TW201618809A

TW201618809A - 用於治療肝醣儲積症及肝醣代謝病症之方法及組合物

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Publication number: TW201618809A
Application number: TW104119311A
Authority: TW
Inventors: 達斯汀Ｄ阿姆斯壯
Original assignee: 維理恩治療公司
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2016-06-01

Abstract

在某些實施例中，本發明提供用於治療福布斯-柯裡氏病(Forbes-Cori)及/或安德森病(Andersen Disease)及/或馮吉爾克病(von Gierke Disease)及/或龐貝氏病(Pompe Disease)及/或拉弗拉病(Lafora Disease)之組合物及方法。

Description

用於治療肝醣儲積症及肝醣代謝病症之方法及組合物

相關申請案

本申請案主張對2014年6月13日申請的美國臨時申請案第62/012,151號、2014年8月27日申請的美國臨時申請案第62/042,689號及2014年12月24日申請的美國臨時申請案第62/096,735號以及2015年6月12日申請的PCT申請案第PCT/US15/35680號的優先權益。上述申請案中每一者之揭示內容係全文以引用方式併入本文中。

肝醣儲積症及肝醣代謝病症係一系列疾病，其係由基礎代謝酶缺陷而引起，由此導致肌肉、肝、神經元及其他細胞類型內之肝醣合成或分解缺陷。肝醣儲積症可為遺傳性(通常作為體染色體隱性病症)或後天性(例如，因生物鹼中毒)(Monga等人，2011,Molecular Pathology of Liver Diseases,Molecular Pathology Library 5，第45章)。有多種不同類型的肝醣儲積症，包括GSD I-XI型、GSD 0型，以及通常稱為肝醣代謝病症之拉弗拉病(Lafora disease)。該等疾病關於突變之酶及/或受影響之原生組織不同(Monga等人及Gentry等人，2013,FEBS J,280(2)：525-37)。

a. 福布斯-柯裡氏病(Forbes-Cori Disease)

福布斯-柯裡氏病亦稱為GSD III型、GSD III或肝醣去支酶缺失，其係體染色體隱性神經肌肉/肝疾病，估計發病率為100,000名新生兒中1例。該等術語在通篇中可互換使用。福布斯-柯裡氏病佔所有肝醣儲積症之約27%。福布斯-柯裡氏病之臨床表現已充分確定但極其多變。儘管一般認為係一種肝病，具有肝腫大及硬化，但福布斯-柯裡氏病之特徵亦在於多個其他系統的異常。在此疾病中亦可觀察到肌無力、肌肉消瘦、低血糖症、異常血脂症及偶然地智力遲鈍。一些患者具有面部異常。一些患者亦可具有增加的骨質疏鬆症風險。不同患者可經受一種或一種以上該等症狀。此疾病之臨床表現之差異通常與此疾病之不同亞型相關。

福布斯-柯裡氏病有4種亞型。A型亞型佔病例之約80%，缺乏酶活性(例如，與天然酶活性相關之葡萄糖苷酶及轉移酶活性二者)且影響肝及肌肉二者。B型亞型佔病例之約15%，缺乏酶活性(例如，與天然酶活性相關之葡萄糖苷酶及轉移酶活性二者)且僅影響肝。C型及D型亞型佔病例之小於5%，與葡萄糖苷酶活性(C型)或轉移酶活性(D型)之選擇性損失相關且臨床上與A型亞型類似。

福布斯-柯裡氏病係由AGL基因中之突變引起。該AGL基因編碼澱粉-1,6-葡萄糖苷酶(AGL)蛋白質(基因庫登錄號NP_000019.2；NM_000645.2；及NM_000646.2)，該蛋白質係負責催化肝醣及類似分子中之末端α-1,6-葡萄糖苷鍵聯裂解之細胞質酶。AGL蛋白質具有兩種單獨的酶活性：4-α-葡糖轉移酶活性及澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性。正常肝醣去支活性需要兩種催化活性。肝醣係葡萄糖殘基之高度分支聚合物。

AGL負責將肝醣之3個葡萄糖亞單位從一個平行鏈轉移至另一個平行鏈，由此在加長一個線形支鏈的同時縮短另一個線性支鏈。隨後，供體支鏈仍將含有具有α-1,6鍵聯之單一葡萄糖殘基。然後，AGL之α-1,6葡萄糖苷酶將移除該殘留殘基，生成肝醣分子上該鏈之「去支鏈」形式。在肝醣未適當去支鏈之情況下，如在不存在功能性AGL時所發生者，在身體各個組織(包括肝細胞及肌細胞)中產生並累積類似於支鏈澱粉樣結構(葡聚糖)之異常肝醣。肝醣之此異常形式通常不溶且可對細胞具有毒性。

目前，福布斯-柯裡氏病之主要治療係膳食性治療且旨在維持血糖濃度正常(Ozen等人，2007,World J Gastroenterol,13(18)：2545-46)。為此，向患者頻繁餵食碳水化合物及玉米澱粉供應高之膳食。亦向肌病患者餵食高蛋白飲食。肝移植解決所有肝相關的生物化學異常，但肝移植對肌病/心肌病之長期效應未知(Ozen等人，2007)。該等用於管控福布斯-柯裡氏病之工具係不夠的。膳食方案具有顯著順從性問題-尤其對於年輕患者。因此，業內需要減少肝醣及/或葡聚糖積累之福布斯-柯裡氏病療法。

b. 安德森氏病(Andersen’s Disease)

IV型肝醣儲積症(GSD IV)亦稱為安德森病、安德森氏病或澱粉黏膠質病(且該等術語在本文中可互換使用)，其係由於肝醣分支酶(GBE)(基因庫登錄號NP_000149.3，亦稱為澱粉-(1,4至1,6)轉糖苷酶)缺失引起的罕見的體染色體隱性病症。GBE經由涉及將6-7個葡萄糖殘基(來自長度為至少11個葡萄糖殘基之聚合物)之末端片段末端轉移至內部葡萄糖殘基之C-6羥基位置之過程在葡萄糖中產生α-1,6支鏈。在人類中，GBE1基因存於染色體3p12上且編碼具有702個胺基酸之肽。

減少或不存在之GBE之量導致組織累積具有較少分支點及較長外部支鏈之異常肝醣，其類似於支鏈澱粉樣結構，亦稱為葡聚糖(Lee等人，2010,Hum Mol Genet,20(3)：455-465)。葡聚糖具有低溶解性且可在肝、心臟及肌肉中形成沈澱。

安德森病具有臨床異質性，所涉及組織及發病年齡可變(Akman, 2014,Neurology,82(1)：P1.054)。發病年齡介於胎兒至成年期範圍內且分為四組：(i)圍產期，呈現為胎兒運動不能變形序列及圍產期死亡；(ii)先天性(嬰兒期)，具有胎兒水腫、神經元參與及嬰兒早期死亡；(iii)兒童期(少年期)，具有肌病或心肌病；及(iv)成年，具有孤立性肌病或成年葡聚糖體病(Lee等人，2010)。在子宮中或在嬰兒期中，不存在酶活性通常係致死的，主要影響肌肉及肝。然而，殘留酶活性(5-20%)導致少年期或成年發病的病症，其主要影響肌肉以及中樞神經系統及周圍神經系統二者。患有少年期安德森病(其係安德森病之最常見形式)的患者首先在生命最初幾個月內展示症狀，且特徵為肝脾腫大及成長遲緩。然後該等少年期病例通常進展至肝硬化、門靜脈高血壓、食管靜脈曲張及腹水，且通常截至五歲時發生死亡。安德森病之成年病例可表現與少年期病例類似的症狀，但在患者生命後期之前，不會發生該等症狀之發作。

安德森病之治療通常係膳食性治療，藉由維持血糖以及足夠營養攝入以改良肝功能及肌肉強度。在進行性肝衰竭之情形中，可採用肝移植。與用於福布斯-柯裡氏病之療法類似，該等用於管控安德森病之工具係不夠的且該疾病係或可為致命的。因此，業內需要減少肝醣及/或葡聚糖累積之安德森病療法。

c. 馮吉爾克氏病(von Gierke’s Disease)

I型肝醣儲積症(GSD I)或馮吉爾克氏病(在業內及在本文中亦可互換地稱為馮吉爾克病)係最常見之肝醣儲積症，其發病率為50,000至100,000名新生兒中約1例。該缺失損傷肝自肝醣及自糖質新生產生游離葡萄糖之能力。由於該等係肝在禁食期間向身體其餘部分供應葡萄糖之兩種主要代謝機制，其引起嚴重低血糖症且導致肝及腎中之肝醣儲積增加。此可導致兩個器官增大。

GSD I之最常見形式名為GSD Ia及GSD Ib，前者佔已診斷病例之 80%以上且後者佔小於20%。已闡述幾種更罕見之形式。GSD Ia係由G6PC(葡萄糖-6-磷酸酶基因)之突變引起。GSD Ib係由SLC37A4(葡萄糖-6-磷酸酶運輸蛋白)之突變引起。

臨床表現直接或間接由以下引起：在每天之吸收後時間期間不能維持足夠血糖值；器官因肝醣累積而發生變化；生成過量乳酸；及高尿酸血症對組織之損傷。肝醣累積包括在肝中及在腎及小腸中之累積。肝腫大(通常不伴隨脾腫大)在胎兒期開始發展且通常在生命最初幾個月顯著。截至兒童站立並行走時，肝腫大可足夠嚴重而引起腹部突出。

腎通常因肝醣儲積而增大10%至20%。在兒童期，此通常不引起臨床問題，但偶有范康尼症候群(Fanconi syndrome)之例外，其具有腎小管重吸收之多重紊亂，包括近端腎小管酸中毒以及碳酸氫鹽及磷酸鹽浪費。然而，延長之高尿酸血症可引起尿酸腎病變。在患有GSD I之成人中，與糖尿病性腎病變類似之慢性腎小球損傷可導致腎衰竭。

肝併發症在一些患者中嚴重。肝腺瘤可在二十多歲或之後發展，且之後惡性轉變為肝細胞瘤或肝癌之機率較小。在患有GSD I之青少年及成人中報導之其他問題已包括高尿酸血症性痛風、胰臟炎及慢性腎衰竭。

馮吉爾克氏病之治療通常係膳食性治療，藉由頻繁餵食葡萄糖或澱粉(其易於消化為葡萄糖)高之食物來進行，且主要治療目標係預防低血糖症及繼發性代謝紊亂。尤其在兒童中，此需要整夜餵食。已使用兩種方法在年幼兒童中達成此目標：(1)連續夜間灌胃給予葡萄糖或澱粉；及(2)夜間餵食未烹煮玉米澱粉。然而，業內仍需要馮吉爾克氏病療法，例如，在患有GSD I(例如GSD Ia或GSD Ib)之患者之肝及/或腎中減少肝醣累積之療法。

d. 拉弗拉病

拉弗拉病亦稱作拉弗拉進行性肌陣攣性癲癇或MELF，其係罕見的致命的神經退化病症，特徵為在來自受影響個體之大多數組織(包括腦、心臟、肝、肌肉及皮膚)之細胞中累積不溶性低分支過磷酸化肝醣。拉弗拉病患者通常首先在青春期發生症狀。症狀包括暫時失明、抑鬱症、癲癇發作、跌倒發作、肌陣攣、共濟失調、視幻覺、失神及快速發展之嚴重失智症。通常在發病後2-10年(平均5年)發生死亡。

拉弗拉病之盛行率未知。儘管此疾病在世界範圍內發生，但其在地中海國家、中亞之多個部分、印度、巴基斯坦、北非及中東最常見。在西方國家，估計盛行率低於1/1,000,000。

拉弗拉病係因以下兩個基因中之一者之突變而引起的體染色體隱性病症：EPM2A及EPM2B。EPM2A編碼稱為拉弗拉蛋白(laforin)之331個胺基酸之蛋白質，其包含胺基-末端碳水化合物結合模組及羧基-末端雙重特異性磷酸酶結構域。EPM2B編碼稱為馬啉素(malin)之E3泛蛋白連接酶。拉弗拉蛋白與馬啉素一起構成被認為參與藉由調節葡萄糖運輸蛋白之亞細胞定位來負向調節葡萄糖攝取之功能性複合物。Singh等人，2012,Mol Cell Biol,32(3)：652-663。最新研究亦表明，肝醣累積負責在拉弗拉病患者腦中觀察到之神經退化及受損自體吞噬。Duran等人，2014,Hum Mol Genet,23(12)：3147-56。

對於患有拉弗拉病之患者，目前無治癒性或有效治療。然而，至少在疾病早期可以抗癲癇藥管控癲癇發作及肌陣攣。

業內需要用於在患有福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或馮吉爾克病及/或龐貝氏病(Pompe Disease)及/或拉弗拉病之患者中清除肝醣積累、尤其細胞質肝醣積累，或用於治療與肝醣積累相關之細胞毒性效應之方法及組合物，以及需要用於治療該等疾病中之任何一或多者之替代性療法。本發明提供該等方法及組合物。舉例而言，業內需要在(例如)細胞(例如肌肉及/或肝及/或腎及/或神經元細胞)之細胞質中減少肝醣累積。在另一實例中，作為減少細胞質肝醣累積之替代或除了減少細胞質肝醣累積以外，該等方法及組合物可在溶酶體及/或核中減少肝醣累積。在某些實施例中，該等方法及組合物可用於在細胞質中以及在溶酶體中(及對於特徵為肝醣之核累積之病況，視情況在核中)減少肝醣累積。在該等病況之情況下，減少細胞質肝醣積累係指減少正常及/或異常肝醣之累積，且可類似地應用於在其他位點減少肝醣累積。因此，在申請案通篇中，除非另外規定，否則在提及清除肝醣積累或減少肝醣累積(或類似術語)時涵蓋清除或減少過量(例如，超出正常生理含量)肝醣，病況清除或減少以異常形式(例如，葡聚糖)存在之過量肝醣。在某些實施例中，本發明提供例如在細胞質中，例如在肌肉細胞(骨骼肌及/或心肌)、肝、腎或神經元中清除或減少過量葡聚糖(例如，清除或減少葡聚糖累積)之方法。在某些實施例中，清除肝醣積累或減少肝醣累積(或類似術語)係指至少在一或多種受影響細胞之細胞質中如此進行。在某些實施例中，例如至少在細胞質中清除肝醣積累或減少肝醣累積係或包含例如至少在細胞質中清除葡聚糖積累或減少葡聚糖累積。尤其在其疾病足夠嚴重及/或足夠晚期而具有顯著異常細胞質肝醣累積(例如，正常及/或異常肝醣)之患者中，該等方法及組合物將改良福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或馮吉爾克病及/或龐貝氏病及/或拉弗拉病之治療。本發明提供該等方法及組合物。在某些實施例中，本文提供之該等方法及組合物至少在細胞質中減少肝醣積累(例如，清除肝醣積累或減少肝醣累積)。在某些實施例中，本發明之方法及組合物減少葡聚糖積累(例如，至少在細胞(例如肌肉及/或肝及/或神經元及/或神經膠細胞)之細胞質中之積累)。在某些實施例中，本發明之方法及組合物至少在至少肌肉及/或肝之細胞質中減少肝醣(例如葡聚糖)積累。

本文提供之該等方法及組合物之一個益處在於，在多種肝醣儲積症、特定而言在福布斯-柯裡氏病、安德森病及龐貝氏病之研究或治療中可使用單一蛋白質(例如，包含如本文所述之GAA多肽部分及如本文所述之內化性部分之嵌合蛋白質)。在某些實施例中，嵌合蛋白質可用於治療馮吉爾克病或用於促進遞送至指示馮吉爾克病之細胞中。在某些實施例中，嵌合蛋白質可用於治療拉弗拉病或用於促進遞送至指示拉弗拉病之細胞中。因此，在某些實施例中，本發明提供適於治療龐貝氏病、福布斯-柯裡氏病、安德森病、馮吉爾克病及拉弗拉病中之任一者、任兩者、任三者、任四者或所有五者之方法及組合物。除了本文提供之基於包含GAA部分及內化性部分之蛋白質治療劑之方法及組合物外，本發明亦提供其中在多種肝醣儲積症之治療或研究中、特定而言在前述疾病中之任一者、任兩者、任三者、任四者或所有五者之治療或研究中可使用單一嵌合蛋白質(例如，包含如本文所述選自GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL多肽部分之非內化性部分多肽部分及如本文所述之內化性部分之蛋白質治療劑)之方法及組合物。在某些實施例中，在拉弗拉病之治療或研究中使用此一包含拉弗拉蛋白多肽部分之嵌合蛋白質。在某些實施例中，在拉弗拉病之治療或研究中使用此一包含馬啉素多肽部分之嵌合蛋白質。在某些實施例中，在拉弗拉病之治療或研究中使用此一包含AGL多肽部分之嵌合蛋白質。在某些實施例中，在拉弗拉病之治療或研究中使用此一包含α-澱粉酶多肽部分之嵌合蛋白質。在某些實施例中，在福布斯-柯裡氏病之治療或研究中使用此一包含α-澱粉酶多肽部分之嵌合蛋白質。類似地，本發明前述嵌合多肽中之任一者可用於在活體外及/或活體內在細胞中(包括在來自該等疾病中之任一者之個體或動物模型之細胞中)減少肝醣累積。明確涵蓋所有該等活體外及活體內方法。

在某些實施例中，包含本文所揭示GAA多肽中之任一者及本文所述內化性部分中之任一者之嵌合多肽可用於治療龐貝氏病、福布斯-柯裡氏病、安德森病、馮吉爾克病或拉弗拉病中之任何一或多者或可用於在細胞(例如患有前述疾病中之任一者之個體之細胞)中減少肝醣累積。在某些實施例中，該等方法係活體內方法。在某些實施例中，包含本文所揭示之AGL多肽中之任一者及本文所述內化性部分中之任一者之嵌合多肽可用於治療拉弗拉病或可用於在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)中減少肝醣累積。在某些實施例中，包含本文所揭示之馬啉素多肽中之任一者及本文所述內化性部分中之任一者之嵌合多肽可用於治療拉弗拉病或可用於在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)中減少肝醣累積。在某些實施例中，包含本文所揭示之α-澱粉酶多肽中之任一者及本文所述內化性部分中之任一者之嵌合多肽可用於治療拉弗拉病或可用於在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)中減少肝醣累積。在某些實施例中，包含本文所揭示之α-澱粉酶多肽中之任一者及本文所述內化性部分中之任一者之嵌合多肽可用於治療福布斯-柯裡氏病或可用於在細胞(例如患有福布斯-柯裡氏病之個體之細胞)中減少肝醣累積。在某些實施例中，包含本文所揭示之拉弗拉蛋白多肽中之任一者及本文所述內化性部分中之任一者之嵌合多肽可用於治療拉弗拉病或可用於在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)中減少肝醣累積。在某些實施例中，個體或細胞可用一或多種不同類型之本文所揭示之嵌合多肽中之任一者來治療。舉例而言，在一些實施例中，個體可用以下之任一組合來治療：包含本文所揭示之任一GAA多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之任一拉弗拉蛋白多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之任一AGL多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之α-澱粉酶多肽中之任一者之嵌合多肽或包含本文所揭示之任一馬啉素多肽之嵌合多肽。在具體實施例中，拉弗拉病個體在某些實施例中係經至少兩種選自由以下組成之群之嵌合多肽治療：包含本文所揭示之任一拉弗拉蛋白多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之任一AGL多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之α-澱粉酶多肽中之任一者之嵌合多肽及包含本文所揭示之任一馬啉素多肽之嵌合多肽。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之安德森病之方法。在某些實施例中，該方法包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)內化性部分。在某些實施例中，內化性部分促進遞送至細胞中。嵌合多肽之兩個部分可經由多種機制中之任一者(例如，經由作為融合蛋白一部分之一或多個連接(例如一或多種化學偶聯)互連、二硫鍵等)來結合。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有安德森病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使該等細胞與(例如藉由投與)嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，個體患有圍產期形式之安德森病。在某些實施例中，個體患有先天形式之安德森病。在某些實施例中，個體患有少年期形式之安德森病。在某些實施例中，個體患有成年形式之安德森病。

在某些實施例中，本發明提供在有需要之個體中治療福布斯-柯裡氏病之方法。在某些實施例中，該方法包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有福布斯-柯裡氏病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使肌肉細胞與嵌合多肽接觸或投與該嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之馮吉爾克病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。

在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有馮吉爾克病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使肝細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，個體或細胞在編碼葡萄糖-6-磷酸酶之基因中具有突變。在某些實施例中，個體在編碼SLC37A4之基因中具有突變。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2A基因中具有突變。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2B基因中具有突變。

在本文所揭示之任一治療方法之某些實施例中，有需要之個體係在起始使用該嵌合多肽之治療之前具有病理性細胞質肝醣累積之個體。

在本文所述任一方法之某些實施例中，該方法係活體外方法且在活體外使細胞接觸。在本文所述任一方法之某些實施例中，該方法係活體內方法且在活體內使細胞接觸，例如藉由投與個體來實施。

在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之嵌合多肽包含本文所述之任一GAA多肽。在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之嵌合多肽包含SEQ ID NO：1或2中所述之GAA多肽。在某些實施例中，嵌合多肽不包含SEQ ID NO：1或2之殘基1-56中所述之GAA多肽之部分。在某些實施例中，嵌合多肽不包含SEQ ID NO：1或2之殘基1-57中所述之GAA多肽之部分。在某些實施例中，嵌合多肽缺少GAA完整連接體區域之至少一部分，其中該完整連接體區域對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸57-78。在某些實施例中，嵌合多肽缺少GAA完整連接體區域之至少一部分，其中該完整連接體區域對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸57-78。在某些實施例中，GAA多肽及嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-60之鄰接胺基酸序列。在某些實施例中，嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列。在某些實施例中，GAA多肽及嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-66之鄰接胺基酸序列。在某些實施例中，嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。在某些實施例中，GAA多肽及嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-69之鄰接胺基酸序列。在某些實施例中，嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：23之序列。在某些實施例中，成熟GAA多肽之分子量為約70-76千道爾頓。在某些實施例中，成熟GAA多肽之分子量為約70千道爾頓。在某些實施例中，成熟GAA多肽之分子量為約76千道爾頓。在某些實施例中，成熟GAA多肽由選自SEQ ID NO：1之殘基122-782或SEQ ID NO：2之殘基204-782之胺基酸序列組成。在某些實施例中，嵌合多肽具有酸性α-葡萄糖苷酶活性。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)拉弗拉蛋白多肽及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)拉弗拉蛋白多肽及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2A基因中具有突變。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2B基因中具有突變。在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之嵌合多肽包含本文所述之任一拉弗拉蛋白多肽。在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少80%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之安德森病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有安德森病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含投與嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，個體患有圍產期形式之安德森病。在某些實施例中，個體患有先天形式之安德森病。在某些實施例中，個體患有少年期形式之安德森病。在某些實施例中，個體患有成年形式之安德森病。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之龐貝氏病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有龐貝氏病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使肌肉細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之馮吉爾克病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有馮吉爾克病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使肝細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，個體或細胞在編碼葡萄糖-6-磷酸酶之基因中具有突變。在某些實施例中，個體或細胞在編碼SLC37A4之基因中具有突變。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2A基因中具有突變。在某些實施例中，個體在EPM2B基因中具有突變。

在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之嵌合多肽包含本文所述之任一AGL多肽。在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之AGL多肽包含與SEQ ID NO：40-42中之任一者至少90%、95%、97%或100%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該等AGL多肽具有澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性及4-α-葡糖轉移酶活性，且嵌合多肽具有澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性及4-α-葡糖轉移酶活性。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)馬啉素多肽及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)馬啉素多肽及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2A基因中具有突變。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2B基因中具有突變。

在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之嵌合多肽包含本文所述之任一馬啉素多肽。在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少80%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在某些實施例中，馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在某些實施例中，馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。

在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)α-澱粉酶多肽及(ii)內化性部分，例如促進遞送至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有拉弗拉病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)α-澱粉酶多肽及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2A基因中具有突變。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2B基因中具有突變。

在某些實施例中，本發明提供在有需要之個體中治療福布斯-柯裡氏病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)α-澱粉酶多肽及(ii)內化性部分。在某些實施例中，內化性部分促進遞送至細胞中，例如嵌合多肽之遞送。在某些實施例中，本發明提供在細胞(例如患有福布斯-柯裡氏病之個體之細胞)之細胞質中減少肝醣累積之方法。在某些實施例中，該方法包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)α-澱粉酶多肽及(ii)內化性部分。在某些實施例中，內化性部分促進運輸至細胞之細胞質中。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2A基因中具有突變。在某些實施例中，個體或細胞在EPM2B基因中具有突變。

在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之嵌合多肽包含本文所述之任一α-澱粉酶多肽。在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少80%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在某些實施例中，α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在某些實施例中，α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。

在某些實施例中，嵌合多肽之兩個部分可經由多種機制中之任一者(例如，經由作為融合蛋白一部分之一或多個連接(例如一或多種化學偶聯)互連、二硫鍵等)來結合。

在本文所揭示之任一方法之某些實施例中，嵌合多肽之內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞中。在某些實施例中，內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞之細胞質中。在某些實施例中，嵌合多肽能被自噬液泡吸收。在某些實施例中，內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肌肉細胞中。在某些實施例中，內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肝細胞中。在某些實施例中，內化性部分促進將該嵌合多肽運輸至神經元中。在某些實施例中，嵌合多肽減少細胞質肝醣累積。在某些實施例中，內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞之細胞質中。在某些實施例中，內化性部分包含可經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)運輸蛋白穿過細胞膜及/或以小於100nM之K_D結合DNA之抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，抗體係單株抗體或其片段。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留細胞穿透活性之變體或其結合與3E10相同之表位之變體，或具有與3E10實質上相同之細胞穿透活性且結合與3E10相同之表位之抗體或前述任一者之抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留3E10之細胞穿透活性之變體或3E10或該3E10變體之抗原結合片段。在某些實施例中，內化性部分包含結合DNA之抗體或抗原結合片段(例如，抗DNA抗體)。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段係嵌合、人類化或完全人類抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：9至少95%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：10至少95%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含： VH CDR1，其具有SEQ ID NO 13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列；該等CDR符合Kabat。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；及VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16或47之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；及VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其具有SEQ ID NO 24之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列； VH CDR3，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列；該等CDR符合IMGT系統。在某些實施例中，內化性部分係scFv。在某些實施例中，內化性部分係Fab。在某些實施例中，內化性部分係抗體。在一些實施例中，內化性部分包含歸向肽。在一些實施例中，內化性部分能以小於100nM之K_D結合DNA。在一些實施例中，內化性部分以小於50nM之K_D結合DNA。

在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之嵌合多肽包含經M6P殘基修飾之N-連接寡糖鏈。在某些實施例中，嵌合多肽進一步包含一或多個多肽部分，其增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與、產生或純化中之一或多者。在一些實施例中，內化性部分經由平衡核苷運輸蛋白1(ENT1)、ENT2、ENT3或ENT4運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分可經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，嵌合多肽包含融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽係在原核或真核細胞中產生。在一些實施例中，真核細胞選自酵母細胞、禽類細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

在一些實施例中，若嵌合多肽包含GAA多肽，則Fab之重鏈之C-末端融合至GAA多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端融合至GAA多肽之N-末端。在一些實施例中，Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至GAA多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至GAA多肽之N-末端。在一些實施例中，連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合多肽係GAA多肽與內化性部分之化學偶聯物。在一些實施例中，嵌合多肽係包含GAA多肽及內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽包含GAA多肽，且GAA多肽經糖基化。在某些實施例中，GAA多肽未經糖基化。在某些實施例中，GAA多肽之糖基化模式與天然人類GAA不同。在一些實施例中，嵌合多肽包含將GAA多肽直接或間接偶聯或接合至內化性部分之連接體。在一些實施例中，嵌合多肽不包括將GAA多肽互連至內化性部分之連接體。在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些實施例中，內化性部分位於GAA多肽之N-末端。在一些實施例中，內化性部分偶聯或接合至GAA多肽之內部胺基酸。在一些實施例中，嵌合多肽具有酸性α-葡萄糖苷酶活性，且其中嵌合多肽不包含約110千道爾頓之GAA前體多肽。

在一些實施例中，若嵌合多肽包含拉弗拉蛋白多肽，則Fab之重鏈之C-末端融合至拉弗拉蛋白多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端融合至拉弗拉蛋白多肽之N-末端。在一些實施例中，Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至拉弗拉蛋白多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至拉弗拉蛋白多肽之N-末端。在一些實施例中，連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在一些實施例中，其中嵌合多肽係拉弗拉蛋白多肽與內化性部分之化學偶聯物。在一些實施例中，其中嵌合多肽係包含拉弗拉蛋白多肽及內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽包含將拉弗拉蛋白多肽直接或間接偶聯或接合至內化性部分之連接體。在一些實施例中，嵌合多肽不包括將拉弗拉蛋白多肽互連至內化性部分之連接體。在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些實施例中，內化性部分位於拉弗拉蛋白多肽之N-末端。在一些實施例中，內化性部分偶聯或接合至拉弗拉蛋白多肽之內部胺基酸。

在一些實施例中，若嵌合多肽包含AGL多肽，則Fab之重鏈之C- 末端融合至AGL多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端融合至AGL多肽之N-末端。在一些實施例中，Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至AGL多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至AGL多肽之N-末端。在一些實施例中，連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合多肽係AGL多肽與內化性部分之化學偶聯物。在一些實施例中，嵌合多肽係包含AGL多肽及內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽包含將AGL多肽直接或間接偶聯或接合至內化性部分之連接體。在一些實施例中，嵌合多肽不包括將AGL多肽互連至內化性部分之連接體。在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些實施例中，內化性部分位於AGL多肽之N-末端。在一些實施例中，內化性部分偶聯或接合至AGL多肽之內部胺基酸。

在一些實施例中，若嵌合多肽包含馬啉素多肽，則Fab之重鏈之C-末端融合至馬啉素多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端融合至馬啉素多肽之N-末端。在一些實施例中，Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至馬啉素多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至馬啉素多肽之N-末端。在一些實施例中，連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合多肽係馬啉素多肽與內化性部分之化學偶聯物。在一些實施例中，其中嵌合多肽係包含馬啉素多肽及內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽包含將馬啉素多肽直接或間接偶聯或接合至內化性部分之連接體。在一些實施例中，嵌合多肽不包括將馬啉素多肽互連至內化性部分之連接體。在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些實施例中，內化性部分位於馬啉素多肽之N-末端。在一些實施例中，內化性部分偶聯或接合至馬啉素多肽之內部胺基酸。

在一些實施例中，若嵌合多肽包含α-澱粉酶多肽，則Fab之重鏈之C-末端融合至α-澱粉酶多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端融合至α-澱粉酶多肽之N-末端。在一些實施例中，Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至α-澱粉酶多肽之N-末端。在一些實施例中，抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至α-澱粉酶多肽之N-末端。在一些實施例中，連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合多肽係α-澱粉酶多肽與內化性部分之化學偶聯物。在一些實施例中，嵌合多肽係包含α-澱粉酶多肽及內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽包含將α-澱粉酶多肽直接或間接偶聯或接合至內化性部分之連接體。在一些實施例中，嵌合多肽不包括將α-澱粉酶多肽互連至內化性部分之連接體。在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些實施例中，內化性部分位於α-澱粉酶多肽之N-末端。在一些實施例中，內化性部分偶聯或接合至α-澱粉酶多肽之內部胺基酸。

在一些實施例中，本文所揭示之任一嵌合多肽具有酸性葡萄糖苷酶活性。

在本文所述任一方法之一些實施例中，嵌合多肽係非經腸投與。在一些實施例中，嵌合多肽係靜脈內投與。在一些實施例中，嵌合多肽係肌內投與。在一些實施例中，嵌合多肽係皮下投與。在一些實施例中，嵌合多肽係經由濃注注射或輸注靜脈內投與。在一些實施例中，嵌合多肽係經由肝門靜脈投與。在一些實施例中，其中嵌合多肽係顱內或鞘內投與。

在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，包含投與有效量之嵌合多肽。在一些實施例中，該方法減少或清除肝醣累積，且該肝醣包含葡聚糖。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少90%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。在一些實施例中，至少95%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。在一些實施例中，至少96%或至少97%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分，其中大於85%之存於該組合物中之GAA多肽具有實質上相同的胺基酸序列。在一些實施例中，至少90%之存於該組合物中之GAA多肽具有實質上相同的胺基酸序列。在一些實施例中，大於90%之存於該組合物中之GAA多肽具有相同的與內化性部分之互連。在一些實施例中，至少95%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。在一些實施例中，大於85%之存於該組合物中之GAA多肽具有大致相同的分子量。在一些實施例中，大於90%之存於該組合物中之GAA多肽在GAA多肽部分之N-末端相差小於5、4、3、2或1個殘基。

在一些實施例中，本文所揭示之任一包括包含GAA多肽之嵌合多肽之組合物實質上不含不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。在一些實施例中，組合物包含小於5重量%之不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及 (ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少85%之該組合物中之嵌合多肽包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，至少90%之該組合物中之嵌合多肽包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，至少95%之該組合物中之嵌合多肽包含相差小於5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少85%之存於該組合物中之GAA包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，至少90%之該組合物中之GAA包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，至少95%之該組合物中之GAA包含相差小於5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分，其中該組合物實質上不含不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分，其中至少91%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。在某些實施例中，至少95%之該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。在某些實施例中，至少98%之該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少85%之存於該組合物中之嵌合多肽具有相同胺基酸序列。在一些實施例中，至少90%之該組合物中之嵌合多肽具有相同胺基酸序列。在一些實施例中，至少95%之該組合物中之嵌合多肽具有相同胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少85%之存於該組合物中之GAA具有相同胺基酸序列。在某些實施例中，至少90%之存於該組合物中之GAA具有相同胺基酸序列。在某些實施例中，至少95%之存於該組合物中之GAA具有相同胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)內化性部分，例如促進運輸至細胞中之內化性部分，其中小於10%之存於該組合物中之GAA係成熟GAA多肽。在一些實施例中，小於5%之存於該組合物中之GAA係成熟GAA多肽。在一些實施例中，小於2%之存於該組合物中之GAA係成熟GAA多肽。在一些實施例中，GAA多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合多肽包含免疫球蛋白或表位標識。在一些實施例中，免疫球蛋白或表位標識用於嵌合多肽之純化。

在某些實施例中，本文所述任一組合物包含本文所揭示之任一嵌合多肽。在某些實施例中，嵌合多肽包含本文所揭示之任一GAA多肽。在某些實施例中，嵌合多肽包含本文所揭示之任一內化性部分。

在某些實施例中，本文所揭示之任一組合物實質上不含熱原。在某些實施例中，組合物在一個瓶子中。在某些實施例中，組合物在一個注射器中。在某些實施例中，組合物在投與之前經儲存。在某些實施例中，本文所揭示之任一組合物可用於治療以下疾病中之一或多者：龐貝氏病、福布斯-柯裡氏病、安德森病、馮吉爾克病或拉弗拉病。在某些實施例中，本文所揭示之任一組合物可用於將GAA活性遞送至細胞中之方法。在一些實施例中，GAA活性係遞送至細胞之細胞質中。在一些實施例中，細胞在活體外，且其中活體外細胞來自患有以下疾病之個體：福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。在一些實施例中，細胞在個體中，且其中該個體患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。

在一些實施例中，本發明提供包含以下之嵌合多肽：(i)拉弗拉蛋白多肽及(ii)內化性部分(例如，本文所述之任一內化性部分)。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在一些實施例中，嵌合多肽具有葡聚糖磷酸酶活性。在一些實施例中，嵌合多肽具有蛋白質磷酸酶活性。在一些實施例中，嵌合多肽能結合碳水化合物。在一些實施例中，嵌合多肽能與馬啉素形成複合物。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽化學偶聯至內化性部分。在一些實施例中，嵌合多肽包含含有拉弗拉蛋白多肽及內化性部分之融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽包含融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含連接體。在一些實施例中，嵌合多肽包含連接體。在一些實施例中，連接體將馬啉素多肽偶聯或接合至內化性部分。在一些實施例中，嵌合多肽不包括將拉弗拉蛋白多肽互連至內化性部分之連接體。在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些實施例中，內化性部分直接或間接偶聯或接合至拉弗拉蛋白多肽之N-末端或C-末端胺基酸。在一些實施例中，內化性部分直接或間接偶聯或接合至拉弗拉蛋白多肽之內部胺基酸。

