CN102834111B

CN102834111B - 用于生产和纯化重组溶酶体α-甘露糖苷酶的方法

Info

Publication number: CN102834111B
Application number: CN201180010683.3A
Authority: CN
Inventors: 延斯·福格; 克拉斯·安德松; 塞西利亚·魏格尔特; 皮亚·许登; 海伦娜·雷乌特瓦尔; 斯特凡·尼尔松
Original assignee: Zymenex AS
Current assignee: Italy Casey Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: KR101856260B1; NO2018032I1; EA022220B1; HUS1800037I1; CN102834111A; LTPA2018512I1; US20180036387A1; CA2790786A1; CA2790786C; CY1123438T1; NO2538968T3; NL300948I2; HUE037943T2; EP3281636B1; SI2538968T1; HK1179869A1; PL2538968T3; AU2011220163A1; US8974780B2; ES2652330T3

Abstract

本发明涉及一种用于纯化重组α-甘露糖苷酶的方法、一种用于生产α-甘露糖苷酶的方法、一种包含α-甘露糖苷酶的组合物、这种组合物作为药物的用途、作为治疗α-甘露糖苷贮积症的药物的用途以及一种治疗α-甘露糖苷贮积症和/或减轻与α-甘露糖苷贮积症相关的症状的方法。

Description

用于生产和纯化重组溶酶体α-甘露糖苷酶的方法

技术领域

背景技术

α-甘露糖苷贮积症

α-甘露糖苷贮积症是世界范围以1/1,000,000和1/500,000之间的频率发生的一种隐性常染色体疾病。甘露糖苷贮积症存在于欧洲、美洲、非洲以及还有亚洲的全部人种类别中。它在对于溶酶体贮积病具有良好诊断服务的所有国家中以相似的频率检测到。他们出生时是表面上健康的，然而本病的症状是进行性的。α-甘露糖苷贮积症显示出临床异质性，范围从十分严重至十分轻微的形式。常见临床症状是：精神发育迟滞、骨骼变化、导致反复感染的受损免疫系统、听力损害，并且本病经常与典型面部特征（如粗糙的脸部、凸出的前额、扁平的鼻梁、小鼻和阔嘴）相关。在最严重的病例（甘露糖苷贮积症I型）中，儿童患有肝脾肿大，并且它们在生命第一年期间死亡。这种早期死亡可能由归因于免疫缺损的重度感染引起，所述免疫缺损由本这种疾病引起。在较轻微的病例（甘露糖苷贮积症2型）中，患者通常达到成年年龄。患者的骨骼虚弱导致在年龄20至40时需要轮椅。这种疾病引起弥散性脑功能障碍，经常导致仅存最基本的简单阅读和写作技能的弱心智能力。与听力下降（hearing inability）和其他临床表现相关的这些问题使患者不能独立生活，结果就是需要终生护理。

α-甘露糖苷贮积症

α-甘露糖苷贮积症因溶酶体α-甘露糖苷酶（LAMAN,EC3.2.1.24）的缺陷活性引起。这种疾病以甘露糖寡糖大量胞内积累为特征，所述甘露糖寡糖是在其非还原末端携带α1,2-、α1,3-和α1,6-甘露糖基残基的寡糖。这些寡糖主要源自带有N联寡糖的糖蛋白的溶酶体内降解。然而，一些寡糖源自多萜醇联寡糖的代谢并源自错误折叠的糖蛋白，这些错误折叠的糖蛋白被再引导至细胞溶胶由蛋白酶体降解（Hirsch等人,EMBO J.22,1036-1046,2003和Saint-Pol等人,生物化学杂志（J Biol Chem.）274,13547-13555,1999）。在类型广泛的细胞类型和组织（包括在全部脑区域内的神经元）中观察到溶酶体贮积。LAMAN是一种外切糖苷酶，它在顺序降解N联糖蛋白期间从非还原性末端水解α-D-甘露糖苷中的这些末端非还原性α-D-甘露糖残基（Aronson和Kuranda美国实验生物学会联合会杂志（FASEB J）3:2615-2622.1989）。这种人前体酶作为1011个氨基酸的单一多肽（包括49个残基的信号肽）合成。该前体经蛋白酶解加工成15kD、42kD和70kD三种主要糖肽以在溶酶体中变成成熟酶。70kD糖肽进一步加工成由二硫键连接的3个亚基。（Berg等人,分子基因和新陈代谢（Mol.Gen.and Metabolism）73,18-29,2001,Nilssen等人,人类分子遗传学（Hum.Mol.Genet.）6,717-726.1997）。

溶酶体α-甘露糖苷贮积症基因

编码LAMAN（MANB）的基因位于第19号染色体（19cen-q12）处（Kaneda等人,染色体(Chromosoma)95:8-12.1987）。MANB由24个外显子组成，覆盖21.5kb（GenBank登录号U60885-U60899；Riise等人,基因组(Genomics)42:200-207,1997）。LAMAN转录物是》3,500个核苷酸（nt）并且含有编码1,011个氨基酸的可读框（GenBank U60266.1）。

编码LAMAN的人cDNA的克隆和测序已经在三篇论文中发表（Nilssen等人,人类分子遗传学（Hum.Mol.Genet.）6,717-726.1997；Liao等人,生物化学杂志（J.Biol.Chem）.271,28348-28358.1996；Nebes等人,生物化学生物物理学研究通讯（Biochem.Biophys.Res.Commun.）200,239-245.1994）。有趣地，这三个序列不是相同的。与Nilssen等人的序列（登录号U60266.1）相比时，Liao等人和Nebes等人发现在位置1670和1671处导致缬氨酸至天冬氨酸置换的TA至AT变化。另外，发现了在位置1152处不引起氨基酸序列任何变化的C至A变化。

诊断

α-甘露糖苷贮积症的诊断目前基于临床评价、检测尿中的甘露糖寡糖和直接测量多种细胞类型如白细胞、成纤维细胞和羊水细胞中的α-甘露糖苷酶活性（Chester等人,引自：Durand P，O’Brian J（编著）糖蛋白代谢的遗传错误（Genetic errors of glycoprotein metabolism）Edi-Ermes,米兰（Milan）,第89-120页,1982；Thomas和Beaudet.引自：Scriver CR,Beaudet AL,Sly WA,Valle D（编著）遗传病的代谢和分子基础（The metabolic and molecular basesof inherited disease）.第5卷McGraw-Hill,纽约（New York）,第2529-2562页1995）。

因为症状起初经常是轻微的并且生物化学诊断是困难的，所以诊断往往在疾病过程的晚期作出。显然患者和他们的家人将从早期诊断中大幅度获益。

动物模型

α甘露糖苷贮积症已经在牛（Hocking等人,生物化学杂志（Biochem J）128:69-78.1972）、猫（Walkley等人,美国科学院院刊（Proc.Nat.Acad.Sci.）91:2970-2974,1994）和豚鼠（Crawley等人,儿科研究（Pediatr Res）46:501-509,1999）中描述。小鼠模型最近通过定向破坏α-甘露糖苷酶基因产生（Stinchi等人,人类分子遗传学（Hum Mol Genet）8:1366-72,1999）。

如同人α甘露糖苷酶中那样，似乎由编码溶酶体α-甘露糖苷酶的基因中的特定突变引起。Berg等人（生物化学杂志（Biochem J.）328:863-870.1997）报道了猫肝脏溶酶体α-甘露糖苷酶的纯化和其cDNA序列的测定。活性酶由3条多肽组成，分子质量据报道是72、41和12kD。与人酶相似，证实了猫酶作为单链前体合成，所述单链前体具有50个氨基酸的推定性信号肽，后续一条957个氨基酸的多肽链，这条多肽链切割成成熟酶的3条多肽。推导的氨基酸序列与人序列和牛序列分别相同81.1%和83.2%。在患病的波斯猫中鉴定到一个4-bp缺失；这个缺失导致从密码子583的移码和在密码子645处提前终止。可能在猫的肝脏检测不到酶活性。表现较轻微表型的家养长毛猫具有正常者的2%酶活性；这种猫没有这个4-bp缺失。Tollersrud等人（欧洲生物化学杂志（Eur J Biochem）246:410-419.1997）纯化了牛肾酶至均一并且克隆了该基因。该基因以涵盖16kb的24个外显子组织起来。基于基因序列，他们鉴定出牛中的两个突变。

α-甘露糖苷贮积症疗法的医学需求

鉴于因富含甘露糖的寡糖积累产生的严重临床表现，充分认识到缺少α-甘露糖苷贮积症的有效疗法。目前，治疗这种疾病的主要治疗选项是骨髓移植，然而，本发明的目标是促进酶替换疗法作为一项有潜力的未来替代物。

