KR20120128647A

KR20120128647A - 재조합 리소좀 알파-만노시다제의 제조 및 정제 방법

Info

Publication number: KR20120128647A
Application number: KR1020127022458A
Authority: KR
Inventors: 옌스 포그; 클라스 안데르센; 세실리아 베이겔트; 피아 하이덴; 헬레나 리우터발; 스티판 닐손
Original assignee: 지메넥스 에이/에스
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2012-11-27
Also published as: CY1123438T1; NZ601790A; US20150306186A1; US20120308549A1; PL2538968T3; CN102834111B; CA2790786A1; US20180036387A1; LTPA2018512I1; PL3281636T3; AU2011220163A1; NO2018032I1; HUS1800037I1; AU2011220163B2; EP2538968A1; EP3281636A1; BR112012020934B1; CN102834111A; DK3281636T3; RS60983B1

Abstract

본 발명은 재조합 알파-만노시다제(alpha-mannosidase)의 정제 방법, 알파-만노시다제의 제조 방법, 알파-만노시다제를 포함하는 조성물, 의약으로서 상기 조성물의 용도, 알파-만노시도시스(alpha-mannosidosis)를 치료하기 위한 의약으로서 용도 및 알파-만노시도시스를 치료하거나 및/또는 알파-만노시도시스 증상을 경감시키는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 리소좀 알파-만노시다제의 제조 및 정제 방법{PROCESS FOR PRODUCTION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT LYSOSOMAL ALPHA-MANNOSIDASE}

알파- 만노시도시스

알파-만노시도시스는 1/1.000.000 내지 1/500.000 빈도로 전세계에서 발생하는 상염색체성 열성 질환(recessive, autosomal disease)이다. 만노시도시스는 유럽, 아메리카, 아프리카 및 아시아의 모든 인종 그룹에서 발견된다. 이는 유사한 빈도로 리소좀 저장 질환에 대한 양호한 진단 서비스에 의해 모든 나라에서 검출된다. 이들은 분명히 건강하게 태어나지만, 이 질환의 증상은 진행성이다. 알파-만노시도시스는 매우 심각한 형태에서부터 매우 미약한 형태에 이르기까지 임상적 이질성을 나타낸다. 전형적인 임상적 증상은 정신지체, 골격 변화, 재발성 감염을 초래하는 손상된 면역계, 청각손상이며, 흔히 이 질환은 거친 얼굴, 돌출 이마, 평탄한 코뿌리(flattened nasal bridge), 작은 코, 및 넓은 입과 같은 특징적인 얼굴 특징과 관련된다. 대부분의 심각한 경우(만노시도시스 유형 I), 어린이들은 간비종대(hepatosplenomegaly)에 걸려서, 그 인생의 첫해 동안 죽는다. 이러한 요절은 상기 질환에 의해 유발된 면역결핍에 기인한 심각한 감염에 의해 유발된다. 경증인 경우(만노시도시스 유형 2), 환자들은 보통 성인 나이에 도달한다. 이들 환자의 골격 약화로 인해 나이 20 내지 40쯤에 휠체어를 필요로 하게 된다. 이 질환은 뇌의 분산성 기능장애를 유발하며, 간단한 읽기와 쓰기와 같은 가장 기본적인 기술도 배제되는 약한 정신적 해결능력을 초래한다. 청각 불능 및 기타 임상적 증상과 관련된 이들 문제는 환자가 독립적인 생활을 하지 못하게 하여, 결국 일생 동안 간호를 필요로 하게 된다.

리소좀 알파- 만노시다제

알파-만노시도시스는 리소좀 알파-만노시다제(LAMAN, EC3.2.1.24)의 결핍 활성으로부터 초래된다. 이 질환은 비-환원성 말단에서 α1,2-, α1,3- 및 α1,6-만노실 잔기를 갖는 올리고당류인 만노스-리치 올리고당류의 세포내 대량 축적을 특징으로 한다. 이들 올리고당류는 N-결합된 올리고당류를 갖는 당단백질의 리소좀내 분해로부터 주로 생긴다. 그러나, 일부는 돌리콜-결합된 올리고당류의 대사로부터 그리고 프로테오좀에 의한 분해를 위해 시토졸(cytosol)에 관련된 미스폴딩된(misfolded) 당단백질로부터 주로 생긴다(Hirsch et al. EMBO J. 22, 1036-1046, 2003 및 Saint-Pol et al. J. Biol. Chem. 274, 13547-13555, 1999). 리소좀 저장은 모든 뇌 영역의 뉴런을 비롯하여 다양한 범위의 세포 유형 및 조직에서 발견된다. LAMAN은 N-결합된 당단백질의 순서화된 분해 동안 비환원성 말단으로부터 알파-D-만노시드 중의 이들 말단성, 비환원성 알파-D-만노스 잔기를 가수분해하는 엑소글리코시다제이다(Aronson and Kuranda FASEB J3 :2615-2622. 1989). 인간 전구체 효소는 49개 잔기의 단일 펩티드를 비롯한 1011개 아미노산의 단일 폴리펩티드로서 합성된다. 상기 전구체는 15, 42 및 70 kD의 3개의 주요 글리코펩티드로 단백질 가수분해적으로 처리되어 리소좀에서 성숙 효소로 된다. 상기 70 kD 글리코펩티드는 더 처리되어 디설피드 브릿지에 의해 결합된 3개의 서브유닛으로 된다(Berg et al. Mol. Gen. and Metabolism 73, 18-29, 2001, Nilssen et al. Hum. Mol. Genet. 6, 717-726. 1997).

리소좀 알파- 만노시다제 유전자

LAMAN를 코딩하는 유전자(MANB)는 염색체 19(19cen-ql2)에 위치한다(Kaneda et al. Chromosoma 95:8-12. 1987). MANB는 24개 엑손으로 구성되며, 21.5 kb에 달한다(GenBank 수탁번호 U60885-U60899; Riise et al. Genomics 42:200-207, 1997). LAMAN 전사물은 ? 3,500 뉴클레오티드(nts)이며, 1,011개 아미노산을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유한다(GenBank U60266.1).

LAMAN를 코딩하는 인간 cDNA의 클로닝 및 서열화는 3개의 논문에 개시되어 있다(Nilssen et al. Hum. Mol. Genet. 6, 717-726. 1997; Liao et al. J.Biol.Chem. 271, 28348-28358. 1996; Nebes et al. Biochem.Biophys.Res.Commun. 200, 239-245. 1994). 흥미롭게는, 상기 3개 서열은 동일하지 않다. Nilssen 등의 서열(수탁 # U60266.1)과 비교할 때 위치 1670 및 1671에서 TA에서 AT 변화는 발린에서 아스파라긴산 치환을 초래하며 이는 Liao 등 및 Nebes 등에 의해 발견되었다. 위치 1152에서 C에서 A로의 변화는 아미노산 서열에서 어떠한 변화도 초래하지 않는 것으로 밝혀졌다.

진단

알파-만노시도시스의 진단은 현재 임상 평가, 요에서 만노스-리치(mannose-rich) 올리고당류의 검출, 및 백혈구, 섬유아세포 및 양수세포와 같은 다양한 세포 유형에서 알파-만노시다제 활성의 직접적 측정을 기본으로 한다(Chester et al., In : Durand P, O'Brian J (eds) Genetic errors of glycoprotein metabolism. Edi-Ermes, Milan, pp 89-120. 1982; Thomas and Beaudet. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WA, Valle D (eds) The metabolic and molecular bases of inherited disease. Vol 5. McGraw-Hill, New York, pp 2529-2562. 1995).

상기 증상은 처음에는 흔히 경증이고 생화학적 진단이 어렵기 때문에, 상기 진단은 상기 질병이 진행하는 동안 후기에 이루어진다. 환자와 이들의 가족들은 조기 진단의 이득을 얻을 수 있음이 분명하다.

동물 모델

알파 만노시도시스는 소(Hocking et al. Biochem J 128:69-78. 1972), 고양이(Walkley et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 91 : 2970-2974, 1994), 및 기니아 피그 (Crawley et al. Pediatr Res 46: 501-509, 1999)에서 기재되어 있다. 마우스 모델은 알파-만노시다제 유전자의 표적 파쇄에 의해 최근에 생성되었다(Stinchi et al. Hum Mol Genet 8: 1366-72, 1999).

인간에서와 같이 알파 만노시다제는 리소좀 알파-만노시다제를 코딩하는 유전자에서 특정 돌연변이에 의해 유발될 수 있는 것으로 보인다. Berg 등(Biochem J. 328:863-870.1997)은 고양이 간 리소좀 알파-만노시다제의 정제 및 그의 cDNA 서열의 결정을 보고하였다. 상기 활성 효소는 분자량이 72, 41, 및 12 kD인 것으로 보고된 3개의 폴리펩티드로 구성된다. 인간 효소와 유사하게, 상기 고양이 효소는 50개 아미노산의 추정 단일 펩티드에 이어 957개 아미노산의 폴리펩티드 사슬을 갖는 단일사슬 전구체로서 합성되며, 성숙 효소의 3개 폴리펩티드로 절단되는 것으로 알려졌다. 추론된 아미노산 서열은 인간 및 소의 서열에 비교하여 각각 81.1% 및 83.2% 동일하였다. 병이 난 페르시안 고양이에서는 4-bp 결실이 확인되었다; 이러한 결실은 코돈 583에서부터 프레임시프트(frameshift)와 코돈 645에서 미성숙 종결(termination)을 초래한다. 상기 고양이의 간에서는 어떠한 효소 활성도 검출될 수 없었다. 경미한 표현형을 나타내는 집에서 기르는 긴털 고양이는 2%의 정상 효소 활성을 가졌다; 상기 고양이는 4-bp 결실을 보유하지 않았다. Tollersrud 등(Eur J Biochem 246:410-419. 1997)은 소 신장 효소를 동종성으로 정제하였고 그 유전자를 클로닝하였다. 상기 유전자는 16 kb에 달하는 24개 엑손으로 이루어져 있었다. 상기 유전자 서열을 토대로 하여, 이들은 소에서 2개의 돌연변이를 확인하였다.

알파- 만노시도시스 요법에 대한 의료적 필요

만노스-리치 올리고당류의 축적에 기인한 심각한 임상적 증상에 비추어 보아, 알파-만노시도시스에 대한 효과적 치료 부족이 잘 인지된다. 현재로서는, 상기 질환을 치료하기 위한 주요 치료적 선택은 골수 이식이다. 그러나, 본 발명의 목적은 장래의 유력한 대체적 요법으로서 효소 치환 요법을 육성하는 것이다.

골수 이식

1996년에 Walkley 등(Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 2970-2974, 1994)은 1991년에 골수 이식(BMT)으로 치료된, 만노시도시스에 걸린 3마리의 고양이에 대한 논문을 발표하였다. 희생된 2마리 동물에서 체내에서 뿐만 아니라 더욱 중요하게는 뇌에서도 정상화가 발견되었다. 세번째 고양이는 6년 이후도 잘 살았다. 보통, 미처리 고양이는 3-6개월 이내에 죽는다. 1987년 만노시도시스에 걸린 한 어린이가 BMT에 의해 치료되었다(Will et al. Arch Dis Child 1987 Oct;62(10): 1044-9). 그 아이는 처치와 관련된 합병증으로 인하여 18주 후에 죽었다. 뇌에서는 효소 활성이 거의 발견되지 않았다. 이러한 실망스런 결과는 죽기 전에 과도한 면역억제 치료에 의한 것으로 설명되거나, 또는 BMT 후에 뇌에서 효소 활성이 증가하기에는 시간이 걸린다는 것으로 설명될 수 있다. 공여자는 엄마(보균자로서 50% 미만의 효소 활성을 가질 것으로 예상됨)이었고 또는 인간에서 BMT가 뇌에서 효소 작용에 대하여 아무런 효과를 갖지 않을 수 있다. 다양한 결과에도 불구하고 골수 이식의 수차례 시도는 성공적인 이식(engraftment)이 알파-만노시도시스의 임상 증상을 적어도 일부 교정할 수 있음을 나타내었다. 그러나, 인간 요법에서 골수 이식을 적용할 때의 심각한 처치 관련 합병증을 감소시키는 도전은 여전히 성공하지 못하고 있다.

효소 치환 요법

리소좀 저장 질환이 발견되었을 때, 이것이 효소 치환에 의해 치료될 수 있을 것이라는 희망이 증가하였다. 효소 치환 요법은 고셔 질환에서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 외인성 리소좀 글루코세레브로시다제가 환자에게 주사되면, 이 효소는 효소 결핍 세포에 의해 흡수된다(Barton et al. N Engl J Med 324: 1464-1470). 이러한 흡수는 예컨대 단핵구 세포/대식세포 세포주 및 간세포와 같은 특정 세포 유형에 한정되는 아시알로 당단백질 수용체 및 만노스 수용체와 같은 세포의 표면 및 기타 수용체 상에 거의 흔하게 있는 만노스-6-포스페이트 수용체와 같은 세포 표면 상의 특정 수용체에 의해 조절된다. 따라서 상기 효소의 세포성 흡수는 그의 글리코실화 특징에 상당히 의존한다. 적절하게 고안되면, 상기 결핍 효소는 당뇨병 환자가 인슐린을 받는 것과 동일한 방식으로 외인성 효소를 규칙적으로 주사하는 것에 의해 치환될 수 있다. 효소-결핍 섬유아세포의 매질에 부가된 정제된 활성 리소좀 알파-만노시다제를 사용한 시험관내 연구는 리소좀 기질 축적의 교정을 나타내었다. 한편, 생체내 치료는 어려운 대규모 생산 및 정제 과정으로 인하여 충분한 양의 효소를 생산하는 문제에 의해, 그리고 외인성 효소에 대한 면역 반응으로부터 기인한 합병증에 의해 부분적으로 방해되어 왔다.

그러나, 가장 중요하게는, 그 임상적 증상이 중앙 신경계 내에서의 증가된 리소좀 저장과 관련된 알파-만노시도시스와 같이, 주요 신경학 성분에 의한 리소좀 저장 질환에 대해서는 특별한 배려를 한다. 따라서 효소 치환 요법은 고셔 질환의 급성 신경병증 변이에 대해서 효과적이지 않은 것으로 알려져 있다(Prows et al. Am J Med Genet 71: 16-21).

치료적 효소를 뇌에 전달하는 것은 혈뇌 장벽(blood-brain barrier)을 통하여 이들 대형 분자의 수송이 부재하는 것에 의해 방지된다. 뇌에서 치료제의 효과를 보기 위해서는 혈뇌 장벽을 피해야한다는 일반적 관념에서, 아주 다양한 전달 시스템의 사용이 고안되었다. 이들은 예를 들어 만니톨에 의한 혈뇌 장벽의 삼투적 개방과 같은 침습적 수법 및 키메라 효소의 수용체 매개된 세포내 섭취(endocytosis)와 같은 비침습적 수법을 포함한다. 효소 치환은 규칙적인 효소의 투여를 필요로 할 것으로 예상되므로, 비침습적 수법의 이용은 피해야 한다. 비침습적 수법의 이용은 동물 모델에서 최근에 들어서야 유망한 결과를 제공하였다(알파-만노시도시스의 경우, 하기 참조, 다른 리소좀 질환의 경우 예를 들어 Grubb et al. PNAS 2008, 105(7) pp. 2616-2621 참조). 내장기관 및 수막에서 저장 감소는 뇌로 전달될 올리고당류의 양을 감소시킬 수 있을 것으로 생각되어 왔다. 그러나 이러한 고려사항은 신경학적 손상이 주된 것이라, 심각한 리소좀 질환에 적용될 수 있을 것이라고는 생각되지 않는다 (Neufeld, E. F. Enzyme replacement therapy, in "Lysosomal disorders of the brain" (Piatt, F. M. Walkley, S. V: eds Oxford University Press).