在一些實施例中，本發明提供包含以下之嵌合多肽：(i)馬啉素多肽及(ii)內化性部分(例如，本文所述之任一內化性部分)。在一些實施例中，馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在一些實施例中，馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在一些實施例中，嵌合多肽具有E3泛蛋白連接酶活性。在一些實施例中，嵌合多肽能與拉弗拉蛋白形成複合物。在一些實施例中，馬啉素多肽化學偶聯至內化性部分。在一些實施例中，嵌合多肽包含含有馬啉素多肽及內化性部分之融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽包含融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含連接體。在一些實施例中，嵌合多肽包含連接體。在一些實施例中，連接體將馬啉素多肽偶聯或接合至內化性部分。在一些實施例中，嵌合多肽不包括將馬啉素多肽互連至內化性部分之連接體。在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些實施例中，內化性部分直接或間接偶聯或接合至馬啉素多肽之N-末端或C-末端胺基酸。在一些實施例中，內化性部分直接或間接偶聯或接合至馬啉素多肽之內部胺基酸。

在一些實施例中，本發明提供包含以下之嵌合多肽：(i)α-澱粉酶多肽及(ii)內化性部分(例如，本文所述之任一內化性部分)。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽係胰腺α-澱粉酶。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽係唾液α-澱粉酶。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。在一些實施例中，嵌合多肽具有α-1,4-葡萄糖苷鍵水解活性。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽化學偶聯至內化性部分。在一些實施例中，嵌合多肽包含含有α-澱粉酶多肽及內化性部分之融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽包含融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含連接體。在一些實施例中，嵌合多肽包含連接體。在一些實施例中，連接體將α-澱粉酶多肽偶聯或接合至內化性部分。在一些實施例中，嵌合多肽不包括將α-澱粉酶多肽互連至內化性部分之連接體。在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些實施例中，內化性部分直接或間接偶聯或接合至α-澱粉酶多肽之N-末端或C-末端胺基酸。在一些實施例中，內化性部分直接或間接偶聯或接合至α-澱粉酶多肽之內部胺基酸。

在本文所揭示之任一方法或組合物之某些實施例中，嵌合多肽之內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞中。在某些實施例中，內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞之細胞質中。在某些實施例中，嵌合多肽能被自噬液泡吸收。在某些實施例中，內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肌肉細胞中。在某些實施例中，內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肝細胞中。在某些實施例中，內化性部分促進將該嵌合多肽運輸至神經元中。在某些實施例中，嵌合多肽減少細胞質肝醣累積。在某些實施例中，內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞之細胞質中。在某些實施例中，內化性部分包含可經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)運輸蛋白穿過細胞膜及/或以小於100nM之K_D結合DNA之抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，抗體係單株抗體或其片段。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留細胞穿透活性之變體或其結合與3E10相同之表位之變體，或具有與3E10實質上相同之細胞穿透活性且結合與3E10相同之表位之抗體或前述任一者之抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留3E10之細胞穿透活性之變體或3E10或該3E10變體之抗原結合片段。在某些實施例中，內化性部分包含結合DNA之抗體或抗原結合片段(例如，抗DNA抗體)。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段係嵌合、人類化或完全人類抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：9至少95%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：10至少95%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其具有SEQ ID NO 13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列；該等CDR符合Kabat。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列； VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；及VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16或47之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其具有SEQ ID NO 24之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列；該等CDR符合IMGT系統。在某些實施例中，內化性部分係scFv。在某些實施例中，內化性部分係Fab。在某些實施例中，內化性部分係抗體。在一些實施例中，內化性部分包含歸向肽。在一些實施例中，內化性部分能以小於100nM之K_D結合DNA。在一些實施例中，內化性部分以小於50nM之K_D結合DNA。在某些實施例中，用於本文所揭示之任一方法中之嵌合多肽包含經M6P殘基修飾之N-連接寡糖鏈。在某些實施例中，嵌合多肽進一步包含一或多個多肽部分，其增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與、產生或純化中之一或多者。在一些實施例中，內化性部分經由平衡核苷運輸蛋白1(ENT1)、ENT2、ENT3或ENT4運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分可經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，嵌合多肽包含融合蛋白。在一些實施例中，嵌合多肽係在原核或真核細胞中產生。在一些實施例中，真核細胞選自酵母細胞、禽類細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

在某些實施例中，本發明提供核酸構築體，其包含編碼呈融合蛋白之本文所揭示之任一嵌合多肽之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供包含本文所揭示之任一核酸之載體。在一些實施例中，本發明提供包含本文所揭示之任一載體之宿主細胞。

在一些實施例中，本發明提供將活性遞送至細胞中之方法，其包含使細胞與本文所揭示之任一嵌合多肽接觸。在一些實施例中，細胞在活體外，其來自患有以下疾病之個體：福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。在一些實施例中，細胞在個體中，且其中該個體患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。在一些實施例中，個體患有拉弗拉病。在一些實施例中，本發明提供例如在細胞中或在有需要之個體中減少肝醣累積之方法，其包含投與本文所揭示之任一嵌合多肽。在一些實施例中，有需要之個體患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。在一些實施例中，有需要之個體患有拉弗拉病。

本發明涵蓋，上文所詳述之本發明之態樣及實施例中之任何一或多者可與彼此及/或與下文所揭示之任一特徵組合。此外，下文所述之本發明特徵中之任何一或多者可組合。

圖1係示意性繪示所生成之兩種不同融合構築體之圖。圖1A係示意性繪示全長GAA蛋白及其不同區域以及內化性部分(在此情形中，DNA結合抗體)之鼠類重鏈及輕鏈之圖。胺基酸殘基1-28對應於信號序列(「SigSeq」)區域，胺基酸29-56對應於前原區，且胺基酸57-78對應於完整連接體區域。殘基1-56在SEQ ID NO：1中突出顯示，此乃因根據Moreland等人，此係GAA轉譯產物中藉由信號肽酶及蛋白酶裂解以產生約110千道爾頓之前體GAA多肽之部分。圖1B係示意性繪示鼠類3E10 Fab-人類GAA融合構築體之圖，而圖1C係示意性繪示鼠類3E10 mAb-人類GAA融合構築體之圖。該等係根據本發明包含GAA多肽及內化性部分之嵌合多肽之實例。該等包括其中內化性部分係全長抗體之實例及其中內化性部分係Fab之實例。

圖2繪示純化人類化Fab-GAA之代表性SEC-HPLC圖表。

圖3顯示自Fab-GAA蛋白之SDS-PAGE分析獲得之代表性凝膠，如使用抗GAA單株抗體(Sigma,SAB2100872)所檢測。在來自龐貝氏病纖維母細胞培養物之培養基或細胞溶解物中檢測Fab-GAA，該培養物經(T1及T2)或未經(C1及C2)人類化3E10 Fab-GAA處理。評價β-肌動蛋白含量作為細胞溶解物樣品之載荷對照。

圖4顯示自GAA蛋白之SDS-PAGE分析獲得之代表性凝膠，如使用抗GAA單株抗體(Sigma,SAB2100872)所檢測。在L6大鼠骨骼肌細胞中檢測GAA，該等細胞在甘露糖-6-磷酸(M6P)存在或不存在下經或未經(對照)人類化或鼠類3E10 Fab-GAA(分別為hFab-GAA及mFab-GAA)處理。亦分別使用抗ENT2抗體(Santa Cruz,sc-134569)及抗M6PR抗體(Abcam,ab124767)量測ENT2及M6P-受體(M6PR)含量。評價β-肌動蛋白含量作為載荷對照。

肝醣係複合多糖，其向人體細胞提供葡萄糖之備便儲備。肝醣主要發現於肝中，其中其被水解並釋放至血流中以向其他細胞提供葡萄糖；及肌肉中，其中得自肝醣水解之葡萄糖向肌肉細胞提供能量。酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-澱粉酶及澱粉葡萄糖苷酶(AGL)係一些介導肝醣水解之酶。亦相信拉弗拉蛋白及馬啉素在肝醣清除中發揮作用。

通常因與該過程相關之基因中之遺傳突變所致之肝醣水解之破壞可導致肝醣儲積症。在多種情形中，疾病症狀之嚴重性與突變程度直接相關。

業內未闡述將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL投與福布斯-柯裡氏病、安德森病、馮吉爾克病及/或拉弗拉病細胞，使得GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL將以此一方式內化以清除肝醣之細胞質累積之任何可靠手段。因此，在一個實施例中，本發明提供包含以下之嵌合多肽：a)包含SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之GAA多肽或其包含成熟GAA之片段，及b)將GAA多肽遞送至細胞之細胞質之內化性部分。本發明亦提供包含以下之嵌合多肽：a)包含SEQ ID NO：38或39之胺基酸序列之拉弗拉蛋白多肽或其生物活性片段，及b)將拉弗拉蛋白多肽遞送至細胞中，例如遞送至細胞之細胞質中之內化性部分。本發明亦提供包含以下之嵌合多肽：a)包含SEQ ID NO：40-42中任一者之胺基酸序列之AGL多肽或其生物活性片段，及b)將AGL多肽遞送至細胞中，例如遞送至細胞之細胞質中之內化性部分。本發明亦提供包含以下之嵌合多肽：3)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之馬啉素多肽或其生物活性片段，及b)將馬啉素多肽遞送至細胞中，例如遞送至細胞之細胞質中之內化性部分。本發明亦提供包含以下之嵌合多肽：a)包含SEQ ID NO：44或45 之胺基酸序列之α-澱粉酶多肽或其生物活性片段，及b)將α-澱粉酶多肽遞送至細胞中，例如遞送至細胞之細胞質中之內化性部分。

與福布斯-柯裡氏病類似，安德森病及拉弗拉病亦與肝醣之細胞質累積相關(Magoulas PL及El-Hattab AW,2013,Gene Reviews；Gentry等人，2013,FEBS J.,280(2)：525-37)。因此，本文所揭示之嵌合多肽將在清除安德森病或拉弗拉病細胞中之細胞質肝醣累積中具有類似用途。此外，如本文所提供之嵌合多肽可用於清除馮吉爾克病細胞及/或龐貝氏病細胞中之細胞質肝醣累積。

該等細胞包括培養物中之細胞，例如來自患有該等疾病中之一者之患者或來自該等疾病中之一者之動物模型之細胞，以及患有該等肝醣儲積或代謝病症中之一者之患者中之細胞。

本發明提供嵌合多肽及使用該等嵌合多肽之組合物及各種方法。本發明嵌合多肽包括促進遞送至細胞中之內化性部分及非內化性部分多肽部分。內化性部分與非內化性部分多肽部分相結合，例如偶聯或以其他方式接合。在某些實施例中，嵌合多肽之非內化性部分多肽部分係GAA多肽，且用於本發明方法及組合物中之GAA多肽之多個實例詳細地提供並闡述於本文中。在某些實施例中，嵌合多肽之非內化性部分多肽部分係AGL多肽，且用於本發明方法及組合物中之AGL多肽之多個實例詳細地提供並闡述於本文中。在某些實施例中，嵌合多肽之非內化性部分多肽部分係拉弗拉蛋白多肽，且用於本發明方法及組合物中之拉弗拉蛋白多肽之多個實例詳細地提供並闡述於本文中。在某些實施例中，嵌合多肽之非內化性部分多肽部分係馬啉素多肽，且用於本發明方法及組合物中之馬啉素多肽之多個實例詳細地提供並闡述於本文中。在某些實施例中，嵌合多肽之非內化性部分多肽部分係α-澱粉酶多肽，且用於本發明方法及組合物中之α-澱粉酶多肽之多個實例詳細地提供並闡述於本文中。

I. GAA多肽

在某些實施例中，用於本文所揭示之方法中之嵌合多肽包含GAA多肽，例如包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽。已證實，無論在低pH(即，溶酶體或自噬液泡之pH)或中性pH(即，細胞質之pH)條件下，成熟GAA多肽具有與全長前體GAA相比增強之肝醣清除(Bijvoet等人，1998,Hum Mol Genet,7(11)：1815-24)。另外，儘管成熟GAA係在較低pH下具有最佳活性之溶酶體蛋白質，但成熟GAA在中性pH(即，細胞質之pH)下保留約40%活性(Martin-Touaux等人，2002,Hum Mol Genet,11(14)：1637-45)。因此，包含成熟GAA之GAA多肽適於細胞質遞送，且因此適於解決尚未解決之福布斯-柯裡氏病、馮吉爾克病、拉弗拉病及/或安德森病之問題：細胞質肝醣累積。然而，不管嵌合多肽之GAA部分是否包含成熟GAA或由其組成，提供本發明之與內化性部分結合之GAA多肽促進遞送至細胞中，且在某些實施例中，遞送至細胞質中。在某些實施例中，嵌合多肽能在甘露糖-6-磷酸受體(MPR)抑制劑之存在下進入細胞之細胞質中。不受限於理論，將本文所揭示之任一嵌合多肽(例如包含成熟GAA之GAA多肽及內化性部分)投與患者將確保，成熟GAA到達諸如肌肉及肝等組織且GAA活性不受限於溶酶體。

不受限於理論，所投與之GAA多肽(例如，包含GAA之本發明嵌合多肽)將至少在細胞質中作用以減少因以下所致之有害肝醣累積：福布斯-柯裡氏病患者中之AGL突變；龐貝氏病中之GAA突變；馮吉爾克病患者中之G6PC或SLC37A4突變；拉弗拉病中之EPM2A及/或EPM2B突變；及/或安德森病患者中之GBE突變。在一些實施例中，所投與之GAA多肽將至少在溶酶體或液泡(例如，自噬液泡)中作用以減少因以下所致之有害肝醣累積：福布斯-柯裡氏病患者中之AGL突變；馮吉爾克病患者中之G6PC或SLC37A4突變；拉弗拉病中之 EPM2A及/或EPM2B突變；及/或安德森病患者中之GBE突變。藉由在細胞中、尤其在肌肉細胞(例如，骨骼肌及/或心肌肌肉)、神經元或神經膠質(在一些適應症中)及/或肝細胞中減少有害肝醣累積，將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL活性遞送至有需要之患者之細胞之細胞質中可用於緩和一些或所有與患者細胞中之肝醣累積(包括異常肝醣累積(例如，葡聚糖)之累積)相關之症狀。在一些實施例中，將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL活性遞送至有需要之患者之溶酶體或液泡(例如，自噬液泡)中可用於緩和一些或所有與患者細胞中之肝醣累積(包括異常肝醣累積(例如，葡聚糖)之累積)相關之症狀。在某些實施例中，本發明嵌合多肽將GAA活性遞送至細胞質及溶酶體及/或液泡(例如，自噬液泡)中之一者或二者中。因此，使用本發明嵌合多肽遞送GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL活性適於治療福布斯-柯裡氏病、龐貝氏病、安德森病、馮吉爾克病及/或拉弗拉病。在某些實施例中，本發明嵌合多肽適於治療有需要之患者之龐貝氏病、福布斯-柯裡氏病、安德森病、拉弗拉病及/或馮吉爾克病。

在某些實施例中，包含GAA多肽及內化性部分之嵌合多肽可在阻斷甘露糖-6-磷酸受體(MPR)之試劑存在下進入細胞中，例如進入細胞質中。

在某些實施例中，本發明提供如本文所述之包含GAA多肽及內化性部分之嵌合多肽。本發明之任一該嵌合多肽可包含與本文所述之任一內化性部分結合之本文所述之任一GAA多肽，且該等嵌合多肽可用於本發明任一方法中。

在某些態樣中，本發明提供使用GAA蛋白(例如，包含成熟GAA蛋白之GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽治療與異常量及/或類型之肝醣之異常累積(例如在福布斯-柯裡氏病、龐貝氏病、馮吉爾克病、拉弗拉病及/或安德森病中所發生者)相關之病況。術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，其皆指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基係相應天然胺基酸之人造化學模擬物之胺基酸聚合物，且適用於天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。

因此，在某些態樣中，本發明提供嵌合多肽，其包含酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽，其可用於治療與福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病相關之症狀。在某些實施例中，本發明嵌合多肽具有GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL生物學活性。舉例而言，本發明嵌合多肽包含具有酶活性之GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶及/或AGL多肽。

在某些實施例中，本發明提供包含以下之嵌合多肽：(i)GAA多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽；及(ii)內化性部分，其促進遞送至細胞中，例如遞送至細胞之細胞質中(例如，遞送至肌肉細胞、神經元細胞及/或肝細胞之細胞質中)。在某些實施例中，本發明提供包含以下之嵌合多肽：(i)GAA多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽；及(ii)內化性部分，其促進遞送至細胞中，例如遞送至細胞之溶酶體或液泡(自噬液泡)中(例如，遞送至肌肉細胞及/或肝細胞之溶酶體或液泡)。除非另外明確指示，否則遞送至細胞質中意指遞送至至少細胞質中，且GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL活性亦可遞送至其他細胞區室(例如溶酶體或液泡)中。在具體實施例中，內化性部分幫助將嵌合多肽遞送至肌肉細胞(例如骨骼肌細胞及/或心肌細胞)中。在另一具體實施例中，內化性部分幫助將嵌合多肽遞送至神經元或肝細胞中。

在某些實施例中，本發明提供嵌合多肽，其用於將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL活性遞送至細胞中，例如遞送至細胞之細胞質中。

內源人類GAA係由長約28kb之基因編碼之952個胺基酸之蛋白質。在人類中，已知3個轉錄物變體(NM_000152.3，其編碼NP000143.2；NM_001079803.1，其編碼NP_001073271.1；及NM_001079804.1，其編碼NP_001073272.1)。然而，所有三個轉錄物變體皆編碼具有實質上相同的胺基酸序列之蛋白質。內源GAA基因編碼包括信號序列之952或957個胺基酸之多肽。此多肽在內質網及高爾基體中經糖基化，產生表觀分子質量為110kDa之糖基化前體。在不成熟前體上有7個潛在糖基化位點，位於SEQ ID NO：1或2之殘基140、233、390、470、652、882及925處。不成熟前體經由甘露糖-6-磷酸受體(MPR)及非甘露糖-6-磷酸(M6P)依賴性路徑靶向溶酶體。110kDa前體蛋白裂解產生GAA之分子量為約95kDa之胞內體中間形式。溶酶體中之後續N-末端及C-末端蛋白分解裂解生成GAA之分子量為約76kDa及約70kDa之成熟活性形式(Moreland等人，Lysosomal Acid α-Glucosidase Consists of Four Different Peptides Processed from a Single Chain Precursor,Journal of Biological Chemistry,280(8)：6780-6791,2005；其係全文以引用方式併入)。由於裂解位點之異質性，替代性起始殘基及/或終止殘基可定義成熟GAA多肽(例如用於本文所揭示之任一方法中之成熟GAA多肽)之N及C末端邊界。舉例而言，約76kDa之成熟GAA多肽之N-末端殘基可在某些實施例中對應於SEQ ID NO：1或2之殘基122(Met)或123(Gly)，而約70kDa之成熟GAA多肽之N-末端殘基可在某些實施例中對應於SEQ ID NO：1或2之殘基204(Ala)、206(Ser)或288(Gly)中之任一者。具有任一前述N-末端殘基之多肽可具有(例如)對應於SEQ ID NO：1或2之殘基816至881中之任一者且可為SEQ ID NO：1或2之殘基782之C-末端殘基。另外，C-末端殘基可為殘基782至816(包括殘基782及816)或殘基782至881(包括殘基782及881)中之任一者。成熟GAA多肽之分子量可為約76kDa或約70kDa，或可根據前述替代性起始及/或終止N及C末端殘基(例如，對應於因替代性裂解而生成之部分)而變。

FDA批准一種GAA形式，其稱為阿葡萄糖苷酶α(Myozyme^®,Genzyme Corporation)，係在CHO細胞中產生之GAA之110kDa前體形式之重組人類GAA(rhGAA)類似物。人們相信Myozyme^®可靶向胞吞/溶酶體路徑，且認為其可在溶酶體中發揮其效應。Myozyme^®似乎不治療細胞質中之肝醣累積(Schoser等人，Therapeutic approaches in Glycogen Storage Disease type II(GSDII)/Pompe Disease,Neurotherapeutics,5(4)：569-578,2008)。如上所述，人們相信此療法靶向溶酶體且係基於遞送蛋白質之不成熟前體形式。然而，蛋白質之前體形式之活性不如GAA之76kDa成熟形式(Human Molecular Genetics,7(11)：1815-1824,1998)。因此，在某些態樣中，以下可係有益的：(i)遞送呈嵌合多肽之GAA之成熟形式，(ii)遞送呈嵌合多肽之GAA多肽，該GAA多肽儘管較成熟形式更長但較110kDa前體形式更短，及/或(iii)遞送呈嵌合多肽之任一大小之具有活性之GAA多肽，其連接至內化性部分以促進將多肽遞送至細胞中，且甚至遞送至適當亞細胞區室中。不受限於理論，即使本發明多肽具有與前體GAA 多肽實質上相同的活性，遞送至適宜細胞位置(視情況藉由促進遞送至細胞質之內化性部分來促進)將增加遞送至細胞之有效GAA活性。在某些實施例中，本發明提供嵌合多肽，其包含含有全長GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之GAA多肽)之GAA多肽。在某些實施例中，本發明提供嵌合多肽，其包含約110kDa之GAA多肽。在某些實施例中，本發明提供嵌合多肽，其包含含有成熟GAA之GAA多肽(包含成熟GAA之GAA部分)及促進遞送至細胞中之內化性部分。換言之，本發明涵蓋嵌合多肽，其包含GAA多肽及內化性部分。適用於本發明嵌合多肽中之GAA多肽之多個實例提供於本文中。具有酶活性之任一該嵌合多肽適用於本文所述任一方法中。

在某些實施例中，本發明提供如本文所述之包含GAA多肽及內化性部分之嵌合多肽。本發明之任一該嵌合多肽可包含與本文所述之任一內化性部分結合之本文所述之任一GAA多肽或由其組成，且該等嵌合多肽可用於本發明任一方法中。

在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含成熟GAA多肽且亦可含有一些來自GAA多肽之其他鄰接胺基酸序列(包括GAA前體多肽之110kD前體多肽或信號序列)。在其他實施例中，本發明嵌合多肽包含成熟GAA多肽但不包括來自並非成熟GAA多肽之GAA多肽之其他鄰接胺基酸序列。因此，本發明涵蓋其中GAA部分包含成熟GAA多肽或由其組成之嵌合多肽。分子量為70-76kD之實例性成熟GAA多肽闡述於本文中。在某些實施例中，嵌合多肽不包括前體GAA多肽之信號序列。在某些實施例中，嵌合多肽不包括對應於SEQ ID NO：1或2之殘基1-56之部分及/或對應於SEQ ID NO：1或2之殘基1-57之部分(例如，GAA多肽不包括對應於SEQ ID NO：1或2之殘基1-56及/或殘基1-57之部分)。在其他實施例中，嵌合多肽包含完整不成熟GAA多肽(例如，SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列)。注意到，包含成熟GAA之GAA多肽亦稱為包含成熟GAA多肽之GAA多肽。此一GAA多肽及本文提供之任一GAA多肽可為單一多肽鏈。

在某些實施例中，GAA多肽部分包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列(例如，GAA多肽包含SEQ ID NO：21)，且因此，嵌合多肽包含具有SEQ ID NO：3或4之胺基酸序列之成熟GAA。在某些實施例中，嵌合多肽不包括來自人類GAA之其他鄰接胺基酸序列-除了SEQ ID NO：21以外。在某些實施例中，GAA多肽或嵌合多肽不包括SEQ ID NO：1之殘基1-56。在某些實施例中，GAA多肽或嵌合多肽不包括SEQ ID NO：1之殘基1-60。在某些實施例中，GAA多肽部分包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列(例如，GAA多肽包含SEQ ID NO：22)，且因此，嵌合多肽包含具有SEQ ID NO：3或4之胺基酸序列之成熟GAA。在某些實施例中，嵌合多肽不包括來自人類GAA之其他鄰接胺基酸序列-除了SEQ ID NO：22以外。在某些實施例中，GAA多肽或嵌合多肽不包括SEQ ID NO：1之殘基1-66。在某些實施例中，GAA多肽部分包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列(例如，GAA多肽包含SEQ ID NO：23)，且因此，嵌合多肽包含具有SEQ ID NO：3或4之胺基酸序列之成熟GAA。在某些實施例中，嵌合多肽不包括來自人類GAA之其他鄰接胺基酸序列-除了SEQ ID NO：23以外。在某些實施例中，GAA多肽或嵌合多肽不包括SEQ ID NO：1之殘基1-69。

如本文所用GAA多肽包括蛋白質之變體，及在一些實施例中，成熟活性形式(約76kDa或約70kDa活性形式或具有替代性起始及/或終止殘基之類似形式，統稱為「成熟GAA」)。術語「成熟GAA」係指具有對應於不成熟GAA蛋白之該部分之胺基酸序列之多肽，其在內源性處理時依據SDS-PAGE具有約70kDa至約76kDa之表觀分子量，以及具有替代性起始及/或終止殘基之類似多肽，如上文所述。在一些實施例中，GAA多肽缺少信號序列(SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-27 或由SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-56指定之序列)。實例性成熟GAA多肽包括具有以下序列之多肽：SEQ ID NO：1或2之殘基122-782；SEQ ID NO：1或2之殘基123-782；或SEQ ID NO：1或2之殘基204-782。

術語「GAA」包括以與內源成熟蛋白質相同或實質上相同之方式經糖基化之多肽(例如，成熟GAA多肽)，且因此具有與預測的分子量相同或類似之分子量。該術語亦包括多肽未經糖基化或經高糖基化，使得儘管其包括相同的一級胺基酸序列，但表觀分子量各不相同。GAA多肽之任一該等變體或同種型、功能性片段或變體、融合蛋白及經修飾形式具有與天然GAA蛋白具有實質性序列一致性之胺基酸序列之至少一部分，且保留酶活性。在某些實施例中，成熟GAA多肽之功能性片段、變體或融合蛋白包含之胺基酸序列與SEQ ID NO：3及4中之一者或二者中所述之成熟GAA多肽至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致，或與對應於以下中之一或多者之成熟GAA多肽至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致：SEQ ID NO：1或2之殘基122-782；SEQ ID NO：1或2之殘基123-782；或SEQ ID NO：1或2之殘基204-782。在一些實施例中，GAA多肽係來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、犬、斑馬魚、豬、山羊、牛、馬、猴或猿)之GAA多肽。在一些實施例中，GAA蛋白包含具有SEQ ID NO：32之胺基酸序列之牛GAA蛋白或其片段(例如，成熟形式)。

在某些實施例中，本文所揭示之任一嵌合多肽之GAA多肽部分(例如，GAA多肽)包含與SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所揭示之任一嵌合多肽之GAA多肽部分包含與對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之殘基57-782之序列至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所揭示之任一嵌合多肽之GAA多肽部分包含與對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之殘基67-782之序列至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所揭示之任一嵌合多肽之GAA多肽部分(例如，GAA多肽)包含與對應於SEQ ID NO：1或2之殘基57-952之序列之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所揭示之任一嵌合多肽之GAA多肽部分包含與對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之殘基67-952之序列至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，GAA多肽包含與SEQ ID NO：21、22及/或23中所述之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

在某些實施例中，用於嵌合多肽中之GAA多肽相對於SEQ ID NO：1或2中所述之人類GAA之對應部分包含1、2、3、4或5個胺基酸取代。在某些實施例中，用於嵌合多肽中之GAA多肽相對於SEQ ID NO：21、22及/或23中所述之人類GAA多肽包含1、2、3、4或5個胺基酸取代(例如，GAA多肽包含SEQ ID NO：21、22及/或23或由其組成，但相對於SEQ ID NO：21、22及/或23具有1、2、3、4或5個胺基酸取代)。在某些實施例中，用於嵌合多肽中之GAA多肽包含SEQ ID NO：21、22及/或23或由其組成，但在其N-或C-末端相差1、2、3、4或5個胺基酸殘基，例如在N及/或C-末端缺失1、2、3、4或5個胺基酸殘基。

明確涵蓋具有本文所述之結構及功能特徵之任一組合之GAA多肽。

在此處及說明書中之其他地方，序列一致性係指在比對序列並引入空位(若需要)以達成完整序列之最大一致性百分比後，候選序列中與其所比較之對應序列之殘基一致之殘基百分比，且不將任何保守取代視作序列一致性之一部分。在某些實施例中，N-或C-末端延伸或插入皆不應理解為減小一致性或同源性。

用於比對序列之方法及電腦程式以及一致性百分比之計算為業內所熟知且易於獲得。序列一致性可使用序列分析軟體來量測。舉例而言，將可經由ExPasy生物資訊學資源入口獲得之比對及分析工具(例如ClustalW算法)設定為默認參數。基於成對或全面比對之適宜序列比對及比較可易於選擇。適於測定序列一致性及序列相似性百分比之算法之一個實例係BLAST算法，其闡述於Altschul等人，J Mol Biol 215：403-410(1990)中。用於實施BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。在某些實施例中，使用具體程式之當前默認設置來比對序列並計算一致性百分比。

在某些特定實施例中，嵌合多肽包含GAA多肽，例如包含成熟GAA之GAA多肽。GAA之活性類似於或實質上等效於人類GAA之內源形式(例如，GAA之110kDa前體形式)之活性。在某些實施例中，成熟GAA之活性類似於或實質上等效於人類GAA之約76kDa或約70kDa內源形式之活性。舉例而言，成熟GAA之肝醣水解活性可為110kDa前體形式之7-10倍，且該比較係在相同或類似條件下進行(例如本文所揭示之成熟GAA-嵌合多肽與內源人類不成熟前體GAA在酸性或中性pH條件下相比)。成熟GAA多肽可為GAA之76kDa或70kDa形式，或使用替代性起始及/或終止殘基之類似形式。如Moreland等人(Lysosomal Acid α-Glucosidase Consists of Four Different Peptides Processed from a Single Chain Precursor,Journal of Biological Chemistry,280(8)：6780-6791,2005)中所述，用於GAA之經處理形式之術語係基於如藉由SDS-PAGE測定之表觀分子質量。在一些實施例中，成熟GAA可缺少通常在內質網中糖基化之N-末端位點。實例性成熟GAA多肽包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。其他實例性成熟GAA多肽可包含大致對應於以下序列之胺基酸序列或由其組成：SEQ ID NO：1或2之殘基122-782；SEQ ID NO：1或2之殘基123-782，例如SEQ ID NO：3中所示；SEQ ID NO：1或2之殘基204-782；SEQ ID NO：1或2之殘基206-782；SEQ ID NO：1或2之殘基288-782，如SEQ ID NO：4中所示。成熟GAA多肽亦可具有上述N-末端及/或C-末端殘基。

在某些實施例中，嵌合多肽包含全長GAA多肽，例如嵌合多肽包含SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列。在某些實施例中，嵌合多肽不包含全長GAA多肽，但包含成熟GAA多肽及全長GAA多肽之至少一部分。換言之，在某些實施例中，嵌合多肽包含GAA多肽及內化性部分。在一些實施例中，嵌合多肽不包含含有SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之全長GAA多肽，但包含含有SEQ ID NO：3或4之胺基酸序列之成熟GAA多肽序列及對應於SEQ ID NO：1-2之胺基酸1-121之胺基酸之至少一部分(例如，鄰接胺基酸之一部分)及/或對應於SEQ ID NO：1之胺基酸783-952之胺基酸之至少一部分(例如，鄰接胺基酸之一部分)。在一些實施例中，嵌合多肽不包含含有SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之全長GAA多肽，但包含含有SEQ ID NO：3或4之胺基酸序列之成熟GAA多肽序列及對應於SEQ ID NO：1之胺基酸783-952之胺基酸之至少一部分(例如，鄰接胺基酸之一部分)。在一些實施例中，嵌合多肽不包含含有SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之全長GAA多肽，但包含含有SEQ ID NO：3或4之胺基酸序列之成熟GAA多肽序列及對應於SEQ ID NO：2之胺基酸783-957之胺基酸之至少一部分(例如，鄰接胺基酸之一部分)。該等係GAA多肽之實例。

在某些實施例中，本文所述嵌合蛋白質之GAA多肽部分(例如，包含含有成熟GAA之GAA多肽之部分；例如，GAA多肽)包含GAA之成熟形式，但不包含SEQ ID NO：1中所述之GAA轉譯產物。在一些實施例中，GAA多肽及嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-27或1-56之鄰接胺基酸序列。在一些實施例中，GAA多肽缺少GAA完整連接體區域之至少一部分，其中完整連接體區域對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸57-78(即，SEQ ID NO：31)。在一些實施例中，GAA多肽不包含對應於以下中之任何一或多者之鄰接胺基酸序列：SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-27、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-61、1-62、1-63、1-64、1-65、1-66、1-67、1-68、1-69、1-70、1-71、1-72、1-73、1-74、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-105、1-110、1-115、1-120或1-121。在其他實施例中，GAA多肽確實包含上述中之任何一或多者。

在具體實施例中，GAA多肽不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-60之鄰接胺基酸序列(例如，嵌合多肽包含GAA多肽部分，該GAA多肽部分包含含有SEQ ID NO：21之胺基酸序列之GAA多肽)。在其他實施例中，GAA部分不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-66之鄰接胺基酸序列(例如，嵌合多肽包含含有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽)。在一些實施例中，GAA部分不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-69之鄰接胺基酸序列(例如，嵌合多肽包含GAA多肽部分，該GAA多肽部分包含含有SEQ ID NO：23之胺基酸序列之GAA多肽)。

在一些實施例中，GAA多肽可經糖基化，或可未經糖基化。對於彼等經糖基化之GAA多肽，糖基化模式可與天然人類GAA相同或可不同。在一些實施例中，前體GAA蛋白上之一或多個糖基化位點可在最終成熟GAA構築體中移除。

GAA已自諸如以下等組織中分離：牛睾丸、大鼠肝、豬肝、人類肝、兔肌肉、人類心臟、人類尿液及人類胎盤。GAA(例如， GAA)亦可使用重組技術來產生，例如用表現全長人類GAA之載體或表現成熟GAA之載體轉染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。然後使用一系列超濾、滲濾、洗滌及溶析步驟自CHO-條件化培養基純化重組人類GAA(rhGAA)或成熟GAA，如Moreland等人所述(Lysosomal Acid α-Glucosidase Consists of Four Different Peptides Processed from a Single Chain Precursor,Journal of Biological Chemistry,280(8)：6780-6791,2005)。GAA片段可根據業內已知之方法來分離，例如親和層析及SDS page。

在某些實施例中，GAA(例如，成熟GAA)或片段或變體係人類GAA。

在某些實施例中，GAA多肽之片段或變體可藉由篩選自編碼GAA多肽之核酸之相應片段重組產生之多肽來獲得。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮天然GAA蛋白之功能之片段或變體，例如，藉由測試其水解肝醣及/或治療福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克氏病及/或拉弗拉病之症狀之能力來測試。

在某些實施例中，本發明涵蓋出於諸如增強治療性或預防性效能或穩定性(例如，離體儲放壽命及對活體內蛋白分解降解之抗性)之目的，修飾GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)之結構。將該等經修飾GAA多肽視為天然GAA多肽之功能等效物。經修飾多肽可藉由(例如)胺基酸取代、缺失或添加來產生。例如，可合理地預期，例如，用異白胺酸或纈胺酸隔離置換白胺酸，用麩胺酸鹽隔離置換天冬胺酸鹽，用絲胺酸隔離置換蘇胺酸，或用結構相關胺基酸類似地置換胺基酸(例如，保守突變)將不會對所得分子之GAA生物學活性造成重大影響。保守置換係彼等在其側鏈相關之胺基酸家族內進行者。

本發明進一步涵蓋生成GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)之組合突變體以及截短突變體之集合，且尤其可用於鑑別功能變體序列。可生成組合衍生之變體，其相對於天然GAA多肽具有選擇性功效。同樣，誘變可產生細胞內半衰期與相應野生型GAA多肽顯著不同之變體。舉例而言，可使經改變蛋白質對蛋白分解降解或導致GAA功能破壞或以其他方式不活化之其他細胞過程更穩定或更不穩定。該等變體可用於藉由調節GAA多肽之半衰期來改變其含量。可藉由多種方式(例如)自簡併寡核苷酸序列生成潛在GAA變體序列之庫。簡併基因序列之化學合成可在自動DNA合成器中實施，然後將合成基因連接為適當基因以供表現。基因之簡併集合之目的係在一個混合物中提供編碼潛在多肽序列之期望集合之所有序列。簡併寡核苷酸之合成為業內所熟知(例如，參見Narang,SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人，(1981)Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，AG Walton編輯，Amsterdam：Elsevier，第273-289頁；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人，(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。該等技術已用於其他蛋白質之定向進化(例如，參見Scott等人，(1990)Science 249：386-390；Roberts等人，(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等人，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS USA 87：6378-6382；以及以下美國專利：第5,223,409號、第5,198,346號及第5,096,815號)。

