透明质酸酶的酶促活性[9]进行比较来评价根据本发明的透明质酸酶的酶促潜力(用pHyal_sk_SL载体转化的大肠杆菌),并且在两种情况下均报告该活性值大于4×104IU/mg(蛋白浓度通过BCA蛋白AssayReagentKit,PIERCE来确定)。
该测定的结果示出了根据本发明的透明质酸酶,尤其是来自用pHyal_sk_SL质粒工程化改造的大肠杆菌菌株的形式,与自体同源形式具有相同的活性。然而,通过本发明中所述的制造和纯化方法能够准确评价根据本发明的重组透明质酸酶翻的酶促活性的值,并且发现其大于40,000U/mg蛋白。
异源和自体同源形式的UV光谱分析和圆二色谱的谱图。
圆二色谱(CD)实验:在室温下在Jasco分光偏振计J-715上收集Far-UV圆二色谱处的谱图,石英比色池的光程长度为1毫米。其他测试设定值为:扫描速度为10nm/min,敏感度为MDEG,时间常数为16s,带宽为3nm。该圆二色谱测量是在蛋白质溶液(自体同源透明质酸酶,根据本发明的重组透明质酸酶)上以2.10-6M的浓度进行的。利用超纯水将所有样品以2.10-6M的最终浓度稀释。在260-195nm处收集CD谱图,对其进行空白校正和调节以用于稀释。
图17中报告了圆二色谱谱图。重叠文件匹配:较下方的线对应于自体同源透明质酸酶[9]而较上方的线对应于根据本发明的异源透明质酸酶。两个谱图具有可重叠的图形,证明两个样品具有相同的结构(图17-a)。注意到的较小差异可能归因于两种溶液的浓度并非完美重合。
根据UV涂片,该重组透明质酸酶样品并未显示出聚集。根据本研究,能够推断出根据本发明的制剂具有非常类似于自体同源透明质酸酶[9]的二级结构,并且根据本发明生产的蛋白并不显示出聚集(图17-b)。
质谱
在RP-HPLC分离轴,利用Quattro微型质谱仪(Waters)来进行用于确定分子量的质谱测定,而利用该的精确质量值来进行肽图谱的测定以确认重组蛋白一级结构的同一性,该精确质量值是在通过MALDI-MSVoyagerDE-PRO系统(AppliedBioSystems,FirminghamMA,USA)的方式确定的。
在RP-HPLC中分离之后,使根据本发明的重组透明质酸酶的纯化后获得的流分经历胰蛋白酶的消化,通过MALDI-MS以反射器模式分析针对每个样品制造的肽混合物。因此,所获得的MALDI图谱的研究和解读分别能够证实参比氨基酸序列[9]的一级结构具有97%同一性以及具有根据本发明产生的样品的氨基酸序列(SEQIDNO:21)的理论氨基酸序列根据本发明的理论氨基酸序列的一级结构具有超过94%同一性(肽序列,通过http://web.expasy.org/translate/预测的)。
此外,通过质谱的方式也图18中所报告的测定结果使根据本发明的重组透明质酸酶的纯化后获得的流分经历蛋白质的分子量确定。
等电子聚焦
将待分析的蛋白流分(根据本发明获得的重组透明质酸酶)与适合的上样缓冲液混合并在pH3-10装载于IPG胶条上(ReadyStrips7cm,BIO-RAD);在25℃孵育直至样品吸收并将胶条装载于PROTEANIEFCell(BIO-RAD)用于等电点聚焦(IEF)。在等电子聚焦运行结束时,用IEF凝胶染色溶液(BIO-RAD)将胶条染色45分钟并且之后用脱色溶液(BIO-RAD)进行脱色。通过实验室图像捕获装置ImageQuant300TL(GEHealthcare)获得脱色的IPG胶条,而利用图像分析软件ImageQuantTL(GEHealthcare)实施(定性和定量)测定。
通过与参比标准物(IEFMarkerpH3-10,SERVA)的等电点进行比较来确定样品的等电点。图19中报告了测定的结果。
通过重组透明质酸酶来表征的毛细管电泳以及摩尔消光系数的确定。