그러나, Roces et al. Human Molecular Genetics 2004, 13(18) pp. 1979-1988, Blanz et al. Human Molecular Genetics 2008, 17(22) pp. 3437-3445 및 WO 05/094874호에 기재된 바와 같이, 예를 들어 알파-만노시다제를 포함하는 제제의 정맥 주사를 사용하여 동물의 중앙신경계에서 LAMAN의 수준을 증가시킬 수 있어, 상기 중앙신경계의 하나 이상의 영역 내에서 중성 만노스-리치 올리고당류의 세포내 수준을 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이는 알파-만노시도시스에 걸린 환자의 효소 치환 요법에서 재조합 알파-만노시다제가 유용하다는 것을 나타낸다. 따라서, 효소 치환을 사용하여 알파-만노시도시스의 효과적인 치료를 제공하는 것에 대한 주요한 남아있는 난관은 충분한 양의 순수한 재조합 알파-만노시다제를 비용 효과적인 방식으로 제공하는 것이다.

알파- 만노시다제의 제조 및 정제

WO 02/099092호는 37℃에서 무혈청 배지를 사용하여 CHO 세포에서 rhLAMAN를 소규모 생산하는 방법을 개시한다. 소규모 정제 방법은 조 효소의 투석여과(diafiltration) 및 포획 단계에서 DEAE 세파로스 FF 컬럼을 이용한 약한 음이온 교환 크로마토그래피에 이어, 소수성 상호작용- 및 혼합 모드 크로마토그래피를 비롯한 다수의 크로마토그래피 정제 단계를 포함하는 것으로 기재되어 있다.

WO 05/094874호는 37℃에서 무혈청 배지를 사용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 rhLAMAN의 소규모 생산 방법을 개시한다. WO 02/099092호의 방법과 유사한 소규모 정제 방법이 또한 기재되어 있다.

WO 05/077093호는 고인산화 리소자임 효소의 제조를 개시한다. 실시예 IV에는 다중모드 수지(블루-세파로스)를 사용하여 산 알파-글루코시다제(GAA)를 정제하는 방법이 기재되어 있다. GAA는 리소자임 효소이지만 rhLAMAN과는 완전히 상이하다. GAA는 고인산화되는 반면에, rhLAMAN는 낮은 인산화 정도를 갖는다. 또한, 서열 동일성 점수는 GAA와 rhLAMAN 사이에 12% 미만이고, 결국 이들의 이론적 등전점은 1 이상의 pH 단위(5.42 및 6.48, 각각) 정도로 상이하다. 따라서, GAA를 정제하기 위한 WO 05/077093호에 기재된 바와 같은 방법은 rhLAMAN에 적용될 수 없다.

0.25% (V/V) 혈청 및 DMSO 부가를 이용하여 CHO 세포에서 rhLAMAN를 소규모 생산하는 방법은 개시되어 있다(Berg et al. Molecular Genetics and Metabolism, 73, pp 18-29, 2001). 이것은 또한 a) 한외여과, 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과를 비롯한 3단계 과정 또는 b) 단일 단계 면역친화성 크로마토그래피를 포함하는 2개의 정제 방법을 기재한다. 방법 a)가 어떻게 55 kDa 및 72 kDa 단편으로 전체적으로 단편화되는 130 kDa 효소 단편을 초래하는지에 대해 기재되어 있는 반면에, 방법 b)는 130 kDa 전구체를 유의한 양의 55 및 72 kDa 단편으로 부분적으로 단편화하는 방법이 개시되어 있다.

따라서, 재조합 알파-만노시다제를 제조하고 정제하기 위한 개선된 방법이 유리할 것이다. 특히, 알파-만노시다제를 발현할 수 있는 세포주를 대규모 배양하는 개선된 방법 및 세포 배양액으로부터 높은 효소 활성을 갖는 순수한 알파-만노시다제를 단리하기 위한 더욱 효과적인 대규모 정제 방법이 유리할 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 알파-만노시다제를 제조하고 정제하는 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 높은 효소 활성을 갖는 고순도 알파-만노시다제를 충분량 제공하는 것에 의해 종래 기술의 상술한 문제를 해결하는 측정가능한 제조 및 정제 방법을 제공하여, 알파-만노시도시스에 걸린 환자 치료를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 일 요지는 세포 배양액으로부터 재조합 알파-만노시다제를 정제하는 방법으로서, 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 상기 세포 배양액의 분획은 다중모드 리간드를 포함하는 수지 상에서 크로마토그래피 처리되는 정제 방법에 관한 것이다. 놀랍게도, 본 발명자들은 상기 정제 방법이 이전에 달성된 것에 비하여 고순도 및 더 높은 %의 소망하는 130 kDa 당단백질 종을 갖는 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 조성물을 초래하는 것을 밝혀내었다. 정제 후 단편화되지 않은 130 kDa 당단백질의 지속적인 높은 %(80% 이상과 같은)를 달성하는 것은 단편화된 효소에 비하여 더욱 균일한 생성물을 제공하므로 유리하고, 따라서 약학 등급 생성물을 얻는 능력을 향상시킨다.

본 발명의 다른 요지는 다음 단계를 포함하는 재조합 알파-만노시아제를 유가식(fed batch)으로 또는 연속적으로 제조하는 방법에 관한 것이다:

a. 0일에 기본 배지(base medium)를 포함하는 생산 반응기에 재조합 알파-만노시다제를 생성할 수 있는 세포를 접종시키는 단계;

b. 상기 세포 배양액에 1일로부터 적어도 1회 유가 배지(feed medium)를 부가하는 단계;

c. 3일 후 또는 생존성 세포 밀도가 2.1 MVC/mL 보다 높을 때 중 먼저 오는 경우에 상기 세포 배양액의 온도를 많아야 35℃, 예컨대 34℃, 33℃, 32℃, 바람직하게는 많아야 31℃로 조절하는 단계.

놀랍게도 본 발명자들은 상기 제조 방법이 희석없이 본 발명의 정제 컬럼으로 용이하게 전달될 수 있는, 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 세포 배양액을 고수율로 초래한다는 것을 발견하였다.

본 발명의 다른 요지는 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 조성물로서, 알파-만노시다제의 적어도 80%가 130 kDa 당단백질로 존재하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 요지는 알파-만노시도시스 치료에 사용하기 위한 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 조성물이다.

본 발명의 다른 요지는 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 검체에게 투여하는 단계를 포함하는, 알파-만노시도시스를 치료하는 방법 및/또는 알파-만노시도시스와 관련된 증상을 감소 또는 경감시키는 방법이다.

도 1은 수집에서부터 약물 물질 충전에 이르기까지의 알파-만노시다제에 대해 현재의 바람직한 정제 방법 설계의 개요를 도시한다.
도 2는 알파-만노시다제에 대한 Capto^TM MMC 컬럼 크로마토그램의 일례를 도시한다.
도 3은 알파-만노시다제에 대한 부틸 세파로스^TM FF 컬럼 크로마토그램의 일례를 도시한다.
도 4는 알파-만노시다제에 대한 CHT 유형 1 컬럼 크로마토그램의 일례를 도시한다.
도 5는 알파-만노시다제에 대한 Q 세파로스^TM HP 컬럼 크로마토그램의 일례를 도시한다.
도 6은 130 kDa, 75 kDa 및 55 kDa 당단백질 종의 분포를 나타내는, 정제된 알파-만노시다제 조성물의 SDS-페이지 크로마토그램을 도시한다.
도 7은 130 kDa 종의 양이 55 및 75 kDa 종과 비교하여 도시되어 있는, 정제된 알파-만노시다제에 대한 3개의 HPLC 다이아그램을 도시한다. 좌측으로부터 제1 피크는 55 kDa 종이고, 이어 각각 130 kDa 및 75 kDa 종이다. 상기 2단계 공정은 다중모드 리간드 크로마토그래피 단계를 이용하지 않는 것인 반면에, 3 및 4-단계 공정은 다중모드 리간드 크로마토그래피 단계를 이용한다.
본 발명은 이하에서 더 자세하게 기재될 것이다.

정의

본 발명을 더욱 자세하게 논의하기 전에, 이하의 용어 및 명명법을 다음과 같이 정의한다:

재조합 알파- 만노시다제

본 발명의 내용에서 재조합 알파-만노시다제는 그의 기원 또는 조작으로 인하여 자연에서 발견되는 야생형 알파-만노시다제의 전체 또는 일부와 동일하지 않은 알파-만노시다제로서 정의된다. 따라서, 이것은 보통 천연에서는 제1 서열이 제2 서열과 융합되지 않는, 적어도 2개의 융합된 DNA 서열을 포함하는 하이브리드 DNA 서열인 재조합 DNA 분자를 포함하는 재조합 수법을 이용하여 작성된다. 상기 재조합 알파-만노시다제 단백질은 인간 기원 또는 비인간 기원일 수 있다. 특히, 이것은 재조합 인간 리소좀 알파-만노시다제(rhLAMAN)일 수 있다. 상기 알파-만노시다제 생성물은 단일 폴리펩티드이거나 또는 단일 폴리펩티드와 그의 분획의 혼합물일 수 있다. 또한 상기 알파-만노시다제는 번역후 수식 처리될 수 있고 따라서 당단백질 형태일 수 있다.

세포 배양

세포 배양은 제어되는 조건하에서 세포가 성장하는 방법이다. 본 발명의 내용에서 상기 세포 배양의 세포는 재조합 알파-만노시다제와 같은 관심을 갖고 있는 단백질을 발현하도록 특이적으로 설계된다. 상기 세포 배양은 화학적 및 물리적 조건의 제어를 허용하도록 특별하게 설계된 바이오리액터(bioreactor)에 존재할 수 있다.

분획

본 발명의 내용에서 분획은 세포 배양의 분획을 지칭한다. 상기 분획은 전체 세포 배양액을 구성할 수 있지만, 흔히 청정화(clarified)되고, 여과되며, 농축되고, 희석되거나, 또는 부분적으로 정제된 분획과 같은 배양액의 처리된 분획이다.

수지

본 발명의 내용에서 수지는 크로마토그래피 계 내에서 정지상의 기본을 구성하며, 그 위에는 소정 분자 또는 관심을 두는 단백질에 대하여 특정 양의 친화성을 제공하도록 다양한 화학 기 또는 물질이 부착되어 있다. 수지는 흔히 공유적으로 결합된 리간드를 갖는 중합체 비이드이며, 상기 수지는 사용된 액체 이동상에서 불용성이다.

다중모드 리간드

다중모드 리간드라는 것은 관심을 두고 있는 분자 또는 단백질과 적어도 2개 방식으로 상호작용하도록 설계된 임의 리간드를 의미한다. 개별 상호작용은 독립적으로 소수성, 친수성, 이온성, 반 데어 발스 상호작용, 수소 결합 또는 임의의 기타 분자간 화학적 또는 물리적 상호작용일 수 있다. 본 발명의 내용에서 리간드는 상기 정의된 바와 같은 수지에 부착된 유기 화학 물질이다. 다중모드 리간드는 이동상에 용해된, 크로마토그래피 컬럼을 통과하여 이동상에 용해된 상이한 물질에 대하여 상이한 친화성을 가질 것이다. 친화성에서 이러한 차이는 크로마토그래피 컬럼 상에서 상이한 물질의 체류 시간에서 다양성을 초래하여, 상기 물질의 분리를 가능하게 할 것이다. 상기 체류 시간은 또한 예를 들어 이동상의 구성성분, pH 및 온도와 같은 다른 인자에도 의존한다. 다중모드 리간드를 포함하는 수지는 때때로 "혼합 모드" 수지로도 지칭되지만, 본 발명의 내용에서 다중모드 리간드를 포함하는 수지는 세라믹 히드록시아파타이트 수지(CHT)의 경우에서 예를 들어 -OH, -Ca⁺ 및 -P0₄ ² ^- 와 같은 대향 전하를 가질 수 있는 동일 수지 상에 몇 개의 상이한 "리간드"를 포함하는 소위 "혼합 모드 이온 교환 수지"와 혼동되지 않아야 한다. 이들 수지에서 상기 개별적 리간드는 다중모드가 아니다.

로딩( loading )

본 발명의 내용에서 로딩은 수집물, 용출물 또는 기타 용액을, 수지를 정지상으로 포함하는 크로마토그래피 컬럼과 같은 크로마토그래피계 상으로 전달하는 것을 지칭한다.

완충액(Buffer)

상기 용어 완충액은 pH에서 변화에 견디는 약산 및/또는 그의 상응하는 염 또는 약 염기 및/또는 그의 상응하는 염을 함유하는 용액의 일반적 기재로서 잘 알려져 있다. 본 발명의 내용에서 사용된 상기 완충액은 크로마토그래피계에 사용하기에 적합하며, 이러한 완충액은 비제한적으로 포스페이트 완충액, 예를 들어 인산 이나트륨(Na₂HP0₄), 인산 나트륨 또는 인산 칼륨, 아세테이트 완충액, 예를 들어 아세트산 나트륨 또는 아세트산 칼륨, 설페이트 완충액, 예를 들어 황산 나트륨 또는 황산 칼륨, 황산 암모늄 또는 Hepes, 또는 기타 완충액, 예를 들어 붕산 나트륨 또는 트리스-HCl 완충액을 포함한다.

한외여과

한외여과는 분자와 용매가 컷오프(cut-off) 크기 또는 값으로도 알려진 특정 크기의 기공을 포함하는 막을 거치게 하기 위해 수압이 이용되는 분리 방법이다. 막의 컷오프 값보다 작은 분자량을 갖는 분자만이 막을 통과할 수 있는 반면에 더 큰 분자량을 갖는 분자는 막을 통과할 수 없고 소위 투석유물((retentate)을 형성한다. 투석유물에 존재하는 분자는 용매가 막을 거쳐 흘러감에 따라서 농축될 수 있다.

특별한 실시양태에서 알파-만노시다제와 같은 폴리펩티드를 포함하는 용액 또는 조성물의 농도는 TFF(Tangential flow filtration)에 의해 실시될 수 있다. 이 방법은 대규모 농축, 즉 1리터 내지 수백 리터 부피를 갖는 용액의 농축에 특히 유용하다. 따라서 이 방법은 공업적 규모로 관심을 두고 있는 폴리펩티드의 농축된 용액의 생성에 특히 유용하다.