或者，可利用其他形式之誘變來生成組合庫。舉例而言，GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)變體可藉由以下方式自庫生成並分離：使用(例如)丙胺酸掃描誘變等篩選(Ruf等人，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等人，(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等人，(1993)基因137：109-118；Grodberg等人，(1993)Eur.J. Biochem.218：597-601；Nagashima等人，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等人，(1991)Biochemistry 30：10832-10838；及Cunningham等人，(1989)Science 244：1081-1085)；連接體掃描誘變(Gustin等人，(1993)Virology 193：653-660；Brown等人，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等人，(1982)Science 232：316)；飽和誘變(Meyers等人，(1986)Science 232：613)；PCR誘變(Leung等人，(1989)Method Cell Mol Biol 1：11-19)；或隨機誘變，包括化學誘變等(Miller等人，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY；及Greener等人，(1994)Strategies in Mol Biol 7：32-34)。尤其在組合環境中之連接體掃描誘變係用於鑑別GAA之截短(生物活性)形式之有吸引力之方法。

眾多種用於篩選藉由點突變及截短製備之組合庫之基因產物及就此而言用於篩選cDNA庫中具有某一性質之基因產物之技術為業內已知。該等技術通常將可調整以供快速篩選藉由GAA多肽之組合誘變生成之基因庫。用於篩選大型基因庫之最廣泛使用的技術通常包含將基因庫選殖至可複製表現載體中，用所得載體庫轉變適當細胞，及在其中檢測期望活性促進相對容易地分離編碼其產物經檢測之基因之載體之條件下表現組合基因。下文所述之每一說明性分析適用於如篩選大量藉由組合誘變技術產生之簡併序列所需之高通量分析。

在某些實施例中，GAA多肽可包括肽及肽模擬物。如本文所用術語「肽模擬物」包括經化學修飾之肽及含有非天然胺基酸、類肽及諸如此類之肽樣分子。肽模擬物提供多種優於肽之優點，包括投與個體時增強之穩定性。用於鑑別肽模擬物之方法為業內所熟知且包括篩選含有潛在肽模擬物庫之資料庫。舉例而言，劍橋結構資料庫(Cambridge Structural Database)含有大於300,000種具有已知晶體結構之化合物之保藏(Allen等人，Acta Crystallogr.章節B,35：2331 (1979))。其中不可獲得靶分子之晶體結構，結構可使用例如程式CONCORD來生成(Rusinko等人，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29：251(1989))。另一資料庫可用化學物質目錄(Available Chemicals Directory)(Molecular Design Limited,Informations Systems；San Leandro Calif.)含有約100,000種市售化合物且亦可搜索以鑑別成熟GAA多肽之潛在肽模擬物。

在某些實施例中，GAA多肽可進一步包含轉譯後修飾。實例性轉譯後蛋白質修飾包括磷酸化、乙醯化、甲基化、ADP-核糖基化、泛蛋白化、糖基化、羰基化、sumo蛋白修飾(sumoylation)、生物素化或添加多肽側鏈或疏水基團。因此，經修飾GAA多肽可含有非胺基酸要素，例如脂質、多糖或單糖以及磷酸酯。可針對GAA多肽之生物學活性(例如其治療福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病之能力及/或其在福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或馮吉爾克病及/或龐貝氏病及/或拉弗拉病細胞之細胞質及/或溶酶體中減少肝醣累積之能力)測試該等非胺基酸要素對其功能性之效應。亦可在無細胞或基於細胞之酶分析中評估GAA之生物學活性。在某些實施例中，GAA多肽可進一步包含一或多個增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與及/或純化中之一或多者之多肽部分。在其他實施例中，內化性部分包含抗體或其抗原結合片段。

在本發明之一個特定實施例中，GAA多肽可經非蛋白質性聚合物修飾。在一個特定實施例中，該聚合物係聚乙二醇(「PEG」)、聚丙二醇或聚氧化烯，如美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所述。PEG係熟知的水溶性聚合物，其可自市場購得或可根據業內熟知之方法藉由乙二醇之開環聚合來製備(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。

術語「生物學活性」、「生物活性」或「功能性」意指GAA蛋白實施與野生型GAA蛋白相關之功能的能力，例如，水解肝醣、例如溶酶體肝醣或細胞質肝醣之α-1,4-及α-1,6-糖苷鍵聯。術語「生物學活性」、「生物活性」及「功能性」在本文中可互換使用。在某些實施例中，且如本文所述，具有生物學活性之GAA蛋白或嵌合多肽具有水解肝醣之能力。在其他實施例中，具有生物學活性之GAA蛋白或嵌合多肽具有降低溶酶體、液泡(例如自噬液泡)及/或細胞質肝醣之濃度之能力。在其他實施例中，GAA蛋白或嵌合多肽具有治療與龐貝氏病及/或福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病相關之症狀之能力。如本文所用「片段」應理解為包括展現如本文所述之「生物活性」之生物活性片段(亦稱為功能性片段)或生物活性變體。亦即，GAA之生物活性片段或變體展現可量測並測試之生物活性。舉例而言，生物活性片段/功能性片段或變體展現與天然(即，野生型或正常)GAA蛋白相同或實質上相同的生物活性，且該生物活性可藉由該片段或變體之諸如以下等能力來評價：在活體外或活體內水解肝醣。如本文所用「實質上相同」係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少70%。在某些實施例中，「實質上相同」亦係指當在相同或實質上相同的條件下評價時，任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%、100%、102%、105%或110%。在某些實施例中，當在相同或實質上相同的條件下評價時，GAA多肽之片段或變體將較佳保留與天然GAA多肽相關之GAA生物學活性的至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。在某些實施例中，GAA多肽之片段或變體之半衰期(t_1/2)相對於天然蛋白質之半衰期有所延長。較佳地，當在相同或實質上相同的條件下評價時，GAA片段或變體之半衰期相對於天然GAA蛋白之半衰期延長至少10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%或甚至1000%。在一些實施例中，蛋白質半衰期係在活體外測定，例如在緩衝鹽水溶液中或在血清中測定。在其他實施例中，蛋白質半衰期係活體內半衰期，例如蛋白質在動物血清或其他體液中之半衰期。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮與天然GAA蛋白等效或實質上類似之功能之片段或變體。

關於提高細胞中GAA生物活性之方法，本發明涵蓋前述態樣及實施例中任一者之所有組合，以及與詳細說明及實例中所述實施例中任一者之組合。基於投與嵌合多肽或使細胞與嵌合多肽接觸之所述方法可在活體外(例如，在細胞或培養物中)或活體內(例如，在患者或動物模型中)實施。在某些實施例中，該方法係活體外方法。在某些實施例中，該方法係活體內方法。在某些實施例中，投與本發明嵌合多肽在活體外及/或活體內提高細胞中之GAA生物活性，且提供其實施方法。

在一些態樣中，本發明亦提供產生如本文所述之前述嵌合多肽中之任一者之方法。此外，本發明涵蓋任一數目之前述方法及組合物之組合。

在某些態樣中，GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)可為融合蛋白，其進一步包含一或多個融合結構域。該等融合結構域之熟知實例包括(但不限於)聚組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G及免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、麥芽糖結合蛋白(MBP)，其尤其可用於藉由親和層析分離融合蛋白。出於親和純化之目的，使用用於親和層析之相關基質，例如麩胱甘肽-、澱粉酶-及鎳-或鈷-偶聯之樹脂。融合結構域亦包括「表位標識」，其通常係可獲得針對其之特異性抗體之短肽序列。易於獲得針對其之特異性單株抗體之熟知的表位標識包括FLAG、流行性感冒病毒血球凝集素(HA)、His及c-myc標識。實例性His標識具有序列HHHHHH(SEQ ID NO：7)，且實例性c-myc標識具有序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO：8)。應認識到，任何該等標識或融合物可附加至嵌合多肽之GAA部分或可附加至嵌合多肽之內化性部分，或二者。在某些實施例中，嵌合多肽在嵌合多肽之N-末端(或在N-末端之10個胺基酸殘基內)包含「AGIH」部分(SEQ ID NO：19)，且該等嵌合多肽可在一或多種表位標識之存在或不存在下提供。在其他實施例中，嵌合多肽在多肽之最N-末端位置包含絲胺酸。在一些實施例中，嵌合多肽在多肽之N-末端(或在N-末端之10個胺基酸殘基內)包含「SAGIH」(SEQ ID NO：20)部分，且該等嵌合多肽可在一或多種表位標識之存在或不存在下提供。

在一些情形中，融合結構域具有例如用於因子Xa或凝血酶之蛋白酶裂解位點，其容許相關蛋白酶部分消化融合蛋白並由此自其釋放重組蛋白質。然後可藉由後續層析分離使所釋放蛋白質與融合結構域分離。在某些實施例中，GAA多肽可含有一或多個能穩定多肽之修飾。舉例而言，該等修飾延長多肽之活體外半衰期，延長多肽之循環半衰期或降低多肽之蛋白分解降解。

在前述任一者之某些實施例中，嵌合蛋白質之GAA部分包含GAA之一種成熟形式，例如76kDa片段、70kDa片段、使用替代性起始及/或終止位點之類似形式或其功能性片段。在某些實施例中，該成熟GAA多肽或其功能性片段保留水解肝醣之能力，如在活體外或活體內所評估。此外，在某些實施例中，包含此一成熟GAA多肽或其功能性片段之嵌合多肽可水解肝醣。實例性生物活性片段包含全長成熟 GAA多肽之至少50、至少60、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少230、至少250、至少260、至少275或至少300個鄰接胺基酸殘基。

在某些實施例中，本文所述嵌合多肽之GAA多肽部分包含GAA之全長不成熟形式(例如，在信號序列之存在或不存在下，包含SEQ ID NO：1及2之胺基酸序列之多肽)。在某些實施例中，本文所述嵌合蛋白質之GAA多肽部分包含GAA(例如，包含成熟GAA之鄰接GAA多肽序列)，但不包含SEQ ID NO：1中所述之GAA多肽。在一些實施例中，GAA多肽缺少GAA完整連接體區域之至少一部分，其中該完整連接體區域對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸57-78(即，SEQ ID NO：31)。在一些實施例中，GAA多肽不包含對應於以下中之任何一或多者之鄰接胺基酸序列：SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-27、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-61、1-62、1-63、1-64、1-65、1-66、1-67、1-68、1-69、1-70、1-71、1-72、1-73、1-74、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、1-100、1-105、1-110、1-115、1-120或1-121。換言之，在某些實施例中，嵌合多肽缺少前述中之任一者。在其他實施例中，GAA多肽確實包含上述中之任何一或多者。在具體實施例中，GAA多肽不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-60之鄰接胺基酸序列(例如，嵌合多肽包含含有SEQ ID NO：21之胺基酸序列之GAA多肽，且在某些實施例中，嵌合多肽不包含SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-60)。在其他實施例中，GAA部分不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-66之鄰接胺基酸序列(例如，嵌合多肽包含含有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽，且在某些實施例中，嵌合多肽不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-60或1-66之鄰接胺基酸序列)。在一些實施例中，GAA部分不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-69之鄰接胺基酸序列(例如，嵌合多肽包含含有GAA多肽之GAA多肽部分，該GAA多肽包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，且在某些實施例中，嵌合多肽不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1-60或1-66或1-69之鄰接胺基酸序列)。明確涵蓋如本文所述之適宜組合。包含任一該等包含成熟GAA之GAA多肽之嵌合多肽可用於將GAA活性遞送至細胞中。

在某些實施例中，本發明涵蓋嵌合蛋白質，其中GAA部分(例如，成熟GAA部分)係前述GAA多肽或功能性片段中任一者之變體。實例性變體具有與天然GAA多肽或其生物活性片段之胺基酸序列至少90%、92%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致之胺基酸序列，並且該等變體保留天然GAA水解肝醣之能力，如在活體外或活體內所評估。本發明涵蓋嵌合蛋白質及該等蛋白質之用途，其中GAA部分包含本文所述之GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、形式或變體中之任一者與本文所述任一內化性部分之組合。實例性成熟GAA多肽闡述於SEQ ID NO：3及4中。包含成熟GAA之實例性GAA多肽闡述於本文中。此外，在某些實施例中，前述嵌合多肽中之任一者之GAA部分在某些實施例中可為融合蛋白。包含GAA部分與內化性部分之任一組合且視情況包括一或多個連接體、一或多個標識等之任何該等嵌合多肽可用於本發明之任一方法中。

在某些實施例中，本發明涵蓋如本文所述之包含GAA多肽之嵌合多肽。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含GAA多肽部分(例如，非內化性部分多肽部分包含GAA多肽)。本發明之適宜嵌合多肽具有酶活性且可用於例如在患有GSD III、GSD IV、龐貝氏病及/或GSD I(包括GSD Ia或GSD Ib)之個體中在細胞質中減少肝醣累積。除非另外明確指示，否則在提及本發明嵌合多肽在細胞質中之活性時係指至少在細胞質中具有活性。在某些實施例中，本發明之適宜嵌合多肽具有酶活性且可用於例如在患有GSD III、GSD IV、龐貝氏病、拉弗拉病或GSD I(包括GSD Ia或GSD Ib)之個體中在溶酶體及液泡(例如，自噬液泡)中減少肝醣累積。

II. 拉弗拉蛋白多肽

在某些實施例中，本發明嵌合多肽(或用於本發明方法中之嵌合多肽)之非內化性部分多肽部分係拉弗拉蛋白多肽。換言之，在某些實施例中，提供含有拉弗拉蛋白之嵌合多肽。用於本發明方法及組合物中之實例性拉弗拉蛋白多肽提供於本文中。

如本文所用，拉弗拉蛋白多肽包括野生型拉弗拉蛋白多肽之各種功能性片段及變體、融合蛋白及經修飾形式。拉弗拉蛋白多肽之該等功能性片段或變體、融合蛋白及經修飾形式具有與天然拉弗拉蛋白多肽具有實質性序列一致性之胺基酸序列之至少一部分，並保留天然拉弗拉蛋白多肽之功能(例如，天然拉弗拉蛋白之蛋白質磷酸酶活性、葡聚糖磷酸酶活性、與馬啉素形成複合物之能力及/或肝醣結合活性)。應注意，「保留功能」並非意指，具體片段之活性必須與天然蛋白質相同或實質上相同，但在一些實施例中如此。然而，為保留天然活性，該天然活性應為與其比較該活性之天然蛋白質之活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，且該比較係在相同或類似條件下進行。在一些實施例中，保留天然活性可包括多種情形，其中片段或變體相對於與其比較該活性之天然蛋白質具有改良之活性，例如至少105%、至少110%、至少120%或至少125%，且該比較係在相同或類似條件下進行。

在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽之功能性片段、變體或融合蛋白包含與拉弗拉蛋白多肽或其片段至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致(例如，與SEQ ID NO：38或39至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致)之胺基酸序列。

在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽及方法中之拉弗拉蛋白多肽係全長或實質上全長拉弗拉蛋白多肽。在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽及方法中之拉弗拉蛋白多肽係具有蛋白質磷酸酶活性、葡聚糖磷酸酶活性、與馬啉素形成複合物之能力及/或碳水化合物結合活性(例如，肝醣結合活性)之功能性片段。

在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽之片段或變體可藉由篩選自編碼拉弗拉蛋白多肽之核酸之相應片段重組產生之多肽來獲得。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮天然拉弗拉蛋白多肽之功能之片段或變體，例如藉由在活體內測試其治療拉弗拉病之能力及/或藉由在活體外(例如，在無細胞或基於細胞之分析中)確認該片段或變體具有蛋白質磷酸酶活性、葡聚糖磷酸酶活性、與馬啉素形成複合物之能力及/或碳水化合物結合活性(例如，肝醣結合活性)來測試。用於測試本文所揭示之拉弗拉蛋白多肽之活性之活體外分析之實例可為用或不用含有拉弗拉蛋白之嵌合多肽處理拉弗拉病細胞，然後在培育時期後，與未經處理的對照細胞相比測定經處理細胞中之LC3染色。與未經處理之對照細胞相比，經處理細胞中LC3染色之量之增加指示，在經處理細胞中可發生自噬功能之改良。

在某些實施例中，本發明涵蓋出於諸如增強治療性或預防性效能或穩定性(例如，離體儲放壽命及在活體內對蛋白分解降解之抗性)之目的修飾拉弗拉蛋白多肽之結構。經修飾多肽可藉由(例如)胺基酸取代、缺失或添加來產生。例如，可合理地預期，例如，用異白胺酸或纈胺酸隔離置換白胺酸、用麩胺酸鹽隔離置換天冬胺酸鹽、用絲胺酸隔離置換蘇胺酸或用結構相關胺基酸類似地置換胺基酸(例如，保守突變)將不會對所得分子之拉弗拉蛋白生物學活性造成重大影響。保守置換係彼等在其側鏈相關之胺基酸家族內進行者。

本發明進一步涵蓋生成拉弗拉蛋白多肽之組合突變體以及截短突變體之集合，且尤其可用於鑑別功能變體序列。可生成組合衍生之變體，其相對於天然拉弗拉蛋白多肽具有選擇性功效。同樣，誘變可產生細胞內半衰期與相應野生型拉弗拉蛋白多肽顯著不同之變體。舉例而言，可使經改變蛋白質對蛋白分解降解或可導致拉弗拉蛋白破壞或以其他方式不活化之其他細胞過程更穩定或更不穩定。該等變體可用於藉由調節其半衰期來改變拉弗拉蛋白多肽含量。可藉由多種方式(例如)自簡併寡核苷酸序列生成潛在拉弗拉蛋白變體序列之庫。簡併基因序列之化學合成可在自動DNA合成器中實施，然後可將合成基因連接為適當基因以供表現。基因之簡併集合之目的係在一個混合物中提供編碼潛在多肽序列之期望集合之所有序列。簡併寡核苷酸之合成為業內所熟知(例如，參見Narang,SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人，(1981)Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，AG Walton編輯，Amsterdam：Elsevier，第273-289頁；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人，(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。該等技術已用於其他蛋白質之定向進化(例如，參見Scott等人，(1990)Science 249：386-390；Roberts等人，(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等人，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS USA 87：6378-6382；以及以下美國專利：第5,223,409號、第5,198,346號及第5,096,815號)。

或者，可利用其他形式之誘變來生成組合庫。舉例而言，拉弗拉蛋白多肽變體可藉由以下方式自庫生成並分離：使用(例如)丙胺酸掃描誘變等篩選(Ruf等人，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang 等人，(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等人，(1993)基因137：109-118；Grodberg等人，(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等人，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等人，(1991)Biochemistry 30：10832-10838；及Cunningham等人，(1989)Science 244：1081-1085)；連接體掃描誘變(Gustin等人，(1993)Virology 193：653-660；Brown等人，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等人，(1982)Science 232：316)；飽和誘變(Meyers等人，(1986)Science 232：613)；PCR誘變(Leung等人，(1989)Method Cell Mol Biol 1：11-19)；或隨機誘變，包括化學誘變等(Miller等人，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY；及Greener等人，(1994)Strategies in Mol Biol 7：32-34)。尤其在組合環境中之連接體掃描誘變係用於鑑別拉弗拉蛋白多肽之截短(生物活性)形式之有吸引力之方法。

眾多種用於篩選藉由點突變及截短製備之組合庫之基因產物及就此而言用於篩選cDNA庫中具有某一性質之基因產物之技術為業內已知。該等技術通常將可調整以供快速篩選藉由拉弗拉蛋白多肽之組合誘變生成之基因庫。用於篩選大型基因庫之最廣泛使用的技術通常包含將基因庫選殖至可複製表現載體中，用所得載體庫轉變適當細胞，及在其中檢測期望活性促進相對容易地分離編碼其產物經檢測之基因之載體之條件下表現組合基因。下文所述之每一說明性分析適用於如篩選大量藉由組合誘變技術產生之簡併序列所需之高通量分析。

在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽可包括肽模擬物。如本文所用術語「肽模擬物」包括經化學修飾之肽及含有非天然胺基酸、類肽及諸如此類之肽樣分子。肽模擬物提供多種優於肽之優點，包括投與個體時增強之穩定性。用於鑑別肽模擬物之方法為業內所熟知且包括篩選含有潛在肽模擬物庫之資料庫。舉例而言，劍橋結構資料庫含有大於300,000種具有已知晶體結構之化合物之保藏(Allen等人，Acta Crystallogr.章節B，35：2331(1979))。其中不可獲得靶分子之晶體結構，結構可使用例如程式CONCORD來生成(Rusinko等人，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29：251(1989))。另一資料庫可用化學物質目錄(Molecular Design Limited,Informations Systems；San Leandro Calif.)含有約100,000種市售化合物且亦可搜索以鑑別拉弗拉蛋白多肽之潛在肽模擬物。

在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽可進一步包含轉譯後修飾。實例性轉譯後蛋白質修飾包括磷酸化、乙醯化、甲基化、ADP-核糖基化、泛蛋白化、糖基化、羰基化、sumo蛋白修飾、生物素化或添加多肽側鏈或疏水基團。因此，經修飾拉弗拉蛋白多肽可含有非胺基酸要素，例如脂質、多糖或單糖以及磷酸酯。可針對拉弗拉蛋白多肽之生物學活性(例如其蛋白質磷酸酶活性、葡聚糖磷酸酶活性、與馬啉素形成複合物之能力及/或碳水化合物結合活性(例如，肝醣結合活性)及/或其治療拉弗拉病之能力)測試該等非胺基酸要素對其功能性之效應。在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽可進一步包含一或多個增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與及/或純化中之一或多者之多肽部分。在其他實施例中，內化性部分包含抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽未經N-糖基化或缺少一或多個存於野生型拉弗拉蛋白多肽中之N-糖基化基團。舉例而言，用於本發明中之拉弗拉蛋白多肽可相對於天然拉弗拉蛋白缺少所有N-糖基化位點，或用於本發明中之拉弗拉蛋白多肽可相對於天然拉弗拉蛋白糖基化不足。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含不能在一或多個N-糖基化位點進行N-糖基化之經修飾胺基酸序列。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽中之至少一個預測N-糖基化位點(即，由胺基酸序列 Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr表示之共有序列)之天冬醯胺(Asn)經另一胺基酸取代。本發明涵蓋，可組合前述實例中之任何一或多者，使得本發明之拉弗拉蛋白多肽缺少一或多個N-糖基化位點，且因此未經糖基化或相對於天然拉弗拉蛋白糖基化不足。

在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽未經O-糖基化或缺少一或多個存於野生型拉弗拉蛋白多肽中之O-糖基化基團。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含不能在一或多個O-糖基化位點進行O-糖基化之經修飾胺基酸序列。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽序列中之任何一或多個預測O-糖基化位點處之絲胺酸或蘇胺酸經取代或缺失。本發明涵蓋，可組合前述實例中之任何一或多者，使得本發明之拉弗拉蛋白多肽缺少一或多個N-糖基化及/或O-糖基化位點，且因此未經糖基化或相對於天然拉弗拉蛋白糖基化不足。

在本發明之一個特定實施例中，拉弗拉蛋白多肽可經非蛋白質性聚合物修飾。在一個特定實施例中，該聚合物係聚乙二醇(「PEG」)、聚丙二醇或聚氧化烯，如美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所述。PEG係熟知的水溶性聚合物，其可自市場購得或可根據業內熟知之方法藉由乙二醇之開環聚合來製備(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。

術語「生物學活性」、「生物活性」或「功能性」意指拉弗拉蛋白多肽實施與野生型拉弗拉蛋白多肽相關之功能之能力，例如具有蛋白質磷酸酶活性、葡聚糖磷酸酶活性、與馬啉素形成複合物之能力及/或碳水化合物結合活性(例如，肝醣結合活性)。術語「生物學活性」、「生物活性」及「功能性」在本文中可互換使用。如本文所用「片段」應理解為包括展現如本文所述之「生物活性」之生物活性片段(亦稱為功能性片段)或生物活性變體。亦即，拉弗拉蛋白之生物活性片段或變體展現可量測並測試之生物活性。舉例而言，生物活性片段/功能性片段或變體展現與天然(即，野生型或正常)拉弗拉蛋白多肽相同或實質上相同的生物活性，且該生物活性可藉由該片段或變體之諸如以下等能力來評價：蛋白質磷酸酶活性、葡聚糖磷酸酶活性、與馬啉素形成複合物之能力及/或碳水化合物(例如，肝醣)結合活性。如本文所用「實質上相同」係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少70%。在某些實施例中，「實質上相同」亦係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%、100%、102%、105%或110%。在某些實施例中，當在相同或實質上相同的條件下評價時，拉弗拉蛋白多肽之片段或變體將較佳保留與天然拉弗拉蛋白多肽相關之拉弗拉蛋白生物學活性之至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。

在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽之片段或變體之半衰期(t_1/2)相對於天然蛋白質之半衰期有所延長。較佳地，拉弗拉蛋白片段或變體之半衰期相對於天然拉弗拉蛋白多肽之半衰期延長至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%或甚至1000%。在一些實施例中，蛋白質半衰期係在活體外測定，例如在緩衝鹽水溶液中或在血清中測定。在其他實施例中，蛋白質半衰期係活體內半衰期，例如蛋白質在動物血清或其他體液中之半衰期。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮與天然拉弗拉蛋白多肽等效或實質上類似之功能之片段或變體。

關於增加細胞中拉弗拉蛋白生物活性之方法，本發明涵蓋前述態樣及實施例中任一者之所有組合，以及與詳細說明及實例中所述實施例中任一者之組合。基於投與嵌合多肽或使細胞與嵌合多肽接觸之所述方法可在活體外(例如，在細胞或培養物中)或活體內(例如，在患者或動物模型中)實施。在某些實施例中，該方法係活體外方法。在某些實施例中，該方法係活體內方法。

在某些態樣中，拉弗拉蛋白多肽可為融合蛋白，其進一步包含一或多個融合結構域。該等融合結構域之熟知實例包括(但不限於)聚組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G及免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、麥芽糖結合蛋白(MBP)，其尤其可用於藉由親和層析分離融合蛋白。出於親和純化之目的，使用用於親和層析之相關基質，例如麩胱甘肽-、澱粉酶-及鎳-或鈷-偶聯之樹脂。融合結構域亦包括「表位標識」，其通常係可獲得針對其之特異性抗體之短肽序列。易於獲得針對其之特異性單株抗體之熟知的表位標識包括FLAG、流行性感冒病毒血球凝集素(HA)、His及c-myc標識。實例性His標識具有序列HHHHHH(SEQ ID NO：7)，且實例性c-myc標識具有序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO：8)。在一些情形中，融合結構域具有例如用於因子Xa或凝血酶之蛋白酶裂解位點，其容許相關蛋白酶部分消化融合蛋白並由此自其釋放重組蛋白質。然後可藉由後續層析分離使所釋放蛋白質與融合結構域分離。在某些實施例中，拉弗拉蛋白多肽可含有一或多個能穩定該等多肽之修飾。舉例而言，該等修飾延長多肽之活體外半衰期，延長多肽之循環半衰期或降低多肽之蛋白分解降解。

在前述任一者之某些實施例中，本發明嵌合多肽之拉弗拉蛋白部分包含拉弗拉蛋白多肽，其在某些實施例中可為拉弗拉蛋白多肽之功能性片段或可為實質上全長拉弗拉蛋白多肽。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽在最N-末端之胺基酸位置缺少甲硫胺酸(例如，在SEQ ID NO：38或39中之任一者之第一個胺基酸處缺少甲硫胺酸)。用於本發明嵌合多肽及方法中之適宜拉弗拉蛋白多肽具有蛋白質磷酸酶活性、葡聚糖磷酸酶活性、與馬啉素形成複合物之能力及/或碳水化合物結合活性(例如，肝醣結合活性)，如在活體外或活體內所評估。實例性功能性片段包含全長拉弗拉蛋白多肽(例如，SEQ ID NO：38或39)之至少100、125、150、175、200、225、250、275、300或317個鄰接胺基酸殘基。在一些實施例中，功能性片段包含全長拉弗拉蛋白多肽(例如，SEQ ID NO：38)之100-150、100-200、100-250、100-300、100-330、200-250、200-300、200-330或300-330個鄰接胺基酸。在一些實施例中，功能性片段包含全長拉弗拉蛋白多肽(例如，SEQ ID NO：39)之100-150、100-200、100-250、100-300、100-316、200-250、200-300、200-316或300-316個鄰接胺基酸。類似地，在某些實施例中，本發明涵蓋嵌合蛋白質，其中拉弗拉蛋白部分係前述拉弗拉蛋白多肽或生物活性片段中之任一者之變體。實例性變體具有與天然拉弗拉蛋白多肽或其功能性片段之胺基酸序列至少90%、92%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致之胺基酸序列，且該等變體保留拉弗拉蛋白變體之蛋白質磷酸酶活性、葡聚糖磷酸酶活性、與馬啉素形成複合物之能力及/或肝醣結合活性。本發明涵蓋嵌合多肽及該等多肽之用途，其中拉弗拉蛋白部分包含本文所述拉弗拉蛋白多肽、片段或變體中之任一者與本文所述任一內化性部分之組合。此外，在某些實施例中，前述嵌合多肽中之任一者之拉弗拉蛋白部分在某些實施例中可為融合蛋白。包含拉弗拉蛋白部分與內化性部分之任一組合，且視情況包括一或多個連接體、一或多個標識等之任何該等嵌合多肽可用於本發明之任一方法中。

III. AGL多肽

在某些實施例中，本發明嵌合多肽(或用於本發明方法中之嵌合多肽)之非內化性部分多肽部分係AGL多肽。換言之，在某些實施例中，提供含有AGL之嵌合多肽。用於本發明方法及組合物中之實例性AGL多肽提供於本文中。

如本文所用，AGL多肽包括野生型AGL多肽之多種功能性片段及變體、融合蛋白及經修飾形式。AGL多肽之該等功能性片段或變體、融合蛋白及經修飾形式具有與天然AGL蛋白質具有實質性序列一致性之胺基酸序列之至少一部分，且保留天然AGL蛋白質之功能(例如，保留天然AGL之兩種酶活性)。應注意，「保留功能」並非意指，具體片段之活性必須與天然蛋白質相同或實質上相同，但在一些實施例中如此。然而，為保留天然活性，該天然活性應為與其比較該活性之天然蛋白質之活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，且該比較係在相同或類似條件下進行。在一些實施例中，保留天然活性可包括多種情形，其中片段或變體相對於與其比較該活性之天然蛋白質具有改良之活性，例如至少105%、至少110%、至少120%或至少125%，且該比較係在相同或類似條件下進行。

在某些實施例中，AGL多肽之功能性片段、變體或融合蛋白包含與AGL多肽或其片段至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致(例如，與SEQ ID NO：40-42至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致)之胺基酸序列。

在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽及方法中之AGL多肽係全長或實質上全長AGL多肽。在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽及方法中之AGL多肽係具有澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性及4-α-葡糖轉移酶活性之功能性片段。

在某些實施例中，AGL多肽之片段或變體可藉由篩選自編碼AGL多肽之核酸之相應片段重組產生之多肽來獲得。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮天然AGL蛋白質功能之片段或變體，例如藉由在活體內測試其治療福布斯-柯裡氏病之能力及/或藉由在活體外(例如，在無細胞或基於細胞之分析中)確認該片段或變體具有澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性及4-α-葡糖轉移酶活性來測試。用於測試本文所揭示之AGL多肽之活性之活體外分析之實例將係用或不用含有AGL之嵌合多肽處理福布斯-柯裡氏病細胞，然後在培育時期後，針對肝醣之存在藉由(例如)使用過碘酸雪夫氏(Schiff，PAS)染色對細胞進行染色。

在某些實施例中，本發明涵蓋出於諸如增強治療性或預防性效能或穩定性(例如，離體儲放壽命及在活體內對蛋白分解降解之抗性)等目的修飾AGL多肽之結構。經修飾多肽可藉由(例如)胺基酸取代、缺失或添加來產生。例如，可合理地預期，例如，用異白胺酸或纈胺酸隔離置換白胺酸、用麩胺酸鹽隔離置換天冬胺酸鹽、用絲胺酸隔離置換蘇胺酸或用結構相關胺基酸類似地置換胺基酸(例如，保守突變)將不會對所得分子之AGL生物學活性造成重大影響。保守置換係彼等在其側鏈相關之胺基酸家族內進行者。

本發明進一步涵蓋生成AGL多肽之組合突變體以及截短突變體之集合，且尤其可用於鑑別功能變體序列。可生成組合衍生之變體，其相對於天然AGL多肽具有選擇性功效。同樣，誘變可產生細胞內半衰期與相應野生型AGL多肽顯著不同之變體。舉例而言，可使經改變蛋白質對蛋白分解降解或可導致AGL破壞或以其他方式不活化之其他細胞過程更穩定或更不穩定。該等變體可用於藉由調節其半衰期來改變AGL多肽含量。可藉由多種方式(例如)自簡併寡核苷酸序列生成潛在AGL變體序列之庫。簡併基因序列之化學合成可在自動DNA合成器中實施，然後將合成基因連接為適當基因以供表現。基因之簡併集合之目的係在一個混合物中提供編碼潛在多肽序列之期望集合之所有序列。簡併寡核苷酸之合成為業內所熟知(例如，參見Narang,SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人，(1981)Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，AG Walton編輯，Amsterdam：Elsevier，第273-289頁；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人，(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。該等技術已用於其他蛋白質之定向進化(例如，參見Scott等人，(1990)Science 249：386-390；Roberts等人，(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等人，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS USA 87：6378-6382；以及以下美國專利：第5,223,409號、第5,198,346號及第5,096,815號)。

或者，可利用其他形式之誘變來生成組合庫。舉例而言，AGL多肽變體可藉由以下方式自庫生成並分離：使用(例如)丙胺酸掃描誘變等篩選(Ruf等人，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等人，(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等人，(1993)基因137：109-118；Grodberg等人，(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等人，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等人，(1991)Biochemistry 30：10832-10838；及Cunningham等人，(1989)Science 244：1081-1085)；連接體掃描誘變(Gustin等人，(1993)Virology 193：653-660；Brown等人，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等人，(1982)Science 232：316)；飽和誘變(Meyers等人，(1986)Science 232：613)；PCR誘變(Leung等人，(1989)Method Cell Mol Biol 1：11-19)；或隨機誘變，包括化學誘變等(Miller等人，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY；及Greener等人，(1994)Strategies in Mol Biol 7：32-34)。尤其在組合環境中之連接體掃描誘變係用於鑑別AGL多肽之截短(生物活性)形式之有吸引力之方法。

眾多種用於篩選藉由點突變及截短製備之組合庫之基因產物及就此而言用於篩選cDNA庫中具有某一性質之基因產物之技術為業內已知。該等技術通常將可調整以供快速篩選藉由AGL多肽之組合誘變生成之基因庫。用於篩選大型基因庫之最廣泛使用的技術通常包含將基因庫選殖至可複製表現載體中，用所得載體庫轉變適當細胞，及在其中檢測期望活性促進相對容易地分離編碼其產物經檢測之基因之載體之條件下表現組合基因。下文所述之每一說明性分析適用於如篩選大量藉由組合誘變技術產生之簡併序列所需之高通量分析。

在某些實施例中，AGL多肽可包括肽模擬物。如本文所用術語「肽模擬物」包括經化學修飾之肽及含有非天然胺基酸、類肽及諸如此類之肽樣分子。肽模擬物提供多種優於肽之優點，包括投與個體時增強之穩定性。用於鑑別肽模擬物之方法為業內所熟知且包括篩選含有潛在肽模擬物庫之資料庫。舉例而言，劍橋結構資料庫含有大於300,000種具有已知晶體結構之化合物之保藏(Allen等人，Acta Crystallogr.章節B，35：2331(1979))。其中不可獲得靶分子之晶體結構，結構可使用例如程式CONCORD來生成(Rusinko等人，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29：251(1989))。另一資料庫可用化學物質目錄(Molecular Design Limited,Informations Systems；San Leandro Calif.)含有約100,000種市售化合物且亦可搜索以鑑別AGL多肽之潛在肽模擬物。