通过BIOTEKNET(Napoli,Italy)以毛细管电泳的方式来进行待分析的蛋白质流分(根据本发明获得的重组透明质酸酶)的定性-定量测定,该毛细管电泳使用装配有二极管阵列检测器和UV灯的P/ACEMDQBeckman-Coulter仪进行,利用熔融石英的毛细管(50cmactuallength,60.2cmtotallength,50μminner直径)和20mM柠檬酸钠缓冲液在pH2.5进行,施加25kV的e.p.d.(确保在电泳分离过程和当前所使用的中的更高稳定性和)持续15分钟并在200nm处进行检测。在进行样品测定之前,利用上述方法以三个不同的浓度(1mg/mL;0.8mg/mL;0.4mg/mL)对BSA(牛血清白蛋白)进行适当分析,并且由此获得校准直线。该测定在同一样品上稀释两次(图20)。在两个电泳图谱中,尽管受到用外标物的校准的影响(BSA),仍可以确定存在单个峰(纯度100%),迁移时间为7.7±0.9分钟并进行蛋白质定量分析,因此不适用相同蛋白质,回到高纯度,并且定量分析可叠加值预期的值(~1mg/ml)。该研究在重组透明质酸酶的摩尔吸光系数的确定的基础上进行,其可分为四个实验部分:1.本发明透明质酸酶样品的密度测量实验,2.本发明透明质酸酶样品的分光光度实验,3.理论吸光度的确定,4.摩尔吸光系数的确定。
此时,在收集了前述步骤中的信息之后,利用Beer-Lambert法则:A=el*1*C,其中el是指摩尔吸光系数,C为溶液的摩尔浓度且1为光程。基于该公式以及我们所获得的信息,在波长280nm处理的摩尔吸光系数如下:12383L*mol-1*cm-1Abs0.1%(=1g/L)0.570(根据本发明生产的透明质酸酶的摩尔吸光系数)。
通过凝胶过滤的方式进行HPLC测定
为了通过凝胶过滤的方式进行该测定,使用装有Bio-SilSEC柱(BIO-RAD)的LC-10ADHPLC仪(SHIMADZU),用0.05MNaH2PO4,0.05MNa2HPO4,0.15MNaCl,pH6.6以1ml/min洗脱。所使用的吸收波长为214nm(SPD-10A,SHIMADZU)。利用软件LCsolution1:21SP1来确定蛋白质的纯度。使如本发明所述的重组透明质酸酶的纯化之后获得的流分经历如上文所述的凝胶过滤柱HPLC。在图21-a中通过色谱图报告了对于重组部分纯度的测定结果,结果为100%。
通过RP-HPLC的方式来确定纯度水平。
Forthepurityassaysbymeansof为了通过反相HPLC的方式进行纯度测定,使用装有Vydac214ATP54C4(GraceDavisonDiscoverySciences)柱的LC-10ADHPLC仪(SHIMADZU),用具有1-丙醇的50mMTris,pH7.5,以0.5ml/min洗脱。所使用的吸收波长为220nm(SPD-10A,SHIMADZU)。利用软件LCsolution1:21SP1来确定蛋白质的纯度。使如本发明所述的重组透明质酸酶的纯化之后获得的流分在输水相柱上经历如上文所述的HPLC(反相)。在图21-b中通过色谱图报告了对于重组部分纯度的测定结果,结果非常接近100%。
在聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳来表征细菌重组透明质酸酶
根据制造商的说明书,利用Mini-PROTEAN3(BIO-RAD),在十二烷基硫酸钠(SDS-PAGE)存在下,在十二烷基硫酸钠(SDS-PAGE)存在下在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳实验利用Laemmli's方法[11]在12%聚丙烯酰胺凝胶上进行。通过与标准分子量蛋白质(GEHealthcare)进行比较来估计发酵产物中和不同纯化步骤中的透明质酸酶的分子量。
用实验室图像捕获装置ImageQuant300TL(GEHealthcare)获得在电泳运行之后适合于用考马斯蓝(BIO_RAD)染色的聚丙烯酰胺凝胶,而利用图像分析软件ImageQuantTL(GEHealthcare)进行(定性和定量)测定。