상기 TFF 기술은 용액이 여과되어 반투과성 막을 통과하게 하는 특정 장치의 이용을 기본으로 한다; 막 기공보다 작은 분자만이 막을 통과하여, 여액을 형성하며, 더 큰 것은 수집된다(투석유물). 이 TFF 방법을 이용할 때 2개의 상이한 압력이 인가된다; 하나는 용액을 펌핑하여 계로 보내어 이것이 계 내에서 순환하게 하는 것(입구 압력), 그리고 다른 압력은 막 위에 인가되어(막 압력) 소형 분자와 용매가 막을 통과하게 한다. 입구 압력은 전형적으로 1-3 바, 예컨대 1.5-2 바 범위일 수 있다. 투과압(transmembrane pressure: TMP)은 전형적으로 1 바(bar)보다 더 클 수 있다. 관심을 갖고 있는 폴리펩티드의 농축 조성물은 TFF를 사용하여 조성물을 농축할 때 투석유물로서 수집될 수 있다. TFF에 유용한 막은 전형적으로 재생 셀룰로오스 또는 폴리에테르설폰(PES)으로 제조될 수 있다.

투석여과

본 발명의 내용에서 투석여과는 관심을 갖고 있는 종이 투석유물 중에 있는, 즉 필터를 통과할 수 없는 반면에, 예컨대 완충액 및 염과 같은 다른 성분은 필터를 통과하는 여과 공정이다. 따라서 투석여과는 예컨대 1개 완충액을 서로 교환하기 위하여 또는 재조합 알파-만노시다제와 같은 관심을 갖고 있는 종을 함유하는 용액을 농축하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 제1 요지는 세포 배양액으로부터 재조합 알파-만노시다제를 정제하는 방법으로서, 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 상기 세포 배양액의 분획은 다중모드 리간드를 포함하는 수지 상에서 크로마토그래피 처리되는 방법을 제공한다. 본 발명의 내용에서 다중모드 리간드를 포함하는 수지를 사용하는 이점은, 이들 수지가 고 수준의 도전성을 갖는 용액에서 알파-만노시다제 종의 결합을 가능하게 하는 점이다. 이것은 고 도전성을 갖는 희석되지 않은 수집물이 사용될 수 있고, 수집 완충액의 교환이 필요하지 않는 이점을 갖는다. 따라서 다중모드 리간드를 포함하는 크로마토그래피 단계는 바람직하게는 세포 배양액으로부터의 분획을 단리한 후 제1 크로마토그래피 단계일 수 있다. 다중모드 리간드를 포함하는 상기 크로마토그래피 단계를 흔히 "포획 단계"라 칭할 수 있으며, 이는 상기 관심을 갖고 있는 단백질이 컬럼에 먼저 걸리(즉, 포획됨)는 반면에, 많은 불순물들은 세척 단계 동안 상기 컬럼을 통과하기 때문이다. 상기 단백질은 특정 용출 완충액을 사용하여 용출된다.

따라서, 본 발명의 일 실시양태에서 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 세포 배양액의 분획이 청정화된 희석되지 않은 수집물인 방법이 제공된다. 본 발명의 내용에서 용어 "청정화된 희석되지 않은 수집물"은 용해되지 않은 물질 또는 고체를 갖지 않는, 즉 투명한 용액인 세포 배양액의 수집물을 의미한다. 상기 수집물은 투명 용액으로 전환되도록 처리될 수 있다. 이러한 처리는 비제한적으로 여과 및 원심분리를 포함할 수 있다. 또한, 상기 수집물은 크로마토그래피 단계에 처리되기 전에 유의하게 희석되지 않는다. 따라서 상기 수집물은 10% 미만, 예컨대 7% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 예컨대 0.1% 미만으로 희석된다. 가장 바람직한 실시양태에서 상기 수집물은 희석되지 않는다.

다른 실시양태에서 상기 청정화된 희석되지 않은 수집물이 10-20 mS/cm, 예컨대 12-17 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 도전성을 갖는 방법이 제공된다. 상기 도전성은 상기 수집물을 크로마토그래피 계에 로딩하기 전에 측정한다.

일 실시양태에서 상기 크로마토그래피는 카복시산 또는 설폰산 기를 갖는 다중모드 리간드를 포함하는 수지 상에서 실시된다. 이들 리간드에 포함된 카복시산 및/또는 설폰산은 크로마토그래피계에서의 조건, 특히 이동상의 pH에 따라서 양성자화된 형태 또는 탈양성자화된 (염) 형태일 수 있다.

또 다른 실시양태에서 다중모드 리간드에 결합된 수지가 하기 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 물질인 방법이 제공된다:

식 중에서, 화학식(II) 및 (III)의 물질의 R은 하기 화학식(IV)의 작용기임.

화학식(IV)의 작용기로 나타낸 다중모드 리간드는 일반적으로 "Cibracon Blue 3G"로 지칭하며 화학식(I), (II) 및 (III)의 물질로 표시되는 시판되는 생성물의 예는 각각 "Capto^TM MMC", "Capto^TM Blue" 및 "Blue 세파로스^TM fast flow" 이다. 다중모드 유형의 다른 유용한 수지는 다음을 포함한다: Capto^TM Adhere, MEP HyperCel^TM, HEA HyperCel^TM 및 PPA HyperCel^TM. 본 발명의 내용에서 이러한 수지는 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 희석되지 않은 수집물의 초기 정제에서 특히 효과적인 것으로 밝혀져 있다.

본 발명의 부가적 실시양태는 다중모드 리간드를 포함하는 수지 상에 로딩된 상기 세포 배양액의 분획을 이소프로판올, 바람직하게는 적어도 1% (V:V) 이소프로판올, 예컨대 적어도 2%, 3%, 4%, 4.5% (V:V) 이소프로판올, 바람직하게는 적어도 5% (V:V) 이소프로판올을 포함하는 용액을 사용한 적어도 하나의 세척 단계에 처리시키는 방법을 제공한다. 이소프로판올을 포함하는 용액을 사용하는 이점은 원하지 않는 숙주 세포 단백질(HCP)을 더 잘 제거하여, 소망하는 130 kDa rhLAMAN 종의 단백질분해성 분해에 관련된 프로테아제를 제거하도록 돕는 것이다. HCP는 제조하는 동안 세포 배양액에 사용된 숙주 세포에 대한 내생 단백질로서 이해된다. 이소프로판올이 바람직하지만, 상기 방법에 유용한 다른 알코올은 에탄올, n-프로판올 및 n-부탄올을 포함한다.

또 다른 실시양태에서 세척 단계에 사용된 용액의 pH가 pH 3.5-6.5 범위, 예컨대 pH 4.0-6.0, pH 4.5-5.5, 바람직하게는 pH 4.7-5.0인 방법이 제공된다.

다른 실시양태는 세척 단계에 사용된 용액이 바람직하게는 0.05-1.6M, 예컨대 0.1-1.5M, 0.5-1.4M, 0.7-1.3M, 0.8-1.2M, 0.9-1.1M, 바람직하게는 0.95M 범위의 농도로 아세테이트 완충액을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 아세테이트 완충액은 바람직하게는 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨, 아세트산 리튬, 아세트산 암모늄로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태는 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 제1 용출액이 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 수용액을 사용하여, 다중모드 리간드를 포함하는 수지로부터 용출되는 방법을 제공한다. 에틸렌 글리콜을 용출 완충액에 부가하는 것은 용출된 재조합 알파-만노시다제의 수율을 현저히 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 프로필렌 글리콜도 도한 수율을 향상시켰지만, 에틸렌 글리콜이 바람직하다.

일 실시양태는 수용액 중의 에틸렌 글리콜 또는 프로프로필렌 글리콜의 농도가 20-60%, 20-50%, 25-50%, 3O-50%, 35-45%, 예컨대 40%인 방법을 제공한다.

바람직한 실시양태에서 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 수용액이 염화나트륨을 포함하는 방법이 제공된다. 상기 용액에 염화나트륨을 부가하는 것은 rhLAMAN 효소의 용출을 증진시키는 것에 의해 수율을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌다.

다른 실시양태에서 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 수용액 중의 염화 나트륨의 농도는 0.2 내지 2.4 M 범위, 예컨대 0.4 내지 2.2 M, 0.6 내지 2.0 M, 0.8 내지 1.9 M, 1.0 내지 1.8 M, 1.2 내지 1.7 M, 1.4 내지 1.6 M, 바람직하게는 1.5 M이다. 다르게는, 염화 나트륨의 농도는 0.2 내지 1.6 M 범위 또는 1.4 내지 2.4 M 범위일 수 있다.

바람직한 실시양태에서 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 수용액은 완충액을 포함한다. 상기 완충액은 바람직하게는 포스페이트 완충액, 예컨대 인산 나트륨 또는 인산 칼륨일 수 있다. 포스페이트 완충액이 바람직하지만, 수용액에 유용한 부가적인 완충액은 시트레이트 및 보레이트 완충액, 트리스, MES, MOPS 및 Hepes 완충액을 포함한다.

다른 바람직한 실시양태에서, 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 수용액 중의 완충염의 농도는 50-350 mM, 55-300 mM, 65-280 mM, 70-250 mM, 75-200, 80-200 mM, 85-150 mM, 바람직하게는 90 mM이다.

더 다른 바람직한 실시양태에서, 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 수용액의 pH는 pH 7.0-9.0, 예컨대 pH 7.1-8.5, pH 7.2-8.3, pH 7.5-8.0, 바람직하게는 pH 7.7이다.

일 실시양태에서 다중모드 리간드를 포함하는 수지로부터 얻어진 알파 만노시다제를 포함하는 제1 용출액이 다음 단계를 포함하는 방법에 더 처리되는 방법이 제공된다:

i) 알파-만노시다제를 포함하는 분획을 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지에 적용하여 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 용출액을 제공하는 단계;

ii) 알파-만노시다제를 포함하는 분획을 혼합 모드 이온 교환 수지를 통과하게 하면서 오염물의 체류를 허용하여 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 통과분획(flow through)을 제공하는 단계;

iii) 알파-만노시다제를 포함하는 분획을 음이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 처리하여 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 용출액을 제공하는 단계.

일 실시양태에서 상술한 바와 같은 단계 i)-iii)을 포함하는 방법이 제공되며, 단계 i) 중의 분획은 다중모드 리간드를 포함하는 상기 수지 상에서의 정제에 처리되었고, 단계 ii)의 분획은 단계 i)로부터 얻은 용출액으로부터 유도되며, 단계 iii)의 분획은 단계 ii)로부터 얻은 통과분획으로부터 유도된다. 즉, 단계 i) 내지 iii)은 단계 i) 내지 iii) 사이의 중간 단계를 방해하지 않고 이들이 수록된 순서대로 실시된다. 이들은 중간 정제 단계 및/또는 바이러스 감소 또는 바이러스 제거 단계일 수 있다.

바람직한 실시양태에서 단계 i)의 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지는 알킬 치환된 수지, 바람직하게는 부틸 세파로스 수지이다. 알킬 치환된 수지는 에틸-, 부틸- 및 옥틸 세파로스 수지를 포함할 수 있다. 또한, 페닐 세파로스 수지도 적용가능하다. 이러한 수지의 예는 부틸-S 세파로스^TM 6 Fast Flow, 부틸 세파로스^TM4 Fast Flow, 옥틸 세파로스^TM 4 Fast Flow, 페닐 세파로스^TM 6 Fast Flow (high sub) 및 페닐 세파로스^TM 6 Fast Flow(low sub), 부틸 세파로스^TM High Performance, 페닐 세파로스^TM High Performance이다. 소수성으로 상호작용성인 수지 및 특히 부틸 세파로스 수지를 포함하는 정제 단계의 이점은 rhLAMAN 효소의 양호한 수율을 유지하면서 숙주 세포 단백질 및 DNA 잔기를 효과적으로 제거하는 것이다.

또 다른 실시양태에서 단계 i)은 적어도 하나의 세척 단계를 포함하며, 상기 세척에 사용된 용액은 포스페이트 완충액 및 아세테이트 완충액, 바람직하게는 인산 나트륨 및 아세트산 나트륨을 포함한다. 이러한 이중 완충액 세척 단계는 숙주 세포 단백질 및 DNA 잔기와 같은 불순물을 제거하는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.

또 다른 실시양태에서 단계 i)의 이중 완충액 세척에서 포스페이트 완충액의 농도는 5-40 mM 범위, 예컨대 10-30 mM, 15-25 mM, 바람직하게는 20 mM이고, 아세테이트 완충액의 농도는 0.9-1.5 M 범위, 예컨대 1.0-1.4 M, 1.1-1.3 M, 바람직하게는 1.2 M이다.

다른 실시양태에서 단계 i)은 적어도 하나의 세척 단계를 포함하며, 세척에 사용된 용액은 하나 이하의 완충액, 바람직하게는 포스페이트 완충액, 바람직하게는 인산 나트륨을 포함한다.

다른 실시양태에서 하나 이하의 완충액을 포함하는 적어도 하나의 세척 단계의 하나의 완충액은 0.4-0.8 M 범위, 예컨대 0.5-0-7 M, 바람직하게는 0.6 M의 농도로 존재한다.

일 실시양태에서 단계 ii)의 혼합 모드 이온 교환 수지가 세라믹 히드록시아파타이트 또는 플루오로아파타이트 수지, 바람직하게는 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I(CHT I) 수지인 방법이 제공된다. 이 크로마토그래피 단계의 적용은 재조합 알파-만노시다제 조성물로부터 DNA 불순물을 상당량 효과적으로 분리할 수 있고 숙주 세포 단백질을 결합하면서 rhLAMAN 효소 생성물이 결합없이 상기 컬럼을 통과하는 것으로 밝혀져 있다.

다른 실시양태에서 단계 iii)의 음이온 교환 수지는 강한 음이온 교환 수지, 예컨대 4급 암모늄 강한 음이온 교환 수지이다. 이러한 수지는 비제한적으로 다음 예 Q-세파로스^TM HP, Q-세파로스^TM FF, DEAE-세파로스^TM, Capto^TM Q, Uno^TM Q, ANX 세파로스^TM 에 포함된다.

또 다른 실시양태에서 바이러스 불활성화 단계가 바람직하게는 단계 ii) 및 단계 iii) 사이에서 실시될 수 있는 방법이 제공된다.

바람직한 실시양태에서 상기 바이러스 불활성화 단계는 단계 ii)의 통과분획을 이소프로판올(1:1 V/V의 통과분획/수성 이소프로판올)의 수용액과 적어도 2 시간 동안 혼합한 다음, 바람직하게는 한외여과에 의해 농축하고 투석여과를 이용하여 이소프로판올을 제거하는 것을 포함한다. 불활성화 동안의 수성 이소프로판올은 10-50% 범위의 이소프로판올, 예컨대 20-40%, 25-35%, 28-32%, 바람직하게는 30% 이소프로판올 범위일 수 있다. 통과분획 및 수성 이소프로판올의 1:1 V/V 용액은 15%의 이소프로판올의 최종 농도를 갖는다.

다른 바람직한 실시양태는 바이러스 감소 단계가 바람직하게는 크로마토그래피 단계 iii) 이후에 실시되는 방법이다.