骨髓移植

在1996年，Walkley等人（美国科学院院刊（Proc.Nat.Acad.Sci）.91:2970-2974,1994）发表一篇关于3只患有露糖苷贮积症的小猫的论文，所述小猫在1991年用骨髓移植（BMT）治疗。在处死的2只动物中，不仅在身体内，更重要地，还在脑内见到正常化。第三只在6年后完好无损。通常，未治疗的猫在3-6月死亡。在1987年，一名患有甘露糖苷贮积症的儿童用BMT治疗（将等人,Arch Dis Child 1987年10月；62（10）:1044-9）。他在18周后因而方法相关的并发症死亡。在脑中，发现很少酶活性。这个令人沮丧的结果可以由死亡前重度免疫抑制性治疗或在BMT后酶活性花费长时间在脑内增加来解释。供体是母亲（其作为携带者预期必须具有小于50%的酶活性）或可能是在男性中的BMT对脑内的酶功能没有影响。尽管获得可变的结果，骨髓移植的少量尝试已经因而表明，成功的植活可以纠正α-甘露糖苷贮积症的临床表现，至少部分如此。然而，在人疗法中采用骨髓移植时减少方法相关的严重并发症的难题仍待解决。

酶替换疗法

在发现溶酶体贮积疾病时，提出了可能通过酶置换法治疗这种疾病的希望。酶替换疗法已经证明在戈谢病（Gaucher disease）中有效。当外源溶酶体葡糖脑苷脂酶注射入患者时，这种酶由酶缺陷细胞摄入（Barton等人,新英格兰医学期刊（N Engl J Med）324:1464-1470）。此类摄入受细胞表面上的某些受体（例如在细胞表面上几乎普遍存在的甘露糖-6-磷酸受体）和限于某些细胞类型如单核细胞/巨噬细胞细胞系的细胞和肝细胞的其他受体（如脱唾液酸糖蛋白受体和甘露糖受体）调节。酶的细胞摄入因此严重依赖于其糖基化概况（glycosylation profile）。如果恰当地设计，可以通过按照与糖尿病患者接受胰岛素的相同方式定期注射外源酶，替换缺陷酶。将纯化的活性溶酶体α-甘露糖苷酶添加至酶缺陷性成纤维细胞培养基的体外研究显示纠正溶酶体底物积累。另一方面，体内治疗已经部分地受阻于产生足量酶的问题（这归因于困难的大规模生产和纯化方法）和因针对外源酶的免疫反应产生的并发症。

然而，最重要地，特殊考虑事项相对于具有主要神经学组分的溶酶体贮积疾病如α-甘露糖苷贮积症适用，其中临床表现与中枢神经系统内溶酶体贮积增加相关。因而，酶替换疗法未曾证明有效对抗戈谢病（Gaucher disease）的急性神经病变形（Prows等人,美国医学遗传学杂志（Am J Med Genet）71:16-21）。

递送治疗性酶类至脑受无法转运这些大分子透过血脑屏障阻碍。从必须绕过血脑屏障以便在脑中实现治疗药作用的共识中，已经构思了使用众多不同的递送系统。这些包括侵入性技术如采用例如山梨醇的血脑屏障的渗透开口和非侵入性技术如受体介导的嵌合酶内吞。由于预期酶替换需要定期地施用酶，应当避免侵入性技术的使用。非侵入性技术的用途仅最近才在动物模型中提供有希望的结果（对于α-甘露糖苷贮积症，见下文，对于其他溶酶体病症，见例如：Grubb等人,PNAS 2008,105(7)第2616-2621页）。已经构思在内脏器官和在脑膜中减少的贮积可能减少运送至脑的寡糖的量。然而，此类考虑没有考虑到适用于其中神经学损伤是主要和严重的溶酶体病症（Neufeld,E.F.酶替换疗法（Enzyme replacement therapy）,引自“脑的溶酶体病症（Lysosomal disordersof the brain）”（Platt,F.M.Walkley,S.V:编著，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)）。

然而，如Roces等人,人类分子遗传学（Human Molecular Genetics）2004,13（18）第1979-1988页,Blanz等人,人类分子遗传学（Human MolecularGenetics）2008,17（22）第3437-3445页和WO98/07409中所述，已经证明，可以使用例如包含α-甘露糖苷酶的制剂的静脉内注射，增加动物的中枢神经系统内LAMAN的水平，从而减少中枢神经系统的一个或多个区域内富含中性甘露糖的寡糖的胞内水平。这表明重组α-甘露糖苷酶在α-甘露糖苷贮积症患者的酶替换疗法中有用。因而，对于使用酶替换法提供α-甘露糖苷贮积症的高效治疗的一个剩余主要障碍是以有成本效率的方式提供足够量的纯重组α-甘露糖苷酶。

α-甘露糖苷酶的产生和纯化

WO 02/099092公开了一种在中华仓鼠卵巢细胞（CHO cell）中于37℃使用无血清培养基的rhLAMAN的小规模生产方法。还描述了一种小规模纯化方法，包括透滤粗制酶和在捕获步骤中使用二乙胺基乙基纤维素（DEAE）琼脂糖凝胶FF柱的弱阴离子交换层析，随后是众多层析纯化步骤，包括疏水相互作用层析和混合模式层析。

WO 05/094874公开了一种在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中于37℃使用无血清培养基的rhLAMAN的小规模生产方法。还描述了与WO 02/099092的一种方法类似的一种小规模纯化方法。

WO 05/077093描述了高度磷酸化的溶酶体酶的制造。在实施例IV中，描述了使用多模态树脂（蓝色琼脂糖凝胶(blue-sepharose)）的用于酸性α-葡糖苷酶（GAA）的纯化方法。GAA，虽然是一种溶酶体酶，然而与rhLAMAN完全不同。GAA是高度磷酸化的，而rhLAMAN具有低程度的磷酸化。另外，在GAA和rhLAMAN之间的序列同一性评分小于12%，并且最终，它们的理论等电点相差多于一个pH单位（分别是5.42和6.48）。因而，如WO 05/077093中所述的纯化GAA的方法不适用于rhLAMAN。

已经公开了一种在CHO细胞中使用0.25%（V/V）血清和DMSO添加物的rhLAMAN的小规模生产方法（Berg等人,分子遗传学和新陈代谢（Molecular Genetics and Metabolism）,73,第18-29页,2001）。还描述了两种纯化工艺，包括a）一个超滤、阴离子交换层析和凝胶过滤的三步骤方法或b）单步骤免疫亲和层析法。还公开方法a）怎样导致130kDa酶完全片段化成55kDa和72kDa片段，而方法b）怎样导致130kDa前体部分地片段化成明显量的55kDa和72kDa片段。

因而，用于生产和纯化重组α-甘露糖苷酶的改进方法将是有利的。具体而言，用于大规模培养能够表达α-甘露糖苷酶的细胞系的改进方法和用于从细胞培养物中分离具有高度酶活性的纯α-甘露糖苷酶的更高效的大规模纯化方法将是有利的。

发明简述

因而，本发明的目的涉及重组α-甘露糖苷酶的生产和纯化方法。

具体而言，本发明的目的是提供一种可扩展的生产和纯化方法，所述方法通过提供足够量的具有高度酶活性的高纯度α-甘露糖苷酶解决以上提到的现有技术问题，从而为患有α-甘露糖苷贮积症的患者提供一种疗法。

因而，本发明的一个方面涉及一种用于从细胞培养物中纯化重组α-甘露糖苷酶的方法，其中包含重组α-甘露糖苷酶的细胞培养物部分在包含多模态配体的树脂上经历层析。本发明人令人惊讶地发现这种纯化方法产生组合物，所述组合物包含与先前所实现相比具有更高纯度和更高百分数所需130kDa糖蛋白种类的重组α-甘露糖苷酶。在纯化后实现持续的高百分数（如多于80%）的非片段化的130kDa糖蛋白是有利的，因为这提供了与片段化酶相比更均一的产物，这转而增强获得药用级产物的能力。

本发明的另一个方面涉及一种用于分批补料生产或连续生产重组α-甘露糖苷酶的方法，包括以下步骤：

a.在第0日用能够产生重组α-甘露糖苷酶的细胞接种包含基础培养基的生产反应器以提供细胞培养物；

b.从第1日添加进料培养基至所述细胞培养物至少一次；

c.在第3日后或在活细胞密度高于2.1MVC/mL时，以先到者为准，调节所述细胞培养物的温度最多到35℃，如34℃、33℃、32℃、优选地最多31℃。

本发明人令人惊讶地发现以上生产方法以高产率产生包含重组α-甘露糖苷酶的细胞培养物，所述细胞培养物在无任何稀释的情况下轻易地转移至本发明的纯化柱。

本发明的又一个方面是提供一种包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物，其中至少80%的α-甘露糖苷酶作为130kDa糖蛋白存在。

本发明的一个其他方面是一种用于治疗α-甘露糖苷贮积症的包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物。

本发明的又一个方面是一种治疗α-甘露糖苷贮积症和/或减少或减轻与α-甘露糖苷贮积症相关的症状的方法，所述方法包括步骤：施用包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物至有需求的受试者。

