EA022220B1

EA022220B1 - Способ получения и очистки рекомбинантной лизосомальной альфа-маннозидазы

Info

Publication number: EA022220B1
Application number: EA201270715A
Authority: EA
Inventors: Йенс Фогх; Клаэс Андерссон; Сесилиа Веигельт; Пиа Хюден; Хелена Реутервалль; Стефан Нильссон
Original assignee: Сюменекс А/С
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2015-11-30
Also published as: CN102834111B; CA2790786A1; NO2018032I1; NL300948I2; NZ601790A; FR18C1038I2; CY1123438T1; PL3281636T3; JP2013520184A; PT2538968T; LT2538968T; WO2011103877A1; DK2538968T3; KR20120128647A; EP2538968B1; US20180036387A1; EP3281636B1; SI3281636T1; LTC2538968I2; LTPA2018512I1

Abstract

Изобретение относится к способу очистки рекомбинантной альфа-маннозидазы, способу получения альфа-маннозидазы, композиции, включающей альфа-маннозидазу, применению композиции в качестве лекарственного препарата, применению в качестве лекарственного препарата для лечения альфа-маннозидоза и способу лечения альфа-маннозидоза и/или облегчения симптомов альфа-маннозидоза.

Description

(57) Изобретение относится к способу очистки рекомбинантной альфа-маннозидазы, способу получения альфа-маннозидазы, композиции, включающей альфа-маннозидазу, применению композиции в качестве лекарственного препарата, применению в качестве лекарственного препарата для лечения альфа-маннозидоза и способу лечения альфа-маннозидоза и/или облегчения симптомов альфа-маннозидоза.

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантной альфа-маннозидазы, способу получения альфа-маннозидазы, композиции, включающей альфа-маннозидазу, применению композиции в качестве лекарственного препарата, применению в качестве лекарственного препарата для лечения альфа-маннозидоза и способу лечения альфа-маннозидоза и/или облегчения симптомов альфаманнозидоза.

Уровень техники настоящего изобретения

Альфа-маннозидоз.

Альфа-маннозидоз является рецессивным, аутосомным заболеванием, которое встречается по всему миру с частотой от 1/1000000 и до 1/500000. Маннозидоз обнаруживают во всех этнических группах в Европе, Америке, Африке и также Азии. Его выявляют во всех странах с хорошей диагностической сферой для лизосомальных болезней накопления с аналогичной частотой. Они рождаются практически здоровыми, однако симптомы заболевания являются прогрессирующими. Альфа-маннозидоз проявляет клиническую разнородность, изменяющуюся в диапазоне от очень тяжелых до очень легких форм. Типичными клиническими симптомами являются умственная отсталость, изменения скелета, ослабленная иммунная система, что приводит к рецидивирующим инфекциям, нарушению слуха, и часто заболевание связано с типичными характерными чертами лица, такими как грубое лицо, выступающий лоб, уплощенная переносица, маленький нос и широкий рот. В наиболее тяжелых случаях (маннозидоз типа I) дети страдают от гепатоспленомегалии, и они умирают в первые годы жизни. Возможно, эту раннюю смерть вызывают тяжелые инфекции из-за иммунодефицита, вызванного заболеванием. В более легких случаях (маннозидоз типа 2) пациенты обычно достигают совершеннолетия. Слабость скелета пациентов приводит к потребностям в креслах на колесах в возрасте от 20 до 40. Заболевание вызывает диффузную дисфункцию мозга, часто приводящую к слабой умственной деятельности, что исключает все, кроме самых базовых навыков простого чтения и письма. Эти проблемы, связанные с неспособностью слышать и другими клиническими проявлениями заболевания, препятствуют независимой жизни пациента, при этом последствием является то, что необходим пожизненный уход.

Лизосомальная альфа-маннозидаза.

Альфа-маннозидоз возникает в результате недостаточной активности лизосомальной альфаманнозидазы (ΕΑΜΑΝ, КФ 3.2.1.24). Заболевание характеризуется массивным внутриклеточным аккумулированием богатых маннозой олигосахаридов, а именно олигосахаридов, несущих α1,2-, α1,3- и а1,6-маннозильные остатки на их нередуцирующем конце. Эти олигосахариды в основном образованы в результате внутрилизосомального разрушения гликопротеинов с Ν-связанными олигосахаридами. Однако некоторые образованы в результате катаболизма связанных с долихолом олигосахаридов и из неправильно свернутых гликопротеинов, перенаправляемых в цитозоль для разрушения с помощью протеасомы (Н1гксЬ е! а1. ΕΜΒΟ 1., 22, 1036-1046, 2003 и 8аш!-Ро1 е! а1. 1. Βΐοΐ. СЬет., 274, 13547-13555, 1999). Лизосомальное накопление наблюдают в широком диапазоне типов клеток и тканей, включая нейроны во всех областях мозга. ΕΑΜΑΝ представляет собой экзогликозидазу, которая гидролизует эти концевые нередуцирующие альфа-Э-маннозные остатки в альфа-Э-маннозидах от нередуцирующего конца во время упорядоченного разрушения Ν-связанных гликопротеинов (Агоикои апб Кигапба, ΡΑ8ΕΒ 1., 3:26152622, 1989). Предшественник фермента человека синтезируется в виде одного полипептида из 1011 аминокислот, включая сигнальный пептид из 49 остатков. Предшественник подвергается протеолитическому процессингу в три гликопептида из 15, 42 и 70 кДа до зрелого фермента в лизосоме. 70 кДа гликопептид в дальнейшем расщепляется на субъединицы, связанные дисульфидными мостиками (Вегд е! а1. Μο1. Оеп. апб Ме1аЬоЙ8т, 73, 18-29, 2001, №1ккеп е! а1. Нит. Μο1. Оепе!., 6, 717-726, 1997).

Ген лизосомальной альфа-маннозидазы.

Ген, кодирующий ΕΑΜΑΝ (ΜΑΝΒ), расположен в 19 хромосоме (19сеп-д12), (Капеба е! а1. СЬготокота, 95:8-12, 1987). ΜΑΝΒ состоит из 24 экзонов, охватывающих 21,5 т.п.о. (номера доступа ОепЕапк и60885-И60899; Кике е! а1. Оепотюк, 42:200-207, 1997). Транскрипт ΕΑΜΑΝ представляет собой 3500 нуклеотидов (п!к) и содержит открытую рамку считывания, кодирующую 1011 аминокислот (ОепΒапк И60266.1).

Клонирование и секвенирование человеческой кДНК, кодирующей ΕΑΜΑΝ, было опубликовано в трех статьях (№1ккеп е! а1. Нит. Μο1. Оепе!., 6, 717-726, 1997; Мао е! а1. 1. Β^ο1. СЬет., 271, 28348-28358, 1996; №Ьек е! а1. ΒΟΗ^ιη. ΒΟρΙη^. Кек. Соттип., 200, 239-245, 1994). Любопытно, что три последовательности не являются идентичными. При сравнении с последовательностью из №1ккеп и соавт. (номер доступа И60266.1) Мао и соавт. и №Ьек и соавт. была обнаружена замена ТА на ΑΤ в положениях 1670 и 1671, приводящая к замене валина на аспарагиновую кислоту. Также была обнаружена замена С на А в положении 1152, которая не приводит к каким-либо изменениям в аминокислотной последовательности.

Диагностика.

Диагностика альфа-маннозидоза в настоящее время основывается на клинической оценке, обнаружении богатых маннозой олигосахаридов в моче и прямых измерениях активности альфа-маннозидазы в различных типах клеток, таких как лейкоциты, фибробласты и амниоциты (СЬек!ег е! а1., в Эигапб Р.,

- 1 022220

О'Впап ί. (ейк) Оепейс еггогк оТ §1усорго1с1п те1аЬоНкт, ЕйКЕттек, МПап. р. 89-120, 1982; ТНотак апй Веаийе!. 1п: 8спуег С.К., Веаийе! Л.Ь., 81у \У.А., Уа11е Ό. (ейк) ТНе те1аЬо11с апй то1еси1аг Ьакек оТ 1пНегйей Фкеаке, Уо1. 5, МсОга^-НШ, Ые\у Уогк, р. 2529-2562, 1995).

Поскольку симптомы первоначально часто являются легкими, и биохимическая диагностика затруднительна, то диагностику часто проводят на поздних стадиях заболевания. Очевидно, что пациенты и их семьи получили бы значительную пользу от ранней диагностики.

Экспериментальные модели на животных.

Альфа-маннозидоз был описан у крупного рогатого скота (Носкшд е! а1. ВюсНет 1., 128:69-78, 1972), кошек (^а1к1еу е! а1. Ргос. Ыа!. Асай. δοΐ., 91:2970-2974, 1994) и морских свинок (СтаМеу е! а1. Рей1а1т Кек, 46:501-509, 1999). Недавно была создана мышиная модель путем целенаправленного разрушения гена альфа-маннозидазы (§!шсЫ е! а1. Нит Мо1 Оепе!, 8:1366-72, 1999).

Как и у людей, альфа-маннозидоз, по-видимому, вызван специфическими мутациями в гене, кодирующем лизосомальную альфа-маннозидазу. Вегд и соавт. (ВюсНет 1., 328:863-870, 1997) описали очистку лизосомальной альфа-маннозидазы кошачьей печени и определение последовательности ее кДНК. Активный фермент состоит из 3 полипептидов с молекулярными массами, как было сообщено, 72, 41 и 12 кДа. По аналогии с человеческим ферментом было показано, что кошачий фермент синтезируется в виде одноцепочечного предшественника с предполагаемым сигнальным пептидом из 50 аминокислот, за которым следует полипептидная цепь из 957 аминокислот, которая расщепляется на 3 полипептида зрелого фермента. Выведенная аминокислотная последовательность была на 81,1 и 83,2% идентичной последовательностям человека и быка соответственно. Была идентифицирована делеция 4 п.о. у пораженной персидской кошки; делеция приводила к сдвигу рамки считывания с кодона 583 и преждевременной терминации на кодоне 645. Выявить активность фермента в печени кошки было невозможно. Домашняя длинношерстная кошка, экспрессирующая фенотип с более легкой формой заболевания, имела активность фермента 2% от нормальной; эта кошка не имела делеции 4 п.о. ТоНегкгий и соавт. (Еиг. 1. ВюсНет., 246:410-19, 1997) очистили фермент из почки быка до гомогенности и клонировали этот ген. Ген был организован в 24 экзона, которые охватывали 16 т.п.о. На основе последовательности гена они идентифицировали две мутации у крупного рогатого скота.

Медицинская необходимость терапии альфа-маннозидоза.

Ввиду тяжелых клинических проявлений заболевания, возникающих в результате аккумуляции богатых маннозой олигосахаридов, хорошо известно отсутствие эффективного лечения альфа-маннозидоза. На сегодняшний день основным возможным методом лечения данного заболевания является трансплантация костного мозга, однако целью настоящего изобретения является добиться дальнейшего развития ферментозаместительной терапии как потенциальной будущей альтернативы.

Трансплантация костного мозга.

В 1996 \Уа1к1еу и соавт. (Ргос. Ыа!. Асай. δοΐ., 91:2970-2974, 1994) опубликовали статью о 3 котятах с маннозидозом, которых лечили трансплантацией костного мозга (ВМТ) в 1991. У 2 животных, которых умертвили, была видна нормализация не только в отношении тела, но, что более важно, также в мозге. Третья кошка чувствовала себя хорошо после 6 лет. В норме, кошка без лечения умирает за 3-6 месяцев. В 1987 ребенка с маннозидозом лечили с применением ВМТ (\УП1 е! а1. АгсН Όίκ СНйй, 1987 Ос!; 62(10):1044-9). Он умер спустя 18 недель из-за осложнений, связанных с процедурой. Была обнаружена очень малая активность фермента в мозге. Этот разочаровывающий результат можно объяснить тяжелой иммуносупрессивной терапией перед смертью или тем, что требуется время для повышения активности фермента в мозге после ВМТ. Донором была мать (которая, как следовало ожидать, как носитель имела активность фермента менее 50%), или, возможно, ВМТ у человека не влияет на функционирование фермента в мозге. Несмотря на наличие переменных результатов, несколько попыток трансплантации костного мозга, таким образом, показали, что успешное приживление трансплантата может корректировать клинические проявления альфа-маннозидоза, по меньшей мере, частично. Однако проблему сокращения серьезных связанных с процедурой осложнений при применении трансплантации костного мозга в терапии у человека еще предстоит преодолеть.

Ферментозаместительная терапия.