일 실시양태에서 상기 바이러스 감소 단계는 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 용액, 바람직하게는 단계 iii)의 용출액의 필터를 통한 여과를 포함하며, 바람직하게는 바이러스 제거 필터, 예컨대 ultipor^TM VF 등급 DV20 필터, 또는 planova^TM15N 또는 20N 필터, 바람직하게는 Planova^TM 15N 필터가 사용된다.

본 발명의 정제 방법은 대규모로 유리하게 실시될 수 있으므로, 바람직한 실시양태에서 적어도 0.5 L의 컬럼 부피, 예컨대 적어도 1.0 L, 2.0 L, 5.0 L, 10 L, 바람직하게는 적어도 13.0 L를 갖는 크로마토그래피 컬럼 상에서 상기 방법이 실시된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 알파-만노시다제가 다음으로부터 선택된 서열을 갖는 상술한 바와 같은 정제 방법이 제공된다:

A) 서열번호 2에 기재된 서열;

B) A)에 기재된 서열의 유사체(analogue);

C) A) 또는 B)에 기재된 서열의 서브서열(subsequence).

서열번호 2에 의해 기재된 서열은 WO 02/099092호에 제공된 바와 같은 재조합 인간 리소좀 알파-만노시다제(rhLAMAN)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.

"서브서열"이라는 것은 모(parent) 서열의 50% 이상, 예컨대 모 서열의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상 또는 95% 이상의 크기를 갖는 모 서열의 단편을 의미한다. 따라서, 관심을 갖고 있는 상기 서브서열은 505-1009 연속 아미노산 잔기, 예컨대 525-1009, 550-1009, 575-1009, 600-1009, 625-1009. 650-1009, 675-1009, 700-1009, 725-1009, 750-1009, 775-1009, 800-1009, 825-1009. 850-1009, 875-1009, 900-1009, 925-1009, 950-1009, 975-1009, 980-1009, 990-1009 또는 1000-1009의 연속 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 또한, 서열번호 2의 관련 서브서열 또는 그의 유사체는 촉매 부위를 보유해야 한다. 인간 LAMAN의 3D 구조는 불명이지만, 소 LAMAN의 3D 구조가 보고되었고 그 데이터를 기초로 하여 하여 하기의 아미노산이 활성 부위에 관여하거나 및/또는 인간 LAMAN에서 활성에 필요한 Zn² ⁺ 원자를 배위하는데 관련된다고 결론지어 졌다: AA 72=H, AA 74=D, AA 196=D, AA 446=H (UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스: O00754, MA2B1_인간_, Heikinheimo et al. J. Mol. Biol. 327, 631-644, 2003). 인간 LAMAN에서 AA 72 및 196의 돌연변이는 효소 활성의 거의 완전한 상실을 초래한다는 것도 밝혀져 있다(Hansen et al., Biochem. J. (2004), 381, pp. 537-567). 활성을 나타내기 위하여, rhLAMAN의 서브서열은 상기 4개 아미노산을 함유하는 영역을 적어도 보유해야 한다.

바람직하게는, rhLAMAN의 서브서열은 예컨대 결합 부위, 베타 회전, 디설피드 브릿지, 중지 코돈 등을 비롯한 하나 이상의 부가적 구조적(conformational) 부분을 포함할 수 있다. LAMAN의 인간 형태에서, 특정 아미노산, 예를 들어 AA 53, 72, 77, 188, 200, 355, 356, 359, 402, 453, 461, 518, 563, 639, 714, 750, 760, 801, 809, 916(The human gene mutation database, HMDG^®professional, Cardiff University, 2009)에 대한 중요성을 나타내는 몇 가지 질병 유발성 돌연변이가 존재하며, AA 133, 310, 367, 497, 645, 651, 692, 766, 832, 930 및 989를 비롯한 글리코실화에 대하여 중요한 아미노산과 AA 55+358, 268+273, 412+472 및 493+501과 같은 디설피드 브릿지에 관여된 아미노산이 존재한다.

"유사체"라는 것은 모 서열과 서열 동일성의 특정 %를 갖는 서열을 의미하며, 이것은 적어도 60% 서열 동일성, 예컨대 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 바람직하게는 99% 서열 동일성일 수 있다. 상술한 유사체 및 서브서열은, 바람직하게는 이들이 실질적으로 동일 효소 활성을 발휘할 수 있는 점에서, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 알파-만노시다제와 기능적으로 동일한 것으로 이해된다.

용어 "실질적으로 동일 효소 활성"은 천연 효소 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 갖는 등가 부분 또는 유사체를 지칭한다. 효소의 기능적 등가 유사체의 일례는 기능적 형태의 효소의 촉매 부위를 포함하는 융합 단백질일 수 있지만, 다른 종으로부터 유도된 효소의 상동 변이체일 수도 있다. 또한, 관련 효소의 특정 효소 활성을 모방하는 완전한 합성 분자는 "기능적 등가 유사체"를 구성할 것이다. LAMAN의 비-인간 유사체는 환자에서 항체 형성을 유도하고 질환을 유발할 가능성이 있기 때문에 일반적으로 치료법으로 적용할 수 없다. 그러나 인간 유사체는, 돌연변이가 질환을 유발하지 않고 소망하는 효소 활성을 현저하게 감소시키지 않을 때, 효소 치환 요법에서 유용할 수 있다. 이러한 돌연변이의 예는 다음과 같다: His70Leu, Gln240Arg, Ser250Ala, Leu278Val, Ser282Pro, Thr312Ile, Ala337Arg, Ser413Asn, Ser481Ala, Gln582Glu, Arg741Gly, Thr873Pro (Source: http://www.ensembl.org; transcript ID ENST00000456935). 또한 Pro669Leu 및 Asp402Lys는 본 발명자에 의해 질환을 유발하지 않는 것으로 알려져 있다.

일반적으로, 당업자는 효소 활성을 결정하기 위한 적절한 에세이를 용이하게 고안할 수 있을 것이다. LAMAN의 경우, 적절한 효소 활성 에세이는 WO 02/099092호, 26쪽, 8-28행에 개시되어 있다. 간단히 말해, 평탄 바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 스크리닝 목적을 위해 하기 과정을 실시할 수 있다: 75 ㎕의 4X 에세이 완충액(8 mM p-니트로페닐-알파-D-만노피라노사이드), 2 mg/mL BSA, 0.4 M Na 아세테이트(pH 4.5)를 75㎕의 샘플 또는 그의 적절한 희석물(10 mM 트리스 내 pH 7.4, 150 mM NaCl + 10% 수퍼블록 함유)에 부가하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 30분간 배양한 다음 75㎕의 1.8 M Na₂C0₃를 사용하여 중지시키고 플레이트 판독기 상, 405 nm에서 흡수를 기록하였다. 96-웰 플레이트는 분광광도계 상에서 판독하였다. 비활성은 mg 단백질당 분당 가수분해된 μ몰의 p-니트로페닐-알파-D-만노피라노사이드로서 정의된다.

일반적으로 정의된 바와 같이 "동일성"은 각각 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 유전자 또는 단백질 사이에서 서열 동일성으로 정의된다. 따라서, 본 발명의 내용에서 "서열 동일성"은 아미노산 수준에서 단백질 사이의 동일성의 정도 및 뉴클레오티드 수준에서 핵산 사이의 동일성의 정도이다. 단백질 서열 동일성은 상기 서열을 정렬할 때 각 서열 중의 소정 위치에 있는 아미노산 서열을 비교하는 것에 의해 결정될 수 있다. 유사하게는, 상기 핵산 서열 동일성은 서열을 정렬할 때 각 서열 중의 소정 위치에 있는 뉴클레오티드 서열을 비교하는 것에 의해 결정될 수 있다.

2개 아미노산 서열 또는 2개 핵산의 % 동일성을 결정하기 위하여, 최적 비교 목적을 위해 서열을 정렬한다(예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있다). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 있는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 중의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치로서 동일 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 그 분자는 상기 위치에서 동일하다. 2개 서열 사이의 % 동일성은 서열에 의해 공유된 동일 위치의 수이다(즉, % 동일성 = 동일 위치의 #/위치의 총 # (예를 들어, 중복 위치) x 100). 일 실시양태에서 상기 2개 서열은 동일 길이이다.

당업자는 상기 서열들을 수동으로 정렬하여 동일 아미노산의 수를 셀 수 있다. 다르게는, % 동일성을 결정하기 위하여 2개 서열의 정렬은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 이러한 알고리즘은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 혼입될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 연구는 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12를 이용하여 실시하여 본 발명의 핵산 분자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 얻는다. BLAST 단백질 연구는 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3을 이용하여 실시하여 본 발명의 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 얻는다. 대비 목적을 위해 갭을 가한(gapped) 정렬을 얻기 위하여, Gapped BLAST가 이용될 수 있다. 다르게는, 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 연구를 실시하기 위하여 PSI-Blast가 이용될 수 있다. NBLAST, XBLAST, 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하여, 각 프로그램의 디폴트 변수(default parameters)가 이용될 수 있다. 참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 다르게는, 서열 동일성은 EMBL 데이터베이스(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)에 있는 예를 들어 BLAST 프로그램에 의해 서열이 정렬된 후 산출할 수 있다. 일반적으로, 예를 들어 "스코링 매트릭스" 및 "갭 페널티"에 관한 디폴트 세팅(default settings)이 정렬에 이용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, BLASTN 및 PSI BLAST 디폴트 세팅이 유리할 수 있다.

2개 서열 사이의 % 동일성은 갭을 허용하거나 허용하지 않고 상술한 수법과 유사한 수법을 이용하여 결정될 수 있다. % 동일성을 산출함에 있어서, 오직 정확한 매칭을 계수한다.

본 발명의 다른 실시양태는 상술한 정제 방법에 의해 얻을 수 있는 알파-만노시다제를 포함하는 조성물이다.

본 발명의 제2 요지에서, 하기 단계를 포함하는, 재조합 알파-만노시다제의 유가식 또는 연속식 제조를 위한 방법이 제공된다:

a. 0일에 기본 배지를 포함하는 생산 반응기에 재조합 알파-만노시다제를 생성할 수 있는 세포를 접종하여 세포 배양액을 제공하는 단계;

b. 1일부터 상기 세포 배양액에 적어도 1회 공급물 배지(유가 배지)를 부가하는 단계;

c. 3일 후 또는 생존가능한 세포 밀도가 2.1 MVC/mL보다 높을 때 중 빠른 것에서 상기 세포 배양액의 온도를 많아야 35℃, 예컨대 34℃, 33℃, 32℃, 바람직하게는 많아야 31℃로 조절하는 단계.

상기 공정에서 접종일이 0일로 정의되고, 이어지는 날이 1일 등으로 정의된다. 0일부터 상기 c에 기재된 조절 때까지 출발 온도는 36-37℃ 범위, 바람직하게는 36.5℃이다. 상술한 온도는 실제 측정 온도이며, 설정온도(set point)가 아니며, 즉 본 발명에 사용된 바이오리액터 설정에서 상술한 31℃의 온도는 32℃의 설정 온도를 필요로 한다는 것을 이해해야 한다. 마찬가지로 36.5℃ 온도는 37℃의 설정 온도를 필요로 한다.

재조합 알파-만노시다제의 발현 및 제조를 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 생물, 바람직하게는 포유류로부터 유도된다. 특히, 재조합 알파-만노시다제를 제조하기 위해 사용된 세포는 SV40에 의해 형질변환된 원숭이 신장 CVI 주(COS-7); 인간 배아 신장 주(293 또는 현탁 배양에서 성장하도록 서브클로닝된 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 중국 햄스터 난소세포/-DHFR(CHO); 마우스 Sertoli 세포(TM4); 원숭이 신장 세포(CV I); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁 경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선종양(MMT 060562); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주(Hep G2)로부터 선택될 수 있다. 곤충 세포주 또는 인간 섬유아세포는 적합한 숙주 세포로서도 유용하다.

재조합 알파-만노시다제의 제조는 당업자에게 공지된 수법을 이용하여 적절한 핵산 작제물(construct)에 의해 형질감염된 세포를 사용하여 얻어진다. 특히, 상기 핵산 작제물은 다음 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함할 수 있다:

i) 서열번호 1에 기재된 핵산 서열; 및

ii) 상기 제공된 바와 같은 서열번호 2에 기재된 서열의 서브서열 또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열.

상기 세포는 바람직하게는 WO 02/099092호에 기재된 바와 같은 재조합 효소를 제조하기 위하여 특이적으로 개발된 rLAMAN 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주일 수 있다. 상기 세포주 DSM ACC2549 배양물은 2002년 6월 6일에 부다페스트에 따른 특허 절차를 위해 독일 데-38124 브라운슈뱌이크 마쉬로더베크 1베(Maschroderweg 1b ,D-38124 Braunschweig)에 소재하는 DSMZ GmbH에 기탁되었다. 이 세포는 서열번호 1에 기재된 서열을 갖는 발현 플라스미드 pLamanExp1를 사용하여 얻을 수 있다.

단계 a-c의 방법은 다음 단계를 더 포함할 수 있다:

d. 상기 세포 배양액으로부터 재조합 알파-만노시다제를 정제하는 방법으로서, 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 상기 세포 배양액의 분획은 상기 기재한 바와 같이 카복시산 또는 설폰산 기를 갖는 다중모드 리간드를 포함하는 수지 상에서 크로마토그래피 처리되는 정제 방법.

또 다른 실시양태에서 제조 공정에 사용된 세포 배양액은 대구 간유 보충제와 같은 동물로부터 유도된 보충제를 본질적으로 갖지 않는다. 이러한 보충제의 사용을 피하면 최종 효소 생성물 중의 바이러스 오염의 위험성을 감소시킬 수 있다.

상기 제조 방법의 일개 바람직한 실시양태에서 유가식 또는 연속식 제조의 희석되지 않은 수집물은 적어도 0.1 g/L, 예컨대 적어도 0.2 g/L, 0.3 g/L, 0.4 g/L, 바람직하게는 적어도 0.5 g/L의 알파-만노시다제 농도를 갖는다.

다른 실시양태에서 유가식 제조 또는 연속식 제조의 희석되지 않은 수집물은 3-35 U/mL 범위, 예컨대 5-35 U/mL, 7-35 U/mL, 바람직하게는 10-35 U/mL 범위의 효소 활성을 갖는다. 추가의 공정 최적화시 상기 수집물의 효소 활성은 35 U/mL보다 훨씬 더 높아질 수 있음을 이해할 것이다.

상기 제조 공정은 대규모로 유리하게 실시될 수 있다. 따라서 일 실시양태에서 유가식 제조 또는 연속식 제조 방법은 적어도 30 L의 부피, 예컨대 적어도 50 L, 75 L, 100 L, 150 L, 200 L, 바람직하게는 적어도 250 L에서 실시된다.

본 발명의 다른 실시양태에서 상기 알파-만노시다제가 하기로부터 선택된 서열을 갖는 상기와 같은 제조 방법이 제공된다:

A) 서열번호 2에 기재된 서열;

B) A)에 기재된 서열의 유사체;

C) A) 또는 B)에 기재된 서열의 서브서열.