附图说明

图1显示了从收获至原料药提交的α-甘露糖苷酶的当前优选纯化方法设计的概览。

图2显示α-甘露糖苷酶的卡普托商标名MMC（Capto^TMMMC）柱层析图的实例。

图3显示α-甘露糖苷酶的丁基琼脂糖凝胶商标名FF柱（ButylSepharose^TMFF column）层析图的实例。

图4显示α-甘露糖苷酶的1型陶瓷羟基磷灰石（CHT）柱层析图的实例。

图5显示α-甘露糖苷酶的Q琼脂糖凝胶HP柱（Q Sepharose^TMHP column）层析图的实例。

图6显示纯化的α-甘露糖苷酶组合物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）层析图，其显示130kDa、75kDa和55kDa糖蛋白种类的分布。

图7显示纯化的α-甘露糖苷酶的三幅高效液相色谱（HPLC）图，其中与55kDa和75kDa种类相比，描述130kDa种类的量。从左侧，第一峰是55kDa种类，随后分别是130kDa和75kDa种类。这个2步骤方法不使用多模态配体层析步骤，而3步骤方法和4步骤方法使用多模态配体层析步骤。

本发明现在将在下文中更详细地描述。

发明详述

定义

在进一步详细讨论本发明之前，首先将定义以下术语和惯例：

重组α-甘露糖苷酶

在本发明的上下文中，重组α-甘露糖苷酶定义为就其起源或操作而言与自然界中存在的野生型α-甘露糖苷酶的全部或一部分不相等的α-甘露糖苷酶。因而，这种重组α-甘露糖苷酶使用包括重组DNA分子的重组技术构建，所述重组DNA分子是包含至少两个融合DNA序列的杂合DNA序列，第一序列在自然界中通常不与第二序列融合。重组α-甘露糖苷酶蛋白可以是人来源或非人来源的。具体而言，它可以是重组的人溶酶体α-甘露糖苷酶（rhLAMAN）。这种α-甘露糖苷酶产物可以是单一多肽或单一多肽及其部分的混合物。另外，α-甘露糖苷酶可以经历翻译后修饰并且可以因此为糖蛋白形式。

细胞培养

细胞培养是在受控条件下培育细胞的过程。在本发明语境下，特别地设计细胞培养物的细胞以表达目的蛋白，如重组α-甘露糖苷酶。细胞培养物可以位于生物反应器内，其中生物反应器经专门设计从而允许控制化学条件和物理条件。

部分

在本发明语境下，部分指细胞培养物的部分。这种部分可以构成完整的细胞培养物，但是经常是培养物的处理部分，如澄清、过滤、浓缩、稀释或部分纯化的部分。

树脂

在本发明的上下文中，树脂构成基础层析系统中固定相的基础，在所述基础上连接多种化学基团或物质以提供某种量的针对的给定分子或目的蛋白的亲和力。树脂经常是具有共价连接的配体的聚合物珠，所述树脂不溶于所用的液态流动相中。

多模态配体

多模态配体意指设计旨在以至少2种方式与分子或目的蛋白相互作用的任何配体。各个相互作用可以独立地是疏水性、亲水性、离子性、范德瓦尔斯相互作用、成氢键或任何其他分子内化学或物理相互作用。在本发明语境下，配体是与如上文定义的树脂连接的有机化学物质。多模态配体将对溶解流动相于中的通过层析柱的不同物质具有不同的亲和力。亲和力的差异导致不同物质在层析柱上的停留时间变化，从而能够分离物质。停留时间还取决于其他因素，例如流动相的组分、pH和温度。包含多模态配体的树脂有时也称作“混合模式”树脂，但是在本发明语境下，包含多模态配体的树脂不与所谓的在相同树脂上包含几种不同“配体”的“混合模式离子交换树脂”混淆，所述的不同配体在陶瓷羟基磷灰石树脂（CHT）情况下可以具有相反电荷，例如-OH、-Ca⁺和-PO₄ ^2-。在这些树脂中，各个配体不是多模态的。

加载

在本发明语境下，加载指将收获物、洗脱物或其他溶液转移到层析系统如包含树脂作为固定相的层析柱上。

缓冲液

术语缓冲液作为一种溶液的一般描述是熟知，这种溶液含有抵抗pH变化的弱酸和/或其相应盐或弱碱和/或其相应盐。在本发明的上下文中，所用的缓冲液适用于层析系统，此类缓冲液包括但不限于：磷酸盐缓冲液，例如，磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、磷酸钠或磷酸钾、乙酸盐缓冲液，例如，乙酸钠或乙酸钾、硫酸盐缓冲液，例如，硫酸钠或硫酸钾、硫酸铵或羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes），或其他缓冲液，例如，硼酸钠或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（tris-HCl）缓冲液。

超滤

超滤是一种分离方法，在其中使用液压来迫使分子和溶剂跨过包含特定尺寸（也称作截留尺寸或截留值）的孔的膜。仅具有小于该膜截留值的分子量的分子能够穿过该膜，而仅具有较大分子量的那些分子不能够穿过该膜并且形成所谓截留物质。截留物质中存在的分子从而可以浓缩为跨过该膜的溶剂流。

在一个特定实施方案中，包含多肽如α-甘露糖苷酶的溶液或组合物的浓缩可以通过切线流过滤法（TFF）进行。这种方法尤其用于大规模浓缩，即，用于浓缩具有几升至几百升体积的溶液。因而，这种方法尤其用于以工业规模生产目的多肽的浓缩溶液。

TFF技术基于特殊装置的用途，所述装置引起待过滤的溶液流动穿过半透膜，仅小于膜孔的分子将通过该膜，形成滤液，留下待收集的较大物质（截留物质）。采用TFF方法时，应用两种不同的压力；将溶液泵送入系统并且使其在系统中循环（入口压力）的一种压力和在膜上施加以使小分子和溶剂穿过该膜的另一个压力（膜压力）。入口压力通常可以在1-3bar范围内，如在1.5-2bar之间。跨膜压力（TMP）通常可以大于1bar。在使用TFF来浓缩组合物时，可以将目的多肽的浓缩组合物收集为截留物质。用于TFF的膜通常可以由再生的纤维素或聚醚（PES）制成。

透滤

在本发明语境下，透滤是目的种类处于截留物质内（即不允许目的种类通过滤器，而其他组分例如缓冲剂和盐通过滤器）的过滤方法。因而透滤可以例如用来将一种缓冲液由另一种缓冲液交换或用来浓缩含有目的种类如重组α-甘露糖苷酶的溶液。

本发明的第一方面是提供一种用于从细胞培养物中纯化重组α-甘露糖苷酶的方法，其中包含重组α-甘露糖苷酶的细胞培养物部分在包含多模态配体的树脂上经历层析。在本发明语境下使用包含多模态配体的树脂的优点在于这些树脂使在具有高电导率水平的溶液中结合α-甘露糖苷酶种类成为可能。这具有以下优点：可以使用具有高电导率水平的未稀释的收获物，并且不需要交换收获物缓冲液。在从细胞培养物分离出所述部分后，包含多模态配体的层析步骤因此可以优选地是第一层析步骤。包含多模态配体的所述层析步骤经常可以称作“捕获步骤”，因为目的蛋白最初固定在柱上（即，捕获），而许多杂质在洗涤步骤期间通过该柱。这种蛋白质随后使用特定洗脱缓冲液洗脱。

因而，在本发明的一个实施方案中，提供一种方法，其中包含重组α-甘露糖苷酶的细胞培养物部分是澄清的未稀释收获物。在本发明的上下文中，术语“澄清的未稀释收获”意指细胞培养物的收获物，它不含未溶解的物质或固形物，即，它是清亮溶液。这种收获物可以已经经历过一种处理以便转变成清亮溶液。此类处理可以包括，但不限于：过滤和离心。另外，这种收获物在经历层析步骤之前不作大幅度稀释。因此，这种收获物稀释小于10%，如小于7%、小于5%、小于2%、小于1%、小于0.5%，如小于0.1%。在最优选的实施方案中，这种收获不作稀释。

在另一个实施方案中，提供一种方法，其中澄清的未稀释收获物具有10-20mS/cm，如12-17mS/cm、优选地15mS/cm的电导率。电导率在加载收获物到层析系统上之前测量。

在一个实施方案中，所述层析在包含具有羧酸或磺酸基团的多模态配体的树脂上进行。这些配体中所包含的羧酸和/或磺酸可以根据层析系统中的条件、尤其流动相的pH处于质子化形式或去质子化（盐）形式。

在又一个实施方案中，提供了一种方法，其中所述结合树脂的多模态配体是式（I）、（II）或（III）的物质：

其中式（I）和（III）的物质的R是式（IV）的官能团：

由式（IV）官能团代表的多模态配体总体上称作“汽巴蓝3G（Cibracon Blue3G）”并且由式（I）、（II）和（III）的物质代表的商品的实例分别是“卡普托MMC（Capto^TM MMC）”、“卡普托蓝（Capto^TM Blue）”和“蓝色琼脂糖凝胶^TM快速流（Blue sepharose^TM fast flow）”。其他有用的多模态型树脂包括：Capto^TMAdhere、MEP HyperCel^TM、HEA HyperCel^TM和PPA HyperCel^TM。在本发明的上下文中，此类树脂已经证明在初步纯化未稀释的包含重组α-甘露糖苷酶的收获物方面是特别有效的。