Когда были открыты заболевания лизосомального накопления, появились надежды, что их можно лечить с помощью замещения фермента. Ферментозаместительная терапия оказалась эффективной при болезни Гоше. Если пациенту вводят инъекцией экзогенную лизосомальную глюкоцереброзидазу, этот фермент поглощается клетками с недостаточностью фермента (Вайоп е! а1. N. Епд1. 1. Мей., 324:14641470). Такое поглощение регулируется определенными рецепторами на поверхности клетки, таким рецептором маннозо-6-фосфата, который практически повсеместно встречается на поверхности клеток, и другими рецепторами, такими как асиалогликопротеиновый рецептор и маннозный рецептор, которые ограничены определенными типами клеток, такими как клетки моноцитарно-макрофагальной клеточной линии и гепатоциты. Поглощение фермента клеткой, таким образом, сильно зависит от его профиля гликозилирования. При надлежащем планировании дефектный фермент можно было бы заменить с помощью регулярных инъекций экзогенного фермента тем же образом, как пациенты с сахарным диабетом получают инсулин. Исследования ш уйто с очищенной активной лизосомальной альфа-маннозидазой,

- 2 022220 добавленной в питательные среды фибробластов с недостаточностью фермента, выявили коррекцию аккумуляции лизосомального субстрата. Лечение ίη νίνο, с другой стороны, было затруднено частично проблемами получения достаточного количества ферментов, вследствие сложных процедур крупномасштабного получения и очистки и осложнениями, возникающими в результате иммунных реакций на экзогенный фермент.

Наиболее важно, однако, особые соображения применяют в отношении болезней лизосомального накопления с главным неврологическим компонентом, таких как альфа-маннозидоз, где клинические проявления связаны с повышенным лизосомальным отложением в пределах центральной нервной системы. Таким образом, ферментозаместительная терапия не доказала свою эффективность против острого нейропатического варианта болезни Гоше (Рго^8 е( а1. Ат ί. Мей. ОепеЕ, 71:16-21).

Доставке терапевтических ферментов в мозг препятствует отсутствие транспорта этих больших молекул через гематоэнцефалический барьер. Исходя из общепринятых представлений, что гематоэнцефалический барьер необходимо обойти для того, чтобы увидеть эффект терапевтических средств в мозге, было рассмотрено применение ряда разнообразных систем доставки. Они включают инвазивные методики, такие как осмотическое открытие гематоэнцефалического барьера с помощью, например, маннита, и неинвазивные методики, такие как рецептор-опосредованный эндоцитоз химерных ферментов. Поскольку, как ожидается, для замещения фермента необходимо регулярное введение фермента, применения инвазивных методик следует избегать. Применение неинвазивных методик только недавно обеспечило многообещающие результаты в экспериментальных моделях на животных (для альфа-маннозидоза смотри ниже, для других лизосомальных болезней смотри, например, ОгиЬЬ е( а1. ΡΝΑ8, 2008, 105(7) р. 26162621). Предполагалось, что уменьшенное накопление во внутренних органах и в оболочках головного мозга может уменьшить количество олигосахаридов, которые переносятся в мозг. Такие соображения, однако, не считаются применимыми в отношении лизосомальных болезней, при которых неврологическое повреждение является первичным и тяжелым (№иГе1й, Е.Р. Εη/уте гер1асетеп( (Иегару, в Ьу8О8ота1 Й18огйег8 οί (Не Ьгат (Р1а((, Р.М. ХУаП^еу, 8.У: ейк ОхГогй ишуегЩу Ргекк).

Однако, как описано в Косек е( а1. Нитап Мо1еси1аг Оепейск, 2004, 13(18), р. 1979-1988, ΒΕιπζ е( а1. Нитап Мо1еси1аг ОепеИск, 2008, 17(22), р. 3437-3445 и документе \УО 05/094874, была доказана возможность увеличения уровней ^ΑМΑN в центральной нервной системе животных с применением, например, внутривенной инъекции состава, включающего альфа-маннозидазу, тем самым снижая внутриклеточные уровни нейтральных богатых маннозой олигосахаридов в пределах одной или нескольких областей центральной нервной системы. Это показывает, что рекомбинантная альфа-маннозидаза является пригодной при ферментозаместительной терапии пациентов, страдающих от альфа-маннозидоза. Таким образом, одним главным оставшимся препятствием на пути обеспечения эффективного лечения альфаманнозидоза с применением замещения фермента является обеспечение достаточных количеств чистой рекомбинантной альфа-маннозидазы экономически эффективным способом.

Получение и очистка альфа-маннозидазы.

Документ \7О 02/099092 раскрывает способ мелкомасштабного получения ^И^ΑМΑN в СНО клетках с применением бессывороточной питательной среды при 37°С. Также описан способ мелкомасштабной очистки, включающий диафильтрацию неочищенного фермента и слабую ионообменную хроматографию со слабыми анионообменниками с применением ΌΕΑΕ-сефарозных РР колонок на этапе захвата с последующим рядом этапов хроматографической очистки, включая хроматографию гидрофобных взаимодействий и хроматографию на наполнителях смешанного типа. Документ \УО 05/094874 раскрывает способ мелкомасштабного получения ^И^ΑМΑN в клетках яичника китайского хомячка (СНО) с применением бессывороточной питательной среды при 37°С. Также описывается способ мелкомасштабного получения, аналогичный таковому из документа \УО 02/099092.

Документ \УО 05/077093 описывает производство сильно фосфорилированных лизосомальных ферментов. В примере IV описан способ очистки для кислой альфа-глюкозидазы (ОАА) с помощью мультимодальной смолы (голубая сефароза). ОАА, хотя и является лизосомальным ферментом, полностью отличается от гНЬАМАХ ОАА является сильно фосфорилированной, тогда как ^И^ΑМΑN имеет низкую степень фосфорилирования. Более того, оценка идентичности последовательностей между ОАА и ^И^ΑМΑN составляет менее 12%, и, наконец, их теоретические изоэлектрические точки отличаются более чем на одну единицу рН (5,42 и 6,48 соответственно). Таким образом, способ, который описан в документе \УО 05/077093 для очистки ОАА, не применим для гНЬАМАХ

Был раскрыт способ мелкомасштабного получения для ^И^ΑМΑN в СНО клетках с применением 0,25% (об./об.) сыворотки и добавлением ДМСО (Вегд е( а1. Мо1еси1аг Оепейск апй МейЬоИкт, 73, р. 1829, 2001). В нем также описываются два способа очистки, включающие а) трехэтапную процедуру, включающую ультрафильтрацию, анионообменную хроматографию и гель-фильтрацию; или Ь) одноэтапную иммуноаффинную хроматографию. Дополнительно раскрыто, как способ а) приводит в результате к полной фрагментации 130 кДа фермента на фрагменты 55 и 72 кДа, тогда как способ Ь) приводит в результате к частичной фрагментации 130 кДа предшественника на значительное количество 55 и 72 кДа фрагментов. Следовательно, улучшенный способ получения и очистки рекомбинантной альфа- 3 022220 маннозидазы был бы преимущественным. В частности, улучшенный способ крупномасштабного культивирования клеточной линии, способной экспрессировать альфа-маннозидазу, и более эффективный способ крупномасштабной очистки для выделения чистой альфа-маннозидазы с высокой ферментативной активностью из культуры клеток будут преимущественными.

Краткое описание изобретения

Таким образом, цель настоящего изобретения относится к способу получения и очистки рекомбинантной альфа-маннозидазы.

В частности, целью настоящего изобретения является обеспечение масштабируемого способа получения и очистки, который решает вышеупомянутые задачи известного уровня техники путем обеспечения достаточных количеств альфа-маннозидазы высокой чистоты с высокой ферментативной активностью, таким образом обеспечивая лечение пациентов, страдающих от альфа-маннозидоза.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к способу очистки рекомбинантной альфа-маннозидазы из культуры клеток, где фракцию указанной культуры клеток, включающую рекомбинантную альфа-маннозидазу, подвергают хроматографии на смоле, включающей мультимодальный лиганд. Неожиданно было обнаружено, что данный способ очистки давал в результате композицию, включающую рекомбинантную альфа-маннозидазу с более высокой степенью чистоты и более высокой долей желаемой 130 кДа разновидности гликопротеина, чем ранее было достигнуто. Достижение постоянных высоких долей (таких как более чем 80%) нефрагментированного 130 кДа гликопротеина после очистки является преимущественным, так как это обеспечивает более однородный продукт по сравнению с фрагментированным ферментом, что, в свою очередь, повышает возможность получения фармацевтического качественного продукта.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу периодического или непрерывного получения рекомбинантной альфа-маннозидазы, включающему следующие стадии, на которых:

a) инокулируют промышленный реактор, включающий основную среду, клетками, способными продуцировать рекомбинантную альфа-маннозидазу, в день 0 с получением культуры клеток;

b) добавляют питательную среду к указанной культуре клеток по меньшей мере один раз от дня 1;

c) корректируют температуру указанной культуры клеток до самое большее 35°С, как, например, 34, 33, 32°С, предпочтительно самое большее 31°С, либо после дня 3, либо когда плотность жизнеспособных клеток будет выше 2,1 млн жизнеспособных клеток/мл, в зависимости от того, что наступит раньше.

Неожиданно было обнаружено, что вышеупомянутый способ получения давал в результате культуру клеток, включающую рекомбинантную альфа-маннозидазу с высокими выходами, которая была легко переносимой в колонку очистки настоящего изобретения без какого-либо разведения.

Еще один другой аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении композиции, включающей очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу, где по меньшей мере 80% альфа-маннозидазы присутствует в качестве 130 кДа гликопротеина.

Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой композицию, включающую очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу, для применения при лечении альфа-маннозидоза.

Еще один другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ лечения альфаманнозидоза и/или уменьшения или облегчения симптомов, связанных с альфа-маннозидозом, причем указанный способ включает стадию введения композиции, включающей очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу, субъекту, нуждающемуся в этом.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показаны основные принципы предпочтительной в настоящее время схемы способа очистки альфа-маннозидазы от сбора до регистрации лекарственного средства;

на фиг. 2 показан пример хроматограммы на колонке Сар1о™ ММС для альфа-маннозидазы; на фиг. 3 показан пример хроматограммы на колонке Ьи1у1 §ерйато8е™ ЕЕ для альфа-маннозидазы; на фиг. 4 показан пример хроматограммы на колонке СНТ типа 1 для альфа-маннозидазы; на фиг. 5 показан пример хроматограммы на колонке О ЗерЬатоке™ НР для альфа-маннозидазы; на фиг. 6 показана δΌδ-раде хроматограмма композиции очищенной альфа-маннозидазы с указанием распределения 130, 75 и 55 кДа разновидностей гликопротеина;

на фиг. 7 показаны три НРЬС графика для очищенной альфа-маннозидазы, где количество 130 кДа разновидности изображено в сравнении с 55 и 75 кДа разновидностями. Первый пик слева представляет собой 55 кДа разновидность, за ним следуют 130 и 75 кДа разновидности соответственно. 2-этапный способ происходит без применения этапа хроматографии с мультимодальным лигандом, между тем как в 3 и 4-этапных способах применяют этап хроматографии с мультимодальным лигандом.

Настоящее изобретение будет теперь более детально описано в следующих разделах.

- 4 022220

Детальное описание настоящего изобретения

Определения.

Перед обсуждением настоящего изобретения более детально сначала будут определены следующие термины и условные обозначения.

Рекомбинантная альфа-маннозидаза

В контексте настоящего изобретения рекомбинантную альфа-маннозидазу определяют как альфаманнозидазу, которая в силу ее происхождения или манипуляции не является одинаковой по отношению ко всем или части альфа-маннозидаз дикого типа, обнаруживаемым в природе. Таким образом, она сконструирована с применением рекомбинантных техник, которые вовлекают молекулы рекомбинантной ДНК, то есть гибридные последовательности ДНК, включающие по меньшей мере две последовательности гибридной ДНК, причем первая последовательность в норме в природе не гибридизована со второй последовательностью. Белок рекомбинантной альфа-маннозидазы может быть человеческого или нечеловеческого происхождения. В частности, это может быть рекомбинантная лизосомальная альфаманнозидаза (τΗΤΆΜΛΝ) человека. Продукт-альфа-маннозидаза может представлять собой одиночный полипептид или смесь одиночного полипептида и его фракций. Альфа-маннозидаза также может подвергаться посттрансляционным модификациям и может, таким образом, находится в форме гликопротеина.

Культивирование клеток.

Культивирование клеток представляет собой процесс, с помощью которого клетки выращивают в контролируемых условиях. В данном контексте клетки, полученные в результате культивирования клеток, специально сконструированы для экспрессии представляющего интерес белка, такого как рекомбинантная альфа-маннозидаза. Культивирование клеток может происходить в биореакторе, который специально разработан, для того чтобы позволить контроль химических и физических условий.

Фракция.

В данном контексте фракция относится к фракции культуры клеток. Фракция может составлять цельную культуру клеток, но зачастую представляет собой обработанную фракцию культуры, такую как очищенная, отфильтрованная, концентрированная, разведенная или частично очищенная фракция.

Смола.