在某些實施例中，AGL多肽可進一步包含轉譯後修飾。實例性轉譯後蛋白質修飾包括磷酸化、乙醯化、甲基化、ADP-核糖基化、泛蛋白化、糖基化、羰基化、sumo蛋白修飾、生物素化或添加多肽側鏈或疏水基團。因此，經修飾AGL多肽可含有非胺基酸要素，例如脂質、多糖或單糖以及磷酸酯。可針對AGL多肽之生物學活性(例如其水解肝醣或治療福布斯-柯裡氏病之能力)測試該等非胺基酸要素對其功能性之效應。在某些實施例中，AGL多肽可進一步包含一或多個增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與及/或純化中之一或多者之多肽部分。在其他實施例中，內化性部分包含抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，AGL多肽未經N-糖基化或缺少一或多個存於野生型AGL多肽中之N-糖基化基團。舉例而言，用於本發明中之AGL多肽可相對於天然AGL缺少所有N-糖基化位點，或用於本發明中之AGL多肽可相對於天然AGL糖基化不足。在一些實施例中，AGL多肽包含不能在一或多個N-糖基化位點進行N-糖基化之經修飾胺基酸序列。在一些實施例中，AGL多肽中之至少一個預測N-糖基化位點(即，由胺基酸序列Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr表示之共有序列)之天冬醯胺(Asn)經另一胺基酸取代。AGL胺基酸序列中之Asn-Xaa-Ser序列伸展之實例包括對應於SEQ ID NO：40之胺基酸位置813-815、839-841、927-929及1032-1034之胺基酸。AGL胺基酸序列中之Asn-Xaa-Thr序列伸展之實例包括對應於胺基酸位置69-71、219-221、797-799、1236-1238及1380-1382之胺基酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO：40之胺基酸位置69、219、797、813、839、927、1032、1236及1380之胺基酸位置中之任一者或組合處之天冬醯胺經取代或缺失。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO：40之胺基酸位置815、841、929及1034之胺基酸位置中之任一者或組合處之絲胺酸經取代或缺失。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO：40之胺基酸位置71、 221、799、1238及1382之胺基酸位置中之任一者或組合處之蘇胺酸經取代或缺失。在一些實施例中，對應於SEQ ID NO：40之胺基酸位置220、798、814、840、928、1033、1237及1381中之任一者或組合之Xaa胺基酸缺失或經脯胺酸置換。本發明涵蓋，可組合前述實例中之任何一或多者，使得本發明之AGL多肽缺少一或多個N-糖基化位點，且因此未經糖基化或相對於天然AGL糖基化不足。

在一些實施例中，AGL多肽未經O-糖基化或缺少一或多個存於野生型AGL多肽中之O-糖基化基團。在一些實施例中，AGL多肽包含不能在一或多個O-糖基化位點進行O-糖基化之經修飾胺基酸序列。在一些實施例中，AGL多肽序列中之任何一或多個預測O-糖基化位點處之絲胺酸或蘇胺酸經取代或缺失。本發明涵蓋，可組合前述實例中之任何一或多者，使得本發明之AGL多肽缺少一或多個N-糖基化及/或O-糖基化位點，且因此未經糖基化或相對於天然AGL糖基化不足。

在本發明之一個特定實施例中，AGL多肽可經非蛋白質性聚合物修飾。在一個特定實施例中，該聚合物係聚乙二醇(「PEG」)、聚丙二醇或聚氧化烯，如美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所述。PEG係熟知的水溶性聚合物，其可自市場購得或可根據業內熟知之方法藉由乙二醇之開環聚合來製備(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。

術語「生物學活性」、「生物活性」或「功能性」意指AGL蛋白質實施與野生型AGL蛋白質相關之功能之能力，例如具有寡-1,4-1,4-葡糖轉移酶活性及/或澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性。術語「生物學活性」、「生物活性」及「功能性」在本文中可互換使用。如本文所用「片段」應理解為包括展現如本文所述之「生物活性」之生物活性片段(亦稱為功能性片段)或生物活性變體。亦即，AGL之生物活性片段或變體展現可量測並測試之生物活性。舉例而言，生物活性片段/功能性片段或變體展現與天然(即，野生型或正常)AGL蛋白質相同或實質上相同的生物活性，且該生物活性可藉由該片段或變體之諸如以下等能力來評價：經由AGL片段或變體之4-α-葡糖轉移酶活性及/或澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性使肝醣去支。如本文所用「實質上相同」係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少70%。在某些實施例中，「實質上相同」亦係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%、100%、102%、105%或110%。在某些實施例中，當在相同或實質上相同的條件下評價時，AGL多肽之片段或變體將較佳保留與天然AGL多肽相關之AGL生物學活性之至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。

在某些實施例中，AGL多肽之片段或變體之半衰期(t_1/2)相對於天然蛋白質之半衰期有所延長。較佳地，AGL片段或變體之半衰期相對於天然AGL蛋白質之半衰期延長至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%或甚至1000%。在一些實施例中，蛋白質半衰期係在活體外測定，例如在緩衝鹽水溶液中或在血清中測定。在其他實施例中，蛋白質半衰期係活體內半衰期，例如蛋白質在動物血清或其他體液中之半衰期。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮與天然AGL蛋白質等效或實質上類似之功能之片段或變體。

關於增加細胞中AGL生物活性之方法，本發明涵蓋前述態樣及實施例中任一者之所有組合，以及與詳細說明及實例中所述實施例中任一者之組合。基於投與嵌合多肽或使細胞與嵌合多肽接觸之所述方法可在活體外(例如，在細胞或培養物中)或活體內(例如，在患者或動物模型中)實施。在某些實施例中，該方法係活體外方法。在某些實施例中，該方法係活體內方法。

在某些態樣中，AGL多肽可為融合蛋白，其進一步包含一或多個融合結構域。該等融合結構域之熟知實例包括(但不限於)聚組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G及免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、麥芽糖結合蛋白(MBP)，其尤其可用於藉由親和層析分離融合蛋白。出於親和純化之目的，使用用於親和層析之相關基質，例如麩胱甘肽-、澱粉酶-及鎳-或鈷-偶聯之樹脂。融合結構域亦包括「表位標識」，其通常係可獲得針對其之特異性抗體之短肽序列。易於獲得針對其之特異性單株抗體之熟知的表位標識包括FLAG、流行性感冒病毒血球凝集素(HA)、His及c-myc標識。實例性His標識具有序列HHHHHH(SEQ ID NO：7)，且實例性c-myc標識具有序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO：8)。在一些情形中，融合結構域具有例如用於因子Xa或凝血酶之蛋白酶裂解位點，其容許相關蛋白酶部分消化融合蛋白並由此自其釋放重組蛋白質。然後可藉由後續層析分離使所釋放蛋白質與融合結構域分離。在某些實施例中，AGL多肽可含有一或多個能穩定該等多肽之修飾。舉例而言，該等修飾延長多肽之活體外半衰期，延長多肽之循環半衰期或降低多肽之蛋白分解降解。

在前述任一者之某些實施例中，本發明嵌合多肽之AGL部分包含AGL多肽，其在某些實施例中可為AGL多肽之功能性片段或可為實質上全長AGL多肽。在一些實施例中，AGL多肽在最N-末端之胺基酸位置缺少甲硫胺酸(例如，在SEQ ID NO：40-42中之任一者之第一個胺基酸處缺少甲硫胺酸)。用於本發明嵌合多肽及方法中之適宜AGL多肽具有寡-1,4-1,4-葡糖轉移酶活性及澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性，如在活體外或活體內所評估。實例性功能性片段包含全長AGL多肽(例如，SEQ ID NO：40-42)之至少500、至少525、至少550、至少575、至少600、至少625、至少650、至少675、至少700、至少725、至少750、至少775、至少800、至少825、至少850、至少875、至少900、至少925、至少925、至少950、至少975、至少1000、至少1025、至少1050、至少1075、至少1100、至少1125、至少1150、至少1175、至少1200、至少1225、至少1250、至少1275、至少1300、至少1325、至少1350、至少1375、至少1400、至少1425、至少1450、至少1475、至少1500、至少1525或至少1532個鄰接胺基酸殘基。在一些實施例中，功能性片段包含全長AGL多肽(例如，SEQ ID NO：40-42)之500-750、500-1000、500-1200、500-1300、500-1500、1000-1100、1000-1200、1000-1300、1000-1400、1000-1500、1000-1532個鄰接胺基酸。類似地，在某些實施例中，本發明涵蓋嵌合蛋白質，其中AGL部分係前述AGL多肽或生物活性片段中之任一者之變體。實例性變體具有與天然AGL多肽或其功能性片段之胺基酸序列至少90%、92%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致之胺基酸序列，且該等變體保留經由AGL變體之寡-1,4-1,4-葡糖轉移酶活性及澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性使肝醣去支之能力。本發明涵蓋嵌合多肽及該等多肽之用途，其中AGL部分包含本文所述AGL多肽、片段或變體中之任一者與本文所述任一內化性部分之組合。此外，在某些實施例中，前述嵌合多肽中之任一者之AGL部分在某些實施例中可為融合蛋白。包含AGL部分與內化性部分之任一組合，且視情況包括一或多個連接體、一或多個標識等之任何該等嵌合多肽可用於本發明之任一方法中。

IV. 馬啉素多肽

在某些實施例中，本發明嵌合多肽(或用於本發明方法中之嵌合多肽)之非內化性部分多肽部分係馬啉素多肽。換言之，在某些實施例中，提供含有馬啉素之嵌合多肽。用於本發明方法及組合物中之實例性馬啉素多肽提供於本文中。

如本文所用，馬啉素多肽包括野生型馬啉素多肽之多種功能性片段及變體、融合蛋白及經修飾形式。馬啉素多肽之該等功能性片段或變體、融合蛋白及經修飾形式具有與天然馬啉素多肽實質性序列一致性之胺基酸序列之至少一部分，且保留天然馬啉素多肽之功能(例如，E3泛蛋白連接酶活性及/或與拉弗拉蛋白形成複合物之能力)。應注意，「保留功能」並非意指，具體片段之活性必須與天然蛋白質相同或實質上相同，但在一些實施例中如此。然而，為保留天然活性，該天然活性應為與其比較該活性之天然蛋白質之活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，且該比較係在相同或類似條件下進行。在一些實施例中，保留天然活性可包括多種情形，其中片段或變體相對於與其比較該活性之天然蛋白質具有改良之活性，例如至少105%、至少110%、至少120%或至少125%，且該比較係在相同或類似條件下進行。

野生型馬啉素多肽具有兩個功能結構域：RING指形E3泛蛋白連接酶結構域及NHL之6個重複，其係藉由(且按其命名)與NCL-1、HT2A及LIN41蛋白質之胺基酸序列同源性來定義。在一些實施例中，馬啉素多肽或其功能性片段或變體包含功能性RING指形E3泛蛋白連接酶結構域及/或至少1、2、3、4、5或所有6個NHL重複。在一些實施例中，馬啉素多肽或其功能性片段或變體包含功能性RING指形E3泛蛋白連接酶結構域及所有6個NHL重複。

在某些實施例中，馬啉素多肽、馬啉素多肽之功能性片段、變體或融合蛋白包含與馬啉素多肽或其片段至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致(例如，與SEQ ID NO：43至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致)之胺基酸序列。

在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽及方法中之馬啉素多肽係全長或實質上全長馬啉素多肽。在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽及方法中之馬啉素多肽係具有E3泛蛋白連接酶活性及/或與拉弗拉蛋白形成複合物之能力之功能性片段。在前述任一者之某些實施例中，馬啉素多肽視情況包括(或不包括)N-末端甲硫胺酸。

在某些實施例中，馬啉素多肽之片段或變體可藉由篩選自編碼馬啉素多肽之核酸之相應片段重組產生之多肽來獲得。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮天然馬啉素多肽功能之片段或變體，例如藉由在活體內測試其治療拉弗拉病之能力及/或藉由在活體外(例如，在無細胞或基於細胞之分析中)確認該片段或變體具有蛋白質E3泛蛋白連接酶活性及/或與拉弗拉蛋白形成複合物之能力來測試。用於測試本文所揭示之馬啉素多肽之活性之活體外分析之實例將為測試馬啉素在活體外泛蛋白化蛋白質受質之能力。

在某些實施例中，本發明涵蓋出於諸如增強治療性或預防性效能或穩定性(例如，離體儲放壽命及在活體內對蛋白分解降解之抗性)等目的修飾馬啉素多肽之結構。經修飾多肽可藉由(例如)胺基酸取代、缺失或添加來產生。例如，可合理地預期，例如，用異白胺酸或纈胺酸隔離置換白胺酸、用麩胺酸鹽隔離置換天冬胺酸鹽、用絲胺酸隔離置換蘇胺酸或用結構相關胺基酸類似地置換胺基酸(例如，保守突變)將不會對所得分子之馬啉素生物學活性造成重大影響。保守置換係彼等在其側鏈相關之胺基酸家族內進行者。

本發明進一步涵蓋生成馬啉素多肽之組合突變體以及截短突變體之集合，且尤其可用於鑑別功能變體序列。可生成組合衍生之變體，其相對於天然馬啉素多肽具有選擇性功效。同樣，誘變可產生細胞內半衰期與相應野生型馬啉素多肽顯著不同之變體。舉例而言，可使經改變蛋白質對蛋白分解降解或可導致馬啉素破壞或以其他方式不活化之其他細胞過程更穩定或更不穩定。該等變體可用於藉由調節其半衰期來改變馬啉素多肽含量。可藉由多種方式(例如)自簡併寡核苷酸序列生成潛在馬啉素變體序列之庫。簡併基因序列之化學合成可在自動DNA合成器中實施，然後可將合成基因連接為適當基因以供表現。基因之簡併集合之目的係在一個混合物中提供編碼潛在多肽序列之期望集合之所有序列。簡併寡核苷酸之合成為業內所熟知(例如，參見Narang,SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人，(1981)Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，AG Walton編輯，Amsterdam：Elsevier，第273-289頁；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人，(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。該等技術已用於其他蛋白質之定向進化(例如，參見Scott等人，(1990)Science 249：386-390；Roberts等人，(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等人，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS USA 87：6378-6382；以及以下美國專利：第5,223,409號、第5,198,346號及第5,096,815號)。

或者，可利用其他形式之誘變來生成組合庫。舉例而言，馬啉素多肽變體可藉由以下方式自庫生成並分離：使用(例如)丙胺酸掃描誘變等篩選(Ruf等人，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等人，(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等人，(1993)基因 137：109-118；Grodberg等人，(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等人，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等人，(1991)Biochemistry 30：10832-10838；及Cunningham等人，(1989)Science 244：1081-1085)；連接體掃描誘變(Gustin等人，(1993)Virology 193：653-660；Brown等人，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等人，(1982)Science 232：316)；飽和誘變(Meyers等人，(1986)Science 232：613)；PCR誘變(Leung等人，(1989)Method Cell Mol Biol 1：11-19)；或隨機誘變，包括化學誘變等(Miller等人，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY；及Greener等人，(1994)Strategies in Mol Biol 7：32-34)。尤其在組合環境中之連接體掃描誘變係用於鑑別馬啉素多狀之截短(生物活性)形式之有吸引力之方法。

眾多種用於篩選藉由點突變及截短製備之組合庫之基因產物及就此而言用於篩選cDNA庫中具有某一性質之基因產物之技術為業內已知。該等技術通常將可調整以供快速篩選藉由馬啉素多肽之組合誘變生成之基因庫。用於篩選大型基因庫之最廣泛使用的技術通常包含將基因庫選殖至可複製表現載體中，用所得載體庫轉變適當細胞，及在其中檢測期望活性促進相對容易地分離編碼其產物經檢測之基因之載體之條件下表現組合基因。下文所述之每一說明性分析適用於如篩選大量藉由組合誘變技術產生之簡併序列所需之高通量分析。

在某些實施例中，馬啉素多肽可包括肽模擬物。如本文所用術語「肽模擬物」包括經化學修飾之肽及含有非天然胺基酸、類肽及諸如此類之肽樣分子。肽模擬物提供多種優於肽之優點，包括投與個體時增強之穩定性。用於鑑別肽模擬物之方法為業內所熟知且包括篩選含有潛在肽模擬物庫之資料庫。舉例而言，劍橋結構資料庫含有大於300,000種具有已知晶體結構之化合物之保藏(Allen等人，Acta Crystallogr.章節B，35：2331(1979))。其中不可獲得靶分子之晶體結構，結構可使用例如程式CONCORD來生成(Rusinko等人，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29：251(1989))。另一資料庫可用化學物質目錄(Molecular Design Limited,Informations Systems；San Leandro Calif.)含有約100,000種市售化合物且亦可搜索以鑑別馬啉素多肽之潛在肽模擬物。

在某些實施例中，馬啉素多肽可進一步包含轉譯後修飾。實例性轉譯後蛋白質修飾包括磷酸化、乙醯化、甲基化、ADP-核糖基化、泛蛋白化、糖基化、羰基化、sumo蛋白修飾、生物素化或添加多肽側鏈或疏水基團。因此，經修飾馬啉素多肽可含有非胺基酸要素，例如脂質、多糖或單糖以及磷酸酯。可針對馬啉素多肽之生物學活性(例如其E3泛蛋白連接酶活性之保留及/或與拉弗拉蛋白形成複合物之能力及/或其治療拉弗拉病之能力)測試該等非胺基酸要素對其功能性之效應。在某些實施例中，馬啉素多肽可進一步包含一或多個增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與及/或純化中之一或多者之多肽部分。在其他實施例中，內化性部分包含抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，馬啉素多肽未經N-糖基化或缺少一或多個存於野生型馬啉素多肽中之N-糖基化基團。舉例而言，用於本發明中之馬啉素多肽可相對於天然馬啉素缺少所有N-糖基化位點，或用於本發明中之馬啉素多肽可相對於天然馬啉素糖基化不足。在一些實施例中，馬啉素多肽包含不能在一或多個N-糖基化位點進行N-糖基化之經修飾胺基酸序列。在一些實施例中，馬啉素多肽中之至少一個預測N-糖基化位點(即，由胺基酸序列Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr表示之共有序列)之天冬醯胺(Asn)經另一胺基酸取代。本發明涵蓋，可組合前述實例中之任何一或多者，使得本發明之馬啉素多肽缺少一或多個N-糖基化位點，且因此未經糖基化或相對於天然馬啉素糖基化不足。

在一些實施例中，馬啉素多肽未經O-糖基化或缺少一或多個存於野生型馬啉素多肽中之O-糖基化基團。在一些實施例中，馬啉素多肽包含不能在一或多個O-糖基化位點進行O-糖基化之經修飾胺基酸序列。在一些實施例中，馬啉素多肽序列中之任何一或多個預測O-糖基化位點處之絲胺酸或蘇胺酸經取代或缺失。本發明涵蓋，可組合前述實例中之任何一或多者，使得本發明之馬啉素多肽缺少一或多個N-糖基化及/或O-糖基化位點，且因此未經糖基化或相對於天然馬啉素糖基化不足。

在本發明之一個特定實施例中，馬啉素多肽可經非蛋白質性聚合物修飾。在一個特定實施例中，該聚合物係聚乙二醇(「PEG」)、聚丙二醇或聚氧化烯，如美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所述。PEG係熟知的水溶性聚合物，其可自市場購得或可根據業內熟知之方法藉由乙二醇之開環聚合來製備(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。

術語「生物學活性」、「生物活性」或「功能性」意指馬啉素多肽實施與野生型馬啉素多肽相關之功能之能力，例如E3泛蛋白連接酶活性及/或與拉弗拉蛋白形成複合物之能力。術語「生物學活性」、「生物活性」及「功能性」在本文中可互換使用。如本文所用「片段」應理解為包括展現如本文所述之「生物活性」之生物活性片段(亦稱為功能性片段)或生物活性變體。亦即，馬啉素之生物活性片段或變體展現可量測並測試之生物活性。舉例而言，生物活性片段/功能性片段或變體展現與天然(即，野生型或正常)馬啉素多肽相同或實質上相同的生物活性，且該生物活性可藉由該片段或變體之諸如以下等能力來評價：E3泛蛋白連接酶活性及/或與拉弗拉蛋白形成複合物之能力。如本文所用「實質上相同」係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少70%。在某些實施例中，「實質上相同」亦係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%、100%、102%、105%或110%。在某些實施例中，當在相同或實質上相同的條件下評價時，馬啉素多肽之片段或變體將較佳保留與天然馬啉素多肽相關之馬啉素生物學活性之至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。

在某些實施例中，馬啉素多肽之片段或變體之半衰期(t_1/2)相對於天然蛋白質之半衰期有所延長。較佳地，馬啉素片段或變體之半衰期相對於天然馬啉素多肽之半衰期延長至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%或甚至1000%。在一些實施例中，蛋白質半衰期係在活體外測定，例如在緩衝鹽水溶液中或在血清中測定。在其他實施例中，蛋白質半衰期係活體內半衰期，例如蛋白質在動物血清或其他體液中之半衰期。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮與天然馬啉素多肽等效或實質上類似之功能之片段或變體。

關於增加細胞中馬啉素生物活性之方法，本發明涵蓋前述態樣及實施例中任一者之所有組合，以及與詳細說明及實例中所述實施例中任一者之組合。基於投與嵌合多肽或使細胞與嵌合多肽接觸之所述方法可在活體外(例如，在細胞或培養物中)或活體內(例如，在患者或動物模型中)實施。在某些實施例中，該方法係活體外方法。在某些實施例中，該方法係活體內方法。

在某些態樣中，馬啉素多肽可為融合蛋白，其進一步包含一或多個融合結構域。該等融合結構域之熟知實例包括(但不限於)聚組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G及免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、麥芽糖結合蛋白(MBP)，其尤其可用於藉由親和層析分離融合蛋白。出於親和純化之目的，使用用於親和層析之相關基質，例如麩胱甘肽-、澱粉酶-及鎳-或鈷-偶聯之樹脂。融合結構域亦包括「表位標識」，其通常係可獲得針對其之特異性抗體之短肽序列。易於獲得針對其之特異性單株抗體之熟知的表位標識包括FLAG、流行性感冒病毒血球凝集素(HA)、His及c-myc標識。實例性His標識具有序列HHHHHH(SEQ ID NO：7)，且實例性c-myc標識具有序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO：8)。在一些情形中，融合結構域具有例如用於因子Xa或凝血酶之蛋白酶裂解位點，其容許相關蛋白酶部分消化融合蛋白並由此自其釋放重組蛋白質。然後可藉由後續層析分離使所釋放蛋白質與融合結構域分離。在某些實施例中，馬啉素多肽可含有一或多個能穩定該等多肽之修飾。舉例而言，該等修飾延長多肽之活體外半衰期，延長多肽之循環半衰期或降低多肽之蛋白分解降解。

在前述任一者之某些實施例中，本發明嵌合多肽之馬啉素部分包含馬啉素多肽，其在某些實施例中可為馬啉素多肽之功能性片段或可為實質上全長馬啉素多肽。在一些實施例中，馬啉素多肽在最N-末端之胺基酸位置缺少甲硫胺酸(例如，在SEQ ID NO：43之第一個胺基酸處缺少甲硫胺酸)。用於本發明嵌合多肽及方法中之適宜馬啉素多肽具有E3泛蛋白連接酶活性及/或與拉弗拉蛋白形成複合物之能力，如在活體外或活體內所評估。實例性功能性片段包含全長馬啉素多肽 (例如，SEQ ID NO：43)之至少100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、370、380、390或395個鄰接胺基酸殘基。在一些實施例中，功能性片段包含全長馬啉素多肽(例如，SEQ ID NO：43)之100-150、100-200、100-250、100-300、100-395、200-250、200-300、200-395、300-395、350-395或380-395、390-395個鄰接胺基酸。類似地，在某些實施例中，本發明涵蓋嵌合蛋白質，其中馬啉素部分係前述馬啉素多肽或生物活性片段中之任一者之變體。實例性變體具有與天然馬啉素多肽或其功能性片段之胺基酸序列至少90%、92%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致之胺基酸序列，且該等變體具有E3泛蛋白連接酶活性及/或與拉弗拉蛋白形成複合物之能力。本發明涵蓋嵌合多肽及該等多肽之用途，其中馬啉素部分包含本文所述馬啉素多肽、片段或變體中之任一者與本文所述任一內化性部分之組合。此外，在某些實施例中，前述嵌合多肽中之任一者之馬啉素部分在某些實施例中可為融合蛋白。包含馬啉素部分與內化性部分之任一組合，且視情況包括一或多個連接體、一或多個標識等之任何該等嵌合多肽可用於本發明之任一方法中。

V. α-澱粉酶多肽

在某些實施例中，本發明嵌合多肽(或用於本發明方法中之嵌合多肽)之非內化性部分多肽部分係α-澱粉酶多肽(例如，唾液或胰腺α-澱粉酶)。換言之，在某些實施例中，提供含有α-澱粉酶之嵌合多肽。用於本發明方法及組合物中之實例性α-澱粉酶多肽提供於本文中。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽可用於在患病細胞中清除過多肝醣。在一些實施例中，患病細胞係患有肝醣儲積症或肝醣代謝失調之個體之細胞。在一些實施例中，患病細胞來自患有龐貝氏病、安德森病、馮吉爾克病、拉弗拉病及/或福布斯-柯裡氏病之個體。在一些實施例中，患病細胞來自患有拉弗拉病及/或福布斯-柯裡氏病之個體。

在某些實施例中，本文中所提及之任一α-澱粉酶多肽可經γ-澱粉酶取代。在某些實施例中，γ-澱粉酶能催化自多糖鏈之非還原末端連續水解末端1,4-連接之α-D-葡萄糖殘基並釋放β-葡萄糖。在一些實施例中，當在肝醣分子中之序列中，下一鍵結係1,4鍵時，γ-澱粉酶亦能水解1,6-α-葡萄糖苷鍵。

在一些實施例中，α-澱粉酶係單體。在一些實施例中，α-澱粉酶係二聚體或三聚體。在一些實施例中，α-澱粉酶已發生突變，使得其不能多聚化(例如，α-澱粉酶已發生突變，使得其不能二聚化或三聚化)。在一些實施例中，α-澱粉酶已經抑制α-澱粉酶之多聚化(例如，二聚化或三聚化)之試劑處理。在一些實施例中，該試劑係小分子。

如本文所用，α-澱粉酶多肽包括野生型α-澱粉酶多肽之多種功能性片段及變體、融合蛋白及經修飾形式。在某些實施例中，α-澱粉酶或其片段或變體係唾液α-澱粉酶或其片段或變體。在某些實施例中，α-澱粉酶或其片段或變體係胰腺α-澱粉酶或其片段或變體。在某些實施例中，α-澱粉酶或其片段或變體係哺乳動物α-澱粉酶或其片段或變體。在具體實施例中，α-澱粉酶或其片段或變體係人類α-澱粉酶或其片段或變體。α-澱粉酶多肽之該等功能性片段或變體、融合蛋白及經修飾形式具有與天然α-澱粉酶多肽具有實質性序列一致性之胺基酸序列之至少一部分，且保留天然α-澱粉酶多肽之功能(例如，水解α-1,4-葡萄糖苷鍵之能力)。應注意，「保留功能」並非意指，具體片段之活性必須與天然蛋白質相同或實質上相同，但在一些實施例中如此。然而，為保留天然活性，該天然活性應為與其比較該活性之天然蛋白質之活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，且該比較係在相同或類似條件下進行。在一些實施例中，保留天然活性可包括多種情形，其中片段或變體相對於與其比較該活性之天然蛋白質具有改良之活性，例如至少 105%、至少110%、至少120%或至少125%，且該比較係在相同或類似條件下進行。

在某些實施例中，α-澱粉酶多肽之功能性片段、變體或融合蛋白包含與α-澱粉酶多肽或其片段至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致(例如，與SEQ ID NO：44或45至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致)之胺基酸序列。

在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽及方法中之α-澱粉酶多肽係全長或實質上全長α-澱粉酶多肽。在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽及方法中之α-澱粉酶多肽係具有α-1,4-葡萄糖苷鍵水解活性之功能性片段。

在某些實施例中，α-澱粉酶多肽之片段或變體可藉由篩選自編碼α-澱粉酶多肽之核酸之相應片段重組產生之多肽來獲得。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮天然α-澱粉酶多肽功能之片段或變體，例如藉由在活體內測試其治療拉弗拉病之能力及/或藉由在活體外(例如，在無細胞或基於細胞之分析中)確認該片段或變體具有α-1,4-葡萄糖苷鍵水解活性來測試。用於測試本文所揭示之α-澱粉酶多肽之活性之活體外分析之實例將係用或不用含有α-澱粉酶之嵌合多肽處理拉弗拉病細胞，然後在培育時期後，檢查葡聚糖含量。

在某些實施例中，本發明涵蓋出於諸如增強治療性或預防性效能或穩定性(例如，離體儲放壽命及在活體內對蛋白分解降解之抗性)等目的修飾α-澱粉酶多肽之結構。經修飾多肽可藉由(例如)胺基酸取代、缺失或添加來產生。例如，可合理地預期，例如，用異白胺酸或纈胺酸隔離置換白胺酸、用麩胺酸鹽隔離置換天冬胺酸鹽、用絲胺酸隔離置換蘇胺酸或用結構相關胺基酸類似地置換胺基酸(例如，保守突變)將不會對所得分子之α-澱粉酶生物學活性造成重大影響。保守置換係彼等在其側鏈相關之胺基酸家族內進行者。

本發明進一步涵蓋生成α-澱粉酶多肽之組合突變體以及截短突變體之集合，且尤其可用於鑑別功能變體序列。可生成組合衍生之變體，其相對於天然α-澱粉酶多肽具有選擇性功效。同樣，誘變可產生細胞內半衰期與相應野生型α-澱粉酶多肽顯著不同之變體。舉例而言，可使經改變蛋白質對蛋白分解降解或可導致α-澱粉酶破壞或以其他方式不活化之其他細胞過程更穩定或更不穩定。該等變體可用於藉由調節其半衰期來改變α-澱粉酶多肽含量。可藉由多種方式(例如)自簡併寡核苷酸序列生成潛在α-澱粉酶變體序列之庫。簡併基因序列之化學合成可在自動DNA合成器中實施，然後可將合成基因連接為適當基因以供表現。基因之簡併集合之目的係在一個混合物中提供編碼潛在多肽序列之期望集合之所有序列。簡併寡核苷酸之合成為業內所熟知(例如，參見Narang,SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人，(1981)Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，AG Walton編輯，Amsterdam：Elsevier，第273-289頁；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science198：1056；Ike等人，(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。該等技術已用於其他蛋白質之定向進化(例如，參見Scott等人，(1990)Science 249：386-390；Roberts等人，(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等人，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS USA 87：6378-6382；以及以下美國專利：第5,223,409號、第5,198,346號及第5,096,815號)。

或者，可利用其他形式之誘變來生成組合庫。舉例而言，α-澱粉酶多肽變體可藉由以下方式自庫生成並分離：使用(例如)丙胺酸掃描誘變等篩選(Ruf等人，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等人，(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等人，(1993)基因137：109-118；Grodberg等人，(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等人，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等人，(1991)Biochemistry 30：10832-10838；及Cunningham等人，(1989)Science 244：1081-1085)；連接體掃描誘變(Gustin等人，(1993)Virology 193：653-660；Brown等人，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等人，(1982)Science 232：316)；飽和誘變(Meyers等人，(1986)Science 232：613)；PCR誘變(Leung等人，(1989)Method Cell Mol Biol 1：11-19)；或隨機誘變，包括化學誘變等(Miller等人，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY；及Greener等人，(1994)Strategies in Mol Biol 7：32-34)。尤其在組合環境中之連接體掃描誘變係用於鑑別α-澱粉酶多肽之截短(生物活性)形式之有吸引力之方法。

眾多種用於篩選藉由點突變及截短製備之組合庫之基因產物及就此而言用於篩選cDNA庫中具有某一性質之基因產物之技術為業內已知。該等技術通常將可調整以供快速篩選藉由α-澱粉酶多肽之組合誘變生成之基因庫。用於篩選大型基因庫之最廣泛使用的技術通常包含將基因庫選殖至可複製表現載體中，用所得載體庫轉變適當細胞，及在其中檢測期望活性促進相對容易地分離編碼其產物經檢測之基因之載體之條件下表現組合基因。下文所述之每一說明性分析適用於如篩選大量藉由組合誘變技術產生之簡併序列所需之高通量分析。

在某些實施例中，α-澱粉酶多肽可包括肽模擬物。如本文所用術語「肽模擬物」包括經化學修飾之肽及含有非天然胺基酸、類肽及諸如此類之肽樣分子。肽模擬物提供多種優於肽之優點，包括投與個體時增強之穩定性。用於鑑別肽模擬物之方法為業內所熟知且包括篩選含有潛在肽模擬物庫之資料庫。舉例而言，劍橋結構資料庫含有大於 300,000種具有已知晶體結構之化合物之保藏(Allen等人，Acta Crystallogr.章節B，35：2331(1979))。其中不可獲得靶分子之晶體結構，結構可使用例如程式CONCORD來生成(Rusinko等人，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29：251(1989))。另一資料庫可用化學物質目錄(Molecular Design Limited,Informations Systems；San Leandro Calif.)含有約100,000種市售化合物且亦可搜索以鑑別α-澱粉酶多肽之潛在肽模擬物。

在某些實施例中，α-澱粉酶多肽可進一步包含轉譯後修飾。實例性轉譯後蛋白質修飾包括磷酸化、乙醯化、甲基化、ADP-核糖基化、泛蛋白化、糖基化、羰基化、sumo蛋白修飾、生物素化或添加多肽側鏈或疏水基團。因此，經修飾α-澱粉酶多肽可含有非胺基酸要素，例如脂質、多糖或單糖以及磷酸酯。可針對α-澱粉酶多肽之生物學活性(例如α-1,4-葡萄糖苷鍵水解活性及/或其治療拉弗拉病之能力)測試該等非胺基酸要素對其功能性之效應。在某些實施例中，α-澱粉酶多肽可進一步包含一或多個增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與及/或純化中之一或多者之多肽部分。在其他實施例中，內化性部分包含抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，α-澱粉酶多肽未經N-糖基化或缺少一或多個存於野生型α-澱粉酶多肽中之N-糖基化基團。舉例而言，用於本發明中之α-澱粉酶多肽可相對於天然α-澱粉酶缺少所有N-糖基化位點，或用於本發明中之α-澱粉酶多肽可相對於天然α-澱粉酶糖基化不足。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽包含不能在一或多個N-糖基化位點進行N-糖基化之經修飾胺基酸序列。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽中之至少一個預測N-糖基化位點(即，由胺基酸序列Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr表示之共有序列)之天冬醯胺(Asn)經另一胺基酸取代。本發明涵蓋，可組合前述實例中之任何一或多者，使得本發明之α-澱粉酶多肽缺少一或多個N-糖基化位點，且因此未經糖基化或相對於天然α-澱粉酶糖基化不足。

在一些實施例中，α-澱粉酶多肽未經O-糖基化或缺少一或多個存於野生型α-澱粉酶多肽中之O-糖基化基團。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽包含不能在一或多個O-糖基化位點進行O-糖基化之經修飾胺基酸序列。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽序列中之任何一或多個預測O-糖基化位點處之絲胺酸或蘇胺酸經取代或缺失。本發明涵蓋，可組合前述實例中之任何一或多者，使得本發明之α-澱粉酶多肽缺少一或多個N-糖基化及/或O-糖基化位點，且因此未經糖基化或相對於天然α-澱粉酶糖基化不足。

在本發明之一個特定實施例中，α-澱粉酶多肽可經非蛋白質性聚合物修飾。在一個特定實施例中，該聚合物係聚乙二醇(「PEG」)、聚丙二醇或聚氧化烯，如美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所述。PEG係熟知的水溶性聚合物，其可自市場購得或可根據業內熟知之方法藉由乙二醇之開環聚合來製備(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。

術語「生物學活性」、「生物活性」或「功能性」意指α-澱粉酶多肽實施與野生型α-澱粉酶多肽相關之功能之能力，例如α-1,4-葡萄糖苷鍵水解活性。術語「生物學活性」、「生物活性」及「功能性」在本文中可互換使用。如本文所用「片段」應理解為包括展現如本文所述之「生物活性」之生物活性片段(亦稱為功能性片段)或生物活性變體。亦即，α-澱粉酶之生物活性片段或變體展現可量測並測試之生物活性。舉例而言，生物活性片段/功能性片段或變體展現與天然(即，野生型或正常)α-澱粉酶多肽相同或實質上相同的生物活性，且該生物活性可藉由該片段或變體之諸如以下等能力來評價：水解碳水化合物中之α-1,4-葡萄糖苷鍵。如本文所用「實質上相同」係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少70%。在某些實施例中，「實質上相同」亦係指任何參數(例如，活性)係針對其量測該參數之對照的至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%、100%、102%、105%或110%。在某些實施例中，當在相同或實質上相同的條件下評價時，α-澱粉酶多肽之片段或變體將較佳保留與天然α-澱粉酶多肽相關之α-澱粉酶生物學活性之至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。