本发明的额外实施方案提供一种方法，其中加载到包含多模态配体的树脂上的所述细胞培养物部分经历采用包含异丙醇、优选地至少1%（V:V）异丙醇，如至少2%、3%、4%、4.5%（V:V）异丙醇、优选地至少5%（V:V）异丙醇的溶液的至少一个洗涤步骤。使用包含异丙醇的溶液的优点在于它引起较好地移除不想要的宿主细胞蛋白（HCP），特别地它帮助除去负责蛋白酶解性降解所需的130kDa rhLAMAN种类的蛋白酶。将HCP理解为相对于生产期间在细胞培养时所用的宿主细胞为内源的蛋白质。虽然异丙醇是优选的，但是用于这种方法的其他醇类包括乙醇、正丙醇和正丁醇。

在又一个实施方案中，提供了一种方法，其中用于洗涤步骤的溶液的pH处于3.5-6.5的pH范围内，如pH4.0-6.0、pH4.5-5.5、优选地pH4.7-5.0。

另一个实施方案提供了一种方法，其中用于洗涤步骤的溶液包括乙酸盐缓冲液，优选地在0.05-1.6M范围内的浓度，如0.1-1.5M、0.5-1.4M、0.7-1.3M、0.8-1.2M、0.9-1.1M、优选地0.95M。乙酸盐缓冲剂可以优选地选自乙酸钠、乙酸钾、乙酸锂、乙酸铵。

又一个实施方案提供了一种方法，其中包含重组α-甘露糖苷酶的第一洗脱物从包含多模态配体的树脂中使用包含乙二醇或丙二醇的水溶液洗脱。发现添加乙二醇至洗脱缓冲液显著地增强洗脱的重组α-甘露糖苷酶的产率。丙二醇还增强产率，但优选乙二醇。

一个实施方案提供了一种方法，其中乙二醇或丙二醇在水溶液中的浓度是20-60%、20-50%、25-50%、30-50%、35-45%，如40%。

在优选的实施方案中，提供了一种方法，其中包含乙二醇或丙二醇的水溶液包含氯化钠。发现添加氯化钠至这种溶液通过促进rhLAMAN酶洗脱显著地增强产率。

在另一个实施方案中，氯化钠在包含乙二醇或丙二醇的水溶液中的浓度处于0.2至2.4M的范围内，如在0.4至2.2M、0.6至2.0M、0.8至1.9M、1.0至1.8M、1.2至1.7M、1.4至1.6M的范围内，优选地是1.5M。备选地，氯化钠的浓度可以处于0.2至1.6M的范围内或处于1.4至2.4M的范围内。

在一个优选实施方案中，包含乙二醇或丙二醇的水溶液包含缓冲剂。所述缓冲剂可以优选地磷酸盐缓冲剂，如磷酸钠或磷酸钾。虽然磷酸盐缓冲剂是优选的，但是这种水溶液的额外有用的缓冲剂包括柠檬酸盐剂和硼酸盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙基磺酸甲酯（MES）、吗啉基丙磺酸（MOPS）和羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）缓冲剂。

在另一个优选实施方案中，缓冲盐在包含乙二醇或丙二醇的水溶液中的浓度是50-350mM、55-300mM、65-280mM、70-250mM、75-200mM、80-200mM、85-150mM，优选地90mM。

在又一个优选实施方案中，包含乙二醇或丙二醇的水溶液的pH是pH7.0-9.0，如pH7.1-8.5、pH7.2-8.3、pH7.5-8.0、优选地pH7.7。

在一个实施方案中，提供了一种方法，其中从包含多模态配体的树脂中获得的包含重组α-甘露糖苷酶的第一洗脱物进一步经历包括以下步骤的方法：

i)施加包含α-甘露糖苷酶的部分至疏水性相互作用层析树脂以提供包含重组α-甘露糖苷酶的洗脱物，

ii)使包含α-甘露糖苷酶的部分通过混合模式离子交换树脂以允许滞留杂质以便提供包含重组α-甘露糖苷酶的通流；和

iii)使包含α-甘露糖苷酶的部分在阴离子交换树脂上经历层析以提供包含重组α-甘露糖苷酶的洗脱物。

在一个实施方案中，提供了包括如上文所述的步骤i）-iii）的一种方法，其中，步骤i）中的部分已经在包含多模态配体的所述树脂上经历纯化，步骤ii）的部分从来自步骤i）的洗脱物衍生，并且步骤iii）的部分从来自步骤ii）的通流衍生。换而言之，步骤i）至iii）依照列出它们的顺序进行，不排除步骤i）至iii）之间的中间步骤。这些可以中间纯化步骤和/或病毒缩减或病毒去除步骤。

在优选的实施方案中，步骤i）的疏水性相互作用层析树脂是烷基取代的树脂，优选地是丁基琼脂糖凝胶树脂。烷基取代的树脂可以包括乙基-、丁基-和辛基琼脂糖凝胶树脂。另外，苯基琼脂糖凝胶树脂也是可应用的。此类树脂的实例是丁基-S Sepharose^TM快速流6、丁基Sepharose^TM快速流4、辛基Sepharose^TM快速流4、苯基Sepharose^TM快速流6（高亚型）和苯基Sepharose^TM快速流6（低亚型）、丁基Sepharose^TM高性能、苯基Sepharose^TM高性能。包括疏水性相互作用树脂和特别包括丁基琼脂糖凝胶树脂的纯化步骤的优点是有效去除宿主细胞蛋白和DNA残余物，同时保留rhLAMAN酶的良好产率。

在又一个实施方案中，步骤i）包含至少一个洗涤步骤，其中用于洗涤的溶液包括磷酸盐缓冲剂和乙酸盐缓冲剂，优选地磷酸钠和乙酸钠。这种双重缓冲剂洗涤步骤已经证明在去除杂质如宿主细胞蛋白和DNA残余物方面特别有效。

在又一个实施方案中，磷酸盐缓冲剂在步骤i）的双重缓冲剂中的浓度处于5-40mM的范围，如10-30mM、15-25mM、优选地20mM，并且乙酸盐缓冲剂的浓度处于0.9-1.5M的范围，如1.0-1.4M、1.1-1.3M、优选地1.2M。

在另一个实施方案中，步骤i）包含至少一个洗涤步骤，其中用于洗涤的溶液包含不多于一种缓冲剂，优选地是磷酸盐缓冲剂，优选地是磷酸钠。

在另一个实施方案中，包括不多于一种缓冲剂的至少一个洗涤步骤的一种缓冲液以0.4-0.8M范围（如0.5-0-7M）、优选地0.6M的浓度存在。

在一个实施方案中，提供了一种方法，其中步骤ii）的混合模式离子交换树脂是陶瓷羟基磷灰石或氟磷灰石树脂，优选地是陶瓷羟基磷灰石类I型（CHTI）树脂。采用这个层析步骤已经显示高效地将明显量的DNA杂质与重组α-甘露糖苷酶组合物分离并且结合宿主细胞蛋白，同时rhLAMAN酶产物通过该柱，不结合。

在另一个实施方案中，步骤iii）的阴离子交换树脂是强阴离子交换树脂，如季铵强阴离子交换树脂。此类树脂包括但是不限于以下实例：Q-琼脂糖凝胶^TMHP、Q-琼脂糖凝胶^TMFF、DEAE-琼脂糖凝胶^TM、Capto^TM Q、Uno^TM Q、ANX琼脂糖凝胶^TM。

在又一个实施方案中，提供了一种方法，其中进行病毒灭活步骤，优选地步骤ii）和步骤iii）之间进行。

在一个优选实施方案中，病毒灭活步骤包括将步骤ii）的通流与异丙醇的水溶液混合（通流:异丙醇1:1V/V）至少2小时，优选地随后通过超滤浓缩并且使用透滤除去异丙醇。在灭活期间，含水的异丙醇可以处于10-50%异丙醇的范围内，如20-40%、25-35%、28-32%、优选地30%异丙醇。通流和含水异丙醇的1:1V/V溶液因而具有15%的异丙醇终浓度。

另一个优选实施方案是其中进行一个病毒缩减步骤、优选在层析步骤iii）后进行的方法。

在一个实施方案中，病毒缩减步骤包括通过滤器、优选地病毒去除滤器（如ultipor^TMVF级DV20滤器或planova^TM15N或20N滤器）过滤包含重组α-甘露糖苷酶、优选地步骤iii）洗脱物的溶液。优选地，使用Planova^TM15N滤器。

本发明的纯化方法可以有利地以大规模进行，因而在优选的实施方案中，这种方法在具有至少0.5L（如至少1.0L、2.0L、5.0L、10L）、优选地至少13.0L的柱体积的层析柱上进行