В контексте настоящего изобретения смола составляет основу стационарной фазы в хроматографической системе, на которую присоединены различные химические группы или вещества для обеспечения определенной степени сродства для данной молекулы или представляющего интерес белка. Смолы часто представляют собой полимерные гранулы с ковалентно присоединенными лигандами, причем указанные смолы являются нерастворимыми в применяемых жидких мобильных фазах.

Мультимодальные лиганды.

Под мультимодальным лигандом подразумевают любой лиганд, который сконструирован для взаимодействия с молекулой или интересующим белком по меньшей мере двумя способами. Отдельные взаимодействия могут независимо представлять собой гидрофобные, гидрофильные, ионные, Ван-дерВаальсовы взаимодействия, водородные связи или любое другое межмолекулярное химическое или физическое взаимодействие. В данном контексте лигандом является органическое химическое вещество, присоединенное к смоле, как определено выше. Мультимодальный лиганд будет иметь разные степени сродства к разным веществам, растворенным в мобильной фазе, которые пропускают через хроматографическую колонку. Различия в степени сродства приводят к изменениям во времени удержания разных веществ на хроматографической колонке, делая возможным разделение веществ. Время удержания также зависит от других факторов, таких как, например, компоненты мобильной фазы, рН и температура. Смолы, включающие мультимодальные лиганды, иногда называют также смолами смешанного действия, но в данном контексте смолы, включающие мультимодальный лиганд, не следует путать с так называемыми ионообменными смолами смешанного действия, которые включают несколько разных лигандов на одной смоле, которые могут иметь противоположные заряды, такие как, например, -ОН, -Са+ и РО₄ ^2- в случае смолы керамического гидроксиапатита (СНТ). В этих смолах отдельные лиганды не являются мультимодальными.

Загрузка.

В данном контексте загрузка относится к переносу сбора, элюата или другого раствора на хроматографическую систему, такую как хроматографическая колонка, включающая смолу в качестве стационарной фазы.

Буфер.

Термин буфер хорошо известен в качестве общего описания раствора, содержащего либо слабую кислоту и/или ее соответствующую соль, либо слабое основание и/или его соответствующую соль, который устойчив к изменениям рН. В контексте настоящего изобретения применяемые буферы являются подходящими для применения в хроматографических системах, такие буферы включают, но без ограничений: фосфатные буферы, например, гидрофосфат натрия (Ыа₂НРО₄), фосфат натрия или фосфат калия, ацетатные буферы, например, ацетат натрия или ацетат калия, сульфатные буферы, например, сульфат натрия или сульфат калия, сульфат аммония или Нерек, или другие буферы, например, борат натрия или трис-НС1 буфер.

- 5 022220

Ультрафильтрация.

Ультрафильтрация представляет собой способ разделения, в котором применяют гидравлическое давление для принудительного продвижения молекул и растворителя через мембрану, включающую поры определенного размера, также известного как пороговый размер или значение. Только молекулы, которые имеют молекулярную массу меньше порогового значения мембраны, способны пересекать мембрану, в то время как молекулы с большей молекулярной массой не пересекают мембрану и образуют так называемый ретентат. Молекулы, присутствующие в ретентате, можно таким образом концентрировать, по мере того как растворитель проникает через мембрану.

В отдельных вариантах осуществления концентрирование раствора или композиции, включающей полипептид, такой как альфа-маннозидаза, может быть выполнено посредством тангенциальной поточной фильтрации (ТРР). Этот способ является, в частности, пригодным для крупномасштабного концентрирования, т.е. для концентрирования растворов с объемом от 1 л до нескольких сотен литров. Таким образом, данный способ является, в частности, пригодным для получения концентрированных растворов представляющего интерес полипептида в промышленном масштабе.

Методика ТРР основана на применении особого устройства, которое заставляет раствор, который следует отфильтровать, протекать через полупроницаемую мембрану; только молекулы, меньшие, чем поры мембраны, пройдут через мембрану, образуя фильтрат, оставляя большее количество материала для сбора (ретентат). В ТРР способе прилагают два разных давления; одно для закачивания раствора в систему и для его циркуляции в системе (давление на входе) и другое давление прилагают через мембрану (мембранное давление) для принудительного продвижения малых молекул и растворителя через мембрану. Давление на входе, как правило, может находиться в диапазоне 1-3 бар, как, например, 1,5-2 бар. Трансмембранное давление (ТМР), как правило, может составлять более 1 бар. Концентрированная композиция представляющего интерес полипептида может быть собрана в виде ретентата, если для концентрирования композиции применяют ТРР. Мембраны, пригодные для ТРР, как правило, могут быть выполнены из регенерированной целлюлозы или полиэфирсульфона (РЕ§).

Диафильтрация.

В данном контексте диафильтрация представляет собой способ фильтрации, где представляющая интерес разновидность присутствует в ретентате, т.е. она не может пройти через фильтр, в то время как другие компоненты, такие как, например, буферы и соли, все-таки проходят через фильтр. Таким образом, диафильтрацию можно, например, применять для замены одного буфера другим или для концентрирования растворов, содержащих представляющую интерес разновидность, такую как рекомбинантная альфа-маннозидаза.

Первым аспектом настоящего изобретения является обеспечение способа очистки рекомбинантной альфа-маннозидазы из культуры клеток, где фракцию указанной культуры клеток, включающую рекомбинантную альфа-маннозидазу, подвергают хроматографии на смоле, включающей мультимодальный лиганд. Преимуществом применения смол, включающих мультимодальный лиганд, в данном контексте является то, что эти смолы позволяют связывание альфа-маннозидазной разновидности в растворах с высокими уровнями проводимости. Это имеет то преимущество, что можно применять неразбавленный сбор с высокими уровнями проводимости, и нет необходимости заменять буфер для сбора. Этап хроматографии, включающий мультимодальный лиганд, может, таким образом, предпочтительно являться первым этапом хроматографии после выделения фракции из культуры клеток. Указанный этап хроматографии, включающий мультимодальный лиганд, могут часто называть этапом захвата, поскольку представляющий интерес белок первоначально удерживается на колонке (т.е. захвачен), в то время как многие примеси проходят через колонку в течение этапов отмывки. Белок впоследствии элюируют с применением специфического элюирующего буфера.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения приведен способ, где фракция культуры клеток, включающая рекомбинантную альфа-маннозидазу, представляет собой очищенный неразбавленный сбор. В контексте настоящего изобретения термин очищенный неразбавленный сбор означает сбор культуры клеток, не содержащий нерастворенный материал или твердые частицы, т.е. он представляет собой прозрачный раствор. Сбор мог быть подвергнут обработке для превращения его в прозрачный раствор. Такие обработки могут включать, но без ограничений: фильтрацию и центрифугирование. Кроме того, сбор не подвергают значительному разбавлению перед проведением этапов хроматографии. Следовательно, сбор разбавляют менее чем на 10%, как, например, менее чем на 7%, менее чем на 5%, менее чем на 2%, менее чем на 1%, менее чем на 0,5%, как, например, менее чем 0,1%. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления сбор не разбавляют.

В другом варианте осуществления приведен способ, где осветленный неразбавленный сбор имеет проводимость 10-20 мСм/см, такую как 12-17 мСм/см, предпочтительно 15 мСм/см. Проводимость измеряют до загрузки сбора на хроматографическую систему.

В одном варианте осуществления указанную хроматографию осуществляют на смоле, включающей мультимодальный лиганд с группой карбоновой кислоты или сульфоновой кислоты. Карбоновые и/или сульфоновые кислоты, входящие в состав этих лигандов, могут находиться в протонированной форме или в депротонированной (соль) форме, в зависимости от условий в хроматографической системе, осо- 6 022220 бенно рН мобильной фазы.

В еще одном, другом варианте осуществления приведен способ, где мультимодальный лиганд, связанный со смолой, представляет собой вещество формул (I), (II) или (III)

где К веществ формул (II) и (III) представляет собой функциональную группу формулы (IV)

Мультимодальный лиганд, представленный функциональной группой формулы (IV), обычно называют СзЬгасоп В1ие 30, и примерами коммерческих продуктов, представленных веществами формул (I), (II) и (III), являются Сар1о™ ММС, Сар1о™ В1ие и В1ие керЬагоке™ Гак! йоте соответственно. Другие пригодные смолы мультимодального типа включают Сар!о™ Лййеге, МЕР НурегСе1™, НЕА НурегСе1™ и РРА НурегСе1™. В контексте настоящего изобретения такие смолы оказались особенно эффективными в первоначальной очистке неразбавленного сбора, включающего рекомбинантную альфаманнозидазу.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ, где фракцию указанной культуры клеток, загруженную на смолу, включающую мультимодальный лиганд, подвергают по меньшей мере одному этапу отмывки раствором, включающим изопропанол, предпочтительно по меньшей мере 1% (об./об.) изопропанол, такой как по меньшей мере 2, 3, 4, 4,5% (об./об.) изопропанол, предпочтительно по меньшей мере 5% (об./об.) изопропанол. Преимуществом применения раствора, включающего изопропанол, является то, что он обеспечивает лучшее удаление нежелательных белков клетки-хозяина (НСР), особенно это помогает удалить протеазу, отвечающую за протеолитическое расщепление желаемой 130 кДа разновидности γΗΣΑΜΑΝ. НСР следует понимать как белки, эндогенные по отношению к клетке-хозяину, применяемой в культуре клеток в ходе получения. Хотя изопропанол является предпочтительным, другие пригодные спирты для данного способа включают этанол, нпропанол и н-бутанол.

В еще одном, другом варианте осуществления приведен способ, где рН раствора, применяемого для этапа отмывки, находится в диапазоне рН 3,5-6,5, таком как рН 4,0-6,0, рН 4,5-5,5, предпочтительно рН 4,7-5,0.

Другой вариант осуществления обеспечивает способ, где раствор, применяемый для этапа отмывки, включает ацетатный буфер предпочтительно в концентрации в диапазоне 0,05-1,6 М, таком как 0,1-1,5 М, 0,5-1,4 М, 0,7-1,3 М, 0,8-1,2 М, 0,9-1,1 М, предпочтительно 0,95 М. Ацетатный буфер можно предпочтительно выбрать из группы, включающей ацетат натрия, ацетат калия, ацетат лития, ацетат аммония.

Другой еще вариант осуществления обеспечивает способ, где первый элюат, включающий рекомбинантную альфа-маннозидазу, элюируют из смолы, включающей мультимодальный лиганд, с помощью водного раствора, включающего этиленгликоль или пропиленгликоль. Добавление этиленгликоля к элюирующему буферу, как было обнаружено, значительно повышает выход элюируемой рекомбинантной альфа-маннозидазы. Пропиленгликоль также повышал выход, но этиленгликоль является предпочтительным.

Один вариант осуществления обеспечивает способ, где концентрация этиленгликоля или пропиленгликоля в водном растворе составляет 20-60, 20-50, 25-50, 30-50, 35-45%, как, например, 40%.

- 7 022220

В предпочтительном варианте осуществления приведен способ, где водный раствор, включающий этиленгликоль или пропиленгликоль, включает хлорид натрия. Добавление хлорида натрия к данному раствору, как было обнаружено, значительно повышает выходы, способствуя элюированию фермента гЬЬАМАЫ.

В другом варианте осуществления концентрация хлорида натрия в водном растворе, включающем этиленгликоль или пропиленгликоль, находится в диапазоне от 0,2 до 2,4 М, как, например, в диапазоне от 0,4 до 2,2 М, от 0,6 до 2,0 М, от 0,8 до 1,9 М, от 1,0 до 1,8 М, от 1,2 до 1,7 М, от 1,4 до 1,6 М, предпочтительно 1,5 М. Альтернативно, концентрация хлорида натрия может находиться в диапазоне от 0,2 до 1,6 М или в диапазоне от 1,4 до 2,4 М.

В предпочтительном варианте осуществления водный раствор, включающий этиленгликоль или пропиленгликоль, включает буфер. Указанный буфер может предпочтительно являться фосфатным буфером, таким как фосфат натрия или фосфат калия. Хотя фосфатные буферы являются предпочтительными, дополнительные пригодные буферы для водного раствора включают цитратные и боратные буферы, Трис, МЕЗ, МОРЗ и Нерек буферы.

В другом предпочтительном варианте осуществления концентрация буферных солей в водном растворе, включающем этиленгликоль или пропиленгликоль, составляет 50-350, 55-300, 65-2800, 70-250, 75200, 80-200, 85-150, предпочтительно 90 мМ.

В еще другом предпочтительном варианте осуществления рН водного раствора, включающего этиленгликоль или пропиленгликоль, составляет рН 7,0-9,0, такой как рН 7,1-8,5, рН 7,2-8,3, рН 7,5-8,0, предпочтительно рН 7,7.