본 발명의 다른 실시양태는 상술한 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 알파-만노시다제를 포함하는 조성물이다. 이러한 조성물은 바람직한 실시양태에서 부가적 활성 생성물 성분(API), 보조제, 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제3 요지에서 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 조성물로서, 상기 알파-만노시다제의 적어도 80%가 130 kDa 당단백질로서 존재하는 조성물이 제공된다.

바람직한 실시양태에서 재조합 알파-만노시다제가 +5℃에서 저장될 때 적어도 4일간 또는 -20℃에서 저장될 때 적어도 24개월 동안 액체 용액에서 안정하게 유지하는 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 상기 조성물이 제공된다.

rhLAMAN 효소 생성물에 대한 제제화 완충 용액에 대해 현재 바람직한 조성물은 이하에 기재하며 달성된 안정성이 또한 수록된다:

Na₂HPO₄ 3.50 mM (이염기성 인산 나트륨)

NaH₂P0₄ 0.17 mM (일염기성 인산 나트륨)

글리신 27 mM

만니톨 250 mM

pH 7.70, 290 mOsm/kg (등장 용액)

사용시 안정성 : 안정한 용액 +5℃ - 4일간

+20℃ - 6시간

-20℃ - 24개월

동결건조됨 +5℃ - 24 개월

본 발명의 다른 실시양태에서 알파-만노시다제가 다음 군으로부터 선택된 서열을 갖는 상술한 조성물이 제공된다:

A) 서열번호 2에 기재된 서열;

B) A)에 기재된 서열의 유사체;

C) A) 또는 B)에 기재된 서열의 서브서열.

다른 바람직한 실시양태는 의약으로서 사용하기 위한 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 상기 조성물이다.

다른 실시양태에서 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 상기 조성물은 알파-만노시도시스 치료에 사용하기 위한 것이다.

더 다른 실시양태는 알파-만노시도시스 치료를 위한 의약 제조를 위한 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 상기 조성물의 용도이다.

다른 실시양태는 상기 기재한 바와 같이 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 검체에게 투여하는 단계를 포함하는, 알파-만노시도시스를 치료하거나 및/또는 알파-만노시도시스와 관련된 증상을 감소 또는 경감시키는 방법이다.

본 발명의 요지의 하나와 관련하여 기재된 실시양태 및 특징은 본 발명의 다른 요지에도 적용될 수 있음을 알아야 한다.

본 출원에 인용된 모든 특허 및 비특허 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.

본 발명은 이하의 비제한적인 실시예에 의해 더욱 자세하게 기재될 것이다.

실시예

사용된 약어:

CIP: Clean In Place

CV: 컬럼 부피

Cv: 생존성 세포 밀도

DF: 투석여과

DO: 용존 산소

IPA: 이소프로판올

MVC/mL: 10⁶ 생존성 세포/mL

NaPi: 인산 나트륨

NaAc: 아세트산 나트륨

OD: 광학 밀도

EG: 에틸렌 글리콜

TFF: 탄젠트 유동 여과(Tangential Flow Filtration)

TMP: (Transmembrane pressure) 투과압

UF: 한외여과

실시예 1 - 현재 바람직한 전반적 정제 과정

본 발명의 내용에서 알파-만노시다제에 대한 최적 수율 및 순도를 얻기 위한 정제 과정은 이하에 기재한 바와 같다. 수지의 재생 및 세정을 위한 표준 조건이 개별 수지에 대해 기재된 바와 같이 사용된다(참조: 또한 실시예 2-5). 사용된 수지는 GE healthcare life sciences 및 BioRad에서 입수할 수 있다.

● 알파-만노시다제의 제조로부터 얻은 수집물의 분획을 제공하고, 유의한 희석없이, 바람직하게는 전혀 희석하지 않고 상기 분획을 청정화한다.

● 다중모드 리간드를 포함하는 수지 상에서 상기 분획의 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 포획 단계를 실시. 이들 수지는 Capto^TM MMC, Capto^TM Adhere, PlasmidSelect^TMXtra, Capto^TM Blue, Blue 세파로스^TM Fast Flow 수지, MEP HyperCel^TM, HEA HyperCel^TM 및 PPA HyperCel^TM로 이루어진 군으로부터 선택된다.

몇 개의 세척은 pH 4.5-8.5에서 실시하고, 세척 완충액은 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨, 아세트산 암모늄, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 황산 나트륨, 황산 칼륨, 황산 암모늄, MES, MOPS, Hepes, 붕산 나트륨, 트리스-HCl, 시트레이트 완충액 또는 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다(이후, 완충액 그룹 A라 칭함). 그러나 적어도 일회의 세척에서, 상기 세척 용액은 이소프로판올을 포함하고 pH는 pH 4-6 범위이다. 용출 완충액은 완충액 그룹 A로부터 선택되고, 상기 용출 용액은 에틸렌 글리콜을 포함한다. 용출 pH는 pH 7.0-8.5에서 유지된다.

● 알파-만노시다제를 포함하는 조성물의 컬럼 크로마토그래피를 포함한 능동 중간 단계를 소수성 상호작용 수지 상에서 실시. 이들 수지는 부틸-S 세파로스^TM 6 Fast Flow, 부틸 세파로스^TM 4 Fast Flow, 옥틸 세파로스^TM 4 Fast Flow, 페닐 세파로스^TM6 Fast Flow (high sub) 및 페닐 세파로스^TM 6 Fast Flow (low sub), 부틸 세파로스^TMHigh Performance, 페닐 세파로스^TM High Performance로 이루어진 군으로부터 선택된다.

pH 7-8에서 수 회의 세척을 실시한다. 이들 세척 완충액은 완충액 그룹 A로부터 선택한다. 용출 완충액은 또한 완충액 그룹 A로부터 선택되고 용출 pH는 pH 7-8 사이이다.

● 알파-만노시다제를 포함하는 조성물의 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 수동적 중간 단계를 혼합 모드 이온 교환 수지 상에서 실시하여 통과분획을 제공한다. 이들 수지는 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I 또는 II(바람직하게는 유형 I) 수지, 또는 플루오로아파타이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 1회 세척을 실시하여 pH 7-8에서 통과분획을 제공한다. 세척 완충액은 완충액 그룹 A로부터 선택된다.

● 알파-만노시다제를 포함하는 조성물의 컬럼 크로마토그래피를 비롯한 연마 단계를 음이온 교환 수지 상에서 실시. 이들 수지는 Q-세파로스^TM HP, Q-세파로스^TMFF, DEAE-세파로스^TM Capto^TM Q, Uno^TM Q, ANX 세파로스^TM로 이루어진 군으로부터 선택된다.

pH 7-8에서 수회의 세척을 실시한다. 세척 완충액은 완충액 그룹 A 및 트리스-HCl 완충액으로부터 선택된다. 용출 완충액은 완충액 그룹 A로부터 선택되고 용출 pH는 pH 7-8에서 유지된다.

● 알파-만노시다제의 용액을 이소프로판올과 접촉시켜 바이러스 불활성화 단계를 실시.

● 나노여과를 이용하여 바이러스 제거 단계를 실시.

본 발명에 따른 알파-만노시다제를 포함하는 정제된 조성물에 대한 수율 및 생성물 성분비는 이전의 방법과 대비하여 표 1에 나타낸다.

방법 1: 본 발명에 따른 현재 바람직한 방법.

방법 2: 연마 단계를 갖지 않는 이외는 방법 1과 유사. 이 방법은 또한 포획 단계에서 이소프로판올을 포함하는 세척 단계를 갖지 않고 능동 중간 단계에서 세척 수가 적고 마지막으로 바이러스 불활성화/제거 단계를 갖지 않는다.

방법 3: WO 02/099092호(다중모드 리간드가 사용되지 않음)에 기재된 바와 같음.

과거 및 현재의 정제 과정으로부터 얻은 수율 및 순도

방법	전체 수율	전체 순도	% 130 kDa	% 55 kDa	% 75 kDa	규모 (배양 부피)
1	70%	99.6%	95.2%	1.5%	2.9%	250L
2	60-70%	98.2%	92.1%	2.6%	3.5%	30L
3	70-80%	80%	<80%	>5%	>5%	1L

실시예 10 및 도 7 또한 참조.

실시예 2- 다중모드 리간드를 사용한 크로마토그래피 포획 단계

알파-만노시다제를 포함하는 청정화되고 희석되지 않은 수집물은 본 실시예에 사용된 바와 같은 Capto^TM MMC와 같은 다중모드 리간드 유형 수지에 혼합 모드 상호작용에 의해 결합된다. 염 증가 및 에틸렌 글리콜 부가는 생성물을 용출한다. Capto^TMMMC의 수용력은 260 U/ml 수지이었다. 포획 단계는 이하의 단계를 이용하여 실시하였다:

● 1-2 컬럼 부피(CV)의 3M NaCl를 사용하여 pH 10-12, 300 cm/hr로 컬럼을 재생시킨다.

● 5 CV의 50 mM 인산 나트륨 완충액(NaPi), 0.15 NaCl을 사용하여 pH 7.5, 300 cm/hr로 평형화시킨다.

● 청정화되고 희석되지 않은 수집물(도전성 ~15 mS/cm)을 300 cm/hr로 로딩한다.

● 세척 1: 4 CV의 평형 완충액.

● 세척 2: 3 CV의 0.95 M NaAc, 5%(v:v) 이소프로판올, pH 4.9, 300 cm/hr.

● 세척 3: 4 CV의 평형 완충액(안정한 베이스라인까지, 5 mm 플로우셀에 의해 ~0.06 Au), 300 cm/hr.

● 상기 생성물을 6 CV의 1.5 M NaCl, 90 mM NaPi 중의 40% 에틸렌 글리콜, pH 7.7에 의해 최대 120 cm/hr로 용출. 흡수가 증가할 때(새로운 베이스라인으로부터 약 10 mAu) 수집을 개시한다. ~4CV 수집.

● 상기 기재한 바와 같이 3 CV에 의해 하향 유동 방향으로, 최대 120 cm/hr로 컬럼 재생.

● 바람직하게는 3 CV의 H₂0, 3 CV의 1 M NaOH (~60 분 접촉 시간), 2-3 CV의 포스페이트 완충액, pH ~7, 3 CV의 20 mM 인산 나트륨 + 20% 에탄올에 의한 상향 유동 방향으로 CIP 처리하고 위생처리. 20 mM 인산 나트륨 + 20% 에탄올에 저장.

표 2는 정제 계획의 일례를 도시한다. 표 3은 단계를 요약한다. 도 2는 상기 단계에 대한 크로마토그램의 일례를 도시한다.

13.5 x 2ml (27 ml) XK 16 컬럼에 팩킹된 Capto^TM MMC

단계	부피 ( ml )	활성 (U/ ml )	전체 활성(U)	OD280 1.8로 나뉨	수율 (%)	HCP ㎍/ ml
로딩	439	15	6585 (=244 U/ml 수지)
통과분획 + 제1 평형 (평형) 완충액 세척	560		~37		0.6
0.95M NaAc+5%IPA, pH 4.9	90		0
평형 완충액	101	0.3	30		0.5
용출액	118	50	5900	2.2	89	28

Capto^TM MMC 포획 단계에 대한 조건의 요약

단계	완충액	유동속도 ( cm / hr )	부피 ( CV )	유동 방향
재생	3M NaCl, pH ~11	300	2	하향
평형	50 mM NaPi, 150 mM NaCl, pH 7.5	300	5	하향
로딩	수집물	300		하향
세척 1	50 mM NaPi, 150 mM NaCl, pH 7.5	300	4	하향
세척 2	0.95 M NaAc, 5% IPA, pH 4.8	300	3	하향
세척 3	50 mN NaPi, 150 mM NaCl, pH 7.5	300	4	하향
용출	90 mM NaPi, 1.5M NaCl, 40% EG, pH 7.7	≤120	6	하향
재생	2M NaCl, pH ~11	120	3	하향
플러쉬	물	300	3	상향
CIP	1M NaOH	300	3	상향
컨디셔닝	포스페이트 완충액 (결정하기 까지 RB)	300	1-3	상향
저장	20 mM NaPi + 20% 에탄올	100	3	상향

실시예 3 - 소수성 상호작용을 이용한 크로마토그래피 중간 능동 단계

알파-만노시다제를 포함하는 상기 포획 단계로부터의 생성물은 황산 나트륨 부가 후 소수성 상호작용에 의해, 이 실시예에 사용된 바와 같은 부틸 세파로스^TM 4 FF와 같은 소수성 상호작용 유형 수지에 결합한다. 염 농도 감소는 생성물을 용출한다. 수용능은 195 U/ml 수지이었다. 이하의 단계가 중간 능동 단계에 사용되었다:

● 1 CV의 20 mM 인산 나트륨(NaPi) 완충액 pH 7.5에 의해 100 cm/hr로 컬럼을 재생한다.

● 5 CV의 0.5 M Na₂S0₄, 20 mM NaPi, pH 7.5에 의해 150 cm/hr로 컬럼을 평형화시킨다.

● 단계 1로부터 얻은 상기 생성물 풀(pool)을 동일 부피의 20 mM NaPi, 0.8 M Na₂S0₄, pH 7.5와 혼합한 다음 이것을 컬럼에 70 cm/hr로 로딩한다. 상기 혼합물은 로딩 개시 전에 인-라인 또는 최대 3시간 동안 실시될 수 있다. 1:1 부피:부피 (v:v) 혼합물은 약 1.11:1, 중량: 중량(w:w) (용출액: 황산 나트륨 완충액)에 상응한다. 필요한 경우 컨디셔닝된 로딩물은 로딩 전에 0.45 ㎛ 필터(친수성 PES 또는 PVDF)를 통하여 여과되어야 한다.

● 상기 컬럼을 3 CV의 평형 완충액에 의해 70 cm/hr로 세척하여, 이전 단계로부터의 숙주 세포 단백질 이외에, 에틸렌 글리콜을 제거한다.

● 3.5 CV의 20 mM NaPi, 1.2 M NaAc, pH 7.5에 의해 100 cm/hr로 세척한다.

● 3.5 CV의 0.6 M NaPi, pH 7.0에 의해 150 cm/hr로 세척한다.

● 상기 생성물을 4 CV의 60 mM NaPi, pH 7.5에 의해 150 cm/hr로 용출한다. 흡수의 초기 증가로부터 베이스라인이 ~2CV에 도달할 때까지 피크를 수집한다.

● 상기 컬럼을 2 CV의 20 mM NaPi, pH 7.5에 이어, 3 CV의 H₂0에 의해 150 cm/hr로 재생한다.

● 3 CV의 1 M NaOH (60분 접촉시간), 1 CV의 H₂0, 1-3 CV의 포스페이트 완충액 및 2 CV의 20 mM 인산 나트륨 + 20% 에탄올을 사용하여 세정하고 위생처리한다. 20 mM 인산 나트륨 + 20% 에탄올에 저장.

표 4는 정제 계획의 일례를 도시한다. 표 5는 상기 단계를 요약한다. 도 3은 상기 단계에 대한 크로마토그램의 일례를 도시한다.