在某些實施例中，α-澱粉酶多肽之片段或變體之半衰期(t_1/2)相對於天然蛋白質之半衰期有所延長。較佳地，α-澱粉酶片段或變體之半衰期相對於天然α-澱粉酶多肽之半衰期延長至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%或甚至1000%。在一些實施例中，蛋白質半衰期係在活體外測定，例如在緩衝鹽水溶液中或在血清中測定。在其他實施例中，蛋白質半衰期係活體內半衰期，例如蛋白質在動物血清或其他體液中之半衰期。另外，片段或變體可使用業內已知之技術(例如習用Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法)化學合成。片段或變體可經產生(以重組方式或藉由化學合成)並測試以鑑別彼等可發揮與天然α-澱粉酶多肽等效或實質上類似之功能之片段或變體。

關於增加細胞中α-澱粉酶生物活性之方法，本發明涵蓋前述態樣及實施例中任一者之所有組合，以及與詳細說明及實例中所述實施例中任一者之組合。基於投與嵌合多肽或使細胞與嵌合多肽接觸之所述方法可在活體外(例如，在細胞或培養物中)或活體內(例如，在患者或動物模型中)實施。在某些實施例中，該方法係活體外方法。在某些實施例中，該方法係活體內方法。

在某些態樣中，α-澱粉酶多肽可為融合蛋白，其進一步包含一或多個融合結構域。該等融合結構域之熟知實例包括(但不限於)聚組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G及免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、麥芽糖結合蛋白(MBP)，其尤其可用於藉由親和層析分離融合蛋白。出於親和純化之目的，使用用於親和層析之相關基質，例如麩胱甘肽-、澱粉酶-及鎳-或鈷-偶聯之樹脂。融合結構域亦包括「表位標識」，其通常係可獲得針對其之特異性抗體之短肽序列。易於獲得針對其之特異性單株抗體之熟知的表位標識包括FLAG、流行性感冒病毒血球凝集素(HA)、His及c-myc標識。實例性His標識具有序列HHHHHH(SEQ ID NO：7)，且實例性c-myc標識具有序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO：8)。在一些情形中，融合結構域具有例如用於因子Xa或凝血酶之蛋白酶裂解位點，其容許相關蛋白酶部分消化融合蛋白並由此自其釋放重組蛋白質。然後可藉由後續層析分離使所釋放蛋白質與融合結構域分離。在某些實施例中，α-澱粉酶多肽可含有一或多個能穩定該等多肽之修飾。舉例而言，該等修飾延長多肽之活體外半衰期，延長多肽之循環半衰期或降低多肽之蛋白分解降解。

在前述任一者之某些實施例中，本發明嵌合多肽之α-澱粉酶部分包含α-澱粉酶多肽，其在某些實施例中可為α-澱粉酶多肽之功能性片段或可為實質上全長α-澱粉酶多肽。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽在最N-末端之胺基酸位置缺少甲硫胺酸(例如，在SEQ ID NO：44或45中之任一者之第一個胺基酸處缺少甲硫胺酸)。用於本發明嵌合多肽及方法中之適宜α-澱粉酶多肽具有α-1,4-葡萄糖苷鍵水解活性，如在活體外或活體內所評估。實例性功能性片段包含全長α-澱粉酶多肽 (例如，SEQ ID NO：44或45)之至少100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或511個鄰接胺基酸殘基。在一些實施例中，功能性片段包含全長α-澱粉酶多肽(例如，SEQ ID NO：44或45)之100-150、100-200、100-250、100-300、100-400、100-500、100-511、200-500、300-500、400-500、450-500、475-500或500-511個鄰接胺基酸。類似地，在某些實施例中，本發明涵蓋嵌合蛋白質，其中α-澱粉酶部分係前述α-澱粉酶多肽或生物活性片段中之任一者之變體。實例性變體具有與天然α-澱粉酶多肽或其功能性片段之胺基酸序列至少90%、92%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致之胺基酸序列，且該等變體保留α-澱粉酶變體之α-1,4-葡萄糖苷鍵水解活性。本發明涵蓋嵌合多肽及該等多肽之用途，其中α-澱粉酶部分包含本文所述α-澱粉酶多肽、片段或變體中之任一者與本文所述任一內化性部分之組合。此外，在某些實施例中，前述嵌合多肽中之任一者之α-澱粉酶部分在某些實施例中可為融合蛋白。包含α-澱粉酶部分與內化性部分之任一組合，且視情況包括一或多個連接體、一或多個標識等之任何該等嵌合多肽可用於本發明之任一方法中。

VI. 內化性部分

用於本文所揭示之方法中之嵌合多肽包含內化性部分。如本文所用術語「內化性部分」係指能與靶組織或細胞類型相互作用以實現將所附接分子遞送至細胞中(即，穿透期望細胞；跨過細胞膜運輸；跨過細胞膜遞送至至少細胞質)之部分。較佳地，本發明係關於促進遞送至(例如)肌肉細胞及肝細胞之內化性部分。具有有限交叉反應性之內化性部分一般較佳。在某些實施例中，本發明係關於選擇性地但並不一定排他地靶向並穿透肌肉細胞之內化性部分。在某些實施例中，內化性部分具有有限交叉反應性，且因此優先靶向具體細胞或組織類型。然而，應理解，本發明之內化性部分並非排他性地靶向特定細胞類型。相反，內化性部分促進優先於其他細胞類型遞送至一或多種具體細胞類型，且由此提供並非普遍存在之遞送。在某些實施例中，適宜內化性部分包括(例如)抗體、單株抗體或其衍生物或類似物。其他內化性部分包括(例如)歸向肽、融合蛋白、受體、配體、適配體、肽模擬物及特定結合對之任一成員。在某些實施例中，內化性部分介導經由ENT2運輸蛋白跨過細胞膜運送。在一些實施例中，內化性部分幫助嵌合多肽有效且高效地穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分經由平衡核苷(ENT)運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分經由ENT1、ENT2、ENT3或ENT4運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)及/或ENT3運輸蛋白穿過或可穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分促進遞送至肌肉細胞(例如，骨骼肌或心肌)中。在其他實施例中，內化性部分促進遞送至除了肌肉細胞以外之細胞中，例如神經元、上皮細胞、肝細胞(例如，肝細胞)、腎細胞或萊迪希氏細胞(Leydig cell)。對於前述中之任一者，在某些實施例中，內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞質中。

在某些實施例中，內化性部分係結合DNA之抗體或抗體片段。換言之，在某些實施例中，抗體或抗體片段(例如，包含抗原結合片段之抗體片段)結合DNA。在某些實施例中，DNA結合能力係針對雙鏈DNA受質來量測。在某些實施例中，內化性部分係結合DNA並可經由ENT2穿過細胞膜之抗體或抗體片段。

在某些實施例中，內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞質中。不受限於理論，不管嵌合多肽之非內化性部分多肽部分是否包含GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL或由其組成，其與內化性部分之結合促進將嵌合多肽、且因此非內化性部分遞送至細胞質，且視情況遞送至溶酶體及/或自噬液泡中。在某些實施例中，內化性部分將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL活性遞送至細胞中。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有GAA之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含GAA多肽或由其組成)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有AGL之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含AGL多肽或由其組成)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有拉弗拉蛋白之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含拉弗拉蛋白多肽或由其組成)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有馬啉素之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含馬啉素多肽或由其組成)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有α-澱粉酶之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含α-澱粉酶多肽或由其組成)。本文所述之任一內化性部分可與如本文所述之任一非內化性部分多肽部分組合，以生成本發明嵌合多肽。

在某些實施例中，內化性部分能結合多核苷酸。在某些實施例中，內化性部分能結合DNA。在某些實施例中，內化性部分係能結合DNA之抗體。在某些實施例中，內化性部分能以小於1μM之K_D結合DNA。在某些實施例中，內化性部分能以小於100nM、小於75nM、小於50nM或甚至小於30nM之K_D結合DNA。K_D可使用表面電漿共振(SPR)或石英晶體微量天平(QCM)根據當前標準方法來量測。舉例而言，已知3E10抗體或抗體片段以小於100nM之K_D結合DNA，該3E10抗體或抗體片段包括包含具有SEQ ID NO：9中所述胺基酸序列之VH及具有SEQ ID NO：10中所述胺基酸序列之VL之抗體或抗體片段。因此，在某些實施例中，用於本發明嵌合多肽中之內化性部分係可穿過細胞膜進入細胞質中並結合至DNA之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)。此亦係抗DNA抗體之實例。在某些實施例中，用於本文中之內化性部分係抗DNA抗體或其抗原結合片段。

事實上，包含前述VH及VL之全長抗體以甚至更低之K_D結合雙鏈鈍頭DNA受質，如藉由ELISA所評估。在某些實施例中，內化性部分結合雙鏈鈍頭DNA，且DNA結合活性係或可藉由(例如)ELISA、QCM或Biacore在使用鈍頭DNA之結合分析中顯示(例如，參見Xu等人(2009)EMBO Journal 28：568-577；Hansen等人，(2012)Sci Translation Med 4：DOI 10.1126/scitranslmed.3004385)。在某些實施例中，抗體或抗體片段(例如包含抗原結合片段之抗體片段)之前述K_D係針對雙鏈鈍頭DNA受質、例如Xu等人中所述之DNA受質(例如，包含兩股之DNA，其中一股由以下序列組成：5’-GGG TGA ACC TGC AGG TGG GCA AAG ATG TCC-3’)來評估。在某些實施例中，內化性部分係抗DNA抗體。在某些實施例中，內化性部分係Fab、Fab’或全長抗體。應認識到，3E10及其他抗DNA抗體可能能以高親和性結合多種DNA受質，如已顯示。

在一些實施例中，內化性部分將GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽靶向肌肉細胞，且介導將多肽跨過細胞膜運送至肌肉細胞之細胞質中。在一些實施例中，內化性部分將GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽靶向肝或神經元細胞，且介導將多肽跨過細胞膜運送至肝或神經元細胞之細胞質中。

如本文所用術語「內化性部分」係指能與靶組織或細胞類型相互作用之部分。較佳地，本發明係關於促進遞送至(例如)肌肉細胞及肝細胞中之內化性部分。具有有限交叉反應性之內化性部分一般較佳。然而，應理解，本發明之內化性部分並非排他性地靶向特定細胞類型。相反，內化性部分在某些實施例中一般促進優先於其他細胞類型遞送至一或多種具體細胞類型，且由此提供並非普遍存在之遞送。在某些實施例中，適宜內化性部分包括(例如)抗體、單株抗體或其衍生物或類似物；且其他內化性部分包括(例如)歸向肽、融合蛋白、受體、配體、適配體、肽模擬物及特定結合對之任一成員。在一些實施例中，內化性部分幫助嵌合多肽有效且高效地穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分經由平衡核苷(ENT)運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分經由ENT1、ENT2、ENT3或ENT4運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)及/或ENT3運輸蛋白穿過或可穿過細胞膜。在一些實施例中，內化性部分促進遞送至肌肉細胞(例如，骨骼肌或心肌)中。在其他實施例中，內化性部分促進遞送至除了肌肉細胞以外之細胞中，例如神經元、上皮細胞、肝細胞、腎細胞或萊迪希氏細胞。在某些實施例中，內化性部分促進遞送至至少肌肉細胞及肝細胞中。

(a)抗體

在某些態樣中，內化性部分可包含抗體，包括單株抗體、多株抗體及人類化抗體。不受限於理論，該抗體可結合至靶組織之抗原，且由此介導將標的嵌合多肽遞送至靶組織(例如，肌肉、神經元及/或肝細胞)中。在一些實施例中，內化性部分可包含抗體片段、其衍生物或類似物，包括(但不限於)：包含抗原結合片段(例如，Fv片段、單鏈Fv(scFv)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)之抗體片段、單一結構域抗體、駱駝化抗體及抗體片段、人類化抗體及抗體片段、人類抗體及抗體片段及前述之多價形式；多價內化性部分，包括(但不限於)：Fv片段、單鏈Fv(scFv)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、單一結構域抗體、駱駝化抗體及抗體片段、人類化抗體及抗體片段、人類抗體及抗體片段及前述之多價形式；多價內化性部分，包括(但不限於)：單特異性或雙特異性抗體，例如二硫鍵穩定之Fv片段、scFv串聯物((scFv)₂片段)、雙價抗體、三價抗體或四價抗體，其通常係共價連接或以其他方式穩定(即，白胺酸拉鍊或螺旋穩定)之scFv片段；與期望靶分子天然相互作用之受體分子。在一些實施例中，抗體或其變體可為嵌合的，例如其可包括來自鼠類3E10抗體之可變重鏈或輕鏈區域，但可包括來自另一物種(例如，人類)之抗體之恆定區。在一些實施例中，抗體或其變體可包含係若干種不同抗體亞類恆定結構域之雜合體(例如，來自任一物種或物種組合之IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgG4之任一組合)之恆定區。在一些實施例中，抗體或其變體(例如，嵌合多肽之內化性部分)包含以下恆定結構域方案：IgG2a CH1-IgG1鉸鏈-IgG1 CH2-CH3，例如前述中之任一者可為人類IgG或鼠類IgG。亦涵蓋其他適宜組合。在其他實施例中，抗體包含全長抗體，且CH1、鉸鏈、CH2及CH3來自相同恆定結構域亞類(例如，IgG1)。在一些實施例中，抗體或其變體係抗體片段(例如，內化性部分係包含抗原結合片段之抗體片段；例如，內化性部分係抗原結合片段)，其包含免疫球蛋白之恆定結構域之一部分，例如以下恆定結構域方案：IgG2a CH1-IgG1上鉸鏈。在一些實施例中，抗體或其變體包含κ恆定結構域(例如，SEQ ID NO：34)。在抗體及抗原結合片段之範圍內包括重鏈恆定結構域(用於全長抗體或用於抗體片段(例如，抗原結合片段)，該抗體片段相對於天然IgG結構域包含胺基酸取代以降低效應物功能及/或促進產生)。舉例而言，重鏈中相對於天然鼠類或人類免疫球蛋白恆定區之1、2、3或4個胺基酸取代，例如在重鏈恆定區之鉸鏈或CH2結構域中。

在某些實施例中，內化性部分包含抗體，且重鏈包含VH區域及包含CH1、鉸鏈、CH2及CH3結構域之恆定結構域。在某些實施例中，重鏈包含VH區域及包含CH1結構域及視情況上鉸鏈之恆定結構域。上鉸鏈可包括(例如)鉸鏈區之1、2、3或4個胺基酸殘基。在某些實施例中，上鉸鏈不包括半胱胺酸殘基。在某些實施例中，上鉸鏈在存於天然鉸鏈序列中之半胱胺酸之N-末端包括一或多個鄰接殘基。在某些實施例中，重鏈包含CH區域及包含CH1結構域及鉸鏈之恆定結構域。在某些實施例中，鉸鏈(係作為全長抗體之一部分或抗體片段存在)在對應於Kabat位置222之位置包含C至S取代(例如，鉸鏈中之C222S，其中該變異位於對應於Kabat位置222之位置)。換言之，在某些實施例中，內化性部分在鉸鏈結構域中對應於Kabat 222之位置包含絲胺酸殘基而非半胱胺酸殘基。在某些實施例中，重鏈包含含有CH1、鉸鏈、CH2及視情況CH3結構域之恆定結構域。在某些實施例中，CH2結構域在對應於Kabat位置297之位置包含N至Q取代(例如，CH2結構域中之N297Q，其中該變異位於對應於Kabat位置297之位置)。換言之，在某些實施例中，內化性部分在對應於Kabat位置297之位置包含麩醯胺酸而非天冬醯胺。

在一些實施例中，內化性部分包含免疫球蛋白Fc區域之全部或一部分。換言之，除了抗原結合部分外，在某些實施例中，內化性部分包含免疫球蛋白之重鏈恆定區之全部或一部分(例如，重鏈恆定區之一個或兩個多肽鏈)。眾所周知，每一免疫球蛋白重鏈恆定區包含4或5個結構域。該等結構域係如下依序命名：CH1-鉸鏈-CH2-CH3(-CH4)。重鏈結構域之DNA序列在免疫球蛋白種類之間具有交叉同源性，例如IgG之CH2結構域與IgA及IgD之CH2結構域同源，且與IgM及IgE之CH3結構域同源。如本文所用術語「免疫球蛋白Fc區域」理解為意指免疫球蛋白鏈恆定區、較佳免疫球蛋白重鏈恆定區或其部分之羧基末端部分。舉例而言，免疫球蛋白Fc區域可包含1)CH1結構域、CH2結構域及CH3結構域，2)CH1結構域及CH2結構域，3)CH1結構域及CH3結構域，4)CH2結構域及CH3結構域，或5)兩個或更多個結構域與免疫球蛋白鉸鏈區或鉸鏈之一部分(例如，上鉸鏈)之組合。在某些實施例中，內化性部分進一步包含輕鏈恆定區(CL)。

在一個實施例中，自其獲得重鏈恆定區之免疫球蛋白之種類係IgG(Igγ)(γ亞類1、2、3或4)。可使用其他種類之免疫球蛋白，IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)及IgM(Igμ)。業內認為熟習此項技術者可熟練地自某些免疫球蛋白種類及亞類選擇具體免疫球蛋白重鏈恆定區序列以達成具體結果。編碼免疫球蛋白Fc區域之DNA構築體之一部分較佳包含鉸鏈結構域之至少一部分，且較佳包含Fc γ之CH₃結構域或IgA、IgD、IgE或IgM中之任一者之同源結構域之至少一部分。此外，預期免疫球蛋白重鏈恆定區內胺基酸之取代或缺失可用於實踐本發明。一個實例將係在上CH2區域中引入胺基酸取代以產生具有降低之對Fc受體之親和性之Fc變體(Cole等人(1997)J.IMMUNOL.159：3613)。熟習此項技術者可使用熟知的分子生物學技術製備該等構築體。

在某些實施例中，抗體或其變體可經修飾以使其在投與個體時免疫原性較低。舉例而言，若個體係人類，則抗體可經「人類化」；其中已將源自融合瘤之抗體之互補決定區移植至人類單株抗體中，例如如Jones,P.等人(1986),Nature,321,522-525或Tempest等人(1991),Biotechnology,9,266-273中所述。術語人類化及經人類化在涉及抗體時為業內所充分理解。在一些實施例中，內化性部分係任一肽或抗體樣蛋白質，其具有3E10抗體序列或與3E10結合相同表位(例如，相同靶，例如DNA)之抗體之互補決定區(CDR)。同樣，轉基因小鼠或其他哺乳動物可用於表現人類化或人類抗體。該人類化可為部分或完全人類化。

在某些實施例中，內化性部分包含單株抗體3E10或其抗原結合片段。在其他實施例中，內化性部分包含抗體或其抗原結合片段，例如本文所述抗原結合片段中之任一者。舉例而言，抗體或其抗原結合片段可為單株抗體3E10或其保留細胞穿透活性之變體或3E10或該 3E10變體之抗原結合片段。另外，抗體或其抗原結合片段可為與3E10結合至相同表位(例如，靶，例如DNA)之抗體，或具有與3E10實質上相同之細胞穿透活性之抗體，或其抗原結合片段。該等係可經由ENT2穿過細胞之實例。在某些實施例中，內化性部分能結合多核苷酸。在某些實施例中，內化性部分能結合DNA，例如雙鏈鈍頭DNA。在某些實施例中，內化性部分能以小於100nM之K_D結合DNA。在某些實施例中，內化性部分能以小於100nM、小於75nM、小於50nM或甚至小於30nM之K_D結合DNA。K_D係使用SPR或QCM或ELISA根據製造商說明書及當前實踐來測定。在某些實施例中，關於結合至雙鏈鈍頭DNA之K_D係使用以下DNA作為受質來評估：係針對雙鏈鈍頭DNA受質、例如Xu等人中所述之DNA受質(例如，包含兩股之DNA，其中一股由以下序列組成：5’-GGG TGA ACC TGC AGG TGG GCA AAG ATG TCC-3’)來評估。在某些實施例中，內化性部分係抗DNA抗體或抗原結合片段。

在某些實施例中，抗原結合片段係Fv或其scFv片段。單株抗體3E10可藉由以ATCC登錄號PTA-2439永久保存於美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC)之融合瘤3E10產生且揭示於美國專利第7,189,396號中。已顯示此抗體可結合DNA。另外或或者，3E10抗體可藉由在宿主細胞中表現編碼3E10抗體之重鏈及輕鏈之核苷酸序列來產生。術語「3E10抗體」或「單株抗體3E10」用於指抗體，不管用於產生該抗體之方法如何。類似地，在提及3E10之變體或抗原結合片段時，該等術語之使用不涉及產生該抗體之方式。就此而言，3E10一般並非由融合瘤產生，而係重組產生。因此，在本申請案之情況下，除非另外規定，否則3E10抗體將係指具有融合瘤序列或包含含有SEQ ID NO：9中所述胺基酸序列(其相對於由ATCC保存之3E10抗體具有一個胺基酸取代，如本文所述)之可變重鏈結構域及含有SEQ ID NO：10中所述胺基酸序列之可變輕鏈結構域之抗體及其抗體片段。

內化性部分亦可包含mAb 3E10之變體，例如3E10之保留與mAb 3E10相同之細胞滲透特徵之變體，以及藉由突變修飾以改良其實用性(例如，改良之靶向特定細胞類型之能力、改良之穿透細胞膜之能力、改良之定位於細胞DNA之能力、便捷的偶聯位點及諸如此類)之變體。該等變體包括其中將一或多個保守取代引入抗體重鏈、輕鏈及/或恆定區中之變體。該等變體包括3E10或3E10變體之人類化形式。在一些實施例中，輕鏈或重鏈可在N-末端或C-末端經修飾。類似地，變體之前述說明適用於抗原結合片段。該等抗體、變體或片段中之任一者可係藉由在宿主細胞中表現核苷酸序列來重組製備。

已顯示單株抗體3E10可穿透細胞以將蛋白質及核酸遞送至靶組織之細胞質或核空間中(Weisbart RH等人，J Autoimmun.1998年10月；11(5)：539-46；Weisbart RH等人Mol Immunol.2003年3月；39(13)：783-9；Zack DJ等人，J Immunol.1996年9月1日；157(5)：2082-8.)。此外，3E10之VH及Vk序列與人類抗體高度同源，且各別人類性z-評分為0.943及-0.880。因此，預期Fv3E10可誘導小於多種其他已批准人類化抗體之抗抗體反應(Abhinandan KR等人，Mol.Biol.2007 369,852-862)。3E10之單鏈Fv片段具有初始單株抗體之全部細胞穿透能力，且諸如過氧化氫酶、肌肉萎縮蛋白、HSP70及p53等蛋白質在偶聯至Fv3E10後保留其活性(Hansen JE等人，Brain Res.2006年5月9日；1088(1)：187-96；Weisbart RH等人，Cancer Lett.2003年6月10日；195(2)：211-9；Weisbart RH等人，J Drug Target.2005年2月；13(2)：81-7；Weisbart RH等人，J Immunol.2000年6月1日；164(11)：6020-6；Hansen JE等人，J Biol Chem.2007年7月20日；282(29)：20790-3)。3E10係在存於所有哺乳動物中之抗體支架上構建；小鼠可變重鏈及可變κ輕鏈。3E10可經由尤其在骨骼肌及癌細胞中富集之ENT2核苷酸運輸蛋白得以進入細胞，且活體外研究已顯示3E10無毒性。(Weisbart RH等人，Mol Immunol.2003年3月；39(13)：783-9；Pennycooke M等人，Biochem Biophys Res Commun.2001年1月26日；280(3)：951-9)。3E10可能亦能經由ENT3穿過膜。

內化性部分亦可包括mAb 3E10之突變體，例如3E10之保留與mAb 3E10相同或實質上相同的細胞滲透特徵之變體，以及藉由突變修飾以改良其實用性(例如，改良之靶向特定細胞類型之能力、改良之穿透細胞膜之能力、改良之定位至細胞DNA之能力、改良之結合親和性及諸如此類)之變體。該等突變體包括其中將一或多個保守取代引入抗體重鏈、輕鏈及/或恆定區中之變體。在例如美國專利7,189,396及WO 2008/091911中已表徵mAb 3E10之多個變體，其教示內容係全文以引用方式併入本文中。

在某些實施例中，內化性部分包含抗體或抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO：9至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列之VH結構域及/或含有與SEQ ID NO：10至少85%、90%、95%、96%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列之VL結構域，或其人類化變體。在一些實施例中，內化性部分包含本文所述輕鏈可變結構域及具有與SEQ ID NO：34至少85%、90%、95%、96%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列之κ恆定結構域(CL)中之任一者。在一些實施例中，內化性部分包含與SEQ ID NO：35至少85%、90%、95%、96%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，內化性部分包含與SEQ ID NO：37至少85%、90%、95%、96%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列。應理解，在包括信號序列以供表現抗體或抗體片段時，該信號序列一般經裂解且並不存在於已完成的嵌合多肽中(例如，信號序列一般經裂解且在蛋白質產生期間僅短暫存在)。在某些實施例中，該等內化性部分可經由ENT2穿過細胞及/或結合DNA。

在某些實施例中，內化性部分能結合多核苷酸。在某些實施例中，內化性部分能結合(特異性結合)DNA。在某些實施例中，內化性部分能以小於100nM之K_D結合DNA。在某些實施例中，內化性部分能以小於50nM之K_D結合DNA。在某些實施例中，內化性部分係抗DNA抗體，例如結合雙鏈鈍頭DNA之抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，內化性部分係抗DNA抗體或抗原結合片段(其)，其中K_D係針對例如本文所提供之雙鏈DNA受質來評估。

在某些實施例中，內化性部分係抗原結合片段，例如包含SEQ ID NO：9及10之3E10之單鏈Fv(scFv)。在某些實施例中，內化性部分包含3E10之單鏈Fv(或另一抗原結合片段)，且V_H結構域之胺基酸序列與SEQ ID NO：9至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致，且V_L結構域之胺基酸序列與SEQ ID NO：10至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。變體3E10或其片段保留內化性部分之功能。在內化性部分係scFv時，VH及VL結構域通常經由連接體、例如gly/ser連接體來連接。VH結構域可位於VL結構域之N-末端或反之亦然。

在某些實施例中，內化性部分係抗原結合片段，例如包含VH及VL之Fab。在某些實施例中，內化性部分係Fab(或另一抗原結合片段，例如Fab’)，且V_H結構域之胺基酸序列與SEQ ID NO：9至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在某些實施例中，內化性部分係Fab(或另一抗原結合片段，例如Fab’)，且V_L結構域之胺基酸序列與SEQ ID NO：10至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。類似地涵蓋本文所述之本發明VH及VL結構域或其組合。在某些實施例中，在內化性部分係Fab時，重鏈包含CH1結構域及免疫球蛋白恆定區之上鉸鏈。在某些實施例中，上鉸鏈相對於天然免疫球蛋白恆定區包含取代，例如以降低效應物功能及/或消除半胱胺酸(例如，C至S)。在某些實施例中，上鉸鏈不包括半胱胺酸。

在某些實施例中，抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)之恆定結構域包含人類Fc結構域之全部或一部分。在某些實施例中，內化性部分係全長抗體，且抗體之恆定結構域包含CH1、鉸鏈、CH2及CH3結構域。在某些實施例中，恆定結構域相對於天然免疫球蛋白包含一或多個降低效應物功能之取代。視情況，在某些實施例中，此一恆定結構域可在重鏈恆定結構域中，例如在鉸鏈及/或CH2結構域中包括一或多個(例如，1個取代、2個取代、3個取代)取代，例如以降低效應物功能。該等取代為業內已知。

在某些實施例中，內化性部分係抗原結合片段-包含抗原結合片段之抗體片段。適宜的該等抗體片段，例如scFv、Fab、Fab’及諸如此類闡述於本文中。在某些實施例中，內化性部分係抗原結合片段或全長抗體。在某些實施例中，內化性部分包含含有恆定區(CL)之輕鏈。在某些實施例中，內化性部分包含含有恆定區之重鏈，其中該恆定區包含CH1結構域。在某些實施例中，內化性部分包含含有恆定區之重鏈及含有恆定區之輕鏈，其中該重鏈恆定區包含CH1結構域。視情況，內化性部分可進一步包含含有鉸鏈之全部或一部分(例如，上鉸鏈或多於上鉸鏈)之重鏈恆定區。視情況，內化性部分可進一步包含含有CH2及/或CH3結構域之重鏈。

在一些實施例中，內化性部分包含3E10抗體之一或多個CDR。在某些實施例中，內化性部分包含3E10抗體之一或多個CDR，其包含與SEQ ID NO：9一致之V_H結構域之胺基酸序列及與SEQ ID NO：10一致之V_L結構域之胺基酸序列。3E10抗體之CDR可使用業內可得之任一CDR鑑別方案來測定。舉例而言，在一些實施例中，3E10抗體之 CDR係根據Kabat定義來定義，如Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中所述。在其他實施例中，3E10抗體之CDR係根據以下文獻來定義：Chothia等人，1987,J Mol Biol.196：901-917及Chothia等人，1989,Nature.342：877-883。在其他實施例中，3E10抗體之CDR係根據國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)來定義，如LeFranc等人，2003,Development and Comparative Immunology,27：55-77中所述。在其他實施例中，3E10抗體之CDR係根據Honegger A、Pluckthun A.,2001,J Mol Biol.,309：657-670來定義。在一些實施例中，3E10抗體之CDR係根據Kunik等人，2012,PLoS Comput Biol.8(2)：e1002388中論述之任一CDR鑑別方案來定義。出於根據業內已知之任一CDR鑑別方案鑑別CDR之目的，為了將3E10抗體之殘基編號，可在抗體序列之多個同源性區域比對3E10抗體與業內已知用於所選CDR鑑別方案之「標準」編號序列。框架殘基之最大比對通常需要在編號系統中插入「間隔體」殘基，以用於Fv區域。另外，在任一給定位點編號之某些個別殘基之身份可因種間或等位基因趨異而隨抗體鏈而變。

在某些實施例中，如使用Kabat CDR鑑別方案所測定，內化性部分包含3E10之至少1、2、3、4或5個CDR(例如，SEQ ID NO：13-18中所述之CDR；內化性部分係抗體或其抗原結合片段，其包含含有分別如SEQ ID NO：13、14及15中所述之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈及含有分別如SEQ ID NO：16、17及18中所述之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈；例如，且內化性部分中之該等CDR係如使用Kabat方案所測定)。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO：46中所述之VH CDR2及/或如SEQ ID NO：48中所述之VL CDR2及/或如SEQ ID NO：47中所述之VL CDR1。

在某些實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段包含可變重鏈結構域，其包含一個或至少一個不同於SEQ ID NO：9中所述之相應CDR之CDR，如使用Kabat CDR鑑別方案所測定。在一些實施例中，一個或至少一個不同CDR係如SEQ ID NO：46中所述之V_H CDR2。

在某些實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段包含可變輕鏈結構域，其包含一個或至少一個不同於SEQ ID NO：10中所述之相應CDR之CDR，如使用Kabat CDR鑑別方案所測定。在一些實施例中，一個或至少一個不同CDR係如SEQ ID NO：47中所述之V_L CDR1。在一些實施例中，一個或至少一個不同CDR係如SEQ ID NO：48中所述之V_L CDR2。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO：46中所述之VH CDR2及/或如SEQ ID NO：48中所述之VL CDR2及/或如SEQ ID NO：47中所述之VL CDR1。

在其他實施例中，如使用IMGT鑑別方案所測定，內化性部分包含3E10之至少1、2、3、4或5個CDR(例如，SEQ ID NO：24-29中所述之CDR；內化性部分係抗體或其抗原結合片段，其包含含有分別如SEQ ID NO：24、25及26中所述之CDR1、CDR2及CDR3之重鏈，及含有分別如SEQ ID NO：27、28及29中所述之CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈；例如，且內化性部分中之該等CDR係如使用IMGT鑑別方案所測定)。在某些實施例中，如使用Kabat CDR鑑別方案所測定，內化性部分包含3E10之所有6個CDR(例如，包含SEQ ID NO 13-18)。在其他實施例中，如使用IMGT鑑別方案所測定，內化性部分包含3E10之所有6個CDR(例如，其係如SEQ ID NO：24-29所述)。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其具有SEQ ID NO 13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列； VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列；該等CDR符合Kabat。

在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其具有SEQ ID NO 24之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列； VL CDR2，其具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列；該等CDR符合IMGT系統。

對於前述中之任一者，在某些實施例中，內化性部分係與3E10結合相同表位(例如，相同靶，例如DNA)之抗體及/或內化性部分與3E10競爭結合至抗原。實例性內化性部分可靶向並經由ENT2穿過細胞。實例性內化性部分包含結合DNA、例如雙鏈鈍頭DNA之抗體或抗原結合片段。

在某些實施例中，內化性部分包含抗體片段，且該抗體片段包含抗原結合片段，例如Fab或Fab’。換言之，在某些實施例中，內化性部分包含Fab或Fab’。

在某些實施例中，內化性部分與藉由以ATCC登錄號PTA-2439永久保存於美國模式培養物保藏所(ATCC)中之融合瘤3E10產生之抗體之抗體(或抗原結合片段)競爭結合DNA受質，例如雙鏈鈍頭DNA。

本發明利用3E10或3E10片段或變體之細胞穿透能力來促進在活體內遞送GAA(例如，成熟GAA或包含成熟GAA之GAA多肽)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL或在活體外遞送至細胞中，例如遞送至細胞之細胞質中。3E10及3E10變體及片段尤其適用於此，此乃因其顯示有效促進遞送至肌肉細胞(包括骨骼肌及心肌)以及橫膈膜。因此，在某些實施例中，3E10及3E10變體及片段(或結合相同表位及/或經由ENT2穿過細胞之抗體或抗體片段)可用於在個體、例如患有福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病或重述福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病之症狀之人類患者或模型生物體中促進有效遞送至細胞中。在某些實施例中，其中內化性部分與3E10相關之嵌合多肽適於促進將包含GAA之GAA多肽((例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL遞送至細胞之細胞質。

如下文進一步闡述，重組3E10或3E10樣變體或片段可偶聯、連接或以其他方式接合至GAA多肽，例如包含成熟GAA多肽之GAA多肽。在一些實施例中，重組3E10或3E10樣變體或片段可偶聯、連接或以其他方式接合至拉弗拉蛋白多肽。在一些實施例中，重組3E10或3E10樣變體或片段可偶聯、連接或以其他方式接合至AGL多肽。在一些實施例中，重組3E10或3E10樣變體或片段可偶聯、連接或以其他方式接合至馬啉素多肽。在一些實施例中，重組3E10或3E10樣變體或片段可偶聯、連接或以其他方式接合至α-澱粉酶多肽。在使嵌合多肽至GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL之情況下，化學偶聯以及使嵌合多肽成為融合蛋白係可用的且為業內已知。

抗體或其片段(例如，由V_H-連接體-V_L或V_L-連接體-V_H或Fab編碼之單鏈Fv片段)之製備為業內所熟知。具體而言，mAb 3E10抗體片段之重組產生方法已闡述於WO 2008/091911中。此外，生成抗體或Fab之scFv片段之方法為業內所熟知。在重組產生抗體或抗體片段時可使用連接體。舉例而言，撓性蛋白質區域中之典型表面胺基酸包括Gly、Asn及Ser。一種實例性連接體提供於SEQ ID NO：5、6或30中。可預期含有Gly、Asn及Ser之胺基酸序列之排列會符合連接體序列之準則(例如，具有最小疏水或帶電荷特徵之撓性)。另一實例性連接體具有式(G₄S)n，其中n係1-10之整數，例如2、3或4。其他近中性胺基酸(例如Thr及Ala)亦可用於連接體序列中。

除了互連例如scFv之各部分之連接體以外，本發明涵蓋使用其他連接體以例如將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL部分與嵌合多肽之抗體部分互連。