В одном варианте осуществления приведен способ, где первый элюат, включающий альфаманнозидазу, полученную со смолы, включающей мультимодальный лиганд, дополнительно подвергают способу, включающему этапы, на которых:

ί) наносят фракцию, включающую альфа-маннозидазу, на смолу для хроматографии с гидрофобным взаимодействием с получением элюата, включающего рекомбинантную альфа-маннозидазу;

ίί) пропускают фракцию, включающую альфа-маннозидазу, через ионообменную смолу смешанного действия для удерживания загрязняющих примесей с получением фильтрата, включающего рекомбинантную альфа-маннозидазу;

ш) подвергают фракцию, включающую альфа-маннозидазу, хроматографии на анионообменной смоле с получением элюата, включающего рекомбинантную альфа-маннозидазу.

В одном варианте осуществления приведен способ, включающий этапы ί)-ίίί), как описано выше, где фракцию этапа ί) подвергли очистке на указанной смоле, включающей мультимодальный лиганд, фракцию этапа ίί) получают из элюата из этапа ί) и фракцию этапа ίίί) получают из фильтрата из этапа ίί). Другими словами, этапы ί)-ίίί) выполняют в том порядке, в котором они перечислены, однако без исключения промежуточных этапов между этапами ί)-ίίί). Они могут представлять собой этапы промежуточной очистки и/или этапы снижения количества вируса или удаления вируса.

В предпочтительном варианте осуществления смола для хроматографии гидрофобного взаимодействия этапа ί) представляет собой алкилзамещенную смолу, предпочтительно бутилсефарозную смолу. Алкилзамещенные смолы могут включать этил-, бутил- и октилсефарозные смолы. Кроме того, также применимы фенилсефарозные смолы. Примерами таких смол являются Ви1у1-З ЗерЬагоке™ 6 Еак! Е1ом, Ви1у1 ЗерЬагоке™ 4 Еак! Е1ом, Ос1у1 ЗерЬагоке™ 4 Еак! Е1ом, РЬеиу1 ЗерЬагоке™ 6 Еак! Е1ом (ШдЬ киЬ) и РЬеиу1 ЗерЬагоке™ 6 Рак1 Е1ом (1ом киЬ), Ви1у1 ЗерЬагоке™ Ηίμΐι РегГогтапсе, РЬепу1 ЗерЬагоке™ Ηίμΐι РегГогтапсе. Преимуществом этапа очистки, задействующего гидрофобно взаимодействующие смолы, и особенно бутилсефарозную смолу, является эффективное удаление белков клетки-хозяина и остатков ДНК, в то время как сохраняется хороший выход фермента гЬЬАМАЫ.

В еще другом варианте осуществления этап ί) включает по меньшей мере один этап отмывки, где применяемый для отмывки раствор включает фосфатный буфер и ацетатный буфер, предпочтительно фосфат натрия и ацетат натрия. Этот этап отмывки двойным буфером оказался особенно эффективным при удалении примесей, таких как белки клетки-хозяина и остатки ДНК.

В еще другом варианте осуществления концентрация фосфатного буфера при отмывке двойным буфером этапа ί) находится в диапазоне 5-40 мМ, таком как 10-30, 15-25, предпочтительно 20 мМ, и концентрация ацетатного буфера находится в диапазоне 0,9-1,5 М, таком как 1,0-1,4, 1,1-1,3, предпочтительно 1,2 М.

В другом варианте осуществления этап ί) включает по меньшей мере один этап отмывки, где применяемый для отмывки раствор включает не более одного буфера, предпочтительно фосфатный буфер, предпочтительно фосфат натрия.

В другом варианте осуществления один буфер по меньшей мере одного этапа отмывки, включающий не более одного буфера, присутствует в концентрации в диапазоне 0,4-0,8 М, таком как 0,5-0,7 М, предпочтительно 0,6 М.

В одном варианте осуществления приведен способ, где ионообменная смола смешанного действия этапа ίίί) представляет собой смолу на основе керамического гидроксиапатита или фтороапатита, пред- 8 022220 почтительно смолу на основе керамического гидроксиапатита типа I (СНТ I). Применение этого этапа хроматографии, как было показано, эффективно отделяет значительное количество ДНК-примесей от композиции рекомбинантной альфа-маннозидазы и связывает белки клетки-хозяина, в то время как ферментный продукт τΗΣΑΜΑΝ проходит колонку без связывания.

В другом варианте осуществления анионообменная смола этапа ίίί) представляет собой сильную анионообменную смолу, такую как сильная анионообменная смола на основе четвертичного аммония. Такие смолы включены в следующие примеры: ф-5ерЬато5е™ НР, ф-5ерЬато5е™ РР, ПЕАЕ-зерЬагозе™, Сар1о™ О. Иио™ О. ΑΝΧ 5ерЬаго5е™, но не ограничиваются ими.

В еще другом варианте осуществления приведен способ, где выполняют этап инактивации вируса, предпочтительно между этапом ίί) и этапом ίίί).

В предпочтительном варианте осуществления этап инактивации вируса включает смешивание фильтрата этапа ίί) с водным раствором изопропанола (1:1 об./об. фильтрат/водный изопропанол) в течение по меньшей мере 2 ч, предпочтительно с последующим концентрированием ультрафильтрацией и удалением изопропанола с помощью диафильтрации. Водный изопропанол во время инактивации может находиться в диапазоне 10-50% изопропанола, таком как 20-40, 25-35, 28-32, предпочтительно 30% изопропанола. Раствор 1:1 об./об. фильтрата и водного изопропанола, таким образом, имеет конечную концентрацию изопропанола 15%.

Другой предпочтительный вариант осуществления представляет собой способ, где выполняют этап снижения количества вируса, предпочтительно после этапа хроматографии ίίί).

В одном варианте осуществления этап снижения количества вируса включает фильтрацию раствора, включающего рекомбинантную альфа-маннозидазу, предпочтительно элюат этапа ίίί), через фильтр, предпочтительно фильтр для удаления вируса, такой как фильтр иШрот™ УР дтабе ЭУ20 или фильтр р1аиоча™ 15Ν или 20Ν, предпочтительно применяют фильтр Р1апоуа™ 15Ν.

Способ очистки по настоящему изобретению можно преимущественно выполнять в крупном масштабе, таким образом в предпочтительных вариантах осуществления способ выполняют на хроматографических колонках с объемом колонки по меньшей мере 0,5 л, таким как по меньшей мере 1,0, 2,0, 5,0, 10 л, предпочтительно по меньшей мере 13,0 л.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения приведен способ очистки, как описано выше, где альфа-маннозидаза имеет последовательность, выбранную из:

Л) последовательности, изложенной в §Еф ГО ΝΟ: 2;

B) аналога последовательности в А;

C) подпоследовательности последовательности в А) или В).

Где последовательность, описанная посредством §Еф ГО ΝΟ: 2, представляет аминокислотную последовательность рекомбинантной лизосомальной альфа-маннозидазы человека (τΗΣΑΜΑΝ), приведенную в документе \УО 02/099092.

Под подпоследовательностью подразумевают фрагмент исходной последовательности с размером не менее 50% от исходной последовательности, таким как не менее 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или не менее 95% от исходной последовательности. Соответственно подпоследовательности, о которых идет речь, могут иметь длину от 505 до 1009 идущих подряд аминокислотных остатков, такую как от 525 до 1009, от 550 до 1009, от 575 до 1009, от 600 до 1009, от 625 до 1009, от 650 до 1009, от 675 до 1009, от 700 до 1009, от 725 до 1009, от 750 до 1009, от 775 до 1009, от 800 до 1009, от 825 до 1009, от 850 до 1009, от 875 до 1009, от 900 до 1009, от 925 до 1009, от 950 до 1009, от 975 до 1009, от 980 до 1009, от 990 до 1009 или такую как от 1000 до 1009 идущих подряд аминокислотных остатков. Кроме того, релевантные подпоследовательности §Еф ГО ΝΟ: 2 или их аналоги должны сохранять каталитический участок. Хотя трехмерная структура ΡΑΜΑΝ человека неизвестна, трехмерная структура ΡΑΜΑΝ быка была опубликована, и на основании тех данных был сделан вывод, что следующие аминокислоты участвуют в образовании активного центра, и/или отвечают за координирование Ζη²+ атома, необходимого для активности также ΡΑΜΑΝ человека: АК 72=Н, АК 74=Ό, АК 196=Ό, АК 446=Н (база данных ИтРтоЖВ/§и155-Рго1: 000754, ΜΑ2Β1_ΗυΜΑΝ_, НокшЬото е1 а1. ί. Мо1. Вю1., 327, 631-644, 2003). Было показано, что мутации в АК 72 и 196 в ΡΑΜΑΝ человека приводят к почти полной потере ферментативной активности (Нап5еп е1 а1., ВюсНет. ί., (2004), 381, р. 537-567). Для того чтобы проявлять активность, подпоследовательность белка τΗΣΑΜΑΝ должна сохранять, по меньшей мере, участки, содержащие четыре вышеупомянутые аминокислоты.

Предпочтительно подпоследовательности τΗΣΑΜΑΝ также включают одну или несколько дополнительных конформационных частей, включая, например, сайты связывания, бета-изгибы, дисульфидные мостики, стоп-кодоны и другие. У формы ΡΑΜΑΝ человека существует несколько вызывающих заболеваний мутаций, указывающих на важность данной конкретной аминокислоты, например, АК 53, 72, 77, 188, 200, 355, 356, 359, 402, 453, 461, 518, 563, 639, 714, 750, 760, 801, 809, 916 (ТЬе Ьитап депе тШайоп ба1аЬа5е, ΗΜ^С® ргоГе55Юпа1, СагбТГ итуег5Йу, 2009), и существуют также аминокислоты, которые представляют важность для гликозилирований, включая АК 133, 310, 367, 497, 645, 651, 692, 766, 832, 930 и 989, и аминокислоты, вовлеченные в образование дисульфидных мостиков, такие как АК

- 9 022220

55+358, 268+273, 412+472 и 493+501.

Под аналогом подразумевают последовательность с определенным процентом идентичности последовательности с исходной последовательностью, это может быть по меньшей мере 60% идентичности последовательности, как, например, по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 95, 98 или предпочтительно 99% идентичности последовательности. Будет понятно, что аналоги и подпоследовательности, изложенные выше, являются предпочтительно функционально эквивалентными альфа-маннозидазе с аминокислотной последовательностью, изложенной в 8ЕЦ ГО N0: 2, в том смысле, что они способны проявлять, по существу, такую же ферментативную активность.

Термин по существу, такая же ферментативная активность относится к эквивалентной части или аналогу по меньшей мере с 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% активностью природного фермента. Примером функционально эквивалентного аналога фермента может быть химерный белок, который включает каталитический участок фермента в функциональной форме, но он также может представлять собой гомологичный вариант фермента, полученного из другого вида. Также полностью искусственные молекулы, которые имитируют специфическую ферментативную активность соответственного фермента, будут составлять функционально эквивалентные аналоги. Не свойственные человеку аналоги ΕΆΜΛΝ обычно не применимы для терапии, так как они могут потенциально индуцировать образование антител в организме пациента и вызывать заболевание. Свойственные человеку аналоги, однако, могут быть пригодными в ферментозаместительной терапии, если мутации не вызывают заболевание и значительно не ослабляют желаемую активность фермента. Примерами таких мутаций являются Н1870Ьеи, С1и240Ат§, 8ет250А1а, Ьеи278Уа1, 8ет282Рто, ТЬт31211е, А1а337Ат§, 8ет413А5и, 8ет481А1а, О1и582О1и, Аг§741О1и, ТЬт873Рто (источник: Ы1р://№№№.еи8ешЫ.ог§; ГО транскрипта ΕΝ8Τ00000456935). Также Рто669Ьеи и А8р402Ьу8, как известно настоящим изобретателям, не вызывают заболевание.

В общем, специалист будет в состоянии легко разработать соответствующие анализы для определения ферментативной активности. Для Б-ΛΜΛΝ соответствующий анализ ферментативной активности раскрыт в документе АО 02/099092, с. 26, строки 8-28. Вкратце, можно выполнить следующую процедуру с целями скрининга с применением плоскодонных 96-луночных планшетов: 75 мкл 4-кратного буфера для анализа (8 мМ п-нитрофенил-альфаГО-маннопиранозида, 2 мг/мл В8А, 0,4 М №-ацетата (рН 4,5) добавляют к 75 мкл образца или его соответствующего разведения (в 10 мМ Трис, рН 7,4, содержащем 150 мМ ΝηΟ + 10% кирегЫоск). Планшеты инкубируют при 37°С в течение 30 мин и останавливают реакцию 75 мкл 1,8 М №-ьСО₃, и абсорбцию регистрируют при 405 нм на планшет-ридере. 96-луночные планшеты считывают на спектрофотометре. Специфическую активность определяют как мкмоли гидролизированного п-нитрофенил-альфаГО-маннопиранозида в мин на 1 мг белка.