另一方面,对于蛋白质印迹,蛋白质在SDS-PAGE中以12%被分馏并转移至硝酸纤维素膜。然后通过与1:2000倍稀释的抗-透明质酸酶抗体(Abnova)在10%奶粉/PBS中一起孵育12小时来鉴定感兴趣的蛋白,并且通过在1小时内持续加入与碱性磷酸酶缀合的小鼠抗-IgGs二抗,之后用BCIP/NBT底物(BUF045A,SEROTEC)进行检测的方式来突出显示具体的反应。
由大肠杆菌BL21(DE3)工程化细胞制造根据本发明的重组透明质酸酶并且因此不存在动物衍生物使得能够生产具有高特异性酶促活性(>40000单位/mgof蛋白)的蛋白质。如图图22中所示,该根据本发明产生的重组蛋白具有的纯度水平比来自哺乳动物睾丸(EDQM,FIP透明质酸酶,H1115000)的透明质酸酶标准物高100倍。而根据本发明纯化的重组透明质酸酶在12%SDS-PAGE凝胶上迁移并用GelMateBlue(EuroClone)考马斯亮蓝染色之后具有单一条带,可从市场上获得牛透明质酸酶显示出若干杂质。通过蛋白质印迹法与抗-透明质酸酶多克隆抗体(Abnova)反应的蛋白质涂片中的较小条带(约75-80kDa)证明了该酶透明质酸酶是来源于动物的透明质酸酶的较小组分(图22)。
内毒素检测
鲎阿米巴样细胞溶解物测试(LAL),其使用由美洲鲎(limulusPoliphemus)的血液制备的试剂,显示出其为对于检测和测量制造中使用的原料中细菌内毒素水平以及用于“过程中(in-process)”监测内毒素水平的最大敏感性和特异性测试。内毒素更常被称作热原,其起因于发热至不可逆的休克,在血压和组织交换中的困难会导致致命的后果。
利用在大肠杆菌中产生的根据本发明的重组透明质酸酶,其对于评价最终产品中的内毒素水平是必需的。为此目的,我们使用了"Chromo-LAL"的方法,其是用于定量检测革兰氏阴性细菌产生的内毒素的动态显色测试。
简言之,在"ChromoLAL(art32427,PBIS.p.A–Italy)"测试中,将共同冻干的裂解液和显色试剂底物与透明质酸酶样品(根据本发明产生的)在多孔微量培养板(96孔)中混合并在适合的读板器ELX808IU,BioTek)中在37±1℃孵育。收集吸光度值并通过专用软件进行分析。计算透明质酸酶样品达到特定吸光度值(光密度)所需的时间。此外,构建标准校准曲线(CSE,lot.104,art.17078,PBIS.p.A-Italy),其示出了"开始时间"log和标准内毒素浓度的log之间的线性相关。标准曲线的内毒素浓度之间的最大范围为0.005EU/ml-50EU/ml。根据用于构建该标准曲线的内毒素的最低浓度来确定该测试的敏感度[19]。该测试的最大敏感度为0.005EU/ml。
从标准曲线读出对应于透明质酸酶样品的"开始时间"的内毒素浓度,该标准曲线为从通过计算"开始时间"比标准浓度获得的评分得到的log-log图。
最后,通过Gen5软件(BioTek)来计算根据本发明产生的透明质酸酶样品中的内毒素的估计值,得到低于0.5内毒素单位/mg的重组透明质酸酶(表4)。
来源于宿主细胞的蛋白质和DNA的确定
对于来源于用于重组透明质酸酶异源表达的大肠杆菌宿主细胞的蛋白(如本发明所述的)的确定,使用ELISA方法,尤其是来自Cygnustechnologies(F010)的EnzymeImmunoAssaykit"大肠杆菌HCP"。该测定是基于亲和-纯化的抗体的混合应用(sandwicheduse),其涉及常用于克隆和表达重组蛋白的6个大肠杆菌菌株的混合物。
该测试根据制造商的说明书在重组透明质酸酶的纯化样品上进行,来源于大肠杆菌(宿主菌株)的蛋白的浓度与由缀合于该抗体的碱性磷酸酶的酶促反应造成的颜色出现成正比。