在本发明的另一个实施方案中，提供如上文所述的纯化方法，其中α-甘露糖苷酶具有选自以下的序列：

A）SEQ ID NO2中所述的序列

B）A）中的序列的类似物

C）A）或B）中的序列的子序列。

其中由SEQ ID NO2描述的序列代表如WO02/099092中提供的重组人溶酶体α-甘露糖苷酶（rhLAMAN）的氨基酸序列。

“子序列”意指亲本序列的片段，这种片段具有不短于50%亲本序列的尺寸，如不短于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或不短于95%的亲本序列。因而，所讨论的子序列可以具有505-1009个连续氨基酸残基的长度，如525-1009、550-1009、575-1009、600-1009、625-1009.650-1009、675-1009、700-1009、725-1009、750-1009、775-1009、800-1009、825-1009.850-1009、875-1009、900-1009、925-1009、950-1009、975-1009、980-1009、990-1009或如1000-1009个连续基酸残基。另外，SEQ ID NO2的相关子序列或其类似物必须保留催化性位点。虽然人LAMAN的3D结构是未知的，但是已经报道了牛LAMAN的3D结构，并且基于这种数据，已经得出结论：以下氨基酸参与活性部位和/或负责配位在人LAMAN中也需要的Zn²⁺原子：AA72=H，AA74=D，AA196=D，AA446=H（UniProtKB/Swiss-Prot数据库：O00754,MA2B1_HUMAN_,Heikinheimo等人,J.Mol.Biol.327,631-644,2003）。已经显示，人LAMAN中AA72和196的突变导致酶活性几乎完全丧失（Hansen等人,Biochem.J.（2004）,381,第537-567页）。为了显示活性，rhLAMAN的子序列应当至少保留含有以上四个氨基酸的区域。

优选地，rhLAMAN的子序列还包含一个或多个额外构象性部分，包括例如结合位点、β-转角、二硫键、终止密码子和其他。在LAMAN的人形式中，存在几种引起疾病的突变，从而显示这个特定氨基酸的重要性，例如，AA53、72、77、188、200、355、356、359、402、453、461、518、563、639、714、750、760、801、809、916（人基因突变数据库，专业版，卡迪夫大学(Cardiff university)，2009），并且还存在对于糖基化重要的氨基酸，包括AA133、310、367、497、645、651、692、766、832、930和989，以及参与二硫键的氨基酸如AA 55+358、268+273、412+472和493+501。

“类似物”意指与亲本序列具有某个序列同一性百分比的序列，这个序列同一性百分比可以是至少60%序列同一性，如至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或优选地99%序列同一性。应当理解上文所述的类似物和子序列优选地与具有SEQ ID NO2中所述的氨基酸序列的α-甘露糖苷酶在功能上等同，意指它们能够产生基本上相同的酶活性。

术语“基本上相同的酶活性”指具有天然酶的至少50%、优选地至少60%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90%、更优选地至少95%和最优选地至少97%、至少98%或至少99%活性的等同部分或类似物。这种酶的功能上等同的类似物的实例可以是处于有功能形式的包括该酶催化性位点的融合蛋白，但是它也可以是源自另一个物种的这种酶的同源变体。另外，模拟相关酶的特异性酶活性的完全合成性分子将构成“功能上等同的类似物”。LAMAN的非人类似物总体上不适用于疗法，因为它们可以潜在地在患者中诱导抗体的形成并且引起疾病。然而，当突变不是致病性的并且没有显著地削弱所需的酶活性时，人类似物可以用于酶替换疗法中。此类突变的实例是：His70Leu、Gln240Arg、Ser250Ala、Leu278Val、Ser282Pro、Thr312Ile、Ala337Arg、Ser413Asn、Ser481Ala、Gln582Glu、Arg741Gly、Thr873Pro（来源：http://www.ensembl.org；转录物IDENST00000456935）。另外，本发明人已知Pro669Leu和Asp402Lys不引起疾病。

通常，技术人员将能够轻易地设计用于确定酶活性的适宜测定法。对于LAMAN，WO02/099092第26页第8-28行中公开了适宜的酶活性测定法。简而言之，可以出于筛选目的，使用平底96孔平板进行以下方法：75μl的4X分析缓冲液（8mM对硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷，2mg/mL BSA，0.4M乙酸盐钠（pH4.5）添加至75μl样品，或将其适当稀释（在含有150mM NaCl+10%超级块（superblock）的10mM Tris pH7.4中）。平板在37℃孵育30分钟并且用75μl的1.8M Na₂CO₃终止，并且在405nm在平板读数仪上记录吸光度。96孔平板在分光光度计上读取。比活性定义为每分钟每mg蛋白质水解的对硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷的摩尔数。

如通常定义，“同一性”在此分别定义为基因或蛋白质之间在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。因而，在本发明语境下，“序列同一性”是蛋白质之间在氨基酸水平上的同一性的量度和核酸之间在核苷酸水平上的同一性的量度。蛋白质序列同一性可以通过比对这些序列时比较每个序列中给定位置内的氨基酸序列确定。类似地，核酸序列同一性可以通过比这些对序列时比较每个序列中给定位置内的核苷酸序列确定。

为确定两个氨基酸序列或两种核酸的同一性百分数，出于优化比较目的比对所述序列（例如，可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中导入空位以与第二个氨基酸序列或核酸序列优化比对）。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置由第二序列中在对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的函数（即，％同一性=相同位置的#/总#位置（例如，重叠位置）x100）。在一个实施方案中，这两个序列具有相同的长度。

可以手工地比对所述序列并且计数相同氨基酸的数目。备选地，比对两个序列以确定同一性百分数可以使用数学算法实现。这种算法并入NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸搜索可以在采用NBLAST程序，评分=100、字长度=12的情况下执行以获得以获得与本发明的核苷酸分子同源的核苷酸序列。可以采用XBLAST程序、评分=50、字长度=3进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得空位比对结果，可以使用空位BLAST。备选地，PSI-Blast可以用来进行检测分子之间远缘关系的迭代搜索。当使用NBLAST、XBLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。备选地，在序列已经例如由BLAST程序在EMBL数据库（www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST）中比对后，可以计算序列同一性。总体上，关于例如“评分矩阵”和“空位罚分”的默认设置可以用比对。在本发明的环境下，BLASTN和PSI BLAST默认设置可能是有利的。

可以使用与上文所述那些技术相似的技术，在容许或不容许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数时，仅计数精确匹配。

本发明的另一个实施方案是一种组合物，其包含通过上文所述的纯化方法可获得的α-甘露糖苷酶。

在本发明的第二方面，提供一种用于分批补料生产或连续生产重组α-甘露糖苷酶的方法，所述方法包括以下步骤：

b.从第1日添加进料培养基至所述细胞培养物至少一次；

在以上方法中，接种日定义为第0日，并且随后的日是第1日并且如此类推。从第0日直至点c中所述的调节所使用的起始温度处于36-37℃范围，优选地是36.5℃。应当理解前述温度是实际的测量温度，并非设定点，即，在用于本发明的生物反应器设置中，上文提到的温度31℃需要温度设定点32℃。同样地，36.5℃的温度需要设定点温度37℃。

用于表达和生产重组α-甘露糖苷酶的合适宿主细胞源自多细胞生物，优选地来自哺乳动物。具体而言，用来产生重组α-甘露糖苷酶的细胞可以选自由SV40转化的猴肾CVI系（COS-7）；人胚肾系（亚克隆用于按悬浮培养方式生长的293或293细胞）；幼仓鼠肾细胞（BHK）；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO）；小鼠Sertoli细胞（TM4）；猴肾细胞（CV I）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76）；人宫颈癌细胞（HELA）；犬肾细胞（MDCK）；大鼠（buffalo rat）肝细胞（BRL 3A）；人肺细胞（W138）；人肝细胞（Hep G2,HB 8065）；小鼠乳腺瘤（MMT 060562）；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系（HepG2）。昆虫细胞系或人成纤维细胞也可用作合适的宿主细胞。

使用技术人员已知的技术，使用以适宜的核酸构建体转染的细胞获得重组α-甘露糖苷酶的产生。具体而言，这种核酸构建体可以包含选自以下的核酸序列：

i)SEQ ID NO:1中所述的核酸序列；和

ii)核酸序列，其编码如上文提供的SEQ ID NO2中所述序列的子序列或类似物。

细胞可以优选地是如WO 02/099092中所述的为产生重组酶而专门开发的rLAMAN中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系。为专利保藏目的，根据布达佩斯条约在2002年6月6日，将这种细胞系DSM ACC2549的培养物保藏于德国微生物和细胞培育采集中心（DSMZ GmbH,Maschroderweg）1b,D-38124布伦瑞克（Braunschweig），德国。这种细胞可以使用具有SEQ ID NO1中所示序列的表达质粒pLamanExp1获得。

具有步骤a-c的方法可以进一步包括以下步骤：

d.一种用于从所述细胞培养物中纯化重组α-甘露糖苷酶的方法，其中如上文所述，包含重组α-甘露糖苷酶的细胞培养物部分在包含多模态配体的树脂上经历层析，所述多模态配体具有羧酸或磺酸基团。

在又一个实施方案中，生产方法中所使用的细胞培养物基本上不含源自动物的任何补充物，如鱼肝油补充物。避免使用此类补充物降低了终末酶产物中病毒污染的风险。

在生产方法的一个优选实施方案中，分批补料生产或连续生产的未稀释的收获物具有至少0.1g/L，如至少0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L，优选地至少0.5g/L的α-甘露糖苷酶浓度。