Обычно определяемую идентичность в данном документе определяют как идентичность последовательности между генами или белками на нуклеотидном или аминокислотном уровне соответственно. Таким образом, в данном контексте идентичность последовательности является мерой идентичности между белками на аминокислотном уровне и мерой идентичности между нуклеиновыми кислотами на нуклеотидном уровне. Идентичность белковых последовательностей можно определить путем сравнения аминокислотной последовательности в данном положении у каждой последовательности при выравнивании последовательностей. Аналогично, идентичность последовательностей нуклеиновой кислоты можно определить путем сравнения нуклеотидной последовательности в данном положении у каждой последовательности при выравнивании последовательностей.

Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, гэпы можно вводить в последовательность первой аминокислотной или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом как в соответствующем положении второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в данном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества идентичных положений, являющихся общими для последовательностей (т.е. % идентичности = кол-во идентичных положений/общее кол-во положений (например, перекрывающиеся положения) х 100). В одном варианте осуществления две последовательности имеют одинаковую длину.

Можно вручную выровнять последовательности и посчитать количество идентичных аминокислот. Альтернативно, выравнивание двух последовательностей для определения процента идентичности можно выполнить с применением математического алгоритма. Такой алгоритм включен в программы NВ^А§Τ и ХВЬА8Т. Нуклеотидные поиски ВЬА8Т можно осуществлять с помощью программы

- 10 022220

ΝΒΕΆδΤ, ксоге = 100, \УОгД1епф11 = 12, с тем, чтобы получить нуклеотидные последовательности, гомологичные молекулам нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Белковые поиски ВЬЛ8Т можно осуществлять с помощью программы ХВЬЛ8Т, ксоге = 50, \УОгД1епф11 = 3, с тем, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные белковой молекуле настоящего изобретения. Для получения выравниваний с гэпами для целей сравнения можно использовать ОарреД ВЬА8Т. Альтернативно, можно применять ΡδΙ-ΒΕικΙ для осуществления поиска с итеративным углублением, который обнаруживает взаимосвязь между молекулами. При использовании программ ΝΒΕΑδΤ, ХВЬА8Т и ОарреД ВЬА8Т можно применять параметры соответствующих программ по умолчанию; смотри 1Шр://\у\у\у.псЬгп1т.ш1гдоу. Альтернативно, идентичность последовательностей можно рассчитать после того, как последовательности были выровнены, например с помощью программы ВЬА8Т в базе данных ЕМВЬ (\у\у\у.псЫ.п11п.доу/сщ-ЬВ/ВЕА8Т). В общем, для выравнивания можно применять стандартные настройки в отношении, например, матрицы замен и штрафа за гэп. В контексте настоящего изобретения преимущественными могут быть стандартные настройки Β^ΑδΤN и ΡδΙ ВЬА8Т.

Процент идентичности между двумя последовательностями можно определить с применением методик, аналогичных описанным выше, с или без учета гэпов. При вычислении процента идентичности считают только точные совпадения.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой композицию, включающую альфа-маннозидазу, получаемую посредством способа очистки, описанного выше.

Во втором аспекте настоящего изобретения приведен способ периодического или непрерывного получения рекомбинантной альфа-маннозидазы, включающий следующие стадии, на которых:

c) корректируют температуру указанной культуры клеток до самое большее 35°С, как например 34, 33, 32°С, предпочтительно самое большее 31°С, либо после дня 3, либо когда плотность жизнеспособных клеток будет выше 2,1 МУС/мл, в зависимости от того, что наступит раньше.

В упомянутом выше способе день инокуляции определяют как день 0 и следующий день представляет собой день 1 и так далее. Начальная температура, применяемая от дня 0 до корректировки, описанной в пункте с), находится в диапазоне 36-37°С, предпочтительно составляет 36,5°С. Следует понимать, что вышеупомянутые температуры являются действительными измеренными температурами, а не заданными значениями, т.е. в настройках биореактора, применяемых для настоящего изобретения, вышеупомянутая температура 31°С нуждалась в заданном значении температуры 32°С. Таким же образом температура 36,5°С требует температуру с заданным значением 37°С.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии и продукции рекомбинантной альфа-маннозидазы получают из многоклеточных организмов, предпочтительно из млекопитающих. В частности, клетки, применяемые для продуцирования рекомбинантной альфа-маннозидазы, можно выбрать из группы, включающей линию клеток почки обезьяны СУ1, трансформированную δν40 (ί'.'ϋδ-7); линию человеческих эмбриональных клеток почки (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК); клетки яичника китайского хомячка /-ЭНРК (СНО); клетки Сертоли мыши (ТМ4); клетки почки обезьяны (СУ I); клетки почки африканской зеленой мартышки (УЕКО-76); клетки цервикальной карциномы человека (НЕБА); клетки почки собаки (МЭСК); клетки печени крыс Буффало (ВКЬ 3А); клетки легкого человека (А138); клетки печени человека (Нер 02, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки ТЫ; клетки МКС 5; клетки Ρδ4 и клетки гепатомы человека (Нер 02). Линии клеток насекомых или фибробласты человека также доступны в качестве подходящих клеток-хозяев.

Продуцирование рекомбинантной альфа-маннозидазы достигают с помощью клеток, трансфицированных соответствующим конструктом нуклеиновой кислоты, с применением методик, известных специалисту. В частности, конструкт нуклеиновой кислоты может включать последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, включающей:

ί) последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1;

ίί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая подпоследовательность или аналог последовательности, изложенной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, как представлено выше.

Клетки могут предпочтительно представлять собой линию клеток яичника китайского хомячка гЕАМАЫ (СНО), специально разработанную с целью продуцирования рекомбинантного фермента, как описано в документе АО 02/099092. Культуру этой линии клеток, у которой ΌδΜ АСС2549, депонировали в ΌδΜΖ ОтЬН, МаксНгоДепуед 1Ь, Ό-38124 Вгаии8сЙ№е1д, Оегтапу с целью патентного депонирования согласно Будапештскому договору от 6 июня 2002 г. Эту клетку можно получить с применением плазмиды экспрессии рЬатапЕхр1 с последовательное™, показанной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1.

Способ этапов а)-с) может дополнительно включать следующий этап, на котором

Д) осуществляют способ очистки рекомбинантной альфа-маннозидазы из культуры клеток, где фракцию указанной культуры клеток, включающую рекомбинантную альфа-маннозидазу, подвергают

- 11 022220 хроматографии на смоле, включающей мультимодальный лиганд с группой карбоновой кислоты или группой сульфоновой кислоты, как описано выше.

В еще другом варианте осуществления культура клеток, применяемая в способе получения, по существу, не содержит каких-либо добавок, полученных из животных, таких как добавки на основе рыбьего жира. Уход от применения таких добавок снижает риск вирусной контаминации конечного ферментного продукта.

В одном предпочтительном варианте осуществления способа получения неразбавленный сбор из периодического или непрерывного получения имеет концентрацию альфа-маннозидазы по меньшей мере 0,1 г/л, такую как по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4 г/л, предпочтительно по меньшей мере 0,5 г/л.

В другом варианте осуществления неразбавленный сбор из периодического или непрерывного получения имеет активность фермента в диапазоне 3-35 ед/мл, такую как 5-35, 7-35 ед/мл, предпочтительно в диапазоне 10-35 ед/мл. Следует понимать, что при дополнительной оптимизации способа активность фермента сбора может стать даже выше 35 ед/мл.

Способ получения можно преимущественно осуществлять в крупном масштабе. Таким образом, в одном варианте осуществления способ периодического или непрерывного получения осуществляют в объеме по меньшей мере 30 л, таком как по меньшей мере 50, 75, 100, 150, 200 л, предпочтительно по меньшей мере 250 л.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения приведен способ получения, как описано выше, где альфа-маннозидаза имеет последовательность, выбранную из:

Α) последовательности, изложенной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 2;

Β) аналога последовательности в А;

С) подпоследовательности последовательности в А) или В).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой композицию, включающую альфа-маннозидазу, получаемую посредством способа получения, описанного выше. Такие композиции в предпочтительных вариантах осуществления могут включать ингредиенты дополнительных активных продуктов (ΑΡΙ), вспомогательные вещества и/или наполнители.

В третьем аспекте настоящего изобретения приведена композиция, включающая очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу, где по меньшей мере 80% альфа-маннозидазы присутствует в качестве 130 кДа гликопротеина.

В предпочтительном варианте осуществления приведена композиция, включающая очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу, где рекомбинантная альфа-маннозидаза остается стабильной в жидком растворе в течение по меньшей мере 4 дней при хранении при 5°С или в течение по меньшей мере 24 месяцев при хранении при -20°С.

Ниже описана предпочтительная в настоящее время композиция для раствора буферного состава для ферментного продукта γΗΣΑΜΑΝ, а также перечислены достигнутые стабильности:

№-ьНРО₄ 3,50 мМ (двухосновный фосфат натрия),

NаН₂ΡΟ₄ 0,17 мМ (одноосновный фосфат натрия), глицин 27 мМ, маннит 250 мМ, рН 7,70, 290 мОсм/кг (изотонический раствор), стабильность при использовании: стабильный раствор 5°С - 4 дня, 20°С - 6 ч, -20°С - 24 месяца, лиофилизированный 5°С - 24 месяца.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения приведена композиция, описанная выше, где альфа-маннозидаза имеет последовательность, выбранную из:

Α) последовательности, изложенной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 2,

Β) аналога последовательности в А,

Другой предпочтительный вариант осуществления представляет собой вышеупомянутую композицию, включающую очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу для применения в качестве лекарственного препарата.

В дополнительном варианте осуществления вышеупомянутая композиция, включающая очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу, предназначена для применения в лечении альфа-маннозидоза.

Еще другой вариант осуществления представляет собой применение вышеупомянутой композиции, включающей очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу, для получения лекарственного препарата для лечения альфа-маннозидоза.

Другой еще вариант осуществления представляет собой способ лечения альфа-маннозидоза и/или уменьшения или облегчения симптомов, связанных с альфа-маннозидозом, причем указанный способ включает стадию введения композиции, включающей очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу, как приведено выше, субъекту, нуждающемуся в этом. Следует отметить, что варианты осуществления и признаки, описанные в контексте одного из аспектов настоящего изобретения, также применимы к другим аспектам настоящего изобретения.

- 12 022220

Все ссылки на патенты и на непатентные публикации, цитируемые в настоящем изобретении, полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки.

Настоящее изобретение теперь будет описано более подробно в следующих неограничивающих примерах.

Примеры

Применяемые сокращения:

С1Р - очистка на месте,

СУ - объем колонки,

Су - плотность жизнеспособных клеток,

ЭР - диафильтрация,

ΌΘ - растворенный кислород,

1РА - изопропанол,

МУС/мл - 10⁶ жизнеспособных клеток /мл,

ΝαΡί - фосфат натрия,

ЫаАс - ацетат натрия,

ΘΌ - оптическая плотность,

ЕС - этиленгликоль,

ТЕР - тангенциальная поточная фильтрация,

ТМР - трансмембранное давление,

ИР - ультрафильтрация.

Пример 1. Предпочтительная в настоящее время полная процедура очистки.

Процедура очистки для получения оптимальных выходов и степеней чистоты для альфаманнозидазы в контексте настоящего изобретения описывается ниже. Применяют стандартные условия для регенерации и очистки смол, как прописано для отдельной смолы (смотри также примеры 2-5). Применяемые смолы являются доступными в СЕ ЬеаЬЬсаге Ше зс1епсез и ВюКаб.

Обеспечение фракции сбора из получения альфа-маннозидазы и очистка фракции без значительного разведения. Предпочтительно совсем не осуществляют разведение.

Осуществление этапа захвата, включающего колоночную хроматографию вышеупомянутой фракции, на смоле, включающей мультимодальный лиганд. Эти смолы выбирают из группы, включающей Сар!о™ ММС, Сар!о™ АбЬеге, Р1аз1шбЗе1ес1™ Х1га. Сар!о™ В1ие, В1ие ЗерЬагозе™ Раз! Р1о\у смола, МЕР НурегСе1™, НЕА НурегСе1™ и РРА НурегСе1™.

Несколько отмывок выполняют при рН 4,5-8,5, отмывочные буферы выбирают из группы, включающей ацетат натрия, ацетат калия, ацетат аммония, фосфат натрия, фосфат калия, сульфат натрия, сульфат калия, сульфат аммония, МЕЗ, МОРЗ, Нерез, борат натрия, трис-НС1, цитратный буфер или их комбинации (буферной группы А, в дальнейшем). По меньшей мере в одной отмывке, однако, отмывочный раствор включает изопропанол и рН находится между рН 4-6. Элюирующий буфер выбирают из буферной группы А, и элюирующий раствор включает этиленгликоль. рН элюирования поддерживают на уровне рН 7,0-8,5.