在根据本发明产生的透明质酸酶的样品中估计接近标准物浓度的来源于宿主细菌的蛋白的浓度(通过GEN5软件,BioTek来计算和校准该曲线),其低于10ppm,如表4中所示(主管机关批准的限值为低于100ppm)。
另一方面,利用DNAThreshold方法在重组透明质酸酶(根据本发明产生的)中确定来自大肠杆菌的宿主菌株的DNA的量。
该测定在CharlesRiverBiopharmaceuticalservicesGmbH实验室(德国)进行。该研究由编码M1/F07/12和M2/F07/12表示,得出了来源于细胞宿主的非常低水平DNA的最终结果,计算值低于20pg(主管机关批准的限值为低于或等于300pg/mg蛋白)/毫克重组透明质酸酶(表4)。
实施例20:在琼脂糖凝胶上透明质酸解聚作用的测定
对于在其主要成分N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸中的解聚透明质酸(FidiaS.p.A.,Italy)根据本发明产生的重组透明质酸酶的性能的离体评价,在指定时间内(5分钟至24小时)用1单位重组透明质酸酶消化透明质酸之后,使用在琼脂糖凝胶中的电泳测定方法[20]。
简言之,该透明质酸样品(500kD-730kD)在指定时间内(5分钟至24小时)与重组透明质酸酶反应,利用Sub-CellGT电泳系统(BIO-RAD)以及具有1%琼脂糖的凝胶(长度为25cm)进行分离。在约16℃的温度下以50伏特的恒定电压,样品在电泳中迁移约12小时。如之前的研究中所述进行染色[20]。
图23中示出的结果表明,在前24小时,根据本发明产生的重组透明质酸酶能够完全消化底物直至达到不可检测的透明质酸水平。
实施例21:针对蛋白水解酶的稳定性
透明质酸酶是一种水解透明质酸的酶,因此其使结缔组织的可渗透性增加,增强局部皮下给药的药物在在周围组织中的扩散和分布。
在一些处理中,以低剂量给予透明质酸酶(使用的局部剂量为15单位),以减小由于减少由于抗生素泄漏、高渗溶液、酸性或碱性溶液造成的损伤,或更正透明质酸-系填料以避免过敏和过敏性反应。因此,透明质酸酶在这些剂量中针对结缔组织中存在的蛋白水解酶稳定是重要的,蛋白水解酶一旦注射透明质酸酶就会容易地被消化,并抑制透明质酸酶的作用。为了测试和比较重组透明质酸酶相对于市场上目前使用的牛透明质酸酶对于蛋白水解酶的抗性,提供了用于离体测定的比浊法模型。简言之,在磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中在37℃,分别用两种不同剂量的链霉蛋白酶E(200gand500g)处理浓度为10U(<250ng)的重组透明质酸酶(根据本发明制备的)和100U(300g)牛透明质酸酶1小时、24小时和48小时。根据如专利中所描述的Dorfman's方法来测量用链霉蛋白酶E处理或者不用链霉蛋白酶E处理的两种浓度的酶的残留酶活性(表示为百分比)。所获得的结果位于图表中并在图24中示出。
实施例22:人和动物血清对透明质酸酶活性的影响
在本发明中,由于利用浊度模型的离体测试模型的规定,已经与之前的临床研究合并的模型被证实,即,牛透明质酸酶(牛PH20)的酶促活性受到人和/或动物血液的抑制,但又发现人和/或动物血液并不抑制来自重组S.koganeiensis的透明质酸酶(图25)。在本发明中,所使用的方法评价了AlbertDORFMAN等人[21]之前描述的(动物/人)血液对透明质酸酶活性的抑制。简言之,两种浓度的根据本发明产生的重组透明质酸酶(40单位,400单位)和牛透明质酸酶(40单位,400单位)分别且各自用与含有0.5mg透明质酸的底物缓冲液混合的硫酸盐缓冲溶液(pH7.0)中的来自于动物血液的血清和来自于人血液的血清处理。将由此获得的混合物置于37℃持续30分钟、1小时和6小时。在加入4ml马血清基酸性溶液获得浊度并继续根据之前所述的Dorfman's方法之后,在每一既定时间间隔时测量用血清处理的酶的相对酶促活性。通过除透明质酸酶之外含有所有试剂的空白来校正由于加入血清而出现的浊度。