在另一个实施方案中，分批补料生产或连续生产的未稀释的收获物具有3-35U/mL范围内如5-35U/mL、7-35U/mL、优选地10-35U/mL范围内的酶活性。应当理解当进一步工艺优化时，收获物的酶活性可以是甚至高于35U/mL。

这种生产方法可以有利地以大规模进行。因而在一个实施方案中，用于分批补料生产或连续生产的方法以至少30L，如至少50L、75L、100L、150L、200L、优选地至少250L的体积进行。

在本发明的另一个实施方案中，提供如上文所述的生产方法，其中α-甘露糖苷酶具有选自以下的序列：

A）SEQ ID NO2中所述的序列

B）A）中的序列的类似物

C）A）或B）中的序列的子序列。

本发明的另一个实施方案是组合物，其包含通过上文所述的生产方法可获得的α-甘露糖苷酶。此类组合物可以在优选的实施方案中包含额外的活性产物成分（API）、辅助剂和/或赋形剂。

在本发明的第三方，提供了一种包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物，其中至少80%的α-甘露糖苷酶作为130kDa糖蛋白存在。

在优选的实施方案中，提供包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物，其中所述重组α-甘露糖苷酶在液态溶液中在+5℃贮存时保持稳定至少4日或在-20℃贮存时保持稳定至少24个月。

下文描述用于rhLAMAN酶产物的制剂缓冲溶液的当前优选组成并且还列出所实现的稳定性：

Na₂HPO₄3.50mM（磷酸氢二钠）

NaH₂PO₄0.17mM（磷酸二氢钠）

甘氨酸27mM

山梨醇250mM

pH7.70,290mOsm/kg（等渗溶液）

使用时的稳定性：稳定溶液+5℃-4日

+20℃-6小时

-20℃-24个月

冷冻干燥+5℃-24个月

在本发明的另一个实施方案中，提供如上文所述的组合物，其中α-甘露糖苷酶具有选自以下的序列：

A）SEQ ID NO 2中所述的序列

B）A）中的序列的类似物

C）A）或B）中的序列的子序列。

另一个优选实施方案是包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的以上组合物用作药物。

在又一个实施方案中，包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的以上组合物用于治疗α-甘露糖苷贮积症。

又一个优选实施方案是使用包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的以上组合物用于制备治疗α-甘露糖苷贮积症的药物。

另一个实施方案是一种治疗α-甘露糖苷贮积症和/或减少或减轻与α-甘露糖苷贮积症相关的症状的方法，所述方法包括步骤：给药如上文提供的包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物至有需求的受试者。

应当指出在本发明多个方面之一的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其余方面。

本申请书中引用的全部专利和非专利参考文献因而通过引用方式完整地并入本文。

本发明现在将在以下非限制性实施例中更详细地描述。

实施例

所用的缩写：

CIP：原位清洁（Clean In Place）

CV：柱体积

Cv：活细胞密度

DF：透滤（Diafiltration）

DO：溶解氧

IPA：异丙醇

MVC/mL：10⁶活细胞/mL

NaPi：磷酸钠

NaAc：乙酸钠

OD：光密度

EG：乙二醇

TFF：切线流过滤

TMP：跨膜压力

UF：超滤

实施例1-当前优选的总体纯化方法

用于在本发明背景下获得α-甘露糖苷酶的最佳产率和纯度的纯化方法如下文描述。使用用于树脂再生和清洁的标准条件，如对各个树脂所规定那样（还见实施例2-5）。所用的树脂在通用生命科学部（GE healthcare life sciences）和伯乐（BioRad）获得。

·从α-甘露糖苷酶生产中提供收获物的部分，并且在不作明显稀释的情况下澄清这个部分。优选地完全不作稀释。

·进行捕获步骤，包括以上部分在包含多模态配体的树脂上柱层析。这些树脂选自：Capto^TM MMC、Capto^TM Adhere、PlasmidSelect^TM Xtra、Capto^TM Blue、Blue Sepharose^TM快速流树脂、MEP HyperCel^TM、HEA HyperCel^TM和PPAHyperCel^TM。

·在pH4.5-8.5进行几次洗涤，并且洗涤缓冲液选自：乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、乙基磺酸甲酯（MES）、吗啉基丙磺酸（MOPS）、羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、硼酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（tris-HCl）、柠檬酸盐缓冲液或其组合（下文的缓冲液组A）。然而，在至少一次洗涤中，洗涤液包含异丙醇和pH在pH 4-6之间。洗脱缓冲液选自缓冲液组A，并且洗脱溶液包含乙二醇。洗脱pH保持在pH7.0-8.5。

·进行主动中间步骤，该步骤包括在疏水相互作用树脂上柱层析包含α-甘露糖苷酶的组合物。这些树脂选自：丁基-S Sepharose^TM快速流6、丁基Sepharose^TM快速流4、辛基Sepharose^TM快速流4、苯基Sepharose^TM快速流6（高亚型）和苯基Sepharose^TM快速流6（低亚型）、丁基Sepharose^TM高性能、苯基Sepharose^TM高性能。

·几次洗涤在pH7-8进行。洗涤缓冲液选自缓冲液组A。洗脱缓冲液也选自缓冲液组A并且洗脱pH在pH7-8之间。

·进行被动中间步骤，该步骤包括在混合模式离子交换树脂上柱层析包含α-甘露糖苷酶的组合物以提供通流。这些树脂选自：陶瓷羟基磷灰石I或II型（优选地I型）树脂或氟磷灰石。进行一次洗涤以提供pH7-8的通流。洗涤缓冲液选自缓冲液组A。

·进行整饰步骤（polishing step），该步骤包括在阴离子交换树脂上柱层析包含α-甘露糖苷酶的组合物。这些树脂选自：Q-琼脂糖凝胶^TMHP、Q-琼脂糖凝胶^TMFF、DEAE-琼脂糖凝胶^TM、Capto^TM Q、Uno^TM Q、ANX琼脂糖凝胶^TM。

·几次洗涤在pH7-8进行。洗涤缓冲液选自缓冲液组A和TRIS-HCl缓冲液。洗脱缓冲液也选自缓冲液组A并且洗脱pH保持在pH7-8之间。

·通过使α-甘露糖苷酶的溶液与异丙醇接触，进行病毒灭活步骤。

·使用纳米过滤法，进行病毒除去步骤。

与先前方法相比较，在下表1中显示包含本发明α-甘露糖苷酶的纯化的组合物的产率和产物组分比率，其中：

方法1是：当前优选的本发明方法。

方法2是：与方法1相似，而无整饰步骤。它也没有包括用于捕获步骤的异丙醇的洗涤步骤并且在主动中间步骤中洗涤较少，并且最后它没有病毒灭活步骤。

方法3是：如WO 02/099092中所述（不使用多模态配体）。

表1：因以往和当前纯化方法产生的产率和纯度

还见实施例10和图7。

实施例2-使用多模态配体的层析捕获步骤

包含α-甘露糖苷酶的澄清未稀释的收获物通过混合模式相互作用与多模态配体型树脂如这个实施例中所用的Capto^TMMMC结合。增加盐和添加乙二醇洗脱产物。Capto^TMMMC的容量是260U/ml树脂。使用以下步骤进行捕获阶段：

·用1-2个柱体积（CV）的3M NaCl，pH10-12以300cm/hr再生该柱。

·用5CV的50mM磷酸钠缓冲液（NaPi），0.15M NaCl pH7.5以300cm/hr平衡。

·以300cm/hr加载澄清、未稀释的收获物（电导率约15mS/cm）。

·洗涤1：4CV平衡缓冲液。

·洗涤2：3CV的0.95M NaAc，5%（v:v）异丙醇，pH4.9，300cm/hr。

·洗涤3：4CV平衡缓冲液（直至稳定基线，采用5mm流通池时约0.06Au），以300cm/hr。

·用6CV在90mM NaPi中的1.5M NaCl，40%乙二醇，pH 7.7，以最大120cm/hr洗脱产物。吸光度增加（距新基线约10mAu）时，开始收集。收集约4CV。

·如上文那样用3CV按向下流动方向以最大120cm/hr再生该柱。

·用3CV H₂O、3CV 1M NaOH（约60分钟接触时间）、2-3CV的磷酸盐缓冲液，pH约7，3CV的20mM磷酸钠+20%乙醇原位清洁（CIP）并且消毒，优选地采用向上流动方向。贮存在20mM磷酸钠+20%乙醇中。

表2显示纯化方案的实例。表3汇总步骤。图2显示这个步骤的层析图的实例。

表2：捕获阶段纯化方案：13.5x 2ml（27ml）XK16柱中装填的Capto^TMMMC（在下一页继续）

表3：Capto^TMMMC捕获阶段的条件汇总

实施例3-使用疏水相互作用的层析中间主动步骤

在添加硫酸钠后，包含α-甘露糖苷酶的来自捕获阶段的产物通过疏水相互作用与如这个实施例中所用的疏水相互作用型树脂（如丁基Sepharose^TM4FF）结合。降低盐浓度洗脱这种产物。容量是195U/ml树脂。在中间主动阶段中使用以下步骤：