13.5 cm x 2 cm² (27 ml) XK 16 컬럼에 팩킹된 부틸 세파로스^TM 4FF를 사용한 중간 능동 정제 계획

단계	부피 ( ml )	활성 (U/ ml )	전체 활성 (U)	OD 280 1.8로 나뉨	수율 (%)	HCP ng / mg
로딩	236	23	5413 (=200 U/ml 수지)
통과분획 + 평형 완충액 세척	~390	0.3	~100		1.8
1.2M NaAc, pH 7.5	95	0.5	48		0.8
0.6M NaPi, pH 7.0	97	0.2	19		0.3
용출액	66	81	5346	3	98	940

부틸 세파로스^TM 4FF 단계에 대한 조건 요약

단계	완충액	유동속도 ( cm / hr )	부피 ( CV )	유동 방향
재생	20 mM NaPi, pH 7.5	150	1	하향
평형	20 mM NaPi,0.5M 황산 나트륨, pH 7.5	150	5	하향
로딩	컨디셔닝된 Capto MMC 용출액	70	~6	하향
세척 1	20 mM NaPi, 0.5M 황산 나트륨, pH 7.5	70	3	하향
세척 2	20 mM NaPi, 1.2M NaAc, pH 7.5	100	3.5	하향
세척 3	0.6M NaPi, pH 7.0	150	3.5	하향
용출	60mM NaPi, pH 7.5	150	4	하향
재생	20 mM NaPi, pH 7.5	150	2	하향
플러쉬	물	150	3	상향
CIP	1M NaOH	150	3	상향
플러쉬	물	150	1	상향
컨디셔닝	포스페이트 완충액 (결정하기 까지 RB)	150	1-3	상향
저장	20 mM Na-Pi + 20% 에탄올	150	3	상향

실시예 4 - 혼합 모드 이온 교환을 이용한 크로마토그래피 중간 수동 단계

중간 능동 단계로부터 얻은 알파-만노시다제를 포함하는 2개 용출액을 모아서 1:1 (중량: 중량) 비율로 물과 혼합하여 도전성을 감소시켜 세라믹 히드록시아파타이트 I (CHT I) 수지와 같은 본 실시예에 사용된 혼합 모드 이온 교환 수지 상에 로딩하였다. 이 생성물은 결합하지 않고 통과하는 반면에, 숙주 세포 단백질은 컬럼에 결합한다. 상기 생성물을 함유하는 통과분획을 수집하였다. 수용력은 550 U/ml 수지이었다. 본 실시예의 중간 수동 단계는 다음 단계가 이용되었다:

● 2 CV의 0.6 M NaPi pH 7.0에 의해 300 cm/hr로 컬럼을 재생한다.

● 5 CV의 60 mM NaPi, pH 7.5에 의해 300 cm/hr로 컬럼을 평형화시킨다.

● 단계 2로부터의 컨디셔닝된 용출액을 300 cm/hr로 로딩하고 생성물을 함유하는 통과분획을 수집하였다. 로딩물의 도전성 및 pH는 각각 ~10 mS/cm 및 7.3일 것이다. 20 mAu의 OD 증가로부터 다시 20 mAU로 되돌아갈 때까지 생성물을 함유하는 통과분획을 대략 로딩 부피만큼 수집하고 2 CV 세척하였다. 단계의 말기에 0.45 ㎛ 친수성 PES 또는 PVDF 필터를 통하여 생성물 풀을 여과한다.

● 4 CV의 평형 완충액에 의해 300 cm/hr로 컬럼을 세척한다.

● 3 CV의 0.6M NaPi, pH 7.0에 의해 300 cm/hr로 컬럼을 재생한다.

● 3 CV의 1 M NaOH (60분 접촉 시간), 1 CV의 60 mM NaPi, pH 7.5 및 2 CV의 20 mM 인산 나트륨 + 20% 에탄올에 의해 세정하고 위생처리한다. 20 mM 인산 나트륨 + 20% 에탄올에 저장한다.

표 6은 정제 계획의 일례를 도시한다. 표 7은 상기 단계를 요약한다. 도 4는 상기 단계에 대한 크로마토그램의 일례를 도시한다.

10 cm x 2 cm2 (20 ml) XK 16 컬럼에 팩킹된 CHT I을 사용한 중간 수동 단계에 대한 정제 계획

단계	부피 ( ml )	활성 (U/ ml )	전체 활성 (U)	OD 280 1.8로 나뉨	수율 (%)	HCP ng / mg
로딩	360	31.6	11390 (= 570 U/ml 수지)
통과분획 = 생성물 단계의 말기에 여과	392	27.5	10780		95	~500
0.5M NaPi	40	0.45	18

CHT I 단계에 대한 조건 요약

단계	완충액	유동속도 ( cm / hr )	부피 ( CV )	유동방향
재생	600 mM NaPi, pH 7.0	300	2	하향
평형	60 mM NaPi, pH 7.5	300	5	하향
로딩	부틸 용출액 + H₂O	300		하향
세척 1	60 mM NaPi, pH 7.5	300	4	하향
재생	600 mM NaPi, pH 7.0	300	3	하향
CIP	1 M NaOH	≤300	3	상향
컨디셔닝	NaPi 완충액 (결정할때까지 RB)	300	1	상향
저장	20 mM NaPi + 20% 에탄올	300	3	상향

실시예 5 - 바이러스 불활성화 단계

바이러스 불활성화는 공정의 상이한 단계에서 실시될 수 있다. 이 실시예에서 상기 바이러스 불활성화는 중간 수동 단계 이후 및 연마 단계 이전에 실시할 수 있다. 알파-만노시다제를 포함하는 중간 수동 풀의 바이러스 불활성화는 21℃에서 15% 이소프로판올(30% 수성 이소프로판올과 1:1 혼합물)과 함께 135±15분간 배양하는 것에 의해 얻었다. 탱크는 냉각 재킷에 의해 +4℃에서 냉각되어 공정을 21±5℃에서 유지하였다. 100 kDa 폴리에테르설폰 막에 의해 탄젠트 유동 여과(TFF)하고, 스크린 A(밀리포어 또는 Sartorius 제조)를 사용하여 이소프로판올을 제거하고 인산 나트륨 완충액으로 변경하였다. 이 실시예에서 바이러스를 불활성화하기 위하여 하기 단계가 이용되었다.

● 중간 수동 단계로부터 얻은 생성물(통과분획(flow through))을 60 mM 인산 나트륨 중의 30% 이소프로판올과 1:0:94 (w/w)에 상응하는 1:1 (v:v)로 혼합한다. 예를 들어 재순환 펌핑에 의해 혼합한다. 상기 생성물 단백질 농도는 ~0.3-l mg/ml일 것이다.

● 용매/생성물 풀을 실온에서 135±15 분간 배양한다.

● TFF 막을 60 mM 인산 나트륨 완충액에 의해 평형화한다.

● 상기 풀을 투과압(TMP) 1.1 바, 21±5℃, 내부 압력 = ~1.4-1.5 바 및 외부 압력 = 0.7-~0.8 바에서 한외여과에 의해 표적 농도 2 mg/ml (0.5-3 mg/ml)로 농축한다.

● 60 mM 인산 나트륨 완충액에 대하여 투석여과에 의해 ~6 부피로 교환한다. TMP 1 바(내부 1.4 바/외부 0.6 바)에서 시작. 첫 부피를 교환한 후, TMP는 1.1로 증가될 수 있다.

● 투석유물을 수집한다. 상기 막을 희석 완충액의 2-3 계 부피로 헹구어서 느슨하게 결합된 생성물을 제거하였다. 투석유물을 갖는 헹굼액을 수집한다. 최종 표적 단백질 농도는 2 mg/ml(0.5-3 mg/ml)이다.

● 상기 막을 H₂0에 의해 세정한 다음 0.5 M NaOH(60분 접촉 시간)로 세정한다. 0.1 M NaOH에 저장한다.

표 10은 바이러스 불활성화/TFF 단계에 대한 조건을 나타낸다.

바이러스 불활성화/TFF 단계에 대한 조건의 요약

단계	완충액	희석 w:w	UF	DF	TMP	코멘트
출발	30% IPA/ 70% NaPi	1.94 x				135±15분, RT
평형	NaPi
UF			~5x		1.1 (내부 1.5/ 외부 0.7)	2 mg/ml까지 농축 (0.5-3 mg/ml), 플럭스 ~ 100-65 LMH
DF	NaPi			6x	1.0-1.1 (내부 1.5/ 외부 0.7)	더 낮은 TMP(내부 1.4/외부 0.6)에서 최초 부피, 이어 TMP 1.1로 증가, 플럭스 ~65-100 LMH
계 세척	NaPi					2 계 부피, 표적 농도 2 mg/ml 까지 투석유물을 갖는 풀(0.5-3 mg/ml)
헹굼	물
CIP	0.5-1M NaOH
저장	0.1M NaOH

NaPi= 60 mM 인산 나트륨, pH 7.5

실시예 6 - 음이온 교환을 사용한 크로마토그래피 연마 단계

본 실시예에서 4급 암모늄 고성능 강 음이온 교환 수지(Q Sepahrose^TM HP 수지)와 같은 음이온 교환 수지에 이온성 상호작용에 의해 결합시키기 위하여, 컨디셔닝 완충액(20 mM 트리스-HCl, 10 mM NaCl, 75 mM 만니톨, 0.005% tween^TM 80, pH 7.5)에 의해 6회 희석시키는 것에 의해 중간 수동 단계로부터의 알파-만노시다제를 포함하는 투석유물의 도전성을 감소시켰다. 투석유물은 로딩하기 전에 직접 희석되거나 또는 인-라인 희석시켰다. 생성물은 1CV의 용출 완충액에 의해 미리 충전된 용기에 염화 나트륨 부가에 의해 용출되었다. 수용력은 400 U/ml 수지이었다. 이 실시예에서는 연마 단계를 위해 하기 단계가 이용되었다:

● 1 CV의 50 mM NaPi, 1 M 염화 나트륨, pH 7.5에 의해 120 cm/hr로 컬럼을 재생한다.

● 5 CV의 20 mM 트리스-HCl, 10 mM 염화 나트륨, pH 7.5에 의해 120 cm/hr로 컬럼을 평형화시킨다.

● 단계 4로부터 얻은 희석된 투석유물을 120 cm/hr로 로딩한다.

● 5 CV의 평형 완충액 및 1 CV의 20 mM 인산 나트륨, pH 7.5에 의해 120 cm/hr로 컬럼을 세척한다.

● 4 CV의 50 mM 인산 나트륨, 0.2 M 염화 나트륨, pH 7.5에 의해 120 cm/hr로 생성물을 예비 충전된(1CV의 용출 완충액) 용기에 용출한다. 흡수의 초기 증가(10-20 mAu에서 수집 개시)에서부터 30-50 mAu(2 mm 플로우셀), 0.5-1.5 CV까지 피이크를 수집한다.

● 3 CV의 50 mM NaPi, 1 M 염화 나트륨, pH 7.5에 의해 120 cm/hr로 컬럼을 재생한다.

● 3 CV의 1 M NaOH (60분 접촉시간) 및 3 CV의 10 mM NaOH에 의해 세정하고 위생처리한다. 10 mM NaOH에 저장한다.

표 8은 정제 계획의 일례를 나타낸다. 표 9는 상기 단계를 요약한다. 도 5는 크로마토그램의 일례를 도시한다.

Q 세파로스^TM HP 수지 19 cm x 2 cm² (38 ml)를 사용한 연마 단계에 대한 정제 계획의 예

단계	부피 ( ml )	활성 (U/ ml )	전체 활성 (U)	OD 280 1.8로 나뉨	수율 (%)	HCP ng / mg
로딩	1095	9.6	10500 (=276 U/ml 수지)
통과분획	~1300	0.07	~90		~1
20 mM 인산 나트륨	75	1.7	127		~1
세척
용출	69 (=49 ml 용출액 + 20 ml 예비충전	145	10024	5.3	95.5

Q 세파로스^TM HP 단계에 대한 조건 요약

단계	완충액	유동속도 ( cm / hr )	부피 ( CV )	유동방향
재생	50 mM NaPi, 1M NaCl pH 7.5	120	1	하향
평형	20 mM 트리스-HCl, 10 mM NaCl, pH 7.5	120	5	하향
로딩	컨디셔닝된 투석유물 단계 4	120		하향
세척	20 mM 트리스-HCl, 10 mM NaCl, pH 7.5	120	5	하향
세척	20 mM NaPi, pH 7.5	120	1	하향
예비충된 백으로 용출	50 mM NaPi, 0.2M NaCl, pH 7.5	120	4	하향
재생	50 mM NaPi, 1M NaCl, pH 7.5	120	3	하향
CIP	1M NaOH	120	3	상향
저장	10 mM NaOH	300	3	상향

실시예 7 - 바이러스 감소 단계

바이러스 감소는 공정의 상이한 단계에서 실시될 수 있다. 이 실시예에서 상기 바이러스 감소는 연마 단계 이후에 실시될 수 있다. 연마 단계로부터의 용출액은 0.1 ㎛ 예비여과 후 Planova^TM 15N 필터를 통하여 나노여과된다. 하기 단계가 사용되었다:

● 연마 단계로부터 얻은 용출액은 0.1 ㎛ 필터를 통하여 예비여과하였다. 이 필터를 소부피의 50 mM 인산 나트륨, 0.2 M 염화 나트륨, pH 7.5으로 헹구어서 느슨하게 결합된 생성물을 제거하였다.

● 상기 용출액을 0.8 바의 압력, 실온에서 여과하였다. 여액은 50 mM 인산 나트륨, 0.2 M 염화 나트륨, pH 7.5을 사용한 3개 Planova 15 계 부피로 후 세척하였다.

실시예 8 - 제제화 및 저장

100 kDa, Screen A, 폴리에테르설폰 막(Sartorius^TM 또는 Millipore^TM)을 사용한 탄젠트 유동 여과(TFF)는 완충액을 변경시켜 제제 완충액으로 만든다. +4℃의 냉각 재킷에 의해 탱크를 냉각시켜 상기 공정을 21±5℃로 유지할 수 있다. 추산된 수용능은 100 l/m²이다. 제제화 및 저장에는 하기 단계가 사용되었다:

● 3.5 mM Na₂HP0₄, 0.17 mM NaHP0₄, 250 mM 만니톨, 27 mM 글리신, pH 7.7 (제제화 완충액)에 의해 막을 평형화시켰다.

● 알파-만노시다제를 포함하는 정제된 생성물을 약 1 부피의 제제화 완충액으로 희석시켜 표적 농도 2-3 mg/ml로 만들었다. 상기 단백질 농도가 생성물에서 낮으면, (필수적인 것은 아니나) 제제화 완충액으로 희석하기 전에 부피를 감소시키기 위하여 4-6 mg/ml로 농축시킬 수 있다.

● TMP 0.8 및 21±5℃에서 한외여과에 의해 약 2배 농축하여 표적 농도 6 mg/ml로 만든다.

● TMP 0.8, 21±5℃에서 제제화 완충액에 대하여 투석여과에 의해 6 부피를 교환한다.