因此,这些后续研究示出了,根据本发明产生的重组透明质酸酶对于蛋白水解酶具有高透明质酸酶活性和高稳定性,其能够以其最大生物利用度和在血流中的总活性实施,而未发现细菌或病毒感染的可能性,这证明了其对于心脑血管治疗也是有效的。
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Claims (13)
1.制备源自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的包含SEQ.ID.No.21所示的氨基酸序列的透明质酸酶的方法,包括以下步骤:
a)将细菌培养基与含有包含SEQIDNo.41所示的序列的至少一种载体的重组细胞的接种物一起接种到生物反应器中;
b)在存在营养液的条件下,使步骤a)的所述生物反应器的内容物在pH为6.7至7.1之间经历发酵;
c)向步骤b)的混合物中加入lac基因的诱导物;
d)使步骤c)的混合物经历8至24小时的诱导期;
e)将在步骤d)中获得的细菌细胞离心;
f)重悬浮在步骤e)中获得的沉淀物并使所得的悬液经历渗压震扰;
g)通过离心步骤f)的悬液来提取周质蛋白;
h)通过如下顺序来纯化在步骤g)中获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分:
i.强离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分;
ii.弱阳离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分;以及
iii.芳香疏水相互作用色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤a)的重组细胞选自大肠杆菌的细胞和枯草芽胞杆菌的细胞。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在步骤b)中,使用甘油溶液作为营养液。
4.源自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的透明质酸酶,其具有纯化形式且包含SEQ.ID.No.21的氨基酸序列。
5.多核苷酸,包含SEQ.ID.No.17中所述的核苷酸序列,所述多核苷酸编码包含SEQ.ID.No.21的氨基酸序列的细菌透明质酸酶。
6.基因工程化重组载体,包含根据权利要求5所述的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的载体,其中,所述载体为质粒。
8.宿主细胞,包含根据权利要求6或7之一所述的载体。
9.适合用于制药或化妆品应用的组合物,其包含根据权利要求4所述的透明质酸酶。
10.根据权利要求4所述的透明质酸酶或可通过权利要求1所述的方法获得的透明质酸酶,用于治疗和/或预防疾病或病症,可选地与至少一种另外的有效成分联用。
11.用于根据权利要求10所述用途的透明质酸酶,其中,所述病症或疾病为选自水肿、炎性病症、冻疮、实体肿瘤、IgE-介导的过敏、口腔的疾病、自发性玻璃体出血、动脉硬化、血压病症、心脑血管病症例如脑动脉狭窄或中风或牛乳腺炎的至少一种。
12.根据权利要求4所述的透明质酸酶或可通过权利要求1所述的方法获得的透明质酸酶的非治疗用途,其用于化妆品应用和/或用于改善外形美观。
13.包含SEQ.ID.No.21的氨基酸序列的源自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的透明质酸酶,其能够通过权利要求1-3所述的方法获得。
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