·用1CV的20mM磷酸钠（NaPi）缓冲液，pH7.5以100cm/hr再生该柱。

·用5CV 0.5M Na₂SO₄，20mM NaPi，pH7.5以150cm/hr平衡该柱。

·来自步骤1的产物汇集物与相同体积的20mM NaPi，0.8M Na₂SO₄，pH7.5混合并且将它以70cm/hr加载到该柱上。混合可以在线内或在加载开始之前最多3小时进行。1:1体积:体积（v:v）混合物对应于大约1.11:1重量:重量（w:w）（洗脱物:硫酸钠缓冲液）。如果需要，条件过的加载物应当在加载之前经0.45μm滤器（亲水性PES或聚偏氟乙烯(PVDF)）过滤。

·用3CV平衡缓冲液以70cm/hr洗涤该柱以除去来自先前步骤的乙二醇（除宿主细胞蛋白之外）。

·用3.5CV的20mM NaPi，1.2M NaAc，pH7.5以100cm/hr洗涤。

·用3.5CV的0.6M NaPi，pH7.0以150cm/hr洗涤。

·用4CV的60mM NaPi，pH7.5以150cm/hr洗脱产物。收集从吸光度开始增加直至达到基线的峰，约2CV。

·用2CV 20mM NaPi，pH7.5，随后用3CV H₂O以150cm/hr再生该柱。

·用3CV 1M NaOH（60分钟接触时间）、1CV H₂O、1-3CV的磷酸盐缓冲液和2CV的20mM磷酸钠+20%乙醇清洁并且消毒。贮存在20mM磷酸钠+20%乙醇中。

表4显示纯化方案的实例。表5汇总步骤。图3显示这个步骤的层析图的实例。

表4：使用13.5cm x 2cm²（27ml）XK16柱中装填的丁基Sepharose^TM4FF的中间主动纯化方案（在下一页继续）

表5：丁基Sepharose^TM4FF 步骤的条件的总结

实施例4-使用混合模式离子交换的层析中间被动步骤

来自中间主动步骤的包含α-甘露糖苷酶的两种洗脱物汇集并与水1:1（重量:重量）混合以降低电导率，并且加载到混合模式离子交换树脂上，如本实施例中的陶瓷羟基磷灰石I（CHT I）树脂。产物在不结合的情况下通过，而宿主细胞蛋白与柱结合。收集含有这种产物的通流。容量是550U/ml树脂。在中间被动阶段的这个实施例中使用以下步骤：

·用2CV的0.6M NaPi pH7.0以300cm/hr再生该柱。

·用5CV的60mM NaPi，pH7.5以300cm/hr平衡该柱。

·以300cm/hr加载来自步骤2的条件过的洗脱物并且收集含有产物的通流。加载物的电导率和pH将分别是约10mS/cm和7.3。从OD增加20mAu直至OD返回20mAU，收集含有产物的通流，大约是加载体积和2CV洗液。在步骤结束时，将产物汇集物经0.45μm亲水性PES或PVDF滤器过滤。

·用4CV平衡缓冲液以300cm/hr洗涤该柱。

·用3CV的0.6M NaPi pH7.0以300cm/hr再生该柱。

·用3CV 1M NaOH（60分钟接触时间）、1CV的60mM NaPi，pH7.5和和2CV的20mM磷酸钠+20%乙醇清洁并且消毒。贮存在20mM磷酸钠+20%乙醇中。

表6显示纯化方案的实例。表7汇总步骤。图4显示这个步骤的层析图的实例。

表6：使用10cm x 2cm2（20ml）XK16柱中装填的CHT I的中间被动阶段的纯化方案。

表7:CHT I步骤的条件的总结（在下一页继续）。

实施例5-病毒灭活步骤

病毒灭活可以在方法的不同阶段进行。在这个实施例中，病毒灭活在中间被动步骤后和整饰步骤之前进行。通过在21±5℃与15%异丙醇（与30%含水异丙醇的1:1混合物）一起孵育135±15分钟，实现包含α-甘露糖苷酶的中间被动汇集物的病毒灭活。罐可以通过冷却夹套在4℃冷却以保持这个过程在21±5℃。具有100kDa聚醚砜膜，筛A（来自密理博（Millipore）或塞多利斯(Sartorius)）的切线流过滤（TFF）用来去除异丙醇和改变成磷酸钠缓冲液。以下步骤在这个实施例中用来灭活病毒：

·来自中间被动步骤的产物（通流）与60mM磷酸钠中的30%异丙醇按1:1（v:v）混合，这对应于1:0:94（w/w）。例如，通过再循环泵送混合。产物蛋白质浓度将是约0.3-1mg/ml。

·将溶剂/产物汇集物在室温孵育135±15分钟。

·用60mM磷酸钠缓冲液平衡TFF膜。

·通过以跨膜压力（TMP）1.1巴（bar），在21±5℃，入口压力=约1.4-1.5bar和出口压力=0.7约-0.8bar超滤，将汇集物而浓缩至目标浓度2mg/ml（0.5-3mg/ml）。

·通过对60mM磷酸钠缓冲液透滤，交换约6个体积。在TMP 1bar（1.4bar入口/0.6bar出口）开始。在交换第一体积后，TMP可以增加至1.1。

·收集截留物质。用2-3个系统体积的稀释缓冲液淋洗该膜以除去松散结合的产物。将淋洗液与截留物质一起收集。靶蛋白终浓度是2mg/ml（0.5-3mg/ml）。

·该膜用H₂O，随后用0.5M NaOH（60分钟接触时间）清洁。贮存在0.1M NaOH中。

表10显示病毒灭活/TFF步骤的条件

表10:病毒灭活/TFF步骤的条件的总结

NaPi=60mM磷酸钠，pH7.5

实施例6-使用阴离子交换的层析整饰步骤

来自中间被动阶段的包含α-甘露糖苷酶的截留物质的电导率通过用条件化缓冲液（20mM Tris-HCl，10mM NaCl，75mM山梨醇、0.005%吐温^TM80，pH7.5）稀释6倍而降低，以便通过在阴离子交换树脂（如本实施例中的季铵型高性能强阴离子交换树脂（Q Sepahrose^TMHP树脂）上离子相互作用而结合。截留物质在加载之前直接稀释或通过线内稀释法稀释。通过添加氯化钠，将产物洗脱至用1CV洗脱缓冲液预先填充的容器中。容量是400U/ml树脂。以下步骤在这个实施例中用于整饰阶段：

·用1CV 50mM NaPi，1M氯化钠，pH7.5以120cm/hr再生该柱。

·用5CV 20mM Tris-HCl，10mM氯化钠，pH7.5以120cm/hr平衡该柱。

·以120cm/hr加载来自步骤4的稀释的截留物质。

·用5CV平衡缓冲液和1CV 20mM磷酸钠，pH7.5以120cm/hr洗涤该柱。

·将产物用4CV的50mM磷酸钠，0.2M氯化钠，pH7.5以120cm/hr洗脱至预先填充（1CV洗脱缓冲液）的容器中。收集从吸光度开始增加直至30-50mAu（2mm流通池），0.5-1.5CV。

·用3CV 50mM NaPi，1M氯化钠，pH7.5以120cm/hr再生该柱。

·用3CV 1M NaOH（60分钟接触时间）和3CV 10mM NaOH清洁并且消毒。贮存在10mM NaOH中。

表8显示纯化方案的实例。表9汇总步骤。图5显示层析图的实例。

表8：使用Sepharose^TMHP树脂19cm x2cm²（38ml）的整饰步骤的纯化方案（在下一页继续）。

表9：Q Sepharose^TM4FF步骤的条件的总结

实施例7-病毒减除步骤

病毒减除可以在方法的不同阶段进行。在这个实施例中，病毒减除在整饰步骤后进行。在0.1μm预过滤后，来自整饰步骤的洗脱物经Planova^TM15N滤器进行纳米过滤。使用以下步骤：

·来自整饰步骤的洗脱物经0.1μm滤器预过滤。将滤器用小体积的50mM磷酸钠，0.2M氯化钠，pH7.5淋洗以除去松散结合的产物。

·洗脱物以压力0.8bar在室温过滤。过滤后，用50mM磷酸钠、0.2M氯化钠，pH7.5进行大约3个Planova15系统体积的后续洗涤。

实施例8-配制和贮存

采用100kDa筛A聚醚砜膜（Sartorius^TM或Millipore^TM）的切线流过滤（TFF）将缓冲液改变成配制缓冲液。罐可以通过冷却夹套在4℃冷却以保持这个过程在21±5℃。估计的容量是100l/m²。以下步骤用于配制和贮存：

·该膜用3.5mM Na₂HPO₄，0.17mM NaHPO₄，250mM山梨醇，27mM甘氨酸，pH7.7（配制缓冲液）平衡。

·用1体积配制缓冲液稀释包含α-甘露糖苷酶的纯化产物至目标浓度2-3mg/ml。如果蛋白质浓度在产物中低，可以（但不必需）浓缩至4-6mg/ml以在用配制缓冲液稀释之前缩减体积。