抗體之製備可藉由任一數量之用於生成單株抗體之熟知方法來完成。該等方法通常包括用期望免疫原(例如，期望靶分子或其片段) 對動物(通常小鼠)進行免疫之步驟。在小鼠已經免疫，且較佳用期望免疫原加強一或多次後，可根據熟知方法製備並篩選產生單株抗體之融合瘤(例如，關於單株抗體產生之一般概述參見Kuby,Janis,Immunology，第3版，第131-139頁，W.H.Freeman & Co.(1997)，其中之該部分係以引用方式併入本文中)。在過去數十年中，抗體生產已變得極為穩健。組合抗體識別與噬菌體展示技術之活體外方法容許擴增並選擇具有極高特異性結合能力之抗體。例如，參見Holt,L.J.等人，「The Use of Recombinant Antibodies in Proteomics」，Current Opinion in Biotechnology,2000,11：445-449，其係以引用方式併入本文中。該等方法通常顯著不如藉由傳統單株抗體製備方法製備融合瘤麻煩。在一個實施例中，噬菌體展示技術可用於生成對期望靶分子具有特異性之內化性部分。在動物(例如小鼠、兔、山羊或其他動物)中引發對所選免疫原之免疫反應，且加強該反應以擴大免疫原特異性B細胞群。自彼等B細胞或視情況單株或多株融合瘤群分離信使RNA。藉由已知方法使用聚-A引子或通常對毗鄰期望V_H及V_L鏈之序列具有特異性之鼠類免疫球蛋白特異性引子使mRNA逆轉錄，以產生cDNA。通常使用V_H及V_L特異性引子集藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增期望V_H及V_L鏈，並將其連接在一起，由連接體隔開。V_H及V_L特異性引子集可自市場購得，例如購自加利福尼亞拉荷雅的Stratagene公司。選擇經裝配的V_H-連接體-V_L產物(編碼scFv片段)進行PCR且藉由PCR擴增。藉由PCR用包括限制位點之引子將限制位點引入V_H-連接體-V_L產物末端且將scFv片段插入適宜表現載體(通常質體)中以供噬菌體展示。可將其他片段(例如Fab’片段)選殖至噬菌體展示載體中以供在噬菌體顆粒上表面表現。該噬菌體可為任一噬菌體，例如λ，但通常係絲狀噬菌體，例如fd及M13，通常係M13。

在某些實施例中，抗體或抗體片段係在宿主細胞中重組製得。換言之，得知抗體序列(例如，使用上述方法)後，該抗體可使用標準技術重組製得。

在某些實施例中，內化性部分可經修飾以使其對蛋白酶裂解之抗性更強。舉例而言，包含多肽之內化性部分之穩定性可藉由用D-胺基酸取代(L)構形中之一或多個天然胺基酸來增強。在各個實施例中，內化性部分之至少1%、5%、10%、20%、50%、80%、90%或100%之胺基酸殘基可具有D構形。自L胺基酸轉換為D胺基酸消除在消化道中發現之多種遍在肽酶之消化能力。或者，包含肽鍵之內化性部分之增強之穩定性可藉由引入傳統肽鍵聯之修飾來達成。舉例而言，在多肽主鏈中引入環形環可賦予增強之穩定性，以防止發生多種蛋白分解酶已知可在胃或或其他消化器官及在血清中消化多肽之效應。在其他實施例中，內化性部分之增強之穩定性可藉由在內化性部分之胺基酸之間嵌入一或多個右旋胺基酸(例如，右旋苯丙胺酸或右旋色胺酸)來達成。在實例性實施例中，該等修飾增加內化性部分之蛋白酶抗性而不影響與期望靶分子相互作用之活性或特異性。

(b)歸向肽

在某些態樣中，內化性部分可包含歸向肽，其將標的嵌合GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL多肽選擇性引導至靶組織(例如，肌肉)。舉例而言，將嵌合多肽遞送至肌肉可藉由包含胺基酸序列ASSLNIA之歸向肽來介導。其他實例性歸向肽揭示於WO 98/53804中。用於靶組織(或器官)之歸向肽可使用業內熟知之多種方法來鑑別。歸向肽之其他實例包括HIV轉錄反式激活蛋白(TAT)，其包含核定位序列Tat48-60；果蠅觸角足轉錄因子同源異型域(例如，包含Antp43-58同源異型域第3螺旋之穿膜肽(penetratin))；高精胺酸肽(例如，缺血性大鼠心臟之Arg7肽-PKC-ε激動劑保護)；α-螺旋肽；陽離子肽(「超正」荷電蛋白質)。在一些實施例中，歸向肽經由平衡核苷(ENT)運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，歸向肽經由ENT1、ENT2、ENT3或ENT4運輸蛋白穿過細胞膜。在一些實施例中，歸向肽靶向ENT2。在其他實施例中，歸向肽靶向肌肉細胞。歸向肽所靶向之肌肉細胞可包括骨骼肌、心肌或平滑肌細胞。在其他實施例中，歸向肽靶向神經元、上皮細胞、肝細胞、腎細胞或萊迪希氏細胞。

在某些實施例中，歸向肽能結合多核苷酸。在某些實施例中，歸向肽能結合DNA。在某些實施例中，歸向肽能以小於1μM之K_D結合DNA。在某些實施例中，歸向肽能以小於100nM之K_D結合DNA。

另外，用於靶組織(或器官)之歸向肽可使用業內熟知之多種方法來鑑別。在某些實施例中，一旦鑑別後，可使用對具體靶組織具有選擇性之歸向肽。

實例性方法係活體內噬菌體展示方法。特定而言，隨機肽序列表現為與噬菌體之表面蛋白質之融合肽，且將此隨機肽庫輸注至體循環中。在輸注至宿主小鼠中後，收穫靶組織或器官，然後分離並擴增噬菌體，且將注射程序再重複兩次。每輪注射默認包括負向選擇組份，此乃因所注射病毒有機會隨機結合至組織或特異性結合至非靶組織。特異性結合至非靶組織之病毒序列將藉由選擇過程快速清除，同時非特異性結合噬菌體之數目隨每輪選擇而減小。多個實驗室已鑑別對以下之血管分佈具有選擇性之歸向肽：腦、腎、肺、皮膚、胰臟、腸、子宮、腎上腺、視網膜、肌肉、前列腺或腫瘤。例如，參見Samoylova等人，1999,Muscle Nerve,22：460；Pasqualini等人，1996,Nature,380：364；Koivunen等人，1995,Biotechnology,13：265；Pasqualini等人，1995,J.Cell Biol.,130：1189；Pasqualini等人，1996,Mole.Psych.,1：421,423；Rajotte等人，1998,J.Clin.Invest.,102：430；Rajotte等人，1999,J.Biol.Chem.,274：11593。亦參見美國專利第5,622,699號、第6,068,829號、第6,174,687號、第6,180,084 號、第6,232,287號、第6,296,832號、第6,303,573號、第6,306,365號。可使用靶向上述組織中之任一者之歸向肽來將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL蛋白質靶向該組織。

(c)對溶酶體及自噬液泡之其他靶向

將蛋白質靶向溶酶體之傳統方法係用M6P殘基修飾該蛋白質，該修飾經由M6P殘基與諸如高爾基體或晚期胞內體等結構之內表面上之M6PR分子之相互作用將其運輸引導至溶酶體。將內源GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL運輸至溶酶體依賴於M6P與M6PR相互作用。亦存在GAA之非M6P依賴性運輸形式，如藉由GAA甚至在患有I細胞疾病之患者中之正常活性所證實，該疾病表現為嚴重缺乏其他溶酶體酶(Wisselar等人，J.Biological Chemistry,268(3)：2223-2231,1993)。GAA之非M6P依賴性運輸之其他證據係藉由在肌肉特異性M6PR敲除(knockout)之小鼠靶向中顯示溶酶體GAA無破壞之研究所證實(Wylie等人，2003,Am J Pathol,162(1)：321-28)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽(例如，包含GAA、例如成熟GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL之多肽；及內化性部分)可進一步包括修飾以促進經由M6PR或以不依賴M6PR之路徑對溶酶體之其他靶向。該等靶向部分可在例如嵌合多肽之N-末端或C-末端添加，且經由偶聯添加至3E10或GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL。在其他實施例中，嵌合多肽之GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL部分包含全部或一些內源序列以促進M6P運輸。

在一些實施例中，經由自體吞噬之細胞過程將本發明嵌合多肽運輸至溶酶體。自體吞噬係異化機制，其涉及不需要的或功能不良的細胞組份經由溶酶體機構之細胞降解。在此過程期間，所靶向之細胞質成份在稱為自噬小體之液泡內與細胞其餘部分分離，然後其與溶酶體融合並降解或再循環。將蛋白質攝取至自噬液泡中係藉由所靶向細胞區域周圍之膜形成及隨後液泡與溶酶體之融合來介導。已知若干種用於自體吞噬之機制，包括巨自噬，其中細胞器及蛋白質隔絕在細胞內稱為自噬液泡之液泡中。在與溶酶體融合後，自噬液泡之內容物藉由酸性溶酶體水解酶降解。在微自噬中，溶酶體直接吞沒細胞質，且在伴護蛋白介導之自體吞噬中，具有共有肽序列之蛋白質由含有hsc70之伴護蛋白-共伴護蛋白複合物結合，其由溶酶體蛋白質識別並移位跨過溶酶體膜。自噬液泡具有溶酶體環境(低pH)，其有助於諸如GAA(例如，成熟GAA)等酶之活性。

自體吞噬天然發生在哺乳動物之肌肉細胞中(Masiero等人，2009,Cell Metabolism,10(6)：507-15)。由於自噬液泡自細胞質吸收蛋白質，故預期本發明嵌合多肽可由含有肝醣之自噬液泡吸收，其中嵌合多肽將自由以降解存於彼等液泡內之任何肝醣。因此，在一些實施例中，嵌合多肽能在不添加任何自噬液泡特異性靶向基序之情況下由自噬液泡吸收。

在某些實施例中，本發明嵌合多肽可進一步包括修飾以促進其他靶向至自噬液泡。一種已知的伴護蛋白-靶向基序係KFERQ樣基序。因此，此基序可添加至如本文所述之嵌合多肽，以靶向用於自體吞噬之多肽。該等靶向部分可在例如嵌合多肽之N-末端或C-末端且經由偶聯至3E10或GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL來添加。

M6P殘基或伴護蛋白-靶向基序可添加至GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL多肽。

III. 嵌合多肽

本發明提供嵌合多肽，其包含內化性部分及非內化性部分。如上文所詳述，非內化性部分多肽部分包含GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽或AGL多肽或由其組成。內化性部分之多個實例及潛在非內化性部分多肽部分中之每一者闡述於上文中，且涵蓋用於生成嵌合多肽之內化性部分及非內化性部分多肽部分之所有適宜組合。

不受限於理論，不管嵌合多肽之非內化性部分多肽部分是否包含GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL或由其組成，其與內化性部分之結合促進將嵌合多肽、且因此非內化性部分遞送至細胞質，且視情況遞送至溶酶體及/或自噬液泡中。在某些實施例中，內化性部分將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL活性遞送至細胞中。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有GAA之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含GAA多肽或由其組成)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有AGL之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含AGL多肽或由其組成)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有拉弗拉蛋白之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含拉弗拉蛋白多肽或由其組成)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有馬啉素之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含馬啉素多肽或由其組成)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽包含含有α-澱粉酶之嵌合多肽(例如，非內化性部分包含α-澱粉酶多肽或由其組成)。本文所述之任一內化性部分可與如本文所述之任一非內化性部分多肽部分組合，以生成本發明嵌合多肽。

本發明提供嵌合多肽(例如，本發明嵌合多肽)。用於本文所揭示之方法中之嵌合多肽可以多種方式製得。嵌合多肽可包含如本文所揭示之內化性部分及GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素或AGL多肽部分(例如，包含成熟GAA之GAA多肽，如本文所述)中之任一者。如本文所用，本發明嵌合多肽包含(i)GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL多肽部分及(ii)內化性部分。另外，本文所揭示之任一嵌合多肽可用於本文所揭示之任一方法或組合物。在一些實施例中，內化性部分(例如抗體或歸向肽)直接或間接連接至本文所揭示之GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL及/或片段或變體中之任一者。

在一些實施例中，嵌合多肽包含不成熟GAA多肽，例如具有SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之GAA多肽。在一些實施例中，嵌合多肽不包含：i)約110kDa之不成熟GAA多肽及/或，ii)具有信號序列(即SEQ ID NO：1或2之胺基酸殘基1-27)之不成熟GAA。換言之，本發明涵蓋嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含成熟GAA多肽，但亦可包括其他來自GAA多肽之多肽序列，包括與成熟GAA多肽鄰接之序列(例如，GAA多肽部分包含含有成熟GAA多肽序列之GAA多肽)。舉例而言，在一些實施例中，嵌合多肽包含含有SEQ ID NO：21-23中之任一者之胺基酸序列之GAA多肽(例如，SEQ ID NO 21-23係包含成熟GAA但亦包括GAA多肽之其他鄰接胺基酸之GAA多肽之實例)。本發明亦涵蓋多個實施例，其中嵌合多肽包含成熟GAA多肽，但不包括與成熟GAA多肽部分鄰接之其他GAA多肽序列。最後，本發明涵蓋多個實施例，其中該嵌合多肽不包括除了成熟GAA多肽以外之其他GAA多肽部分。

在某些實施例中，可期望將本文所述之任一內化性部分與成熟GAA多肽(例如，具有SEQ ID NO：3或4之胺基酸序列之GAA多肽)偶聯，以減小包含更大GAA多肽(例如，具有SEQ ID NO：21-23中之任一者之胺基酸序列之GAA多肽)之嵌合多肽在個體之所靶向細胞攝取該嵌合多肽之前，在存於全長GAA多肽中之任一裂解位點不慎被該個體之蛋白酶裂解(例如，在對應於SEQ ID NO：1之胺基酸56-57、77-78、113-114、121-122、200-201、203-204、781-782或791-792之胺基酸中之任一者之間裂解)之可能性。

在一些實施例中，嵌合多肽包含與SEQ ID NO：38-45中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%一致性之胺基酸序列或其生物片段。

在某些實施例中，GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽之C-末端可直接或間接連接至內化性部分(例如，抗體、抗體片段或歸向肽)之N-末端。或者，內化性部分(例如，抗體、抗體片段或歸向肽)之C-末端可直接或間接連接至GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL多肽之N-末端。舉例而言，嵌合多肽可設計為將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL多肽置於mAb 3E10之抗體重鏈或輕鏈之胺基或羧基末端。在一些實施例中，GAA多肽包含融合至內化性部分之C-末端之SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列。在一些實施例中，GAA多肽包含融合至Fab內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列。在一些實施例中，GAA多肽包含融合至全長抗體內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列。

在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含融合至內化性部分之C-末端之SEQ ID NO：38或39之胺基酸序列或其變體或片段。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含融合至Fab內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：38或39之胺基酸序列或其變體或片段。在一些實施例中，拉弗拉蛋白多肽包含融合至全長抗體內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：38或39之胺基酸序列或其變體或片段。

在一些實施例中，AGL多肽包含融合至內化性部分之C-末端之SEQ ID NO：40-42中任一者之胺基酸序列或其變體或片段。在一些實施例中，AGL多肽包含融合至Fab內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：40-42中任一者之胺基酸序列或其變體或片段。在一些實施例中，AGL多肽包含融合至全長抗體內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：40-42中任一者之胺基酸序列或其變體或片段。

在一些實施例中，馬啉素多肽包含融合至內化性部分之C-末端之SEQ ID NO：43之胺基酸序列或其變體或片段。在一些實施例中，馬啉素多肽包含融合至Fab內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：43之胺基酸序列或其變體或片段。在一些實施例中；馬啉素多肽包含融合至全長抗體內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：43之胺基酸序列或其變體或片段。

在一些實施例中，α-澱粉酶多肽包含融合至內化性部分之C-末端之SEQ ID NO：44或45之胺基酸序列或其變體或片段。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽包含融合至Fab內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：44或45之胺基酸序列或其變體或片段。在一些實施例中，α-澱粉酶多肽包含融合至全長抗體內化性部分之重鏈區段之C-末端之SEQ ID NO：44或45之胺基酸序列或其變體或片段。

在某些實施例中，潛在構形包括視需要使用抗體重鏈及輕鏈序列(例如，mAB 3E10)之截短部分以維持所附接成熟GAA多肽之功能完整性。此外，內化性部分可連接至GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL或其變體之暴露之內部(非末端)殘基。在其他實施例中，可採用GAA-內化性部分構形之任一組合，由此使GAA：內化性部分比率大於1：1(例如，兩個成熟GAA分子對一個內化性部分)。在其他實施例中，可採用拉弗拉蛋白-內化性部分構形之任一組合，由此使拉弗拉蛋白：內化性部分比率大於1：1(例如，兩個拉弗拉蛋白分子對一個內化性部分)。在其他實施例中，可採用AGL-內化性部分構形之任一組合，由此使AGL：內化性部分比率大於1：1(例如，兩個AGL分子對一個內化性部分)。在其他實施例中，可採用馬啉素-內化性部分構形之任一組合，由此使馬啉素：內化性部分比率大於1：1(例如，兩個馬啉素分子對一個內化性部分)。在其他實施例中，可採用α-澱粉酶-內化性部分構形之任一組合，由此使α-澱粉酶：內化性部分比率大於1：1(例如，兩個α-澱粉酶分子對一個內化性部分)。

GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽及內化性部分可直接彼此連接。或者，其可經由連接體序列彼此連接，該連接體序列使GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽及內化性部分相隔足夠距離，以確保每一結構域適當摺疊為其二級及三級結構。較佳連接體序列(1)應採取撓性擴展構象，(2)應不展現發展可與GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽或內化性部分之功能結構域相互作用之有序二級結構之傾向，且(3)應具有最小疏水或帶電特徵，其可促進與功能性蛋白質結構域之相互作用。撓性蛋白質區域中之典型表面胺基酸包括Gly、Asn及Ser。預期含有Gly、Asn及Ser胺基酸序列之排列可滿足上文對連接體序列之準則。其他近中性胺基酸(例如Thr及Ala)亦可用於連接體序列中。在特定實施例中，可使用約20個胺基酸之連接體序列長度來提供功能性蛋白質結構域之適宜分割，但亦可使用更長或更短連接體序列。分隔GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽與內化性部分之連接體序列之長度可為5至500個胺基酸之長度，或更佳5至100個胺基酸之長度。較佳地，連接體序列之長度為約5-30個胺基酸。在較佳實施例中，連接體序列為約5至約20個胺基酸，且有利地為約10至約20個胺基酸。在其他實施例中，將GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽接合至內化性部分之連接體可為抗體之恆定結構域(例如，mAb 3E10之恆定結構域或另一抗體之Fc區域之全部或一部分)。在某些實施例中，連接體係可裂解連接體。在某些實施例中，連接體序列包含SEQ ID NO：30之連接體序列。在某些實施例中，內化性部分係抗體或抗體片段且偶聯包括化學或重組偶聯至恆定結構域，例如抗體或抗體片段之重鏈之恆定結構域。在該等實施例中，應瞭解，GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽及內化性部分可經由抗體或抗體片段之重鏈與輕鏈之間之結合來進一步結合。此亦包括在偶聯之範圍內。

在其他實施例中，GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽或其功能性片段可直接偶聯或接合至內化性部分。舉例而言，重組偶聯之嵌合多肽可作為GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL部分與內化性部分之框內融合物來產生。在某些實施例中，連接體可為可裂解連接體。在前述實施例中之任一者中，內化性部分可偶聯(直接或經由連接體)至GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽之N-末端或C-末端胺基酸，例如偶聯至包含成熟GAA之GAA多肽之N-末端或C-末端胺基酸。在其他實施例中，內化性部分可偶聯(直接或間接)至GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽之內部胺基酸。注意，該構築體之兩個部分彼此偶聯/接合。除非另外規定，否則將嵌合多肽闡述為GAA部分至內化性部分之偶聯物與內化性部分至GAA部分之偶聯物等效使用。除非另外規定，否則將嵌合多肽闡述為拉弗拉蛋白部分至內化性部分之偶聯物與內化性部分至拉弗拉蛋白部分之偶聯物等效使用。除非另外規定，否則將嵌合多肽闡述為AGL部分至內化性部分之偶聯物與內化性部分至AGL部分之偶聯物等效使用。除非另外規定，否則將嵌合多肽闡述為馬啉素部分至內化性部分之偶聯物與內化性部分至馬啉素部分之偶聯物等效使用。除非另外規定，否則將嵌合多肽闡述為α-澱粉酶部分至內化性部分之偶聯物與內化性部分至α-澱粉酶部分之偶聯物等效使用。此外，除非另外規定，否則偶聯及/或接合係指化學或遺傳偶聯。

在某些實施例中，本發明嵌合多肽可使用熟知交聯試劑及方案來生成。舉例而言，有大量化學交聯劑為熟習此項技術者已知且可用於將GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽與內化性部分(例如，抗體)交聯。舉例而言，交聯劑係異雙官能交叉連接體，且可用於以逐步方式連接分子。異雙官能交叉連接體提供以下能力：設計用於偶聯蛋白質之更特異性之偶合方法，由此減少諸如同源蛋白質聚合物等不期望副反應之發生。眾多種異雙官能交叉連接體為業內已知，包括4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)；N-(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸琥珀醯亞胺基酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)；4-琥珀醯亞胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)、N-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀醯亞胺基酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯]己酸酯(LC-SPDP)。彼等具有N-羥基琥珀醯亞胺部分之交聯劑可作為一般具有更大水溶性之N-羥基磺基琥珀醯亞胺類似物來獲得。另外，彼等在連接鏈內具有二硫橋之交聯劑可代替地作為烷基衍生物來合成，以減少活體內連接體裂解之量。除了異雙官能交叉連接體以外，存在多種其他交聯劑，包括同雙官能及光反應性交叉連接體。辛二酸二琥珀醯亞胺基酯(DSS)、雙馬來醯亞胺基己烷(BMH)及庚二醯亞胺酸二甲基酯.2 HCl(DMP)係可用同雙官能交聯劑之實例，且雙-[B-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)及N-6(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸琥珀醯亞胺基酯(SANPAH)係用於本發明中之可用光反應性交叉連接體之實例。關於蛋白質偶合技術之最新評論參見Means等人(1990)Bioconjugate Chemistry.1：2-12，其係以引用方式併入本文中。

上文所包括之異雙官能交叉連接體之一個尤其有用之種類含有一級胺反應基團N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)或其水溶性類似物N-羥基磺基琥珀醯亞胺(磺基-NHS)。一級胺(離胺酸ε基團)在鹼性pH下未質子化且藉由對NHS或磺基-NHS酯之親核攻擊來反應。此反應導致形成醯胺鍵，且釋放NHS或磺基-NHS作為副產物。可用作異雙官能交叉連接體之一部分之另一反應基團係硫醇反應基團。常見硫醇反應基團包括馬來醯亞胺、鹵素及吡啶基二硫化物。馬來醯亞胺與游離硫氫基(半胱胺酸殘基)在數分鐘內在微酸性至中性(pH 6.5-7.5)條件下進行特異性反應。鹵素(碘代乙醯基官能基)與--SH基團在生理pH下反應。該等反應基團皆導致形成穩定硫醚鍵。異雙官能交叉連接體之第三組份係間隔體臂或橋。該橋係連接兩個反應性末端之結構。該橋之最明顯特質係其對立體阻礙之效應。在一些情況下，橋愈長愈可易於橫跨連接兩個複雜生物分子所需之距離。

在一些實施例中，嵌合多肽包含多個連接體。舉例而言，若嵌合多肽包含scFv內化性部分，則嵌合多肽可包含將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素偶聯至內化性部分之第一連接體及在scFv中將V_H結構域(例如，SEQ ID NO：9)偶聯至V_L結構域(例如，SEQ ID NO：10)之第二連接體。

使用異雙官能試劑製備蛋白質偶聯物係涉及胺反應及硫氫基反應之二步驟製程。對於第一步驟，即胺反應，所選蛋白質應含有一級胺。此可係在大多數蛋白質N-末端發現之離胺酸ε胺或一級α胺。該蛋白質應不含游離硫氫基。在兩種欲偶聯蛋白質皆含有游離硫氫基之情形中，一種蛋白質可使用例如N-乙基馬來醯亞胺經修飾使得所有硫氫基皆被封阻(參見Partis等人(1983)J.Pro.Chem.2：263，其係以引用方式併入本文中)。可使用Ellman試劑來計算具體蛋白質中硫氫基之量(例如，參見Ellman等人(1958)Arch.Biochem.Biophys.74：443及Riddles等人(1979)Anal.Biochem.94：75，其係以引用方式併入本文中)。

在某些特定實施例中，本發明嵌合多肽可藉由使用通用載劑系統來產生。舉例而言，GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽可偶聯至常用載劑，例如蛋白質A、聚-L-離胺酸、己-組胺酸及諸如此類。然後所偶聯載劑將形成與用作內化性部分之抗體之複合物。可使用負責結合免疫球蛋白之載劑分子之小部分作為載劑。

在某些實施例中，本發明嵌合多肽可藉由使用標準蛋白質化學技術來產生，例如彼等闡述於以下文獻中者：Bodansky,M.Principles of Peptide Synthesis,Springer Verlag,Berlin(1993)及Grant G.A.(ed.),Synthetic Peptides：A User's Guide,W.H.Freeman and Company,New York(1992)。另外，自動化肽合成器可自市場購得(例如，Advanced ChemTech 396型；Milligen/Biosearch 9600)。在用於將拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素、AGL及/或成熟GAA化學偶聯至內化性部分之前述任一交聯方法中，可使用可裂解結構域或可裂解連接體。裂解將容許分離內化性部分與GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽。舉例而言，在嵌合多肽滲透細胞後，可裂解連接體之裂解將容許GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL與內化性部分分離。

在某些實施例中，包含GAA多肽部分(例如，包含成熟GAA多肽序列之GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽及內化性部分之嵌合多肽可作為含有GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽及內化性部分之融合蛋白來生成。在某些實施例中，本發明嵌合多肽可作為含有GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽及內化性部分(例如，抗體或歸向肽)之融合蛋白來生成，作為一種鄰接多肽鏈來表現。在某些實施例中，嵌合多肽係作為包含GAA多肽部分及內化性部分之融合蛋白來生成，其中該GAA多肽部分包含成熟GAA多肽且亦包括其他來自GAA多肽之多肽序列，包括與成熟GAA多肽鄰接之序列。在某些實施例中，嵌合多肽係作為包含拉弗拉蛋白多肽部分及內化性部分之融合蛋白來生成。在某些實施例中，嵌合多肽係作為包含AGL多肽部分及內化性部分之融合蛋白來生成。在某些實施例中，嵌合多肽係作為包含馬啉素多肽部分及內化性部分之融合蛋白來生成。在某些實施例中，嵌合多肽係作為包含α-澱粉酶多肽部分及內化性部分之融合蛋白來生成。在該融合蛋白之製備中，構築融合基因，其包含編碼拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽、AGL多肽及/或成熟GAA多肽之核酸及內化性部分，及視情況橫跨GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽與內化性部分之肽連接體序列。產生融合基因且轉譯產物為期望融合蛋白之重組DNA技術之使用為業內所熟知。基因之編碼序列及其調節區域二者可經重新設計以改變蛋白質產物之功能性質、所製得蛋白質之量或其中產生該蛋白質之細胞類型。基因之編碼序列可廣泛改變，例如藉由將其一部分融合至不同基因之編碼序列以產生編碼融合蛋白之新穎雜合基因。產生融合蛋白之方法之實例闡述於PCT申請案PCT/US87/02968、PCT/US89/03587及PCT/US90/07335以及Traunecker等人(1989)Nature 339：68中，其係以引用方式併入本文中。基本上，編碼不同多肽序列之各種DNA片段之接合係根據習用技術來實施，採用用於連接之鈍頭端或交錯端末端、提供適當末端之限制性酶消化、視需要之黏合端之填充、避免不期望接合之鹼性磷酸酶處理及酶連接。或者，融合基因可藉由習用技術來合成，包括自動化DNA合成器。在另一種方法中，可使用錨定引子實施基因片段PCR擴增，其在兩個鄰接基因片段之間產生互補懸突，其隨後可退火以生成嵌合基因序列(例如，參見Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons：1992)。由該融合基因編碼之嵌合多肽可使用如業內所熟知(亦見下文)之各種表現系統重組產生。

重組偶聯之嵌合多肽包括多個實施例，其中GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽偶聯至內化性部分之N-末端或C-末端。其中GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽偶聯至Fv3E10之變體輕鏈及重鏈之實例性嵌合多肽指示於SEQ ID NO：11及12中。在某些實施例中，本發明嵌合多肽在N-末端(在N-末端之10個胺基酸殘基處或其內)進一步包含SEQ ID NO：19或20中所述之胺基酸序列。

重組偶聯之嵌合多肽包括多個實施例，其中內化性部分位於GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽之N-末端；及多個實施例，其中內化性部分位於GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽部分之C-末端。注意到，重組製造融合蛋白之方法為業內所熟知。本文所述之任一嵌合蛋白質可易於重組製造。此包括具有一或多個取代基之標識及/或一或多個連接體之蛋白質。舉例而言，若嵌合多肽包含scFv內化性部分，則該嵌合多肽可包含內化性部分至GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、馬啉素多肽及/或AGL多肽部分之第一連接體互連及scFv中偶聯V_H結構域之第二連接體。此外，在某些實施例中，嵌合多肽在嵌合多肽之N-末端(或在N-末端之10個胺基酸殘基內)上包含「AGIH」部分(SEQ ID NO：19)，且該等嵌合多肽可在一或多種表位標識之存在或不存在下提供。在其他實施例中，嵌合多肽在多肽之最N-末端位置包含絲胺酸。在一些實施例中，嵌合多肽在多肽之N-末端(或在N-末端之10個胺基酸殘基內)包含「SAGIH」(SEQ ID NO：20)部分，且該等嵌合多肽可在一或多種表位標識之存在或不存在下提供。

在一些實施例中，嵌合多肽包含信號序列(例如，SEQ ID NO：33 或36)。在一些實施例中，信號序列(例如，SEQ ID NO：33)位於本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段之輕鏈序列之N-末端。在一些實施例中，信號序列(例如，SEQ ID NO：33)位於胺基酸序列SEQ ID NO：10或其片段或變體之N-末端。在一些實施例中，信號序列(例如，SEQ ID NO：36)位於本文所揭示之任一抗體或抗原結合片段之重鏈序列之N-末端。在一些實施例中，信號序列(例如，SEQ ID NO：36)位於胺基酸序列SEQ ID NO：9或其片段或變體之N-末端。

在一些實施例中，嵌合多肽係在細胞中重組產生。在一些實施例中，細胞係細菌(例如，大腸桿菌)、酵母(例如，畢赤酵母(Picchia))、昆蟲細胞(例如，Sf9細胞)或哺乳動物細胞(例如，CHO或HEK-293細胞)。在某些實施例中，本發明嵌合多肽係使用業內公認用於自細胞或細胞上清液製造並純化蛋白質之技術在培養中在前述任一細胞中製得。

嵌合多肽中免疫球蛋白或表位標識(例如HA或myc標識)之全部或一部分之存在提供用於純化嵌合多肽之區域。在一些實施例中，使用嵌合多肽之標識或免疫球蛋白部分進行純化，使得包含本發明嵌合多肽之組合物相對於未互連至內化性部分之GAA部分經富集及/或實質上經純化。舉例而言，GAA之存在經富集，使得組合物中大於90%之GAA係作為互連至內化性部分之多肽存在。在其他實施例中，組合物經富集，使得組合物中大於80%、大於85%、大於90%或大於95%之GAA具有大致相同的分子量及/或在GAA部分之N-末端處相差小於5個胺基酸殘基。

在一些實施例中，嵌合多肽之免疫原性可藉由鑑別橫跨嵌合多肽之接合區域內之候選T細胞表位及改變接合區域內之胺基酸來降低，如美國專利公開案第2003/0166877號中所述。

本發明嵌合多肽可用於多種目的。注意到，本文所述之任一嵌合多肽可用於本文所述任一方法中，且明確涵蓋該等適宜組合。

本文所述之嵌合多肽可用於將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL多肽遞送至細胞，尤其肌肉細胞。在某些實施例中，嵌合多肽將GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL遞送至肝細胞。因此，嵌合多肽可用於促進在活體外或活體內將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL運輸至細胞。藉由促進運輸至細胞，嵌合多肽改良遞送效率，由此促進在活體外或活體內對GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL多肽之作用。此外，藉由提高運輸效率，嵌合多肽可幫助減少活體外或活體內實驗所需GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL之量。此外，藉由促進遞送至細胞質，本發明嵌合多肽及方法可解決例如福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病中與肝醣之細胞質累積相關之問題。

嵌合多肽可用於研究GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL在培養中之細胞中之功能，以及用於研究GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL之運輸。嵌合多肽可用於鑑別細胞中GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL之結合配偶體，例如在細胞質與溶酶體之間之運輸。嵌合多肽可在篩選中用於鑑別細胞中GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或AGL活性之改性劑(例如，有機小分子或多肽改性劑)。嵌合多肽可用於幫助在人類或動物模型中治療或緩和福布斯-柯裡氏病及/或安德森病(及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病)之症狀。上文僅係標的嵌合多肽之用途的實例。

本文所述之任一嵌合多肽(包括組合GAA多肽、內化性部分及連接體之任一特徵之嵌合多肽)可用於本發明之任一方法中。

IV. GAA相關核酸及表現

在某些實施例中，本發明利用核酸來產生GAA多肽，例如成熟GAA多肽(包括其功能性片段、變體及融合物)，例如產生包含成熟GAA多肽之GAA多肽。在某些實施例中，本發明利用核酸來產生拉弗拉蛋白多肽(包括其功能性片段、變體及融合物)。在某些實施例中，本發明利用核酸來產生AGL多肽(包括其功能性片段、變體及融合物)。在某些實施例中，本發明利用核酸來產生馬啉素多肽(包括其功能性片段、變體及融合物)。在某些實施例中，本發明利用核酸來產生α-澱粉酶多肽(包括其功能性片段、變體及融合物)。在某些特定實施例中，核酸可進一步包含編碼內化性部分(例如，抗體或歸向肽)之DNA用於製造本發明之重組嵌合蛋白質。

在某些實施例中，核酸構築體不編碼包含約110kDa之GAA前體多肽之嵌合多肽。在某些實施例中，核酸構築體編碼包含不成熟GAA多肽(例如，具有SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之GAA多肽)之GAA多肽。在其他實施例中，核酸構築體編碼包含成熟GAA之GAA多肽，但不編碼包含以下之GAA多肽：(i)SEQ ID NO：1或2中所述之胺基酸序列或(ii)對應於SEQ ID NO：1或2之殘基1-27及/或1-56之部分。所有該等核酸統稱為成熟GAA核酸，此乃因其編碼包含成熟GAA多肽及視情況GAA多肽之其他鄰接部分之多肽。

該等核酸可為單鏈或雙鏈DNA或RNA分子。在某些實施例中，本發明係關於與GAA核苷酸序列之區域(例如，基因庫登錄號：NM_000152.3，其編碼NP000143.2；NM_001079803.1，其編碼NP_001073271.1；及NM_001079804.1，其編碼NP_001073272.1)至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之分離或重組核酸序列。在某些實施例中，GAA核苷酸編碼成熟GAA(例如，成熟GAA核苷酸序列)。在某些實施例中，本發明係關於與拉弗拉蛋白核苷酸序列之區域(例如，基因庫登錄號NM_005670.3或基因庫登錄號 NM_001018041.1)至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之分離或重組核酸序列。在某些實施例中，本發明係關於與AGL核苷酸序列之區域(例如，基因庫登錄號-NM_000642；基因庫登錄號-NM_000644；基因庫登錄號-NM_000643；基因庫登錄號-NM_000028；基因庫登錄號-NM_000645；或基因庫登錄號-NM_000646)至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之分離或重組核酸序列。在某些實施例中，本發明係關於與馬啉素核苷酸序列之區域(例如，基因庫登錄號AY324850.1)至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之分離或重組核酸序列。在某些實施例中，本發明係關於與α-澱粉酶核苷酸序列之區域(例如，基因庫登錄號AH002672.1或AH002671.1)至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之分離或重組核酸序列。在其他實施例中，GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素核酸序列可經分離、重組及/或與異源核苷酸序列融合，或在DNA庫中。

在某些實施例中，GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素核酸亦包括在高度嚴格條件下與上文所提及之核苷酸序列或其補體序列中之任一者雜交之核苷酸序列。熟習此項技術者將易於理解，促進DNA雜交之適當嚴格條件可改變。舉例而言，可在6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)及約45℃下實施雜交，之後用2.0×SSC在50℃下洗滌。舉例而言，洗滌步驟中之鹽濃度可選自約2.0×SSC在50℃下之低嚴格性至約0.2×SSC在50℃下之高嚴格性。另外，洗滌步驟中之溫度可自低嚴格性條件之約22℃室溫上升至高嚴格性條件之約65℃。溫度及鹽二者皆可變，或溫度或鹽濃度可保持恆定同時改變其他變量。在一個實施例中，本發明提供在6×SSC及室溫下之低嚴格性條件下雜交，之後在2×SSC及室溫下洗滌之核酸。