Осуществление активного промежуточного этапа, включающего колоночную хроматографию композиции, включающей альфа-маннозидазу, на смоле с гидрофобным взаимодействием. Эти смолы выбирают из группы, включающей Ви1у1-З ЗерЬагозе™ 6 Раз! Р1ои, Ви1у1 ЗерЬагозе™ 4 Раз! Р1ои, Ос!у1 ЗерЬагозе™ 4 Раз! Р1ои, РЬепу1 ЗерЬагозе™ 6 Раз! Р1о\у (ЬщЬ зиЬ) и РЬепу1 ЗерЬагозе™ 6 Раз! Р1о\у (1ои зиЬ), Ви1у1 ЗерЬагозе™ Н1§Ь РегРогшаисе, РЬепу1 ЗерЬагозе™ Н1§Ь РегРогшапсе.

Несколько отмывок выполняют при рН 7-8. Отмывочные буферы выбирают из буферной группы А. Элюирующий буфер также выбирают из буферной группы А, и рН элюирования находится между рН 78.

Осуществление пассивного промежуточного этапа, включающего колоночную хроматографию композиции, включающей альфа-маннозидазу, на ионообменной смоле смешанного действия с получением фильтрата. Эти смолы выбирают из группы, включающей смолу на основе керамического гидроксиапатита типа I или II (предпочтительно типа I) или фторапатит. Одну отмывку осуществляют для получения фильтрата при рН 7-8. Отмывочный буфер выбирают из буферной группы А.

Осуществление этапа доочистки, включающего колоночную хроматографию композиции, включающей альфа-маннозидазу, на анионообменной смоле. Эти смолы выбирают из группы, включающей Ц-зерЬагозе™ НР, Ц-зерЬагозе™ РР, ЭЕАЕ-зерЬагозе™, Сар!о™Ц, Ипо™ Ц, ΑΝΧ зерЬагозе™.

Несколько отмывок выполняют при рН 7-8. Отмывочные буферы выбирают из буферной группы А и Трис-НС1 буфера. Элюирующий буфер также выбирают из буферной группы А и рН элюирования поддерживают на уровне рН 7,0-8,5.

Осуществление этапа инактивации вируса путем приведения раствора альфа-маннозидазы в контакт с изопропанолом.

Осуществление этапа удаления вируса с применением нанофильтрации.

Выходы и соотношения компонентов продукта для очищенной композиции, включающей альфа- 13 022220 маннозидазу согласно настоящему изобретению, показаны ниже в табл. 1 в сравнении с предыдущими способами, где способ 1 представляет собой предпочтительный в настоящее время способ согласно настоящему изобретению;

способ 2 представляет собой похожий на способ 1 без этапа доочистки. Он также не имеет этапов отмывки, включающих изопропанол для этапа захвата, и имеет меньшее количество отмывок в активном промежуточном этапе, и, наконец, он не имеет этапов инактивации/удаления вируса;

способ 3 представляет собой такой, как описано в документе \УО 02/099092 (без применения мультимодальных лигандов).

Таблица 1

Выходы и чистота, получающиеся в результате прошлых и настоящих процедур очистки

Способ	Общий выход	Общая чистота	% 130 кДа	% 55 кДа	% 75 кДа	Масштаб (объем культуры)
1	70%	99,6%	95,2%	1,5%	2,9%	250 л
2	60-70 %	98,2%	92,1%	2,6%	3,5%	30 л
3	70-80%	80%	<80%	>5%	>5%	1 л

Смотри также пример 10 и фиг. 7.

Пример 2. Этап хроматографического захвата с помощью мультимодального лиганда.

Очищенный неразбавленный сбор, включающий альфа-маннозидазу, связывается путем взаимодействия смешанного типа со смолой по типу мультимодального лиганда, такой как ММС Сар!о™, применяемой в данном примере. Увеличением соли и добавлением этиленгликоля элюируют продукт. Емкость ММС Сар!о™ составляла 260 ед/мл смолы. Стадию захвата осуществляли с помощью следующих этапов:

регенерация колонки 1-2 объемами колонки (СУ) 3 М ЫаС1, рН 10-12 при 300 см/ч, уравновешивание посредством 5 СУ 50 мМ натрий-фосфатного буфера (ЫаРр, 0,15 М ЫаС1 рН 7,5 при 300 см/ч, загрузка очищенного, неразбавленного сбора (проводимость ~15 мСм/см) при 300 см/ч, отмывка 1: 4 СУ равновесного буфера, отмывка 2: 3 СУ 0,95 М ЫаАс, 5% (об./об.) изопропанола, рН 4,9 при 300 см/ч, отмывка 3: 4 СУ равновесного буфера (до стабильного базового уровня, ~0,06 ЕА с 5-мм проточной ячейкой) равновесного буфера при 300 см/ч, элюирование продукта посредством 6 СУ 1,5 М ЫаС1, 40% этиленгликоля в 90 мМ ЫаРк рН 7,7 с максимальным значением 120 см/ч. Начало сбора при увеличении абсорбции (около 10 мЕА от нового базового уровня). Собрать ~4 СУ, регенерировать колонку, как указано выше посредством 3 СУ, с направлением потока вниз, максимальное значение 120 см/ч, очистка на месте (С1Р) и санация предпочтительно с направлением потока вверх посредством 3 СУ Н₂О, 3 СУ 1 М ЫаОН (время контакта ~60 мин), 2-3 СУ фосфатного буфера, рН ~7, 3 СУ 20 мМ фосфата натрия + 20% этанола. Хранение в 20 мМ фосфата натрия + 20% этанола.

Табл. 2 демонстрирует пример схемы очистки. В табл. 3 кратко изложен данный этап. Фиг. 2 демонстрирует пример хроматограммы для данного этапа.

Таблица 2

Схема очистки со стадией захвата: ММС Сар!о™, упакованная в 13,5x2 мл (27 мл) ХК 16 колонке

Этап	Объем (мл)	Активность (ед/мл)	Общая активность (ед)	ОП280, деленная на 1,8	Выход (%)	НСР мкг/мл
Загрузка	439	15	6585 (=244 Ед/мл смолы)
Фильтрат + первая отмывка равновесным (равн,) буфером	560		-37		0.6
0,95 М 19аАс+5% ΙΡΑ, рН 4,9	90		0
Равн. буфер	101	0.3	30		0,5
Элюаг	118	50	5900	2,2	89	28

- 14 022220

Таблица 3

Краткое изложение условий для стадии захвата с ММС Сар!о™

Этап	Буфер	Скорость потока (см/ч)	Объем (СУ)	Направление потока
Регенерация	ЗМЧаС1, рН -11	300	2	вниз
Приведение в	5θΜΜΝβΡί, 150 мМ	300	5	вниз

равновесие	№С1, рН 7,5
Нагрузка	Сбор	300		вниз
Отмывка 1	50 мМ ΝίΡί, 150 мМ ИаС!, рН 7,5	300	4	вниз
Отмывка 2	0,95 М КаАс, 5% ΙΡΑ, рН 4,8	300	3	вниз
Отмывка 3	50мМЫаРт 150 мМ НаС1. рН 7,5	300	4	вниз
Элюирование	90мМК’аР1. 1,5 М ХаС1, 40% ЕО, рН 7,7	<120	6	вниз
Регенерация	2МИаС1, рН~11	120	3	вниз
Промывка	Вода	300	3	вверх
С1Р	1 Μ ΝίιΟΗ	300	3	вверх
Кондиционирование	Фосфатный буфер (КВ по усмотрению)	300	1-3	вверх
Хранение	20 мМ ΝαΡί+20% этанол	100	3	вверх

Пример 3. Хроматографический промежуточной активный этап с помощью гидрофобного взаимодействия.

Продукт из стадии захвата, включающий альфа-маннозидазу, связывается с помощью гидрофобных взаимодействий после добавления сульфата натрия со смолами, действующими по типу гидрофобного взаимодействия, такими как 4 РР Ви1у1 БерЬагоке™, применяемыми в данном примере. Снижением концентрации соли элюируют продукт. Емкость составляла 195 ед/мл смолы. Применяли следующие этапы в промежуточной активной стадии:

регенерация колонки посредством 1 СV 20 мМ натрий-фосфатного (Ν;·ιΡί) буфера, рН 7,5 при 100 см/ч, уравновешивание колонки посредством 5 Ον 0,5 М Ν;·ι₂δΟ₄. 20 мМ Ν;·ιΡί. рН 7,5 при 150 см/ч, смешение пула продуктов из этапа 1 с таким же объемом 20 мМ ΝηΡί, 0,8 М №₂8О₄, рН 7,5 и загрузка этого на колонку при 70 см/ч. Смешивание можно осуществлять поточно или максимум за 3 ч перед началом загрузки. Смесь 1:1 об./об. соответствует приблизительно 1,11:1, вес./вес. (элюат:натриево-сульфатный буфер). При необходимости кондиционированный загружаемый образец следует профильтровать через 0,45-мкм фильтр (гидрофильный РЕ§ или ΡνΌΡ) перед загрузкой, отмывание колонки посредством 3 СV равновесного буфера при 70 см/ч для удаления этиленгликоля, помимо белков клетки-хозяина, из предыдущего этапа, отмывание посредством 3,5 СV 20 мМ Ν;·ιΡί, 1,2 М №-1Ас, рН 7,5 при 100 см/ч, отмывание посредством 3,5 СV 0,6 М Ν;·ιΡί, рН 7,0 при 150 см/ч, элюирование продукта посредством 4 СV 60 мМ Ν;·ιΡί, рН 7,5 при 150 см/ч. Сбор пика от первоначального увеличения абсорбции до достижения базового уровня, ~2 С^, регенерирование колонки посредством 2 ϋν 20 мМ Ν;·ιΡί, рН 7,5 с последующими 3 СV Н₂О при 150 см/ч, очистка и санирование посредством 3 СV 1 М №ЮН (время контакта 60 мин), 1 СV Н₂О, 1-3 СV фосфатного буфера и 2 Ον 20 мМ фосфата натрия + 20% этанола. Хранение в 20 мМ фосфате натрия + 20% этанола.

Табл. 4 демонстрирует пример схемы очистки. В табл. 5 кратко изложен данный этап. Фиг. 3 демонстрирует пример хроматограммы для данного этапа.

- 15 022220

Таблица 4

Схема промежуточной активной очистки с помощью 4РР Ви1у1 ЗерЬагоке™, упакованной в 13,5 смх2 см² (27 мл) ХК 16 колонке

Этап	Объем (мл)	Активность (Ед/мл)	Общая активность(Ед)	ОП 280, деленная на 1,8	Выход (%)	НСР нг/мг
Загрузка	236	23	5413 (=200 ед/мл смолы)
Фильтрат + отмывка равн. буфером	-390	0,3	-100		1,8
1,2 Μ К’аАс, рН 7,5	95	0.5	48		0,8
Ο,όΜΝίιΡί, рН 7,0	97	0,2	19		0,3
Элюат	бб	81	5346	3	98	940

Таблица 5

Краткое изложение условий для этапа с 4РР Ви(у1 ЗерЬагоке™

Этап	Буфер	Скорость потока (см/ч)	Объем (СУ)	Направление потока
Регенерация	20 мМ ΝβΡί, рН 7,5	150	1	вниз
Приведение в равновесие	20 мМ №Р[, 0,5 М сульфат натрия, рН 7,5	150	5	вниз
Загрузка	Кондиционированный элюат Сар1о ММС	70	'6	вниз
Отмывка 1	20 мМ МаРк 0,5 М сульфат натрия, рН 7,5	70	3	вниз
Отмывка 2	20 мМ №Ρί, 1,2 М МаАс, рН 7,5	100	3,5	вниз
Отмывка 3	0,6 Μ ΝηΡι, рН 7,0	150	3,5	вниз
Элюирование	60 мМ ΝβΡί, рН 7,5	150	4	вниз
Регенерация	20 мМ ΝβΡΐ, рН 7,5	150	2	вниз
Промывка	вода	150	3	вверх
С1Р	1 М ИаОН	150	3	вверх

Промывка	вода	150	1	вверх
Кондиционирование	Фосфатный буфер (КВ по усмотрению)	150	1-3	вверх
Хранение	20 мМ №44+20% этанол	150	3	вверх

Пример 4. Хроматографический промежуточный пассивный этап с помощью ионного обмена смешанного действия.