·通过以TMP 0.8和在21±5℃超滤，浓缩约2次至目标浓度6mg/ml。

·在TMP0.8，21±5℃通过对配制缓冲液透滤，交换6个体积。

·通过超滤，浓缩约1.5倍，并且收集截留物质。用1个系统体积的配制缓冲液淋洗该膜以除去松散结合的产物。将淋洗液与截留物质一起收集。替代方案是测量淋洗液中的OD280并且仅在它含有产物时才汇集。靶蛋白终浓度是7±2mg/ml。

表11：配制TFF步骤的条件的总结（在下一页继续）。

产物稀释至5mg/ml并且无菌过滤。过滤的原料药填充至瓶内并冷冻。

实施例9-α甘露糖苷酶的分批补料生产培养方法

在细胞融化后，将细胞在摇瓶、10L种子生物反应器和50L种子生物反应器中扩充，随后转移至生产生物反应器（250L）。在生产生物反应器的接种日，50L种子生物反应器中的细胞密度在2和2.5MVC/mL之间。将细胞从种子生物反应器中以细胞密度0.5MVC/mL在生产反应器中接种，从而在接种完成时，细胞悬液体积是100L。将接种日称作第0日，随后的日称作第1日并且如此类推。从第1日至运行结束，根据预定的比率每日递增（in boost）添加进料培养基（见下文）。从第1日至运行结束，根据预定的比率和规则每日递增（in boost）添加谷氨酰胺和葡萄糖（见下文）。在活细胞密度≥2.2MVC/mL时或在第3日，无论谁先达到，将温度降低至生产温度。

表12：实际的温度和实验条件

（*）在第0日和第2日之间，仅CO₂通过pH控制自动地添加。除非pH将<6.60，否则不添加碱。

基础培养基

补充有2mM谷氨酰胺并且含有11.1mM（2g/L）葡萄糖的ACF培养基（ExCell302,SAFC）。无谷氨酰胺的基础培养基可以转移至生产生物反应器中至多到3日并且在36.5°C贮存，即，在生物反应器的无菌检查期间。否则，培养基在4°C贮存。

进料培养基

进料培养基E35是35%CHO CD高效进料B（英杰公司（InVitrogen），目录号SKU#A10240-01），稀释于无谷氨酰胺并且含有11.1mM葡萄糖的ACF培养基中的进料浓缩物。进料培养基在4°C暗处贮存。进料培养基可以在培养期间在至多到96小时即4日期间于室温暗处静置。

表13：每日添加的进料培养基体积

日	0	1至5	6至16
				添加的体积/日（L）	0	12	4

·添加物

a）2500mM葡萄糖的母液。b）200mM谷氨酰胺的母液。c）碱0.5MNa₂CO₃。

·进料培养基、葡萄糖和谷氨酰胺的递送

每日递增泵送进料培养基。通过按照根据下文的量递增添加葡萄糖和谷氨酰胺的母液，每日添加葡萄糖和谷氨酰胺以将它们的浓度维持在给定目标内。

谷氨酰胺添加规则：

·第1日至第3日：添加一定体积的谷氨酰胺母液，从而生物反应器中的谷氨酰胺浓度是2mM。

·从第4日：添加一定体积的谷氨酰胺母液，从而生物反应器中的谷氨酰胺浓度是1mM。

葡萄糖添加规则：

·第0日至第8日：不添加葡萄糖母液

·从第9日：如果生产生物反应器中的葡萄糖浓度≤8mM，则添加一定体积的葡萄糖母液，从而生物反应器中的葡萄糖浓度是8mM。

过程概述：

表15：培养过程逐日概述：

实施例10-包含α-甘露糖苷酶表16的纯化产物的表征

下表16显示本发明的纯化方案怎样提供分别与75和55kDa分解产物相比具有高比例130kDa糖蛋白种类的α-甘露糖苷酶。该表还显示就产率、总纯度和130kDa种类的产率而言，使用一个4步骤纯化方法的250L工艺怎样表现比使用一个3步骤方法的30L工艺更好，其中所述的250L工艺具有用于多模态配体的捕获步骤和中间主动步骤的改进洗涤步骤以及Q琼脂糖凝胶HP整饰步骤。

表16:纯化产物中α-甘露糖苷酶种类的产率

图7的HPLC图中见三种方法的种类分布，其中以上内容分别代表4-步骤方法和3-步骤方法。所示的2-步骤方法不使用多模态配体步骤。从左侧，第一峰是55kDa种类，随后分别是130kDa和75kDa种类。

参考文献

·Hirsch等人,欧洲分子生物学组织杂志（EMBO J.）22,1036-1046,2003和Saint-Pol等人,生物化学杂志（J.Biol.Chem）.274,13547-13555,1999

·Aronson和Kuranda美国实验生物学会联合会杂志（FASEB J）3:2615-2622.1989

·Nilssen等人,人类分子遗传学（Hum.Mol.Genet.）6,717-726.1997

·Kaneda等人,染色体（Chromosoma）95:8-12.1987

·Riise等人,基因组学（Genomics）42:200-207,1997

·Nilssen等人,人类分子遗传学（Hum.Mol.Genet.）6,717-726.1997

·Liao等人,生物化学杂志（J.Biol.Chem.）271,28348-28358.1996

·Nebes等人,生物化学生物物理学研究通讯（Biochem.Biophys.Res.Commun.）200,239-245.1994

·Chester等人,引自：Durand P，O’Brian J（编著）糖蛋白代谢的遗传错误（Genetic errors of glycoprotein metabolism）.Edi-Ermes,米兰（Milan）,第89-120页.1982

·Thomas和Beaudet.引自：Scriver CR,BeaudetAL,Sly WA,Valle D（编著）遗传病的代谢和分子基础（The metabolic and molecular bases of inheriteddisease.）第5卷,McGraw-Hill,纽约（New York）,第2529-2562页.1995

·Hocking等人,生物化学杂志（Biochem J）128:69-78.1972

·Walkley等人,美国科学院院刊（Proc.Nat.Acad.Sci.）91:2970-2974,1994

·Crawley等人,儿科研究（Pediatr Res）46:501-509,1999

·Stinchi等人,人类分子遗传学（Hum Mol Genet）8:1366-72,1999

·Berg等人,生物化学杂志（Biochem J.）328:863-870.1997

·Tollersrud等人,欧洲生物化学杂志（Eur J Biochem）246:410-419.1997

·Walkley等人,美国科学院院刊（Proc.Nat.Acad.Sci.）91:2970-2974,1994

·Will等人,小儿疾病文献（Arch Dis Child）1987Oct;62（10）:1044-9

·Barton等人,新英格兰医学期刊（N Engl J Med）324:1464-1470

·Prows等人,美国医学遗传学杂志（Am J Med Genet）71:16-21

·Neufeld,E.F.酶替换疗法（Enzyme replacement therapy）,引自“脑的溶酶体病症（Lysosomal disorders of the brain）”（Platt,F.M.Walkley,S.V:编著牛津大学出版社(Oxfor University Press)）.

·Grubb等人,美国科学院院刊（PNAS）2008,105（7）第2616-2621页

·Roces等人,人类分子遗传学（Human Molecular Genetics）2004,13（18）第1979-1988页

·Blanz等人,人类分子遗传学（Human Molecular Genetics）2008,17（22）第3437-3445页

·WO 02/099092

·WO 05/094874

·WO 05/077093

·Berg等人,分子遗传学和新陈代谢（Molecular Genetics and Metabolism）,73,第18-29,2001页

·Heikinheimo等人,分子生物学杂志（J.Mol.Biol.）327,631-644,2003

·Hansen等人,生物化学杂志（Biochem.J.）（2004）,381,第537-567页

Claims

1.一种用于从细胞培养物中纯化人来源重组α-甘露糖苷酶的方法，其中，包含人来源重组α-甘露糖苷酶的所述细胞培养物部分在包含多模态配体的树脂上经历层析，并且其中结合树脂的所述多模态配体是式(I)、(II)或(III)的物质：

其中，式(II)和(III)的物质的R是式(IV)的官能团：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，包含人来源重组α-甘露糖苷酶的所述细胞培养物部分是澄清的未稀释收获物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，加载到包含多模态配体的树脂上的所述细胞培养物部分经历采用包含异丙醇的溶液的至少一个洗涤步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述包含异丙醇的溶液包含以体积比计的至少1％的异丙醇。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述包含异丙醇的溶液包含以体积比计的至少5％的异丙醇。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，重组α-甘露糖苷酶从包含多模态配体的树脂中使用包含乙二醇或丙二醇的水溶液洗脱。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，从包含多模态配体的树脂中获得的重组α-甘露糖苷酶进一步经历包括以下步骤的方法：

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述α-甘露糖苷酶具有SEQID NO2中所述的序列。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤i)的疏水性相互作用层析树脂是烷基或苯基琼脂糖凝胶树脂。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤ii)的混合模式离子交换树脂是陶瓷羟基磷灰石或氟磷灰石树脂。

11.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤iii)的阴离子交换树脂是季铵强阴离子交换树脂。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，进行病毒灭活步骤。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中，进行病毒缩减步骤。