由於遺傳密碼之簡併性而與天然GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素核酸不同之分離核酸亦在本發明之範圍內。舉例而言，多個胺基酸係藉由一個以上三聯體來命名。指定相同胺基酸之密碼子或同義密碼子(例如，CAU與CAC係組胺酸之同義密碼子)可導致不影響蛋白質之胺基酸序列之「沉默」突變。然而，預期在哺乳動物細胞之間將存在確實導致標的蛋白質之胺基酸序列變化之DNA序列多型性。熟習此項技術者將瞭解，由於天然等位基因變異，在給定物種之個體之間可存在編碼具體蛋白質之核酸中一或多個核苷酸(至多約3-5%之核苷酸)之該等變異。任一及所有該等核苷酸變異及所得胺基酸多型性皆在本發明之範圍內。

在某些實施例中，重組GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素核酸可在表現構築體中可操作連接至一或多個調節核苷酸序列。調節核苷酸序列一般將適合於用於表現之宿主細胞。對於多種宿主細胞，多種類型之適當表現載體及適宜調節序列為業內已知。通常，該一或多個調節核苷酸序列可包括(但不限於)啟動子序列、前導序列或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始及終止序列、轉譯起始及終止序列以及增強子或活化劑序列。本發明涵蓋如業內已知之組成型或誘導型啟動子。啟動子可為天然啟動子或組合一個以上啟動子元件之雜合啟動子。表現構築體可存於細胞中之游離基因體(例如質體)上，或表現構築體可插入染色體中。在較佳實施例中，表現載體含有可選標記物基因以容許選擇經轉變宿主細胞。可選標記物基因為業內所熟知且將隨所用宿主細胞而變。在某些態樣中，本發明係關於包含核苷酸序列之表現載體，該核苷酸序列編碼GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、AGL多肽及/或馬啉素多肽，例如本文所述之GAA多肽、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、AGL多肽及/或馬啉素多肽中之任一者，且可操作連接至至少一個調節序列。調節序列為業內公認的且經選擇以引導所編碼多肽之表現。因此，該術語調節序列包括啟動子、增強子及其他表現控制元件。實例性調節序列闡述於Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。應理解，表現載體之設計可取決於諸如以下等因素：欲轉變之宿主細胞之選擇(例如，中國倉鼠卵巢細胞)及/或期望表現之蛋白質之類型。此外，亦應考慮載體之拷貝數、控制該拷貝數之能力及該載體編碼之任何其他蛋白質(例如抗生素標記物)之表現。

在一些實施例中，包含編碼GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、AGL多肽及/或馬啉素多肽或其生物活性片段之核苷酸序列之核酸構築體可操作連接至編碼內化性部分之核苷酸序列，其中該核酸構築體編碼具有GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素生物學活性之嵌合多肽。在某些實施例中，核酸構築體可進一步包含編碼連接體之核苷酸序列。

本發明亦係關於經重組基因轉染之宿主細胞，該重組基因編碼GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、AGL多肽及/或馬啉素多肽或本發明嵌合多肽。該宿主細胞可為任何原核或真核細胞。舉例而言，GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽或嵌合多肽可在諸如大腸桿菌等細菌細胞、昆蟲細胞(例如，使用桿狀病毒表現系統)、酵母或哺乳動物細胞中表現。其它適宜宿主細胞為熟習此項技術者已知。

本發明進一步係關於產生GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、AGL多肽及/或馬啉素多肽或本發明嵌合多肽之方法。舉例而言，可在適當條件下培養經編碼GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽或嵌合多肽之表現載體轉染之宿主細胞以容許進行多肽之表現。該多肽可自含有該等多肽之細胞與培養基之混合物分泌並分離。或者，該等多肽可保留在細胞質中或膜部分中，並收穫、溶解細胞且分離蛋白質。細胞培養物包括宿主細胞、培養基及其他副產物。用於細胞培養之適宜培養基為業內所熟知。多肽可使用業內已知用於純化蛋白質之技術自細胞培養基、宿主細胞或二者分離，該等純化技術包括離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾、電泳及使用對多肽(例如，GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽)之具體表位具有特異性之抗體之免疫親和純化。在較佳實施例中，多肽係含有促進其純化之結構域之融合蛋白。

重組GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素核酸可藉由將經選殖基因或其部分連接至適於在原核細胞、真核細胞(酵母、禽類、昆蟲或哺乳動物)或二者中表現之載體中來產生。產生重組多肽之表現媒劑包括質體及其他載體。例如，適宜載體包括以下類型之質體：在原核細胞(例如大腸桿菌)中表現之pBR322衍生之質體、pEMBL衍生之質體、pEX衍生之質體、pBTac衍生之質體及pUC衍生之質體。較佳哺乳動物表現載體含有促進載體在細菌中繁殖之原核序列及一或多個在真核細胞中表現之真核轉錄單元二者。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo及pHyg衍生之載體係適於轉染真核細胞之哺乳動物表現載體之實例。該等載體中之一些經來自細菌質體(例如pBR322)之序列修飾，以促進在原核及真核細胞二者中之複製及藥物抗性選擇。或者，可使用諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)之衍生物(pHEBo、pREP衍生及p205)在真核細胞中短暫表現蛋白質。用於製備質體及轉變宿主生物體之多種方法為業內所熟知。關於用於原核及真核細胞二者之其他適宜表現系統以及一般重組程序，參見Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook、Fritsch及Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，第16及17章。在一些情況下，可能期望藉由使用桿狀病毒表現系統來表現重組多肽。該等桿狀病毒表現系統之實例包括pVL衍生之載體(例如pVL1392、pVL1393及pVL941)、pAcUW衍生之載體(例如pAcUW1)及pBlueBac衍生之載體(例如含有β-gal之pBlueBac III)。

用於製造融合基因之技術為人所熟知。基本上，編碼不同多肽序列之多個DNA片段之接合係根據習用技術來實施，採用用於連接之鈍頭端或交錯端末端、提供適當末端之限制性酶消化、視需要之黏合端之填充、避免不期望接合之鹼性磷酸酶處理及酶連接。在另一實施例中，融合基因可藉由習用技術(包括自動化DNA合成器)來合成。或者，基因片段之PCR擴增可使用錨定引子來實施，該等錨定引子在兩個鄰接基因片段之間產生互補懸突，其隨後可退火以生成嵌合基因序列(例如，參見Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons：1992)。

本發明涵蓋重組產生嵌合蛋白質之方法，例如上文所述。適宜載體及宿主細胞可易於選擇以供在例如酵母或哺乳動物細胞中表現蛋白質。宿主細胞可穩定或短暫表現編碼嵌合多肽之載體。該等宿主細胞可在適宜條件下培養以表現可易於自細胞培養基分離之嵌合多肽。

本發明嵌合多肽(例如，包含含有成熟GAA之GAA部分及內化性部分之多肽)可表現為單一多肽鏈或一個以上多肽鏈。單一多肽鏈之實例係在GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素部分框內融合至內化性部分時，該內化性部分係scFv。在某些實施例中，此單一多肽鏈係自單一載體作為融合蛋白表現。

一個以上多肽鏈之實例係在內化性部分係抗體或Fab時。在某些實施例中，抗體或Fab之重鏈及輕鏈可在表現單一載體或兩個載體(一個表現重鏈且一個表現輕鏈)之宿主細胞中表現。在任一情形中， GAA多肽(例如，成熟GAA多肽)、拉弗拉蛋白多肽、α-澱粉酶多肽、AGL多肽及/或馬啉素多肽可表現為與例如重鏈C-末端之框內融合物，使得GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽附加至內化性部分，但與內化性部分之抗原結合區域相距一距離。

如上所述，重組表現多肽(包括嵌合多肽)之方法為業內所熟知。可獲得且可使用表現GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽(例如人類GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽，具有具體胺基酸序列)之核苷酸序列。此外，表現內化性部分(例如表現包含SEQ ID NO：9及10中所述VH及VL之3E10抗體、scFv或Fab)之核苷酸序列可公開獲得且可與編碼適宜重鏈及輕鏈恆定區之核苷酸序列組合。本發明涵蓋編碼本發明之任一嵌合多肽之核苷酸序列、包含該等核苷酸序列之載體(單一載體或載體組)、包含該等載體之宿主細胞及培養該等宿主細胞以表現本發明嵌合多肽之方法。

V. 治療方法及其他使用方法

對於本文所述任一方法，本發明涵蓋申請案通篇所述之嵌合多肽及/或組合物中之任一者之用途。另外，對於本文所述任一方法，本發明涵蓋一種方法之任何一或多個步驟與另一種方法之任何一或多個步驟之組合。

舉例而言，本發明之包含GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽部分及內化性部分之嵌合多肽可用於本發明任一方法中。

在某些實施例中，將本發明嵌合多肽(例如，包含GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽部分及內化性部分之多肽)遞送至細胞、例如肌肉(例如，骨骼肌及/或心肌)細胞、神經元細胞及/或肝細胞之細胞質，以降低細胞質肝醣累積(例如，正常或異常肝醣、例如葡聚糖之有害累積)。該等細胞可存於活體外或個體(例如，患者，例如人類)中。在某些實施例中，個體係患有或懷疑患有肝醣儲積症、尤其龐貝氏病、GSD III或GSD IV及/或肝醣代謝病症(例如拉弗拉病)之個體。在某些實施例中，本發明嵌合多肽適用於將GAA遞送至有需要之個體、例如患有龐貝氏病、GSD III或GSD IV及/或肝醣代謝病症(例如拉弗拉病)之個體之細胞質。在某些實施例中，有需要之個體患有或懷疑患有GSD III。在某些實施例中，有需要之個體患有或懷疑患有GSD IV。在某些實施例中，本發明提供治療(例如，改良其一或多種症狀；減少肝醣累積，例如細胞質肝醣累積)GSD III之方法。在某些實施例中，本發明提供治療(例如，改良其一或多種症狀；減少肝醣累積，例如細胞質肝醣累積)GSD IV之方法。在某些實施例中，本發明提供治療(例如，改良其一或多種症狀；減少肝醣累積)拉弗拉病之方法。其他方法闡述於本文中。

不受限於理論，儘管GSD III、GSD IV及拉弗拉病並非由GAA中之突變引起，但兩種病況之特徵皆為肝醣累積。本發明嵌合多肽適於遞送至細胞中，例如至細胞之細胞質中，以減少肝醣累積(例如，或促進肝醣清除)。因此，儘管GSD III、GSD IV及拉弗拉病並非由GAA功能之缺乏或損失引起，但提供本發明嵌合多肽可用於藉由(例如)減少肝醣(例如細胞質肝醣)來治療GSD III及/或GSD IV及/或拉弗拉病，或用於改良肝醣清除。

在一些實施例中，本發明嵌合多肽可用於在細胞中促進肝醣清除。在一些實施例中，細胞係肌肉、肝或神經元細胞。在一些實施例中，細胞係患有GSD III、GSD IV及/或拉弗拉病之個體中之細胞。

在某些實施例中，包含本文所揭示之任一GAA多肽之嵌合多肽可用於治療龐貝氏病、福布斯-柯裡氏病、安德森病、馮吉爾克病或拉弗拉病中之任何一或多者。在某些實施例中，包含本文所揭示之任一AGL多肽之嵌合多肽可用於治療拉弗拉病。在某些實施例中，包含本文所揭示之任一馬啉素多肽之嵌合多肽可用於治療拉弗拉病。在某些實施例中，包含本文所揭示之任一拉弗拉蛋白多肽之嵌合多肽可用於治療拉弗拉病。在某些實施例中，包含本文所揭示之任一α-澱粉酶多肽之嵌合多肽可用於治療拉弗拉病。在某些實施例中，包含本文所揭示之任一α-澱粉酶多肽之嵌合多肽可用於治療福布斯-柯裡氏病。在某些實施例中，個體可經本文所揭示之一或多種不同類型之任一嵌合多肽治療。舉例而言，在一些實施例中，個體可用以下之任一組合來治療：包含本文所揭示之任一GAA多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之任一拉弗拉蛋白多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之任一AGL多肽之嵌合多肽或包含本文所揭示之任一馬啉素多肽之嵌合多肽。在具體實施例中，拉弗拉病個體經至少兩種選自由以下組成之群之嵌合多肽治療：包含本文所揭示之任一拉弗拉蛋白多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之任一AGL多肽之嵌合多肽、包含本文所揭示之α-澱粉酶多肽中之任一者之嵌合多肽及包含本文所揭示之任一馬啉素多肽之嵌合多肽。

在某些實施例中，GAA多肽可包含全長GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之GAA多肽)。在某些實施例中，GAA多肽可包含GAA蛋白之一種成熟活性形式，例如70kDa形式或成熟76kDa形式或二者之組合。成熟GAA多肽亦可與GAA之不成熟110kDa形式組合投與，以靶向儘可能多之細胞器及細胞區域/區室。另外，成熟GAA多肽可與GAA之免疫耐受化片段(例如GAA之小片段)及/或免疫阻抑化合物組合投與及/或在其投與之後投與。在一些實施例中，GAA多肽包含成熟GAA多肽以及來自GAA多肽之其他多肽序列，例如與成熟GAA多肽鄰接之序列。本發明涵蓋，本發明之任一嵌合多肽(例如，包含如本文所述之GAA多肽及如本文所述之內化性部分之嵌合多肽)可用於本文所述任一方法中。

在某些實施例中，本發明提供將嵌合多肽遞送至細胞(包括培養中之細胞(活體外或離體)及個體中之細胞)之方法。遞送至培養中之細胞(例如健康細胞或來自疾病模型之細胞)具有多種用途。該等用途包括鑑別GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素受質或結合配偶體，評估定位及/或運輸(例如，至細胞質、溶酶體及/或自噬液泡)，評估多種條件(例如，pH)下之酶活性，評價肝醣累積，及諸如此類。在某些實施例中，本發明嵌合多肽可用作試劑來理解在健康或疾病情況下之GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素活性、定位及運輸。

遞送至個體(例如遞送至個體中之細胞)具有多種用途。實例性治療性用途闡述於下文中。此外，嵌合多肽可用於診斷或研究目的。舉例而言，本發明嵌合多肽可以可檢測方式經標記並投與個體，例如疾病之動物模型或患者，且用於使個體組織中之嵌合多肽成像(例如，定位至肌肉及/或肝中)。另外，實例性用途包括遞送至個體中之細胞中，例如遞送至疾病(例如，福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病)之動物模型中。舉例而言，本發明嵌合多肽可用作試劑並遞送至動物以理解GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素在健康或患病動物中之生物活性、定位及運輸、蛋白質-蛋白質相互作用、酶活性及對動物生理學之影響。

在某些實施例中，本發明提供治療與以下相關之病況的方法：AGL、GAA、G6P酶、葡萄糖-6-磷酸酶運輸蛋白、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、馬啉素及/或GBE酶之功能障礙；異常肝醣累積；及/或福布斯-柯裡氏病、龐貝氏病、馮吉爾克病、拉弗拉病及/或安德森病。在某些實施例中，肝醣累積位於細胞質中，且GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素之遞送例如在骨骼肌或肝中減少細胞質肝醣累積。在某些實施例中，個體不具有內源GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素之功能障礙(例如，該等方法不包含置換發生突變或對於其存在功能障礙之蛋白質)。

在某些實施例中，該等方法涉及向個體投與治療有效量之如上文所述之嵌合多肽(例如，包含(i)包含GAA多肽之GAA部分及(ii)內化性部分之嵌合多肽)。在某些實施例中，該等方法涉及向個體投與治療有效量之如上文所述之嵌合多肽(例如，包含(i)拉弗拉蛋白多肽及(ii)內化性部分之嵌合多肽)。在某些實施例中，該等方法涉及向個體投與治療有效量之如上文所述之嵌合多肽(例如，包含(i)AGL多肽及(ii)內化性部分之嵌合多肽)。在某些實施例中，該等方法涉及向個體投與治療有效量之如上文所述之嵌合多肽(例如，包含(i)馬啉素多肽及(ii)內化性部分之嵌合多肽)。在某些實施例中，該等方法涉及向個體投與治療有效量之如上文所述之嵌合多肽(例如，包含(i)α-澱粉酶多肽及(ii)內化性部分之嵌合多肽)。該等方法尤其旨在動物及更具體而言人類之治療性及預防性治療。關於治療福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病之方法，本發明涵蓋前述態樣及實施例中任一者之所有組合，以及與詳細說明及實例中所述實施例中任一者之組合。因此，在某些實施例中，本發明嵌合多肽適於治療多種不同GSD，例如GSD III及/或GSD IV及/或龐貝氏病及/或GSD I(包括GSD Ia及/或GSD Ib及/或諸如拉弗拉病等疾病)。在某些實施例中，例如在有需要之患者中，嵌合多肽在細胞、例如骨骼肌及/或肝細胞中減少肝醣累積，以治療GSD III及/或GSD IV及/或拉弗拉病。在某些實施例中，相同嵌合多肽可用於治療一種以上GSD，例如GSD III及GSD IV。在某些實施例中，本發明嵌合多肽可用於治療龐貝氏病及/或馮吉爾克病(GSD Ia及/或GSD Ib)。在某些實施例中，在有需要之患者中，嵌合多肽在細胞、例如神經元細胞中減少肝醣累積，以治療拉弗拉病。

本發明提供經由平衡核苷運輸蛋白(ENT2)路徑將嵌合多肽或核酸構築體遞送至細胞中之方法，包含使細胞與嵌合多肽或核酸構築體接觸。在某些實施例中，該方法包含使細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL、馬啉素及/或成熟GAA多肽或其生物活性片段及內化性部分，該內化性部分可經由ENT2路徑(及視情況經由另一ENT運輸蛋白，例如ENT3)介導跨過細胞膜運輸，由此將嵌合多肽遞送至細胞中。在某些實施例中，細胞係肌肉細胞。使用本文所揭示之任一方法靶向之肌肉細胞可包括骨骼肌、心肌或平滑肌細胞。在其他實施例中，將嵌合多肽遞送至肝或神經元細胞。

本發明亦提供經由容許到達除肌肉細胞以外之細胞之路徑將嵌合多肽或核酸構築體遞送至細胞中之方法。可使用本文所揭示之任一方法靶向之其他細胞類型包括(例如)肝細胞、神經元、上皮細胞、子宮細胞及腎細胞。

在某些實施例中，內化性部分係抗體或抗原結合片段，例如結合DNA之抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，內化性部分係抗體，例如全長抗體或Fab。在某些實施例中，全長抗體或Fab相對於天然免疫球蛋白恆定區包含一或多個取代，以例如降低效應物功能。

福布斯-柯裡氏病(亦稱為肝醣儲積症III型、GSD III或侷限性糖原貯積病)係體染色體隱性神經肌肉/肝病，且估計發病率為83,000-100,000個活產中1例。福布斯-柯裡氏病佔所有肝醣儲積症之約24%。福布斯-柯裡氏病之臨床表現已適當地充分確立，但可變。福布斯-柯裡氏病患者可患有骨骼肌病變、心肌病、肝硬化、肝腫大、低血糖症、身材矮小、異常血脂症、輕度智力遲鈍、面部異常及/或增加之骨質疏鬆症風險(Ozen等人，2007,World J Gastroenterol,13(18)：2545-46)。涉及肌肉之福布斯-柯裡氏病之形式可呈現肌無力、疲勞及肌肉萎縮。進行性肌無力及遠端肌肉消瘦經常在患者三十或四十多歲時變為失能，但已報導在多個日本患者中此病況開始於兒童期。

安德森病(亦稱為肝醣儲積症IV型或GSD IV)亦係體染色體隱性神經肌肉/肝病，且在世界範圍內估計發病率為600,000至800,000個個體中1例。發病年齡介於胎兒至成年期範圍內且分為四個組：(i)圍產期，呈現為胎兒運動不能變形序列和圍產期死亡；(ii)先天性，具有胎兒水腫、神經元參與及嬰兒早期死亡；(iii)兒童期，具有肌病或心肌病；及(iv)成年，具有孤立性肌病或成年葡聚糖體病(Lee等人，2010)。在子宮中或在嬰兒期中，不存在酶活性通常係致死的，主要影響肌肉及肝。然而，殘留酶活性(5-20%)導致少年期或成年發病的病症，其主要影響肌肉以及中樞與周圍神經系統二者。在安德森病患者中觀察到之症狀包括肝功能障礙、關節彎曲、神經元功能障礙、成長遲緩、硬化、門靜脈高血壓、食管靜脈曲張、腹水、肝脾腫大、門靜脈高血壓、低張症、肌病、擴張型心肌病及預期壽命縮短。該等症狀之嚴重度端視影響個體之安德森病之類型可變。

肝醣儲積症I型(GSD I)或馮吉爾克病係最常見肝醣儲積症，且發病率為50,000至100,000個新生兒中約1例。該缺失損傷肝自肝醣及自糖質新生產生游離葡萄糖之能力，引起嚴重低血糖症並導致肝及腎中之肝醣儲積增加。此可導致兩個器官增大。

GSD I之最常見形式命名為GSD Ia及GSD Ib，前者佔已診斷病例之超過80%且後者佔小於20%。已闡述幾種較罕見形式。GSD Ia源自葡萄糖-6-磷酸酶基因G6PC之突變。GSD Ib源自葡萄糖-6-磷酸酶運輸蛋白SLC37A4之突變。在某些實施例中，需要用標的方法治療之患者係患有GSD Ia之患者。在其他實施例中，需要治療之患者係患有GSD Ib之患者。

馮吉爾克病之臨床表現直接或間接源自：在每天之吸收後時間期間不能維持足夠血糖值；器官因肝醣累積而發生變化；生成過量乳酸；及高尿酸血症對組織之損傷。肝醣累積包括在肝中及在腎及小腸中之累積。肝腫大(通常不伴隨脾腫大)在胎兒期開始發展且通常在生命最初幾個月顯著。截至兒童站立並行走時，肝腫大可足夠嚴重而引起腹部突出。

馮吉爾克病患者之腎通常因儲積肝醣而變大10至20%。此在兒童期通常不引起臨床問題，但偶有范康尼症候群之例外，其具有腎小管重吸收之多重紊亂，包括近端腎小管酸中毒以及碳酸氫鹽及磷酸鹽浪費。然而，延長之高尿酸血症可引起尿酸腎病變。在患有GSD I之成人中，與糖尿病性腎病變類似之慢性腎小球損傷可導致腎衰竭。

肝併發症在一些馮吉爾克病患者中嚴重。肝腺瘤可在二十多歲或之後發生，且之後有小幾率惡性轉變為肝細胞瘤或肝癌。在患有GSD I之青少年及成人中報導之其他問題已包括高尿酸血症性痛風、胰臟炎及慢性腎衰竭。

拉弗拉病(亦稱為拉弗拉進行性肌陣攣性癲癇或MELF)係罕見致命的神經退化病症，其特徵為在來自受影響個體之多個組織(包括腦、心臟、肝、肌肉及皮膚)之細胞中細胞質葡聚糖包涵體之累積。拉弗拉病患者通常首先在青春期發生症狀。症狀包括暫時失明、抑鬱症、癲癇發作、跌倒發作、肌陣攣、視幻覺、失神、共濟失調及快速發展之嚴重失智症。死亡通常在發作後2-10年(平均5年)發生。

目前對於患有拉弗拉病之患者尚無治癒或有效治療。然而，至少在疾病早期可用抗癲癇藥管控癲癇發作及肌陣攣。

如本文所用術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及諸如此類一般意指獲得期望藥理及/或生理效應。「治療」病況或疾病係指治癒以及改善該病況或疾病之至少一種症狀，且包括投與組合物，該組合物在有需要之個體中相對於未接受該組合物之個體減小醫學病況之症狀頻率或延遲症狀發作。如本文所用「治療」涵蓋對哺乳動物、尤其人類之疾病或病況之任何治療，且包括：(a)在可能易患疾病或病況但尚未開始經歷症狀之個體中預防該疾病或病況之症狀發生；(b)抑制該疾病或病況(例如，阻止其發展)；或(c)減輕該疾病或病況(例如，引起該疾病或病況消退，提供一或多種症狀之改良)。舉例而言，「治療」福布斯-柯裡氏病、龐貝氏病及/或安德森病涵蓋該疾病之完全逆轉或治癒，或歸因於福布斯-柯裡氏病、龐貝氏病及/或安德森病之症狀及/或不良效應之任何範圍之改良。類似地，涵蓋治療拉弗拉病及/或馮吉爾克病(包括GSD Ia及GSD Ib)且類似地涵蓋該疾病之完全逆轉或治癒，或歸因於該疾病之症狀及/或不良效應之任何範圍之改良。

僅用於說明，「治療」福布斯-柯裡氏病包括與福布斯-柯裡氏病相關之以下效應中之任一者或其組合之改良：骨骼肌病變、心肌病、肝硬化、肝腫大、低血糖症、身材矮小、異常血脂症、成長遲緩、智力遲鈍、面部異常、骨質疏鬆症、肌無力、疲勞及肌肉萎縮。治療亦可包括以下中之一或多者：細胞質肝醣之異常含量之降低，丙胺酸胺基轉移酶、天冬胺酸鹽胺基轉移酶、鹼性磷酸酶或肌酸磷酸激酶中之一或多者之升高含量之降低，例如血清中該等含量之降低。該等病況中之任一者之改良可易於根據業內已知之標準方法及技術來評價。亦可監測上文未列示之其他症狀以測定治療福布斯-柯裡氏病之有效性。藉由本發明方法治療之個體群體包括患有不期望病況或疾病之個體以及具有發生該病況或疾病之風險之個體。

僅用於說明，「治療」安德森病包括與安德森病相關之以下效應中之任一者或其組合之改良：肝功能障礙、關節彎曲、神經元功能障礙、成長遲緩、硬化、門靜脈高血壓、食管靜脈曲張、腹水、肝脾腫大、門靜脈高血壓、低張症、肌病、擴張型心肌病及預期壽命縮短。治療亦可包括細胞質肝醣之異常含量之降低中之一或多者。亦可監測上文未列示之其他症狀以測定治療安德森病之有效性。藉由本發明方法治療之個體群體包括患有不期望病況或疾病之個體以及具有發生該病況或疾病之風險之個體。

在某些實施例中，需要治療之個體係患有圍產期形式之安德森病(例如，圍產期形式之GSD IV)之個體。在其他實施例中，需要治療之個體係患有先天(嬰兒期)形式之安德森病之個體。在其他實施例中，需要治療之個體係患有兒童期(少年期)形式之安德森病之個體。在一些實施例中，有需要之個體係患有成年形式之安德森病之個體。因此，在某些實施例中，本發明提供藉由投與本發明嵌合多肽治療前述患者中之任一者之方法。在某些實施例中，本發明提供藉由投與本發明嵌合多肽在前述有需要之個體中之任一者中例如在骨骼肌、心肌及/或肝中減少細胞質肝醣累積之方法。

僅用於說明，「治療」龐貝氏病包括與GAA功能障礙相關之以下效應中之任一者(或其組合)之改良：降低之GAA活性(例如，治療增強GAA活性)、細胞中之肝醣累積(例如，治療減少肝醣累積)、增加之肌酸激酶含量、尿糖四糖之升高、心臟大小、肥厚性心肌病、呼吸系統併發症、對呼吸器之依賴性、肌肉功能障礙及/或虛弱、運動功能損失、對輪椅或其他形式之移動輔助設備之依賴性、對用於直立式坐姿之頸部或腹部支撐物之依賴性、肌肉纖維之超微結構損傷、肌肉張力及功能之損失。該等症狀中之任一者之改良可易於根據業內已知之標準方法及技術來評價。亦可監測上文未列示之其他症狀以測定治療龐貝氏病之有效性。

在某些實施例中，需要治療之個體係患有嬰兒期形式之龐貝氏病之個體。在其他實施例中，需要治療之個體係患有少年期發作或成年發作龐貝氏病之個體。因此，在某些實施例中，本發明提供藉由投與本發明嵌合多肽治療前述患者中之任一者之方法。在某些實施例中，本發明提供藉由投與本發明嵌合多肽在前述有需要之個體中之任一者中例如在骨骼肌、心肌及/或肝中減少細胞質肝醣累積之方法。

僅用於說明，「治療」馮吉爾克病包括與馮吉爾克病相關之以下效應中之任一者或其組合之改良：常常覺餓、易淤血及鼻出血、疲勞、易怒、臉頰浮腫、胸部及四肢消瘦、膨腹、青春期延遲、肝腫大、痛風、發炎性腸病、腎病、腎衰竭、骨質疏鬆症、癲癇發作、嗜睡、身高矮小、口腔潰瘍、腸潰瘍、肝腫瘤、低血糖症、關節炎、生長停滯、肺高血壓及/或不生長。亦可監測上文未列示之其他症狀以測定治療馮吉爾克病之有效性。藉由本發明方法治療之個體群體包括患有不期望病況或疾病之個體以及具有發生該病況或疾病之風險之個體。在某些實施例中，所治療個體係青少年且係在青春期開始之前加以治療。

僅用於說明，「治療」拉弗拉病包括與拉弗拉病相關之以下效應中之任一者或其組合之改良：失明、抑鬱症、癲癇發作、跌倒發作、肝病、肌肉萎縮、肌陣攣、視幻覺、失神、共濟失調、失智症及/或壽命縮短。亦可監測上文未列示之其他症狀以測定治療拉弗拉病之有效性。藉由本發明方法治療之個體群體包括患有不期望病況或疾病之個體以及具有發生該病況或疾病之風險之個體。在某些實施例中，所治療個體係在失智症發作之前或在可量測可感覺之失智症發作之前加以治療。

在某些實施例中，本發明提供將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素活性遞送至患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、馮吉爾克病或拉弗拉病之個體之細胞、例如肌肉及/或肝及/或腎細胞之方法，其包含投與本發明嵌合多肽或包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之本發明嵌合多肽之組合物。

術語「治療有效劑量」意指產生投與其所針對之期望效應之劑量。確切劑量將取決於治療目的，且將可由熟習此項技術者使用已知技術來確定(例如，參見Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。

在某些實施例中，本發明嵌合多肽之投與係經由本文所述投與途徑中之任一者，例如皮下、靜脈內或經由肝門靜脈。換言之，本發明涵蓋藉由經由任一該投與途徑投與來遞送之方法。

在某些實施例中，與未偶聯至內化性部分之GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽之以下遞送相比及/或與偶聯至不同內化性部分之GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽之遞送相比，該方法導致將更高GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素活性遞送至細胞質。

在某些實施例中，本發明之一或多種嵌合多肽可一起(同時)或在不同時間(依序)投與。另外，本發明嵌合多肽可單獨投與或與一或多種用於治療龐貝氏病及/或福布斯-柯裡氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病及/或安德森病之其他化合物或療法組合投與。舉例而言，一或多種嵌合多肽可結合一或多種其他治療性化合物共投與。在一些實施例中，一或多種嵌合多肽可結合阿葡萄糖苷酶α(Myozyme,Genzyme Corporation)共投與。在指示共投與時，組合療法可涵蓋同時或交替投與。另外，組合可涵蓋急性或慢性投與。視情況，本發明嵌合多肽及其他化合物以加和性或協同性方式作用於治療福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病。欲用於組合療法中之其他化合物包括(但不限於)小分子、多肽、抗體、反義寡核苷酸及siRNA分子。端視組合療法之性質，本發明嵌合多肽之投與可在投與另一療法的同時及/或其後繼續進行。嵌合多肽之投與可以單一劑量或以多個劑量進行。在一些情況下，嵌合多肽之投與係在另一療法之前至少若干天開始，而在其他情況下，投與係在即將投與另一療法時或在投與另一療法時開始。

一種類型之組合療法利用促進肌肉合成及/或脂肪減少之分子。可將諸如IGF-1、生長激素、類固醇、β-2激動劑(例如克倫特羅(Clenbuterol))及肌肉生長抑制素抑制劑等分子投與患者以構建肌肉組織並減少脂肪浸潤。該等分子亦可增加ENT2含量。因此，該等分子可在用本發明嵌合多肽治療開始之前、在治療之間或在用本發明嵌合多肽治療之後投與。

在一些實施例中，本文所述之任一嵌合多肽係與抗癲癇藥物組合投與個體(例如，患有拉弗拉病之個體)。

在組合療法之另一實例中，本發明之一或多種嵌合多肽可用作與一或多種其他治療模式組合之治療方案之一部分。舉例而言，該等其他治療模式包括(但不限於)膳食療法、職業療法、物理療法、呼吸機支持療法、按摩、針灸、針壓法、助行器、輔助動物及諸如此類。

在某些實施例中，本發明之一或多種嵌合多肽可在肝移植之前或之後投與。

注意，儘管本文所述嵌合多肽可與其他療法組合使用，但在某些實施例中，嵌合多肽係作為唯一治療形式來提供。不管係單獨或與其他藥物或治療方案組合投與，嵌合多肽之投與劑量、頻率、途徑及投與定時係由醫師基於患者之狀況及需要來確定。本發明涵蓋，一種方法可包含以一劑量且按投藥排程來投與，例如在一段時間期間以指定間隔投與。在該等情形中，每一劑量貢獻效能，且因此有效，但可能僅在投與多個劑量後才觀察到症狀之改良。

本發明嵌合多肽具有多種用途，包括活體外及活體內用途。活體內用途不僅包括治療用途，且亦包括在例如前述動物模型中之任一者中之診斷及研究用途。舉例而言，本發明嵌合多肽可用作研究試劑且遞送至動物以理解GAA在健康或患病動物中之生物活性、定位及運輸、蛋白質-蛋白質相互作用、酶活性及對動物生理學之影響。

嵌合多肽亦可在活體外用於評估(例如)培養中之細胞(包括培養中之健康的及GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素缺失細胞)之GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素生物活性、定位及運輸、蛋白質-蛋白質相互作用及酶活性。本發明涵蓋，本發明嵌合多肽可用於將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素遞送至細胞(包括培養中之細胞)之細胞質、溶酶體及/或自噬液泡。

本發明涵蓋，本文所述任一方法可藉由投與本發明嵌合多肽及/或本發明組合物(例如，包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之本發明嵌合多肽之組合物)或使細胞與其接觸來實施。

VI. 基因療法

習用基於病毒及非病毒之基因轉移方法可用於在哺乳動物細胞或靶組織中引入編碼GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素之多肽及/或包含GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素之嵌合多肽之核酸。在某些實施例中，用於本文所述方法中之嵌合多肽包含GAA多肽，但亦包括來自GAA多肽之其他多肽序列，包括與GAA多肽鄰接之序列。該等方法可用於將編碼本發明多肽(例如，GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素，包括其變體，且包括嵌合多肽)之核酸在活體外投與細胞。本發明涵蓋，基因轉移方法可用於遞送編碼本發明之任一嵌合多肽或GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽之核酸。在一些實施例中，投與編碼GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素之核酸用於活體內或離體基因療法用途。在其他實施例中，使用基因遞送技術在基於細胞之模型或動物模型中研究嵌合多肽或GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素多肽之活性，或研究福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或龐貝氏病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病，例如在遞送至健康或患病細胞及組織後評估細胞運輸、酶活性及蛋白質-蛋白質相互作用。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、裸核酸及與諸如脂質體等遞送媒劑複合之核酸。病毒載體遞送系統包括DNA及RNA病毒，其在遞送至細胞後具有游離或整合基因體。該等方法為業內所熟知。

非病毒遞送編碼本發明之經改造多肽之核酸之方法包括脂轉染、顯微注射、生物彈道學、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質：核酸偶聯物、裸DNA、人工病毒體及藥劑增強之DNA攝取。脂轉染方法及脂轉染試劑為業內所熟知(例如，Transfectam^TM及Lipofectin^TM)。適於多核苷酸之有效受體識別脂轉染之陽離子及中性脂質包括Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024之彼等。可遞送至細胞(離體投與)或靶組織(活體內投與)。脂質：核酸複合物(包括所靶向之脂質體，例如免疫脂質複合物)之製備為熟習此項技術者所熟知。

使用基於RNA或DNA病毒之系統來遞送編碼GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素或其變體之核酸利用將病毒靶向體內特定細胞並將病毒酬載運輸至核之高度演化方法。病毒載體可直接投與患者(活體內)或其可用於在活體外處理細胞並將經修飾細胞投與患者(離體)。用於遞送本發明多肽之習用基於病毒之系統可包括用於基因轉移之反轉錄病毒、慢病毒屬、腺病毒、腺相關及單純皰疹病毒載體。病毒載體係當前最有效且通用之在靶細胞及組織中進行基因轉移之方法。使用反轉錄病毒、慢病毒屬及腺相關病毒基因轉移方法在宿主基因體中之整合係可能的，通常導致所插入轉基因之長期表現。另外，已在多種不同細胞類型及靶組織中觀察到高轉導效率。