Два элюата, включающих альфа-маннозидазу, из промежуточного активного этапа объединяли в пул и смешивали 1:1 (вес./вес.) с водой для уменьшения проводимости и загружали на ионообменную смолу смешанного действия, такую как в данном примере смолу на основе керамического гидроксиапатита I (СНТ I). Продукт проходит без связывания, в то время как белки клетки-хозяина связываются с колонкой. Собрали фильтрат, содержащий продукт. Емкость составляла 550 ед/мл смолы. Применяли следующие этапы в данном примере промежуточной пассивной стадии:

регенерация колонки посредством 2 С'У 0,6 М Ν;·ιΡί рН 7,0 при 300 см/ч, уравновешивание колонки посредством 5 С'У 60 мМ Ν;·ιΡί, рН 7,5 при 300 см/ч, загрузка кондиционированного элюата из этапа 2 при 300 см/ч и сбор фильтрата, содержащего продукт. Проводимость и рН загружаемого образца будет составлять ~10 мСм/см и 7,3 соответственно. Сбор фильтрата, содержащего продукт, от увеличения ОП от 20 мЕА до возвращения ОП до 20 мЕА, приблизительно объем загрузки и 2 СУ отмывки. На заключительном этапе профильтровать пул продукта через 0,45-мкм гидрофильный РЕЗ или ΡνΌΡ фильтр, промывка колонки посредством 4 СV равновесного буфера при 300 см/ч, регенерация колонки посредством 3 СV 0,6 М Ν;·ιΡί, рН 7,0 при 300 см/ч, очистка и санация посредством 3 СV 1 М №ЮН (время контакта 60 мин), 1 СV 60 мМ Ν;·ιΡί, рН 7,5 и 2 Ον 20 мМ фосфата натрия + 20% этанола. Хранение в 20 мМ фосфата натрия + 20% этанола.

Табл. 6 демонстрирует пример схемы очистки. В табл. 7 кратко изложен данный этап. Фиг. 4 демонстрирует пример хроматограммы для данного этапа.

- 16 022220

Таблица 6

Схема очистки для промежуточной пассивной стадии с помощью СНТ I, упакованной в 10 смх2 см² (20 мл) ХК 16 колонке

Этап	Объем (мл)	Активность (ед/мл)	Общая активность (ед)	ОП 280 деленная на 1,8	Выход (%)	НСР нг/мкг
Загрузка	360	31,6	11390 (=570 Ед/мл смолы)
Фильтрат=отфильтрованный продукт заключительного этапа	392	27,5	10780		95	-500
0,5 Μ Ν₃Ρί	40	0,45	18

Таблица 7

Краткое изложение условий для этапа с СНТ I

Этап	Буфер	Скорость потока (см/ч)	Объем (СУ)	Направление потока
Регенерация	600 мМ ΝίιΡΪ, рН 7,0	300	2	вниз

Приведение в равновесие	60 мМ ΝϋΡί, рН 7,5	300	5	вниз
Загрузка	Бутиловый элюат+НгО	300		вниз
Отмывка 1	60 мМ ΝβΡί, рН 7,5	300	4	вниз
Регенерация	600 мМ ΝαΡί, рН 7,0	300	3	вниз
С1Р	1 М ИаОН	<300	3	вверх
Кондиционирование	ΝηΡι буфер (КВ по усмотрению)	300	1	вверх
Хранение	20 мМ №Ρί+20% этанол	300	3	вверх

Пример 5. Этап инактивации вируса.

Инактивацию вируса можно осуществлять на разных стадиях способа. В данном примере инактивацию вируса осуществляли после промежуточного пассивного этапа и до этапа доочистки. Инактивацию вируса пула промежуточного пассивного этапа, включающего альфа-маннозидазу, получают с помощью 135±15 мин инкубации при 21±5°С с 15% изопропанолом (1:1 смесь с 30% водным раствором изопропанола). Резервуар можно охладить с помощью охлаждающей рубашки при 4°С для поддержания процесса при 21±5°С. Применяли тангенциальную поточную фильтрацию (ТРР) с мембраной из полиэфирсульфона на 100 кДа, 8сгееп А (от [ШПроте или 8айогшк), для удаления изопропанола и замены на натрийфосфатный буфер. В данном примере применяли следующие этапы для инактивации вирусов:

смешение продукта (фильтрат) из промежуточного пассивного этапа с 30% изопропанолом в 60 мМ фосфате натрия, 1:1 (об./об.), что соответствует 1:0:94 (вес./вес.). Смешать, например, с помощью рециркуляционного насоса. Концентрация белка-продукта будет составлять ~0,3-1 мг/мл, инкубация пула растворитель/продукт при комнатной температуре в течение 135±15 мин, уравновешивание ТРР мембраны посредством 60 мМ натрий-фосфатного буфера, концентрирование пула до заданной концентрация 2 мкг/мл (0,5-3 мкг/мл) путем ультрафильтрации при трансмембранном давлении (ТМР) 1,1 бар, при 21±5°С, давлении на входе =~1,4-1,5 бар и давлении на выходе =0,7—0,8 бар, замена ~6 об. путем диафильтрации относительно 60 мМ натрий-фосфатного буфера. Начинать при ТМР 1 бар (1,4 бар на входе/0,6 бар на выходе). После замены первого объема можно увеличить ТМР до 1,1, сбор ретентата. Промывание мембраны 2-3 системными объемами буфера для разведения для удаления слабосвязанного продукта. Сбор данной жидкости для промывки вместе с ретентататом. Конечная концентрация белка-мишени составляет 2 мкг/мл (0,5-3 мкг/мл), очистка мембраны посредством Н₂О с последующим 0,5 М №)ОН (время контакта 60 мин). Хранение в 0,1 М №)ОН.

Табл. 10 демонстрирует условия для этапа инактивации вируса/ТРР.

- 17 022220

Таблица 10

Краткое изложение условий для этапа инактивации вируса/ТЕЕ

Этап	Буфер	Рааб. вес: вес	иг	Г)Р	ТМР бар	комментарий
Старт	30% 1РА/ 70% ИаР!	1,94х				135±15 мин, КТ (комнатная температура)
Приведение в равновесие	ΝαΡί
иг			~5х		1,1 (1,5 на входе/0,7 на выходе)	Концентрировать до 2 мкг/мл (0,5-3 мкг/мл), расход —100-65 л/м²/ч
ЭР	ΝαΡί			6х	1,0-1,1 (1,5 на входе/0,7 на выходе)	Первый объем при более низком ТМР (1,4 на входе /0,6 на выходе), затем увеличить до ТМР 1,1, расход -65-100 л/м²/ч
Системная отмывка	Ν3Ρί					2 системных объема, объединить с ретентатом до заданной концентрации 2 мкг/мл (0,5-3 мкг/мл).
Промывка	вода
С1Р	0,5-1 ММаОН
Хранить	0,1 МИаОН

№Р1= 60 мМ фосфата натрия, рН 7,5.

Пример 6. Этап хроматографической доочистки с помощью анионного обмена.

Проводимость ретентата, включающего альфа-маннозидазу, из промежуточной пассивной стадии уменьшали путем разбавления в 6 раз буфером для кондиционирования (20 мМ Трис-НС1, 10 мМ ЫаС1, 75 мМ маннит, 0,005% 1мееп™ 80, рН 7,5) для того, чтобы связать с помощью ионного взаимодействия с анионообменной смолой, такой как в данном примере высокоэффективной сильной анионообменной смолой на основе четвертичного аммония (смола О ЗераЬгоке™ НР). Ретентат либо разбавляли прямо перед нагрузкой, либо путем поточного разбавления. Продукт элюировали в контейнер, предварительно наполненный 1СУ элюирующего буфера, путем добавления хлорида натрия.

Емкость составляет 400 ед/мл смолы. В данном примере для стадии доочистки применяли следующие этапы:

регенерирация колонки посредством 1 СУ 50 мМ ЫаРц 1 М хлорида натрия, рН 7,5 при 120 см/ч, уравновешивание колонки посредством 5 СУ 20 мМ Трис-НС1, 10 мМ хлорида натрия, рН 7,5 при

120 см/ч, загрузка разбавленного ретентата из этапа 4 при 120 см/ч, промывка колонки посредством 5 СУ равновесного буфера и 1 СУ 20 мМ фосфата натрия, рН 7,5 при 120 см/ч, элюирование продукта посредством 4 СУ 50 мМ фосфата натрия, 0,2 М хлорида натрия, рН 7,5 при 120 см/ч в предварительно наполненный (1 СУ элюирующего буфера) контейнер. Сбор пика от первоначального увеличения (начать собирать при 10-20 мЕА) абсорбции до 30-50 мЕА (2 мМ проточная ячейка), 0,5-1,5 СУ, регенерация колонки посредством 3 СУ 50 мМ №Рк 1 М хлорида натрия, рН 7,5 при 120 см/ч, очистка и санирование посредством 3 СУ 1 М ЫаОН (время контакта 60 мин) и 3 СУ 10 мМ ЫаОН.

Хранение в 10 мМ ЫаОН.

Табл. 8 демонстрирует пример схемы очистки. В табл. 9 кратко изложен данный этап. Фиг. 5 демонстрирует пример хроматограммы.

Таблица 8

Пример схемы очистки для этапа доочистки с помощью смолы 0 ЗерЬагоке™ НР 19 смх2 см² (38 мл)

Этап	Объем (мл)	Активность (ед/мл)	Общая активность (ед)	ОП 280, деленная на 1,8	Выход (%)	НСР нг/мкг
Загрузка	1095	9,6	10500 (=276 ед/мл смолы)
Фильтрат	-1300	0,07	-90		-1
20 мМ натрийфосфатный промывочный раствор	75	1,7	127		-1
Элюат	69 (=49 мл элюата+20 мл предварительного наполнения	145	10024	5.3	95,5

- 18 022220

Таблица 9

Краткое изложение условий для этапа с О 8ерЬагоке™ НР

Этап	Буфер	Скорость потока (см/ч)	Объем (СУ)	Направление потока
Регенерация	50 мМ ΝβΓ’ι, 1МКаС1 рН7,5	120	1	вниз
Приведение в равновесие	20 мМ Трис-НС1, 10 мМ №С! рН 7,5	120	5	вниз
Загрузка	Кондиционированный ретентат, этап 4	120		вниз
Отмывка	20 мМ Трис-НС1, 10 мМ ИаС1 рН 7,5	120	5	вниз
Отмывка	20 мМ ΝβΡϊ, рН 7,5	120	1	вниз
Элюирование в предварительно наполненный резервуар	50 мМ ΝβΡΐ, 0,2 М ΝβΟΙ, рН 7,5	120	4	вниз
Регенерация	50μΜΝ<ιΡϊ, 1М№С1 рН 7,5	120	3	вниз
СП>	1 М КаОН	120	3	вверх
Хранение	ЮмМИаОН	300	3	вверх

Пример 7. Этап сокращения количества вируса.

Сокращение количества вируса можно осуществлять на разных стадиях способа. В данном примере сокращение количества вируса осуществляли после этапа доочистки. Элюат из этапа доочистки после предварительной фильтрации через 0,1 мкм подвергают нанофильтрации через фильтр Р1апоуа™ 15Ν. Применяли следующие этапы:

элюат из этапа доочистки предварительно фильтруют через 0,1-мкм фильтр. Фильтр промывают небольшим объемом 50 мМ фосфата натрия, 0,2 М хлорида натрия, рН 7,5 для удаления слабосвязанного продукта, элюат фильтруют при давлении 0,8 бар, при комнатной температуре. За фильтрацией следует последующая отмывка приблизительно тремя объемами системы Р1апоуа 15 посредством 50 мМ фосфата натрия, 0,2 М хлорида натрия, рН 7,5.

Пример 8. Состав и хранение.

При тангенциальной поточной фильтрации (ТРР) с мембраной из полиэфирсульфона, 8сгееп А, на 100 кДа (8айогш5™ или МПНроге™) меняют буфер на буферную смесь. Резервуар можно охладить с помощью охлаждающей рубашки при 4°С для поддержания процесса при 21±5°С. Рассчитанная емкость составляет 100 л/м². Применяли следующие стадии для составления и хранения:

уравновешивание мембраны 3,5 мМ №-ьНРО₄. 0,17 мМ ΝβΗΓΟ^ 250 мМ маннита, 27 мМ глицина, рН 7,7 (буферная смесь), разбавление очищенного продукта, включающего альфа-маннозидазу, приблизительно 1 об. буферной смеси до заданной концентрации 2-3 мкг/мл. Если концентрация белка в продукте низкая, можно (но не обязательно) концентрировать до 4-6 мкг/мл для уменьшения объема перед разбавлением буферной смесью, концентрирование —дважды до заданной концентрации 6 мкг/мл путем ультрафильтрации при ТМР 0,8 и при 21±5°С, замена 6 об. путем диафильтрации против буферной смеси при ТМР 0,8, 21±5°С, концентрирование —1,5 раза путем ультрафильтрации и сбор ретентата. Промыть мембрану 1 системным объемом буферной смеси для удаления слабосвязанного продукта. Собрать полученный в результате промывки раствор вместе с ретентатом. Альтернатива заключается в измерении ОП 280 в полученном в результате промывки растворе и пуле, только если он содержит продукт. Конечная заданная концентрация белка составляет 7±2 мкг/мл, очистка мембраны посредством Н₂О с последующим 0,5 М №ЮН (время контакта 60 мин). Хранить в 0,1 М №ОН.