● 한외여과에 의해 약 1.5배 농축시키고 투석유물을 수집한다. 상기 막을 제제화 완충액 1 계 부피에 의해 헹구어서 느슨하게 결합된 생성물을 제거한다. 투석유물을 갖는 헹군 물질을 수집한다. 다르게는 헹굼물에서 OD 280을 측정하며 이것이 생성물을 함유하는 경우에만 수집한다. 최종 표적 단백질 농도는 7±2 mg/ml이다.

● 상기 막을 H₂0, 이어 0.5 M NaOH (60분 접촉시간)에 의해 세척한다. 0.1 M NaOH에서 저장한다.

제제화 TFF 단계에 대한 조건의 요약

단계	완충액	UF / DF 희석인자	표적농도 ( mg / ml )	TMP (바)	코멘트
단계 6 생성물의 희석	제제화 완충액	2	2-3		단계 6 생성물 중의 단백질 농도가 < 4 mg/ml이면, 희석 전에 UF 단계가 도입될 수 있다
평형	제제화 완충액
UF		2	6±2	0.8	1.1 바 내부/0.5 바 외부
DF	제제화 완충액	6±2	6±2	0.8
UF		~1.5	7±2		투석유물 수집
계 세척	제제화 완충액	1 계 부피	투석유물을 갖게 모아지면 7±2	단백질의 경우 투석유물과 함께 수집하고 풀링
헹굼	물
CIP	0.5-1 M NaOH
저장	0.1 M NaOH

생성물은 5 mg/ml로 희석하고 멸균 여과하였다. 여과된 약물 물질은 병에 넣고 냉동시켰다.

실시예 9 - 알파 만노시다제에 대한 유가 배양 방법

세포 해동 후, 제조 바이오리액터(250 L)로 전달하기 전에 진탕 플라스크, 10 L 시드(seed) 바이오리액터 및 50 L 시드 바이오리액터에서 팽창시켰다. 제조 바이오리액터의 접종일에, 50 L 시드 바이오리액터에서 세포 밀도는 2 내지 2.5 MVC/mL이었다. 이들 세포를 시드 바이오리액터로부터 제조 리액터에 0.5 MVC/mL 세포 밀도로 접종하여 접종이 완료되었을 때 세포 현탁액 부피를 100 L로 만들었다. 접종일을 0일이라 칭하며, 그 다음 날이 1일이라고 하는 방식으로 한다. 1일에서부터 실험의 마지막 날에 이르기까지, 유가 배지는 소정 속도(이하 참조)에 따라 부스트(boost) 양으로 매일 부가하였다. 1일에서부터 실험의 마지막 날에 이르기까지, 글루타민 및 글루코오스는 소정 속도와 규칙(이하 참조)에 따라 부스트 양으로 매일 부가하였다. 생존성 세포 밀도가 > 2.2 MVC/mL이거나 또는 3일일 때, 어느 쪽이든 빠른 쪽으로 하여, 온도를 제조 온도로 감소시켰다.

실제 온도 및 실험 조건

DO (%)	40±5
0일 내지 2일의 pH (*)	6.60 내지 6.95 사이
3일에서 종료시까지 pH	6.9±0.05
온도(℃) 온도 이동 조건이 충족되면 A) → B)로 이동	A) 36.5 ±0.5 → B) 31.0 ±0.5
온도 이동 조건	Cv ≥ 2.2 MVC/mL 또는 3일 (어떤 것이든 빠른 쪽)
제조 바이오리액터의 이전의 경험에 따라 조절될 교반 속도(rpm)	제안: 45 rpm, 31℃에서 CHO 세포에 대해 정상인 것으로 추정되는 전단 스트레스 용인성 (시험되지 않음)
생존가능한 세포 밀도 접종, (MVC/mL), 0일	0.5±0.1
액체 상 레벨에서 최대 pCO₂	알려지지 않음, 약 18 kPa
유가 배지, 글루타민 및 글루코오스 공급	아래 내용 참조
배양액 중의 글루코오스 표적 (mM)	6 [5.5 9.0]
배양액 중의 글루타민 표적 (mM)	2 mM D1-D3, 1mM D4 및 포워드(forward)
수집 조건	18-21일 또는 생존성 < 65%, 어느 쪽이든 빠른 쪽
작업 부피(L): 초기 → 최종	100 → 약 200
pH 제어를 위해 부가된 알칼리	0.5 M Na₂CO₃
접종 완료 후 시드 바이오리액터로부터 제조 바이오리액터로 접종 세포 브로쓰를 희석	4
제조 바이오리액터의 접종시 시드 바이오리액터에서 팽창된 세포의 기준
최소 세포 밀도 (MVC/mL)	2.0
최대 세포 밀도 (MVC/mL)	2.5
수백만 생존가능한 세포의 수	44 내지 56
생존성	≥ 93%
제조 바이오리액터의 접종이 다음 (시간) 이전에 시드 바이오리액터 50 L에서 회분 배양	76

(*) 0일 내지 2일 사이에, C0₂ 만이 pH 제어에 의해 자동적으로 부가되었다. pH가 6.60 미만이 아닌 한 알칼리는 부가되지 않았다.

● 기본 배지

2 mM 글루타민에 의해 보충되고 11.1 mM(2 g/L) 글루코오스를 함유하는 ACF 배지(ExCell302, SAFC). 글루타민을 갖지 않는 기본 배지를 3일까지 제조 바이오리액터로 전달하고 36.5℃에서 즉, 바이오리액터의 멸균 시험 동안 저장하였다. 다르게는 상기 배지는 4℃에서 저장한다.

● 유가 배지

유가 배지, E35는 글루타민을 갖지 않는 ACF 배지에서 희석되고 11.1 mM 글루코오스를 함유하는 35 % CHO CD Efficient Feed B(InVitrogen cat nr. SKU# A10240-01) 유가 농축물이었다. 유가 배지는 4℃ 암실에서 저장하였다. 상기 유가 배지는 배양하는 동안 실온에서 96시간까지, 즉 4일 동안 어둡게 유지된다.

매일 부가된 유가 배지 부피

일수	0	1 내지 5	6 내지 16
부가된 부피/일 (L)	0	12	4

● 첨가제

a) 2500 mM 글루코오스의 스톡 용액(Stock solution), b) 200 mM 글루타민의 스톡 용액, c) 알칼리 0.5 M Na₂C0₃.

● 유가 배지, 글루코오스 및 글루타민의 전달

유가 배지는 매일 부스트로 펌핑되었다. 글루코오스 및 글루타민은 글루코오스 및 글루타민의 스톡 용액을 이하에 기재된 양으로 부스트로 부가하는 것에 의해 소정 목표 내의 농도를 유지하도록 매일 부가되었다.

글루타민 부가 규칙:

● 1일 내지 3일; 바이오리액터 내의 글루타민 농도가 2 mM이도록 글루타민 스톡 용액의 부피를 부가한다.

● 4일부터: 바이오리액터 내의 글루타민 농도가 1 mM이도록 글루타민 스톡 용액의 부피를 부가한다.

글루코오스 부가 규칙:

● 0일 내지 8일: 글루코오스 스톡 용액 부가하지 않음

● 9일부터, 제조 바이오리액터 내의 글루코오스 농도가 8 mM 이하이면, 바이오리액터 내의 글루코오스 농도가 8 mM이도록 글루코오스 스톡 용액의 부피를 부가.

방법 개요:

배양 방법의 매일의 개요:

일	작용
-3일 또는 -2일	바이오리액터의 멸균 및 75 L 또는 최소 부피로 글루타민을 갖지 않는 ACF 배지를 충전하여 프로브를 덮음(이 경우 75L보다 큼) DO 프로브의 검량
0일	a) 50 L 시드 바이오리액터로부터 지수적 성장하는 팽창된 세포의 세포 계수 및 접종 기준 충족 b) 부피가 75 L보다 크면 제조 바이오리액터로부터 ACF 배지 제거. 45분 동안 pH 및 온도 설정값에서 제조 바이오리액터 중의 배지 안정화 및 글루타민 부가하여 100 L 배지 중의 2 mM의 최종 글루타민 농도를 얻음. 50 L 시드 바이오리액터로부터 세포 브로쓰(cell broth)에 존재하는 글루타민은 고려하지 않음. c) 50 L 시드 바이오리액터로부터의 세포 브로쓰를 제조 바이오리액터로 전달. d) 제조 바이오리액터 중의 100 L 세포 현탁액으로 부피 조절. e) 약 1hr (45분 내지 2시간 30분 사이) 동안 안정화 및 세포 계수를 위한 샘플, pH 및 대사 변수
1-2일	세포 계수, 샘플, 유가 배지의 공급, 글루코오스 및 글루타민 공급 6.60 내지 6.95 사이로 제어된 pH, CO2 자동 부가 (알칼리 부가 피함)
3일	세포 계수, 샘플, 유가 배지의 공급, 글루코오스 및 글루타민 공급 설정값 6.9±0.05로 제어된 pH, 알칼리 또는 CO₂ 자동 부가 다음일 때 31℃로 온도 감소됨: 1) 생존가능한 세포 밀도가 2.2 MVC/mL에 도달하거나 또는 2) 3일
4-17일	세포 계수, 샘플, 유가 배지의 공급, 글루코오스 및 글루타민 공급
18-21일 또는 생존성 65% 미만	수집

실시예 10 - 알파- 만노시다제를 포함하는 정제된 생성물의 특징화

표 16은 본 발명의 정제 계획이, 75 및 55 kDa의 분해 생성물과 각각 비교하여, 어떻게 고 비율의 130 kDa 당단백질 종을 갖는 알파-만노시다제를 제공하였는지를 나타낸다. 다중모드 리간드를 포함하는 포획 단계 및 중간 능동 단계에 대한 개선된 세척 단계뿐만 아니라 Q 세파로스 HP 연마 단계를 갖는 4-단계 정제 공정을 이용한 250 L 방법이 어떻게 130 kDa 종의 수율, 전체 순도와 수율에 관하여 3 단계 공정을 이용하는 30 L 공정보다 더 잘 실시되었는지를 나타내었다.

정제된 생성물 중의 알파-만노시다제 종의 수율

정제 규모, 방법 및 순도	정제 후 개별 알파- 만노시다제 종의 %
정제 규모, 방법 및 순도	130 kDa	55 kDa	75 kDa
250 L 4-단계, 70% 수율, 순도 = 99.6%	95.2%	1.5%	2.9%
30 L 3-단계, 60-70% 수율, 순도 = 98.2%	92.1%	2.6%	3.52%

종의 분포는 3개 공정에 대한 도 7의 HPLC 다이아그램에서 볼 수 있으며, 상기는 4-단계 및 3-단계 공정을 각각 나타낸다. 도시된 2-단계 공정은 다중모드 리간드 단계를 사용하지 않는다. 좌측으로부터 제1 피크는 55 kDa 종이고, 이어서 130 kDa 및 75 kDa 종이다.

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서열 목록:

뉴클레오티드

( NT )/아미노

서열번호 산( AA ) 명칭

서열번호 1 뉴클레오티드 발현 플라스미드 pLamanExp1

서열번호 2 아미노산 rhLAAN

<110> Zymenex A/S Fogh, Jens Anderson, Claes Weigelt, Cecilia Reuterwall, Helena Hyden, Pia Nilsson, Stefan <120> PROCESS FOR PRODUCTION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT LYSOSOMAL ALPHA-MANNISODASE <130> 45839XX01 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8079 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression plasmid pLamanExp1 <400> 1 agatcttcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat 60 tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc 120 atgtccaata tgaccgccat gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat 180 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt 420 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc 480 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 540 gtacaccaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 600 tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660 caactgcgat cgcccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 720 tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcacta gaagctttat tgcggtagtt 780 tatcacagtt aaattgctaa cgcagtcagt gcttctgaca caacagtctc gaacttaagc 840 tgcagtgact ctcttaaggt agccttgcag aagttggtcg tgaggcactg ggcaggtaag 900 tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag 960 aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact gacatccact ttgcctttct 1020 ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa ggctagagta cttaatacga 1080 ctcactatag gctagcctcg agaattcgcc gccatgggcg cctacgcgcg ggcttcgggg 1140 gtctgcgctc gaggctgcct ggactcagca ggcccctgga ccatgtcccg cgccctgcgg 1200 ccaccgctcc cgcctctctg ctttttcctt ttgttgctgg cggctgccgg tgctcgggcc 1260 gggggatacg agacatgccc cacagtgcag ccgaacatgc tgaacgtgca cctgctgcct 1320 cacacacatg atgacgtggg ctggctcaaa accgtggacc agtactttta tggaatcaag 1380 aatgacatcc agcacgccgg tgtgcagtac atcctggact cggtcatctc tgccttgctg 1440 gcagatccca cccgtcgctt catttacgtg gagattgcct tcttctcccg ttggtggcac 1500 cagcagacaa atgccacaca ggaagtcgtg cgagaccttg tgcgccaggg gcgcctggag 1560 ttcgccaatg gtggctgggt gatgaacgat gaggcagcca cccactacgg tgccatcgtg 1620 gaccagatga cacttgggct gcgctttctg gaggacacat ttggcaatga tgggcgaccc 1680 cgtgtggcct ggcacattga ccccttcggc cactctcggg agcaggcctc gctgtttgcg 1740 cagatgggct tcgacggctt cttctttggg cgccttgatt atcaagataa gtgggtacgg 1800 atgcagaagc tggagatgga gcaggtgtgg cgggccagca ccagcctgaa gcccccgacc 1860 gcggacctct tcactggtgt gcttcccaat ggttacaacc cgccaaggaa tctgtgctgg 1920 gatgtgctgt gtgtcgatca gccgctggtg gaggaccctc gcagccccga gtacaacgcc 1980 aaggagctgg tcgattactt cctaaatgtg gccactgccc agggccggta ttaccgcacc 2040 aaccacactg tgatgaccat gggctcggac ttccaatatg agaatgccaa catgtggttc 2100 aagaaccttg acaagctcat ccggctggta aatgcgcagc aggcaaaagg aagcagtgtc 2160 catgttctct actccacccc cgcttgttac ctctgggagc tgaacaaggc caacctcacc 2220 tggtcagtga aacatgacga cttcttccct tacgcggatg gcccccacca gttctggacc 2280 ggttactttt ccagtcggcc ggccctcaaa cgctacgagc gcctcagcta caacttcctg 2340 caggtgtgca accagctgga ggcgctggtg ggcctggcgg ccaacgtggg accctatggc 2400 tccggagaca gtgcacccct caatgaggcg atggctgtgc tccagcatca cgacgccgtc 2460 agcggcacct cccgccagca cgtggccaac gactacgcgc gccagcttgc ggcaggctgg 2520 gggccttgcg aggttcttct gagcaacgcg ctggcgcggc tcagaggctt caaagatcac 2580 ttcacctttt gccaacagct aaacatcagc atctgcccgc tcagccagac ggcggcgcgc 2640 ttccaggtca tcgtttataa tcccctgggg cggaaggtga attggatggt acggctgccg 2700 gtcagcgaag gcgttttcgt tgtgaaggac cccaatggca ggacagtgcc cagcgatgtg 2760 gtaatatttc ccagctcaga cagccaggcg caccctccgg agctgctgtt ctcagcctca 2820 ctgcccgccc tgggcttcag cacctattca gtagcccagg tgcctcgctg gaagccccag 2880 gcccgcgcac cacagcccat ccccagaaga tcctggtccc ctgctttaac catcgaaaat 2940 gagcacatcc gggcaacgtt tgatcctgac acagggctgt tgatggagat tatgaacatg 3000 aatcagcaac tcctgctgcc tgttcgccag accttcttct ggtacaacgc cagtataggt 3060 gacaacgaaa gtgaccaggc ctcaggtgcc tacatcttca gacccaacca acagaaaccg 3120 ctgcctgtga gccgctgggc tcagatccac ctggtgaaga cacccttggt gcaggaggtg 3180 caccagaact tctcagcttg gtgttcccag gtggttcgcc tgtacccagg acagcggcac 3240 ctggagctag agtggtcggt ggggccgata cctgtgggcg acacctgggg gaaggaggtc 3300 atcagccgtt ttgacacacc gctggagaca aagggacgct tctacacaga cagcaatggc 3360 cgggagatcc tggagaggag gcgggattat cgacccacct ggaaactgaa ccagacggag 3420 cccgtggcag gaaactacta tccagtcaac acccggattt acatcacgga tggaaacatg 3480 cagctgactg tgctgactga ccgctcccag gggggcagca gcctgagaga tggctcgctg 3540 gagctcatgg tgcaccgaag gctgctgaag gacgatggac gcggagtatc ggagccacta 3600 atggagaacg ggtcgggggc gtgggtgcga gggcgccacc tggtgctgct ggacacagcc 3660 caggctgcag ccgccggaca ccggctcctg gcggagcagg aggtcctggc ccctcaggtg 3720 gtgctggccc cgggtggcgg cgccgcctac aatctcgggg ctcctccgcg cacgcagttc 3780 tcagggctgc gcagggacct gccgccctcg gtgcacctgc tcacgctggc cagctggggc 3840 cccgaaatgg tgctgctgcg cttggagcac cagtttgccg taggagagga ttccggacgt 3900 aacctgagcg cccccgttac cttgaacttg agggacctgt tctccacctt caccatcacc 3960 cgcctgcagg agaccacgct ggtggccaac cagctccgcg aggcagcctc caggctcaag 4020 tggacaacaa acacaggccc cacaccccac caaactccgt accagctgga cccggccaac 4080 atcacgctgg aacccatgga aatccgcact ttcctggcct cagttcaatg gaaggaggtg 4140 gatggttagg tctgctggga tgggccctct agagtcgacc cgggcggccg cttcccttta 4200 gtgagggtta atgcttcgag cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 4260 aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 4320 tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 4380 tcaggttcag ggggagatgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 4440 taaaatccga taaggatcga tccgggctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 4500 ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 4560 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 4620 ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 4680 ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagagc tttacggcac ctcgaccgca 4740 aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 4800 gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 4860 cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgggg atttcggcct 4920 attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt 4980 gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccaggc aggcagaagt atgcaaagca 5040 tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 5100 gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 5160 tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 5220 ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 5280 gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg atggttcgac cattgaactg 5340 catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac ggagacctac cctggcctcc 5400 gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca acctcttcag tggaaggtaa 5460 acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc attcctgaga agaatcgacc 5520 tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc aaagaaccac cacgaggagc 5580 tcattttctt gccaaaagtt 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ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 6480 aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 6540 acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 6600 ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 6660 gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 6720 atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 6780 acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 6840 tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 6900 ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 6960 aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 7020 aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 7080 ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 7140 atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 7200 aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 7260 accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 7320 tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 7380 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 7440 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 7500 cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 7560 caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 7620 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 7680 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 7740 gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 7800 acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 7860 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 7920 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 7980 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 8040 tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tggctcgac 8079 <210> 2 <211> 1011 <212> PRT <213> Homo sapiens 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Gly Phe Asp Gly Phe Phe Phe Gly Arg Leu Asp Tyr Gln 210 215 220 Asp Lys Trp Val Arg Met Gln Lys Leu Glu Met Glu Gln Val Trp Arg 225 230 235 240 Ala Ser Thr Ser Leu Lys Pro Pro Thr Ala Asp Leu Phe Thr Gly Val 245 250 255 Leu Pro Asn Gly Tyr Asn Pro Pro Arg Asn Leu Cys Trp Asp Val Leu 260 265 270 Cys Val Asp Gln Pro Leu Val Glu Asp Pro Arg Ser Pro Glu Tyr Asn 275 280 285 Ala Lys Glu Leu Val Asp Tyr Phe Leu Asn Val Ala Thr Ala Gln Gly 290 295 300 Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn His Thr Val Met Thr Met Gly Ser Asp Phe 305 310 315 320 Gln Tyr Glu Asn Ala Asn Met Trp Phe Lys Asn Leu Asp Lys Leu Ile 325 330 335 Arg Leu Val Asn Ala Gln Gln Ala Lys Gly Ser Ser Val His Val Leu 340 345 350 Tyr Ser Thr Pro Ala Cys Tyr Leu Trp Glu Leu Asn Lys Ala Asn Leu 355 360 365 Thr Trp Ser Val Lys His Asp Asp Phe Phe Pro Tyr Ala Asp Gly Pro 370 375 380 His Gln Phe Trp Thr Gly Tyr Phe Ser Ser Arg Pro Ala Leu Lys Arg 385 390 395 400 Tyr Glu Arg Leu Ser Tyr Asn Phe Leu Gln Val Cys Asn Gln Leu Glu 405 410 415 Ala Leu Val Gly Leu Ala Ala Asn Val Gly Pro Tyr Gly Ser Gly Asp 420 425 430 Ser Ala Pro Leu Asn Glu Ala Met Ala Val Leu Gln His His Asp Ala 435 440 445 Val Ser Gly Thr Ser Arg Gln His Val Ala Asn Asp Tyr Ala Arg Gln 450 455 460 Leu Ala Ala Gly Trp Gly Pro Cys Glu Val Leu Leu Ser Asn Ala Leu 465 470 475 480 Ala Arg Leu Arg Gly Phe Lys Asp His Phe Thr Phe Cys Gln Gln Leu 485 490 495 Asn Ile Ser Ile Cys Pro Leu Ser Gln Thr Ala Ala Arg Phe Gln Val 500 505 510 Ile Val Tyr Asn Pro Leu Gly Arg Lys Val Asn Trp Met Val Arg Leu 515 520 525 Pro Val Ser Glu Gly Val Phe Val Val Lys Asp Pro Asn Gly Arg Thr 530 535 540 Val Pro Ser Asp Val Val Ile Phe Pro Ser Ser Asp Ser Gln Ala His 545 550 555 560 Pro Pro Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ser Leu Pro Ala Leu Gly Phe Ser 565 570 575 Thr Tyr Ser Val Ala Gln Val Pro Arg Trp Lys Pro Gln Ala Arg Ala 580 585 590 Pro Gln Pro Ile Pro Arg Arg Ser Trp Ser Pro Ala Leu Thr Ile Glu 595 600 605 Asn Glu His Ile Arg Ala Thr Phe Asp Pro Asp Thr Gly Leu Leu Met 610 615 620 Glu Ile Met Asn Met Asn Gln Gln Leu Leu Leu Pro Val Arg Gln Thr 625 630 635 640 Phe Phe Trp Tyr Asn Ala Ser Ile Gly Asp Asn Glu Ser Asp Gln Ala 645 650 655 Ser Gly Ala Tyr Ile Phe Arg Pro Asn Gln Gln Lys Pro Leu Pro Val 660 665 670 Ser Arg Trp Ala Gln Ile His Leu Val Lys Thr Pro Leu Val Gln Glu 675 680 685 Val His Gln Asn Phe Ser Ala Trp Cys Ser Gln Val Val Arg Leu Tyr 690 695 700 Pro Gly Gln Arg His Leu Glu Leu Glu Trp Ser Val Gly Pro Ile Pro 705 710 715 720 Val Gly Asp Thr Trp Gly Lys Glu Val Ile Ser Arg Phe Asp Thr Pro 725 730 735 Leu Glu Thr Lys Gly Arg Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Gly Arg Glu Ile 740 745 750 Leu Glu Arg Arg Arg Asp Tyr Arg Pro Thr Trp Lys Leu Asn Gln Thr 755 760 765 Glu Pro Val Ala Gly Asn Tyr Tyr Pro Val Asn Thr Arg Ile Tyr Ile 770 775 780 Thr Asp Gly Asn Met Gln Leu Thr Val Leu Thr Asp Arg Ser Gln Gly 785 790 795 800 Gly Ser Ser Leu Arg Asp Gly Ser Leu Glu Leu Met Val His Arg Arg 805 810 815 Leu Leu Lys Asp Asp Gly Arg Gly Val Ser Glu Pro Leu Met Glu Asn 820 825 830 Gly Ser Gly Ala Trp Val Arg Gly Arg His Leu Val Leu Leu Asp Thr 835 840 845 Ala Gln Ala Ala Ala Ala Gly His Arg Leu Leu Ala Glu Gln Glu Val 850 855 860 Leu Ala Pro Gln Val Val Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ala Ala Tyr Asn 865 870 875 880 Leu Gly Ala Pro Pro Arg Thr Gln Phe Ser Gly Leu Arg Arg Asp Leu 885 890 895 Pro Pro Ser Val His Leu Leu Thr Leu Ala Ser Trp Gly Pro Glu Met 900 905 910 Val Leu Leu Arg Leu Glu His Gln Phe Ala Val Gly Glu Asp Ser Gly 915 920 925 Arg Asn Leu Ser Ala Pro Val Thr Leu Asn Leu Arg Asp Leu Phe Ser 930 935 940 Thr Phe Thr Ile Thr Arg Leu Gln Glu Thr Thr Leu Val Ala Asn Gln 945 950 955 960 Leu Arg Glu Ala Ala Ser Arg Leu Lys Trp Thr Thr Asn Thr Gly Pro 965 970 975 Thr Pro His Gln Thr Pro Tyr Gln Leu Asp Pro Ala Asn Ile Thr Leu 980 985 990 Glu Pro Met Glu Ile Arg Thr Phe Leu Ala Ser Val Gln Trp Lys Glu 995 1000 1005 Val Asp Gly 1010

Claims

재조합 알파-만노시다제를 포함하는 세포 배양액의 분획을 다중모드 리간드를 포함하는 수지 상에서 크로마토그래피 처리하는 단계를 포함하는, 세포 배양액으로부터 재조합 알파-만노시다제를 정제하는 방법.
제1항에 있어서,
재조합 알파-만노시다제를 포함하는 세포 배양액의 상기 분획이 청정하고 희석되지 않은 수집물인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
다중모드 리간드에 결합된 상기 수지가 카복시산 또는 설폰산 기를 갖는 물질인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
다중모드 리간드에 결합된 상기 수지가 하기 화학식(I), (II) 또는 (III)의 물질인 방법:

식 중에서, 화학식(II) 및 (III)의 물질의 R은 하기 화학식(IV)의 작용기임.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
다중모드 리간드를 포함하는 수지 상에 로딩된 상기 세포 배양액의 분획을 이소프로판올, 바람직하게는 적어도 1% (V:V) 이소프로판올, 예컨대 적어도 2%, 3%, 4%, 4.5% (V:V) 이소프로판올, 바람직하게는 적어도 5% (V:V) 이소프로판올을 포함하는 용액을 사용한 적어도 하나의 세척 단계에 처리시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
재조합 알파-만노시다제를 포함하는 제1 용출액은 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 수용액을 사용하여 다중모드 리간드를 포함하는 수지로부터 용출되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
다중모드 리간드를 포함하는 수지로부터 얻은 알파 만노시다제를 포함하는 제1 용출액이
i) 알파-만노시다제를 포함하는 분획을 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지에 적용하여 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 용출액을 제공하는 단계;
ii) 알파-만노시다제를 포함하는 분획을 혼합 모드 이온 교환 수지를 통과하게 하면서 오염물의 체류를 허용하여 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 통과분획을 제공하는 단계; 및
iii) 알파-만노시다제를 포함하는 분획을 음이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 처리하여 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 용출액을 제공하는 단계를 포함하는 방법에 더 처리되는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
알파-만노시다제가
A) 서열번호 2에 기재된 서열;
B) A)에 기재된 서열의 유사체(analogue);
C) A) 또는 B)에 기재된 서열의 서브서열(subsequence)로부터 선택된 서열을 갖는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 정제 방법에 의해 얻을 수 있는 알파-만노시다제를 포함하는 조성물.
a. 0일에 기본 배지를 포함하는 제조 반응기를 재조합 알파-만노시다제를 생성할 수 있는 세포를 사용하여 접종시키는 단계;
b. 1일로부터 적어도 1회 상기 세포 배양액에 유가 배지를 부가하는 단계; 및
c. 3일 후 또는 생존성 세포 밀도가 2.1 MVC/mL 보다 높을 때 중 먼저 오는 경우에 상기 세포 배양액의 온도를 많아야 35℃, 예컨대 34℃, 33℃, 32℃, 바람직하게는 많아야 31℃로 조절하는 단계를 포함하는, 재조합 알파-만노시아제를 유가식(fed batch)으로 또는 연속식으로 제조하는 방법.
제 10항에 있어서,
d. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 정제 공정 단계를 더 포함하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 세포 배양은 대구 간유 보충물과 같이 동물로부터 유래한 임의의 보충물을 필수적으로 갖지 않는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
유가식 제조 또는 연속식 제조를 위한 공정이 적어도 30 L, 예컨대 적어도 50 L, 75 L, 100 L, 150 L, 200 L, 바람직하게는 적어도 250 L의 부피로 실시되는 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
알파-만노시다제가
A) 서열번호 2에 기재된 서열;
B) A)에 기재된 서열의 유사체;
C) A) 또는 B)에 기재된 서열의 서브서열로부터 선택된 서열을 갖는 방법.
제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 알파-만노시다제를 포함하는 조성물.
알파-만노시다제의 적어도 80%가 130 kDa 당단백질로서 존재하는 정제된 재조합 알파-만노시다제를 포함하는 조성물.
제16항에 있어서,
상기 재조합 알파-만노시다제가 +5℃에서 저장될 때 적어도 4일간 또는 -20℃에서 저장될 때 적어도 24개월 동안 액체 용액에서 안정하게 유지하는 조성물.
제16항 또는 제17항에 있어서,
상기 알파-만노시다제가
A) 서열번호 2에 기재된 서열;
B) A)에 기재된 서열의 유사체;
C) A) 또는 B)에 기재된 서열의 서브서열로부터 선택된 서열을 갖는 조성물.
제9항, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
의약으로서 사용하기 위한 조성물.
제9항, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
알파-만노시도시스 치료에 사용하기 위한 조성물.
알파-만노시도시스 치료를 위한 의약 제조에 사용하기 위한 제9항, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
제9항, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 정제된 재조합 알파- 만노시다제를 포함하는 조성물을, 치료를 필요로 하는 검체에게 투여하는 단계를 포함하는, 알파-만노시도시스를 치료 및/또는 알파-만노시도시스와 관련된 증상을 감소 또는 경감시키는 방법.