- 19 022220

Таблица 11

Краткое изложение условий для этапа составления с ТРР

Этап	Буфер	иг/пг коэффициент разбавления	Заданная КОНЦ. (мкг/мл)	ТМР (бар)	комментарий
Разбавление продукта этапа 6	Буферная смесь	2	2-3		если конц. белка составляет <4 мкг/мл в продукте этапа 6, можно ввести Цр этап перед разбавлением.
Приведение в равновесие	Буферная смесь
цр		2	6±2	0,8	1,1 бар на входе/0,5 бар на выходе
ЭР	Буферная смесь	6±2	6±2	0,8
цр		-1,5	7±2		Собрать ретентат
Системная отмывка	Буферная смесь	1 системный объем	7±2 при объединении с ретентатом	Собрать и объединить с ретентатом, если белок
Промывка	вода
С1Р	0,5-1 М №ОН
Хранить	0,1 М №011

Продукт разбавляли до 5 мкг/мл и стерильно фильтровали. Наполняли бутылки профильтрованным лекарственным веществом и замораживали.

Пример 9. Способ периодического культивирования для альфа-маннозидазы.

После оттаивания клеток размножали клетки во встряхиваемых колбах в 10-л биореакторе для выращивания посевного материала и 50-л биореакторе для выращивания посевного материала перед их перемещением в продукционный биореактор (250 л). В день инокуляции продукционного биореактора плотность клеток в 50-л биореакторе для выращивания посевного материала составляла 2-2,5 ΜУС/мл. Клетки инокулировали в продукционный реактор из биореактора для выращивания посевного материала при плотности клеток 0,5 ΜУС/мл, так что объем клеточной суспензии составил 100 л по завершении инокуляции. День инокуляции называют день 0, день после называют день 1 и так далее. От дня 1 до конца серии опытов ежедневно добавляли питательную среду с увеличением объема согласно определенной заранее норме (смотри ниже). От дня 1 до конца серии опытов ежедневно добавляли глутамин и глюкозу с увеличением объема согласно определенным заранее нормам и правилам (смотри ниже). Когда плотность жизнеспособных клеток составляла > 2,2 ΜУС/мл или в день 3, что наступит раньше, температуру снижали до температуры продуцирования.

Таблица 12

Фактические температуры и экспериментальные условия

ПО (%)	40 ±5
рН от дня 0 до дня 2 (*)	от 6,60 и до 6,05
рН от дня 3 до конца	6,9 ± 0,05
Температура (°С) А) сдвигается к В), когда выполняются условия сдвига температуры	А) 36,5 ±0,5 -> В) 31,0± 0,5
Условия сдвига температуры	Су > 2,2 МУС/мл или день 3 (что наступит раньше)
Скорость встряхивания (об/мин) следует отрегулировать согласно предыдущему опыту с продукционным биореактором	предложение: 45 об/мин, толерантность клеток к механическому раздражению должна быть нормальной для СНО клеток при 31'С (не тестировалось)
Плотность жизнеспособных клеток при инокуляции, (МУС/мл), в день 0	0,5 ±0,1
Макс. рСО, в уровне жидкой фазы	не известно, ориентировочно 18 кПа
Подача питательной среды, глутамина и глюкозы	Смотри текст ниже
Глюкоза-мишень в культуре (мМ)	6 [5,5 9,01
Глутамин мишень в культуре (мМ)	2мМ Д1-ДЗ, 1мМ Д4 и дальше
Условия сбора	день 18-21 или жизнеспособность <65%,

- 20 022220

	что наступит раньше
Рабочий объем (л): первоначальный -> конечный	100 приблизительно 200
Щелочь, добавленная для контроля рН	0,5МЧа₂СОз
Разбавление инокулируемого клеточного бульона из биореактора для выращивания посевного материала в продукционном биореакторе после завершения инокуляции больше чем	4
Критерии размноженных клеток в биореакторе для выращивания посевного материала при инокуляции продукционного биореактора
Минимальная плотность клеток (МУС/мл)	2,0
Максимальная плотность клеток (МУС/мл)	2,5
Миллионов жизнеспособных клеток	от 44 до 56
Жизнеспособность	> 93 %

Периодическое культивирование биореакторе для выращивания посевного материала на 50 л перед инокуляцией продукционного биореактора не дольше чем (часы) (*) Между днем 0 и днем 2 только СО₂ автоматически добавляли путем контроля рН. Щелочь не добавляли, если рН не был < 6,60.

Основная среда.

АСР среда (ЕхСе11302, ЗАРС), дополненная 2 мМ глутамином и содержащая 11,1 мМ (2 г/л) глюкозы. Основную среду без глутамина можно переносить в продукционный биореактор вплоть до 3 дней и хранить при 36,5°С, т.е. в течение тестирования биореактора на стерильность. В противном случае среду хранят при 4°С.

Питательные среды.

Питательная среда, Е35, представляла собой 35% СНО СО ЕГйаеп! Рееб В (кат. номер ШУЬгодеп ЗКи# А10240-01) питательный концентрат, разбавленный в АСР среде без глутамина и содержащий 11,1 мМ глюкозы. Питательную среду хранили в темноте при 4°С. Питательная среда может находиться в темноте в течение вплоть до 96 ч, т.е. четыре дня при комнатной температуре в течение культивирования.

Таблица 13

Объем питательной среды, добавляемый в день

Дни	0	от 1 до 5
Добавляемый объем /день в (л)	0	12

Добавки.

a. Исходный раствор 2500 мМ глюкозы.

b. Исходный раствор 200 мМ глутамина.

c. Щелочь 0,5 М №ьСО₃.

Доставка питательной среды, глюкозы и глутамина.

Питательную среду накачивали ежедневно с увеличением объема. Глюкозу и глутамин добавляли ежедневно для поддержания их концентраций в пределах данных целевых значений путем добавления с увеличением объема исходных растворов глюкозы и глутамина в количествах, согласно нижеуказанным.

Правила добавления глутамина:

от дня 1 до дня 3: добавлять объем исходного раствора глутамина, так чтобы концентрация глутамина в биореакторе составляла 2 мМ, от дня 4: добавлять объем исходного раствора глутамина, так чтобы концентрация глутамина в биореакторе составляла 1 мМ.

Правила добавления глюкозы:

от дня 0 дня 8: не добавлять исходный раствор глюкозы, от дня 9, если концентрация глюкозы в продукционном биореакторе < 8 мМ, добавить объем исходного раствора глюкозы, так чтобы концентрация глюкозы в биореакторе составляла 8 мМ.

- 21 022220

Обзор способа.

Таблица 15

Обзор способа культивирования день за днем

День	Действие
-3 или -2	Стерилизация биореактора и наполнение АСР средой без глутамина в объеме 75 л или минимальном объеме для покрытия проб (в случае, если это составляет больше 75 л) Калибровка ΌΟ пробы
0	a) Счет размноженных клеток в экспоненциальной фазе роста из 50 л биореактора для выращивания посевного материала и выполнение критериев для инокуляции b) Удаление АСР среды из продукционного биореактора, если объем составляет > 75 л. Стабилизация среды в продукционном биореакторе при заданных значениях рН и температуры в течение по меньшей мере 45 мин и добавление глутамина для получения конечной концентрации глутамина 2 мМ в 100 л среды. Глутамин, присутствующий в клеточном бульоне из 50 л биореактора для выращивания посевного материала, не принимают во внимание. c) Перенос клеточного бульона из 50 л биореактора для выращивания посевного материала в продукционный биореактор ά) Доведение объема до 100 л клеточной суспензии в продукционном биореакторе е) Стабилизация в течение ~ 1 ч (от 45 мин. и до 2 ч 30 мин.) и отбор образцов для счета клеток, определения рН, и параметров метаболизма

от 1 до 2	Счет клеток, отбор образцов, подача питательной среды, подача глюкозы и глутамина рН контролируют от 6,60 и до 6,95 автоматическим добавлением СО2 (избегать добавление щелочи)
3	Счет клеток, отбор образцов, подача питательной среды, подача глюкозы и глутамина рН, контролируемый в заданном значении 6,9 ± 0,05 автоматическим добавлением СО₂ или щелочи Снижение температуры до ЗРС, когда или: 1) плотность жизнеспособных клеток достигла 2,2 МУС/мл или 2) в день 3
от 4 до 17	Счет клеток, отбор образцов, подача соответствующей питательной среды, подача глюкозы и глутамина
18-21 или жизнеспособность <65%	Сбор

Пример 10. Характеристика очищенного продукта, включающего альфа-маннозидазу.

Табл. 16 ниже демонстрирует, как схема очистки настоящего изобретения обеспечила альфаманнозидазу с высокой долей 130 кДа разновидности гликопротеина по сравнению с продуктами распада 75 и 55 кДа соответственно. В ней также продемонстрировано, как 250-л способ с применением 4этапного способа очистки с улучшенными этапами отмывки как для этапа захвата, включающего мультимодальные лиганды, так и для промежуточного активного этапа, а также этапа доочистки с помощью 0 δерЬа^О5е НР, осуществлен лучше, чем 30-л способ с применением 3-этапного способа в отношении как выхода, общей чистоты, так и выхода 130 кДа разновидности.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ очистки рекомбинантной альфа-маннозидазы из культуры клеток, где фракцию указанной культуры клеток, включающую рекомбинантную альфа-маннозидазу, подвергают хроматографии на смоле, включающей мультимодальный лиганд.
2. Способ по п.1, где указанная фракция культуры клеток, включающая рекомбинантную альфаманнозидазу, представляет собой осветленный неразбавленный сбор.
3. Способ по любому из пп.1, 2, где указанный мультимодальный лиганд, связанный со смолой, представляет собой вещество с группой карбоновой кислоты или группой сульфоновой кислоты.
4. Способ по любому из пп.1-3, где мультимодальный лиганд, связанный со смолой, представляет собой вещество формул (I), (II) или (III) где К веществ формул (II) и (III) представляет собой функциональную группу формулы (IV)
5. Способ по любому из пп.1-4, где фракцию указанной культуры клеток, загруженную на смолу, включающую мультимодальный лиганд, подвергают по меньшей мере одной стадии отмывки раствором, включающим изопропанол, предпочтительно по меньшей мере 1% (об./об.) изопропанола, как, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 4,5% (об./об.) изопропанола, предпочтительно по меньшей мере 5% (об./об.) изопропанола.
6. Способ по любому из пп.1-5, где первый элюат, включающий рекомбинантную альфаманнозидазу, элюируют со смолы, включающей мультимодальный лиганд, с помощью водного раствора, включающего этиленгликоль или пропиленгликоль.
7. Способ по любому из пп.1-6, где первый элюат, включающий альфа-маннозидазу, полученный со смолы, включающей мультимодальный лиганд, дополнительно подвергают способу, включающему стадии, на которых:

ί) наносят фракцию, включающую альфа-маннозидазу, на смолу для хроматографии с гидрофобным взаимодействием с получением элюата, включающего рекомбинантную альфа-маннозидазу;

ίί) пропускают фракцию, включающую альфа-маннозидазу, через ионообменную смолу смешанного действия для удерживания загрязняющих примесей с получением фильтрата, включающего рекомбинантную альфа-маннозидазу;

ш) подвергают фракцию, включающую альфа-маннозидазу, хроматографии на анионообменной смоле с получением элюата, включающего рекомбинантную альфа-маннозидазу.
8. Способ по любому из пп.1-7, где альфа-маннозидаза имеет последовательность, выбранную из:

A) последовательности, изложенной в 5>Е0 ГО N0: 2;

B) аналога последовательности в А);

C) подпоследовательности последовательности в А) или В).
9. Композиция, включающая альфа-маннозидазу, получаемую посредством способа очистки по любому из пп.1-8.
10. Способ периодического или непрерывного получения рекомбинантной альфа-маннозидазы, включающий следующие стадии, на которых:

а) инокулируют промышленный реактор, включающий основную среду, клетками, способными продуцировать рекомбинантную альфа-маннозидазу, в день 0 с получением культуры клеток;

- 24 022220

b) добавляют питательную среду к указанной культуре клеток по меньшей мере один раз от дня 1;

c) корректируют температуру указанной культуры клеток до самое большее 35°С, как, например, 34, 33, 32°С, предпочтительно самое большее 31°С, либо после дня 3, либо когда плотность жизнеспособных клеток будет выше 2,1 млн жизнеспособных клеток/мл, в зависимости от того, что наступит раньше;

ά) осуществляют способ очистки по любому из пп.1-8.
11. Применение композиции по п.9 для получения лекарственного препарата для лечения альфаманнозидоза.
12. Способ лечения альфа-маннозидоза и/или уменьшения или облегчения симптомов, связанных с альфа-маннозидозом, причем указанный способ включает стадию, на которой вводят композицию, включающую очищенную рекомбинантную альфа-маннозидазу по п.9 субъекту, нуждающемуся в этом.