反轉錄病毒之向性可藉由納入外源套膜蛋白來改變，從而擴大靶細胞之潛在靶群體。慢病毒載體係能轉導或感染非分裂細胞且通常產生高病毒效價之反轉錄病毒載體。反轉錄病毒基因轉移系統之選擇因此將取決於靶組織。反轉錄病毒載體包括順式作用之長末端重複，其對至多6-10kb之外源序列具有包裝能力。最小順式作用LTR足以複製並包裝該等載體，然後其用於將治療性基因整合至靶細胞中以提供永久轉基因表現。廣泛使用之反轉錄病毒載體包括彼等基於以下病毒者：鼠類白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺失病毒(SW)、人類免疫缺失病毒(HIV)及其組合，其皆為業內所熟知。

在其中較佳短暫表現本發明多肽之應用中，通常使用基於腺病毒之系統。基於腺病毒之載體能在多種細胞類型中具有極高轉導效率且不需要細胞分裂。使用該等載體，已獲得表達之高效價及程度。此載體可在相對簡單之系統中大量產生。腺相關病毒(「AAV」)載體亦用於轉導具有靶核酸之細胞，例如在核酸及肽之活體外產生中，及用於活體內及離體基因療法程序。重組AAV載體之構築闡述於多個出版物中，包括美國專利第5,173,414號；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.5：3251-3260(1985)；Tratschin等人；Mol.Cell.Biol.4：2072-2081(1984)；Hermonat及Muzyczka,PNAS 81：6466-6470(1984)；及Samulski等人，J.Virol.63：03822-3828(1989)。

重組腺相關病毒載體(rAAV)係有前景之替代性基因遞送系統，其基於缺陷性且非病原性小病毒腺相關2型病毒。所有載體皆源自僅保留位於轉基因表現盒兩側之AAV 145bp倒置末端重複之質體。由於整合至經轉導細胞基因體中所致之有效基因轉移及穩定轉基因遞送係此載體系統之關鍵特徵。

複製缺失重組腺病毒載體(Ad)可經改造，使得轉基因置換Ad E1a、E1b及E3基因；隨後複製缺陷體載體在人類293細胞中繁殖，該等細胞供應轉基因中缺失之基因功能。Ad載體可在活體內轉導多種類型之組織，包括非分裂分化細胞，例如彼等在肝、腎及肌肉系統組織中所發現者。習用Ad載體具有較大攜載能力。

包裝細胞用於形成能感染宿主細胞之病毒顆粒。該等細胞包括包裝腺病毒之293細胞，及包裝反轉錄病毒之42細胞或PA317細胞。用於基因療法中之病毒載體通常係由將核酸載體包裝至病毒顆粒中之生產細胞系生成。載體通常含有包裝及隨後整合至宿主中所需之最小病毒序列，其他病毒序列由欲表現蛋白質之表現盒置換。藉由包裝細胞系在轉基因中供應失去的病毒功能。舉例而言，用於基因療法中之AAV載體通常僅具有來自AAV基因體之ITR序列，其為包裝並整合至宿主基因體中所需。病毒DNA包裝於細胞系中，其含有編碼其他AAV基因(即rep及cap)但缺少ITR序列之輔助質體。該細胞系亦經作為輔助體之腺病毒感染。輔助病毒促進AAV載體之複製及來自輔助質體之AAV基因之表現。輔助質體由於缺少ITR序列而並非以大量包裝。腺病毒污染可藉由(例如)熱處理來減少，腺病毒對該熱處理較AAV更敏感。

在多種基因療法應用中，期望以高度特異性將基因療法載體遞送至具體組織類型中。病毒載體通常藉由將配體表現為與病毒外表面上之病毒外殼蛋白之融合蛋白來修飾，以具有對給定細胞類型之特異性。配體經選擇以對已知存於所關注細胞類型上之受體具有親和性。此原則可擴展至其他表現配體融合蛋白之病毒與表現受體之靶細胞之對。舉例而言，絲狀噬菌體可經改造以展示對實際上任何所選擇細胞受體具有特異性結合親和性之抗體片段(例如，FAB或Fv)。儘管上述說明主要適用於病毒載體，但相同原則可適用於非病毒載體。該等載體可經改造以含有認為有利於特定靶細胞、例如肌肉細胞之攝取之特定攝取序列。

基因療法載體可藉由全身投與(例如，靜脈內、腹膜內、肌內、真皮下或顱內輸注)或局部施加投與個別患者來活體內遞送。或者，載體可離體遞送至細胞，例如自個別患者外植之細胞(例如，淋巴球、骨髓抽吸物、組織生檢)或通用供體造血幹細胞，之後通常在選擇已納入載體之細胞後，將該等細胞再植入患者中。

用於診斷、研究或用於基因療法(例如，經由將經轉染細胞再輸注至宿主生物體中)之離體細胞轉染為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，自個體生物體分離細胞，經編碼(例如)GAA(例如，成熟GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素或其變體之核酸(基因或cDNA)轉染，且再輸注回至個體生物體(例如，患者)中。適於離體轉染之各種細胞類型為熟習此項技術者所熟知。

在某些實施例中，在用於細胞轉染及基因療法之離體程序中使用幹細胞。使用幹細胞之優點在於，其可在活體外分化為其他細胞類型，或可引入哺乳動物(例如細胞供體)中，其中其將移入骨髓中。幹細胞使用已知方法經分離用於轉導及分化。

含有治療性核酸之載體(例如，反轉錄病毒、腺病毒、脂質體等)亦可直接投與生物體用於活體內轉導細胞。或者，可投與裸DNA。投與係藉由通常用於將分子引入與血液或組織細胞之最終接觸之任一途徑來實施。投與該等核酸之適宜方法係可或的且為熟習此項技術者所熟知，且儘管一種以上途徑可用於投與具體組合物，但一具體途徑通常可提供較另一途徑更直接且更有效之反應。

醫藥上可接受之載劑部分取決於所投與之具體組合物，以及用於投與該組合物之具體方法。因此，本發明醫藥組合物有眾多種適宜調配物，如本文所述。

VII. 投與方法

已知多種遞送系統可用於投與本發明嵌合多肽。可使用任一該等方法來投與本文所述之任一嵌合多肽。本發明涵蓋可使用本文所揭示之任一投與方法在本文所述任一方法(例如，治療方法；減少細胞質肝醣累積之方法)之情況下遞送本發明之任一嵌合多肽。

引入方法可係腸內或非經腸，包括(但不限於)真皮內、肌內、腹膜內、心肌內、靜脈內、皮下、經肺、鼻內、眼內、硬膜外、鞘內、顱內、室內及經口途徑。嵌合多肽可藉由任一便捷途徑來投與，例如藉由輸注或濃注注射，藉由經上皮或皮膚黏膜內襯(例如，口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身性或局部。

在某些實施例中，嵌合多肽係靜脈內投與。

在某些實施例中，可期望將本發明嵌合多肽局部投與需要治療之區域(例如，肌肉)；此可藉由(例如但不限於)在手術期間局部輸注、藉助導管或藉助植入體來達成，該植入體係多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜，例如矽橡膠膜、纖維或市售皮膚替代物。

在另一實施例中，該局部投與可投與至心臟之全部或一部分。舉例而言，投與可係心包內或心肌內投與。類似地，投與心臟組織可使用意欲用於將藥劑遞送至心臟不同區域之導管、絲線及諸如此類來達成。

在另一實施例中，局部投與係引導至肝。肝中之肝醣儲積及肝醣分解影響體內多種其他組織之肝醣利用度。舉例而言，可將靜脈導管置於肝門靜脈中以將嵌合多肽直接遞送至肝。另外，在其中嵌合多肽之內化性部分顯示對肝細胞之親和性低於對其他細胞類型之一些實施例中，經由肝門靜脈遞送確保足夠濃度之GAA(例如，成熟 GAA)、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素到達肝細胞。

注意，本發明涵蓋其中在相同或不同時間經由一種以上投與途徑投與嵌合多肽之方法。舉例而言，本發明涵蓋其中與經由肝門靜脈局部投與組合，將嵌合多肽全身性(例如藉由靜脈內輸注)投與之方案。

在其他實施例中，本發明嵌合多肽可在液泡、具體而言脂質體中遞送(參見Langer,1990,Science 249：1527-1533)。在另一實施例中，本發明嵌合多肽可在受控釋放系統中遞送。在另一實施例中，可使用幫浦(參見Langer,1990，上文文獻)。在另一實施例中，可使用聚合材料(參見Howard等人，1989,J.Neurosurg.71：105)。在某些特定實施例中，本發明嵌合多肽可靜脈內遞送。

在某些實施例中，嵌合多肽係藉由靜脈內輸注來投與。在某些實施例中，嵌合多肽係在至少10、至少15、至少20或至少30分鐘期間輸注。在其他實施例中，嵌合多肽係在至少60、90或120分鐘期間輸注。不管輸注期多久，本發明涵蓋，每次輸注係總體治療計劃之一部分，其中嵌合多肽係根據定期排程(例如，每週、每個月等)來投與。

上文適用於本文所述之嵌合多肽、組合物及方法中之任一者。本發明明確涵蓋該等嵌合多肽、組合物及方法(單獨或組合)之特徵與針對本章節中所述之多種醫藥組合物及投與途徑所述之特徵之任一組合。

VIII. 醫藥組合物

在某些實施例中，將用於本文所揭示之任一方法中之標的嵌合多肽與醫藥上可接受之載劑一起調配(例如，與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑一起調配)。一或多種嵌合多肽可單獨投與或作為醫藥調配物(組合物)之組份投與。本文所述之任一嵌合多肽可如本文所述來調配且任一該等組合物(例如，醫藥組合物或製劑或調配物) 可用於本文所述任一方法中。在某些實施例中，組合物包含含有全長GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之GAA多肽)之嵌合多肽。在其他實施例中，組合物包含含有成熟GAA多肽之嵌合多肽。在某些實施例中，組合物包括本發明之兩種或更多種嵌合多肽，例如包含約70kDa之成熟GAA之嵌合多肽及包含約76kDa之成熟GAA之嵌合多肽。在其他實施例中，組合物包含含有拉弗拉蛋白多肽之嵌合多肽。在其他實施例中，組合物包含含有AGL多肽之嵌合多肽。在其他實施例中，組合物包含含有馬啉素多肽之嵌合多肽。在其他實施例中，組合物包含含有α-澱粉酶多肽之嵌合多肽。嵌合多肽可經調配用於以任一便捷方式投與用於人類或獸醫醫學。潤濕劑、乳化劑及潤滑劑(例如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂)以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑及加香劑、防腐劑及抗氧化劑亦可存在於組合物中。

標的嵌合多肽之調配物包括(例如)彼等適於經口、經鼻、局部、非經腸、直腸及/或陰道內投與者。調配物可便捷地以單位劑型存在，且可藉由製藥領域熟知之任何方法來製備。可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成份之量將端視所治療主體及具體投與方式而變。可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成份之量一般將為產生治療效應之化合物之量。

在某些實施例中，製備該等調配物或組合物之方法包括組合另一類型之治療劑及載劑及視情況一或多種附加成份。一般而言，調配物可用液體載劑或精細固體載劑或二者來製備，然後若需要使產物成型。

在某些實施例中，本文所述之任一醫藥組合物包含集中量之本文所述之任一嵌合多肽。在一些實施例中，組合物具有與最初自產生該嵌合多肽之細胞純化之嵌合多肽之量相比，50%、100%、150%、200%、250%、300%、350%或400%更集中量之嵌合多肽。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/ml。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少10mg/ml或更高。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少15mg/ml或更高。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少20mg/ml或更高。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少30mg/ml或更高。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少50mg/ml或更高。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少70mg/ml或更高。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少90mg/ml或更高。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為至少110mg/ml或更高。在一些實施例中，嵌合多肽之濃度為10-50mg/ml、10-40mg/ml、10-30mg/ml、10-25mg/ml、10-20mg/ml、20-50mg/ml、50-70mg/ml、70-90mg/ml或90-110mg/ml。在一些實施例中，在4℃下儲存於醫藥上可接受之調配物中時，本文所述任一組合物在至少24小時、2天、4天、1週、2週或1個月中保留至少80%、90%、95%或100%生物學活性(如本文所定義)。在前述中之任一者之一些實施例中，組合物之嵌合多肽部分係實質上純的，如本文所述(例如，大於85%之所存在GAA與內化性部分結合或互連)。

適於經口投與之調配物可呈以下形式：膠囊、扁囊劑、丸劑、錠劑、菱形錠劑(使用矯味基質，通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍膠)、粉末、顆粒；或作為存於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液；或作為水包油型或油包水型液體乳液；或作為酏劑或糖漿劑；或作為軟錠劑(使用惰性基質，例如明膠及甘油，或蔗糖及阿拉伯膠)及/或作為漱口劑及諸如此類，每一者皆含有預定量之標的嵌合多肽治療劑作為活性成份。除活性化合物外，懸浮液可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇及山梨醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂及黃蓍膠及其混合物。

在用於經口投與之固體劑型(膠囊、錠劑、丸劑、糖衣錠、粉末、顆粒及諸如此類)中，可將本發明之一或多種嵌合多肽治療劑與一或多種醫藥上可接受之載劑(例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣)及/或以下中之任一者混合：(1)填充劑或增量劑，例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及/或矽酸；(2)黏合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉；(5)緩溶劑，例如石蠟；(6)吸收加速劑，例如四級銨化合物；(7)潤濕劑，例如鯨蠟醇及甘油單硬脂酸酯；(8)吸收劑，例如高嶺土及膨潤土；(9)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；及(10)著色劑。在膠囊、錠劑及丸劑之情形中，醫藥組合物亦可包含緩衝液。在使用諸如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇及諸如此類等賦形劑之軟質及硬質填充明膠膠囊中，亦可使用類似類型之固體組合物作為填充劑。經口投與之液體劑型包括醫藥上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿劑及酏劑。除活性成份外，液體劑型可含有業內常用之惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑；增溶劑及乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具體而言，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇及山梨醇酐脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物亦可包括佐劑，例如潤濕劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、加香劑及防腐劑。

在某些實施例中，本發明方法包括局部投與至皮膚或黏膜，例如彼等在子宮頸及陰道上之黏膜。局部調配物可進一步包括已知可有效作為皮膚或角質層滲透促進劑之眾多種試劑中之一或多者。該等試劑之實例係2-吡咯啶酮、N-甲基-2-吡咯啶酮、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、丙二醇、甲基或異丙基醇、二甲基亞碸及氮酮。可進一步包括其他試劑以使調配物為化妝品可接受。該等試劑之實例係脂肪、蠟、油、染料、香味劑、防腐劑、穩定劑及表面活性劑。亦可包括角質層分離劑，例如彼等業內已知者。實例係柳酸及硫。用於局部或經皮投與之劑型包括粉末、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏、洗液、凝膠、溶液、貼劑及吸入劑。標的多肽治療劑可在無菌條件下與醫藥上可接受之載劑及與可能需要之任何防腐劑、緩衝液(例如，HEPES緩衝液)或推進劑混合。除標的嵌合多肽劑以外，軟膏劑、糊劑、乳膏及凝膠可含有賦形劑，例如動物及植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧、膨潤土、矽酸、滑石粉及氧化鋅或其混合物。除標的嵌合多肽以外，粉末及噴霧劑可含有賦形劑，例如乳糖、滑石粉、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣及聚醯胺粉末或該等物質之混合物。噴霧劑可另外含有常規推進劑，例如氯氟烴類及未經取代之揮發性烴類，例如丁烷及丙烷。

適於非經腸投與之醫藥組合物可包含一或多種嵌合多肽與以下物質之組合：一或多種醫藥上可接受之無菌等滲水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液；或無菌粉末，其可在即將使用前重構為無菌可注射溶液或分散液，該等物質可含有抗氧化劑、緩衝液(例如HEPES緩衝液)、抑菌劑、可使調配物與既定接受者之血液等滲之溶質或懸浮劑或增稠劑。可用於本發明醫藥組合物中之適宜水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物、植物油(例如橄欖油)及可注射有機酯(例如油酸乙酯)。可藉由(例如)使用諸如卵磷脂等包衣材料、在分散劑情形中藉由維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。

該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可藉由納入各種抗細菌及抗真菌劑來確保防止微生物作用，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及諸如此類。亦可期望在組合物中包括等滲劑，例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外，可注射醫藥形式之長效吸收可藉由納入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。

可注射儲積形式係藉由在生物可降解聚合物(例如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成一或多種多肽治療劑之微囊基質來製備。端視藥物對聚合物之比率及所用具體聚合物之性質，可控制藥物釋放速率。其他生物可降解聚合物之實例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。儲積可注射調配物亦係藉由將藥物包裹於與身體組織相容之脂質體或微乳液中來製備。

在較佳實施例中，本發明嵌合多肽係根據常規程序調配為適於靜脈內投與人類之醫藥組合物。若需要，組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑(例如利多卡因(lidocaine))以減輕注射位點處之疼痛。倘若組合物欲藉由輸注來投與，則可用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶來分配該組合物。倘若組合物藉由注射來投與，則可提供含有注射用無菌水或鹽水之安瓿，使得可在投與之前混合各成份。

在另一實施例中，本發明嵌合多肽經調配用於皮下投與人類。

在某些實施例中，本發明嵌合多肽經調配用於鞘內、顱內及/或室內遞送。在某些實施例中，用於治療拉弗拉病或用於在神經元中(例如在患有拉弗拉病之個體中)減少肝醣累積之本發明嵌合多肽經調配用於鞘內、顱內及/或室內遞送。在某些實施例中，本發明方法、例如用於治療拉弗拉病或用於在神經元中減少肝醣累積之方法包含鞘內、顱內及/或室內遞送本發明嵌合多肽。

在某些實施例中，本發明嵌合多肽經調配用於遞送至心臟，例如用於心肌內或心包內遞送。

在某些實施例中，組合物意欲用於經由肝門靜脈局部投與肝，且相應地調配嵌合多肽。

注意，在某些實施例中，具體調配物適用於經由一種以上途徑遞送之情況。因此，例如，適於靜脈內輸注之調配物亦可適於經由肝門靜脈遞送。然而，在其他實施例中，調配物適用於一種遞送途徑之情況，但不適用於另一種遞送途徑之情況。

將在組織相關病況或疾病(例如，龐貝氏病及/或福布斯-柯裡氏病及/或安德森病及/或馮吉爾克病及/或拉弗拉病)之治療中有效之本發明嵌合多肽之量可藉由標準臨床技術來確定。另外，可視情況採用活體外分析來幫助鑒定最佳劑量範圍。欲用於調配物中之確切劑量亦將取決於投與途徑及病況之嚴重性，且應根據從業醫師之判斷及每一個體之情況來決定。然而，用於靜脈內投與之適宜劑量範圍一般為約20-5000微克活性嵌合多肽/公斤體重。用於鼻內投與之適宜劑量範圍一般為約0.01pg/kg體重至1mg/kg體重。可根據自活體外或動物模型測試系統獲得之劑量反應曲線來推斷有效劑量。

在某些實施例中，本發明組合物(包括醫藥製劑)係非致熱性。換言之，在某些實施例中，組合物實質上不含熱原。在一個實施例中，本發明係不含熱原之調配物，其實質上不含內毒素及/或相關致熱性物質。內毒素包括限於微生物內部且僅在該等微生物破裂或死亡時釋放之毒素。致熱性物質亦包括來自細菌及其他微生物外膜之誘導發熱之熱穩定物質(糖蛋白)。該等物質二者若投與人類皆可引起發熱、低血壓及休克。由於潛在有害效應，即使低量的內毒素亦必須自靜脈內投與之醫藥藥物溶液中移除。食品藥品監督管理局(「FDA」)已設立對於靜脈內藥物施加在單一一小時時段中5個內毒素單位(EU)/劑量/公斤體重之上限(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26(1)：223(2000))。在治療性蛋白質以相對較大劑量及/或在延長時間段期間(例如，在患者整個生命中)投與時，即使少量的有害且危險的內毒素亦可係危險的。在某些特定實施例中，組合物中之內毒素及熱原含量小於10EU/mg，或小於5EU/mg，或小於1EU/mg，或小於0.1EU/mg，或小於0.01EU/mg，或小於0.001EU/mg。

在一些實施例中，本發明提供組合物，例如包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之本發明嵌合多肽之醫藥組合物。該等組合物包括包含本文所述之任一內化性部分及如本文所述包含之GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素部分之組合物。舉例而言，本發明提供包含含有GAA之嵌合多肽、含有AGL之嵌合多肽、含有拉弗拉蛋白之嵌合多肽、含有α-澱粉酶之嵌合多肽或含有馬啉素之嵌合多肽之組合物。在某些實施例中，本文所述任一組合物可基於本文所述之GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素部分及/或內化性部分中之任一者來闡述。此外，任一該等組合物可基於本文所述結構及/或功能特徵中之任一者來闡述。任一該等組合物可用於本文所述任一方法，例如投與需要治療之細胞及/或個體，例如投與患有龐貝氏病、馮吉爾克病、福布斯-柯裡氏病、拉弗拉病或安德森病之細胞及/或個體。任一該等組合物可用於將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素活性遞送至細胞中，例如遞送至有需要之患者(例如，患有龐貝氏病、馮吉爾克病、福布斯-柯裡氏病、拉弗拉病或安德森病之患者)之肌肉及/或肝細胞中。

在某些實施例中，本發明提供包含含有GAA之嵌合多肽之組合物，且存於組合物中之GAA經富集，使得大部分存於該組合物中之GAA相同或實質上相同，例如具有實質上相同的胺基酸序列或與內化性部分之相同互連。舉例而言，在嵌合多肽中存在免疫球蛋白或表位標識(例如HA或myc標識)之全部或一部分提供用於純化嵌合多肽之區域。在一些實施例中，使用嵌合多肽之標識或免疫球蛋白部分進行純化，使得包含本發明嵌合多肽之組合物相對於未互連至內化性部分之GAA部分經富集及/或實質上純化。舉例而言，在某些實施例中，GAA之存在經富集，使得大於90%(大於90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大於99%)之組合物中之GAA係作為互連至內化性部分之多肽而存在。在其他實施例中，組合物經富集，使得大於80%、大於85%、大於90%或大於95%(例如，大於80%、85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大於99%)之組合物中之GAA具有大致相同的分子量及/或在GAA部分之N-末端相差小於5、4、3、2或1個殘基。換言之，在某些實施例中，小於20%(例如，小於10%、9%、8%、7%、6%、5%)之存於組合物中之GAA具有不同分子量及/或在GAA部分之N-末端相差小於5、4、3、2或1個殘基及/或未互連至內化性部分。

該等組合物(包括本文所述任一組合物)可在(例如)瓶或注射器中提供且在投與之前儲存。

在某些實施例中，本發明提供包含本文所述之任一嵌合多肽之醫藥組合物，其中至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。在一些實施例中，醫藥組合物包含嵌合多肽，其中至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之該組合物中之嵌合多肽具有相同胺基酸序列，或相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，醫藥組合物包含嵌合多肽，其中至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之該組合物中之GAA多肽具有相同胺基酸序列，或相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或 1個胺基酸殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，醫藥組合物包含嵌合多肽，其中至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之嵌合多肽或該組合物中之GAA多肽具有相同或實質上相同的分子量。在某些實施例中，組合物實質上不含不包括其他鄰接GAA序列之成熟GAA。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。在某些實施例中，此一百分比係基於組合物中之GAA物質來計算，如藉由SEC或考馬斯(coomasie)染色凝膠所評估。換言之，在某些實施例中，至少85%之存於該組合物中之GAA物質(如藉由SEC或考馬斯染色凝膠所評估)互連至內化性部分，例如與抗體或Fab結合。在其他實施例中，此一百分比係以重量計(例如，至少85重量%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分，例如與抗體或Fab結合。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，大於85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大於99%之存於該組合物中之GAA具有實質上相同的胺基酸序列。在某些實施例中，大於90%(91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大於99%)之存於該組合物中之GAA多肽具有相同的與內化性部分之互連。在某些實施例中，至少95%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。

在某些實施例中，大於85%(大於或至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大於或至少99%)之存於該組合物中之GAA多肽具有大致相同的分子量。

在某些實施例中，大於90%(大於或至少91%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大於或至少99%)之存於該組合物中之GAA多肽在GAA多肽部分之N-末端相差小於5、4、3、2或1個殘基。在某些實施例中，大於85%(大於或至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大於或至少99%)之存於該組合物中之GAA多肽在GAA多肽部分之C-末端相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個殘基。

在某些實施例中，組合物實質上不含不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。在某些實施例中，組合物實質上不含不互連至內化性部分之成熟GAA。

在某些實施例中，組合物實質上不含成熟GAA。在某些實施例中，組合物包含小於5%(例如以重量計)之不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%之該組合物中之嵌合多肽包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%之存於該組合物中之GAA包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，組合物實質上不含不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。在某些實施例中，至少91%(大於90%或至少91%或大於或至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或大於或至少99%)之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分。在某些實施例中，此百分比係在保留抗體重鏈及輕鏈之結合之條件下測定。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%之存於該組合物中之嵌合多肽具有相同胺基酸序列。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%之存於該組合物中之GAA具有相同胺基酸序列。

在某些實施例中，本發明提供包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。在某些實施例中，小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小於1%之存於該組合物中之GAA係成熟GAA多肽。在某些實施例中，小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小於1%之存於該組合物中之GAA係未與內化性部分結合或互連之成熟GAA多肽。

在某些實施例(包括前述中之任一者之某些實施例或其他實施例)中，百分比係基於如藉由SEC或考馬斯染色凝膠所評估之組合物中之GAA物質(或嵌合多肽物質)來計算。換言之，在某些實施例中，如藉由SEC(例如，SEC-HPLC)或考馬斯染色凝膠所評估，至少85%之存於該組合物中之GAA物質(或嵌合多肽物質)互連至內化性部分，例如與抗體或Fab結合，或至少85%之存於該組合物中之GAA物質(例如偶聯至內化性部分之物質)或嵌合多肽物質具有相同胺基酸序列或相差小於(例如)10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基之胺基酸序列。在其他實施例中，此一百分比係以重量計(例如，至少85重量%之存於該組合物中之GAA多肽互連至內化性部分，例如與抗體或Fab結合)。在某些實施例中，SEC或考馬斯藍染色係在維持抗體或抗原結合片段之重鏈及輕鏈之結合之條件下(例如在內化性部分係抗體或抗原結合片段時)實施。

在某些實施例中，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之調配物中之多肽係包含與內化性部分結合或互連之GAA多肽之嵌合多肽。在某些實施例中，組合物中之多肽之百分比係以重量計及/或藉由SEC或考馬斯藍染色來評價。

在某些實施例中，前述百分比中之任一者(例如，至少85%或大於91%)亦可表示為一範圍(例如，85%-95%、90-98%、91-95%、91-96%、91-97%、91-98%、91-99%、95-97%、95-98%、95-99%等)。

在前述任一者之某些實施例中，GAA多肽部分係本文所述之任一GAA多肽部分且內化性部分係本文所述之任一內化性部分。

IX.動物模型 a. 福布斯-柯裡氏病

在其AGL基因中具有框移突變之捲毛尋回犬展示與人類之福布斯-柯裡氏病類似之疾病(Yi等人，2012,Disease Models and Mechanisms,5：804-811)。該等犬在其肝及肌肉中具有異常高之肝醣沈積，且與肌肉及肝損傷一致，在其血清中具有高且逐漸增加之丙胺酸胺基轉移酶、天冬胺酸鹽胺基轉移酶、鹼性磷酸酶及肌酸磷酸激酶含量。參見Yi等人。另外，該等犬展示進行性肝纖維化及肌肉細胞收縮器之破壞及肌原纖維之磨損。參見Yi等人。因此，此福布斯-柯裡氏病之犬模型非常類似於人類疾病，其中肝及骨骼肌中之肝醣累積導致進行性肝纖維化及肌病。參見Yi等人。

最近亦已研發福布斯-柯裡氏病之小鼠模型。在此模型中，小鼠在AGL基因中具有單一ENU誘導鹼基對突變。與福布斯-柯裡氏病之人類患者類似，該等小鼠展現持續升高之丙胺酸胺基轉移酶及天冬胺酸鹽胺基轉移酶含量，該等含量指示肝損傷。Anstee等人，2011,J.Hepatology,54(增刊1-摘要887)：S353。該等小鼠亦展示顯著增加之肝肝醣沈積。參見Anstee等人。因此，該等小鼠展示若干個在福布斯-柯裡氏病之人類患者中亦觀察到之關鍵特徵。

該等模型提供用於評價標的嵌合多肽之活性及有效性之適宜動物模型系統。該等模型與福布斯-柯裡氏病之症狀具有關聯，且因此提供用於研究福布斯-柯裡氏病之適當模型。可在一個或兩個模型中評價該多肽之活性，且將結果與在野生型對照動物及未經該等嵌合多肽治療之動物中所觀察者相比較。可用於評價本文所揭示之任一嵌合多肽在治療福布斯-柯裡氏病小鼠或犬中之效能之分析包括(例如)：評價血清中之丙胺酸胺基轉移酶、天冬胺酸鹽胺基轉移酶、鹼性磷酸酶及/或肌酸磷酸激酶含量之分析；評價來自經治療及未經治療之福布斯-柯裡氏病小鼠或犬之生檢中之肝醣含量之分析(例如，藉由使用例如用於測定肝醣含量之過碘酸雪夫氏染色來檢查肌肉或肝生檢中之肝醣含量)；評價組織肝醣含量之分析(例如，參見Yi等人，2012)；及/或在經治療及未經治療之福布斯-柯裡氏病犬或小鼠中監測肌肉功能、心臟功能、肝功能及/或壽命之分析。用於測試本文所揭示之嵌合多肽之活性之活體外分析的另一實例可係細胞或無細胞分析，其中評價是否嵌合多肽水解作為受質之4-甲基傘形酮基-α-D-葡萄糖苷之能力。

b. 安德森病

對於其GBE1基因中之外顯子12之損失為同型接合之挪威森林貓展示類似於人類安德森病之疾病(Fyfe等人，2007,Molecular Genetics and Metabolism,90(4)：383-392)。大多數患有此疾病之貓在出生後不久死亡。存活之安德森病貓直至約5個月齡之前表現正常，之後會導致嚴重肌無力、萎縮、攣縮及不能使用後肢。該等貓中多種組織之細胞(包括肌肉細胞、肝細胞及神經元)之特徵在於具有對於肝醣染色呈陽性之包涵體集群(Fyfe等人，1992,Pediatric Research,32(6)：719-725)。若干種組織(包括骨骼肌、心肌及中樞神經系統神經元)顯示退化體徵。存活至成年期之貓通常因心臟衰竭而突然死亡(Fyfe等人，1992)。

亦已研發若干種安德森病小鼠模型。早髮型安德森病小鼠模型係藉由利用FLPe介導之外顯子7之同型接合缺失來研發(Akman,2011,Hum Mol Genet,20(22)：4430-9及Akman,2014,Neurology,82(1)：P1.054)。缺少外顯子7之小鼠無GBE活性及早髮型致死。已生成另一早髮型胎兒安德森病模型，其中小鼠係使用基因驅使之ENU(N-乙基-N-硝基脲)-誘變方法經改造以在Gbe1基因中攜載終止突變(E609X)。該等E609X小鼠在懷孕中期及晚期之間展示胎兒水腫及致死，重述人類安德森病之嚴重胎兒神經肌肉形式之臨床特徵(Lee等人，2010,Hum Mol Genet,20(3)：455-465)。另外，已研發安德森病之少年期及成年發作模型。舉例而言，生成安德森病之少年期及成年發作小鼠模型，其在GBE基因之內含子7內含有激酶-新黴素盒，導致GBE表現降低。此少年期及成年發作小鼠模型展示進行性神經肌肉功能障礙、肌肉細胞及肝細胞中之異常肝醣累積以及壽命縮短(Akman等人，2011)。生成另一成年發作安德森病模型，其中將Y329S人類突變插入中小鼠Gbe1基因之外顯子7中，導致該等小鼠之GBE活性降低(Akman,2014)。對於Y329S突變為同型接合之轉基因小鼠展現類似於成年發作安德森病之表型，具有廣泛分佈之葡聚糖累積。該等Y329S小鼠亦展示進行性神經肌肉功能障礙。

c. 馮吉爾克病

發現經改造而缺失G6Pase-α或G6PT活性之小鼠可分別模擬GSD-Ia及GSD-Ib之人類情形(Lei等人，1996,Nat Genet.,13：203-209；Chen等人，2003,Hum Mol Genet,12：2547-2558；Kim等人，2007,FEBS Lett.,581(20)：3833-38)。GSD-1b小鼠表現血糖穩態紊亂特有之代謝異常且亦經受GSD-Ib特有之嗜中性球減少症及嗜中性球功能障礙。類似於GSD-Ia之人類情形，GSD-Ia小鼠具有顯著增加之顆粒球群落刺激因子(G-CSF)及細胞介素誘導之嗜中性球化學吸引劑(KC)之含量。

GSD-Ia之犬模型亦存在(Kishnani等人，2001,Vet Pathol,38(1)：83-91)且在臨床上、生物化學上及病理學上類似於GSD-Ia之人類情形。該犬模型對於M121I GSD-Ia突變為同型接合，該突變導致突變之缺陷性G6P酶基因。對於此突變為同型接合之犬在血糖過低時展現顫抖、虛弱及神經病學體徵。另外，該等動物患有出生後生長遲緩及進行性肝腫大。在該等動物中觀察到生物化學異常，包括禁食低血糖症、高乳酸血症、高膽固醇血症、高三酸甘油脂血症及高尿酸血症。在一些患病動物之腎中，存在節段性腎小球硬化症及近曲小管上皮之空泡形成。該等動物亦與肝及腎中增加之肝肝醣含量及分離之顯著降低之G-6-Pase酶活性相關(Kishnani等人，2001)。

d. 拉弗拉病

經改造缺失馬啉素之小鼠展示類似於在拉弗拉病之人類情形中所觀察之表型。特定而言，馬啉素^-/-小鼠以年齡依賴性方式呈現神經退化、增加之突觸興奮性及經受肌陣攣發作之傾向。Valles-Ortega等人，2011,EMBO Mol Med,3(11)：667-681。另外，該等小鼠累積填充肝醣之包涵體，該等包涵體在海馬體及小腦中最豐富，但亦發現於骨骼肌及心肌細胞中。Valles-Ortega等人。亦發現與在健康對照小鼠之細胞中觀察之肝醣相比，肝醣在馬啉素^-/-小鼠之細胞中較少分支。Valles-Ortega等人。在此小鼠模型中亦闡述升高程度之肝醣過磷酸化。Turnbull等人，2010,Ann Neurol,68(6)：925-33。

經改造缺失拉弗拉蛋白之小鼠亦展示與拉弗拉病之人類情形之一些表型相似性。特定而言，拉弗拉蛋白^-/-小鼠出生時發育正常，但發生年齡依賴性共濟失調及肌陣攣癲癇。Ganesh等人，2002,Hum Mol Genet,11(11)：1251-62。另外，拉弗拉蛋白^-/-小鼠截至兩個月齡時展示廣泛分佈之神經元退化且截至4-12個月齡時展示包涵體之出現。Ganesh等人，2002。缺失拉弗拉蛋白之小鼠亦在腦中展示過磷酸化及tau蛋白聚集。Puri等人，2009,J Biol Chem,284(34)：22657-63。

e. 龐貝氏病

龐貝氏病已在諸如以下等動物中建模：婆羅門牛及短角牛、萊普蘭犬、貓、綿羊及日本鵪鶉品系(Kikuchi等人，Clinical and Metabolic Correction of Pompe Disease by Enzyme Therapy in Acid Maltase-deficient Quail,J.Clin.Invest.,101(4)：827-833,1998)。另外，已藉由靶向GAA基因之破壞來研發小鼠模型(概述於Geel等人，Pompe Disease：Current state of treatment modalities and animal models,Molecular Genetics and Metabolism 92：299-307,2007)。簡言之，具有GAA基因之外顯子13敲除之小鼠在肝、心臟及骨骼肌細胞之溶酶體中展現肝醣累積，但表型保持正常(Bijvoet等人，Generalized glycogen storage and cardiomegaly in a knockout mouse model of Pompe Disease,Human Molecular Genetics,7(1)：53-62,1998)。研發其中GAA基因之外顯子6藉由兩側為LoxP位點之新黴素抗性基因置換之小鼠，且在若干個組織中缺少GAA功能。此小鼠亦已與產生Cre之小鼠雜交，且所得後代在心臟及骨骼肌中具有異常溶酶體肝醣儲積 (Raben等人，Targeted Disruption of the Acid α-Glucosidase Gene in Mice Causes an Illness with Critical Features of Both Infantile and Adult Human Glycogen Storage Disease Type II,J.Biological Chemistry,272(30)：19086-19092,1998)。類似小鼠模型已靶向用新黴素盒置換外顯子14且與新黴素-外顯子6小鼠相當(Raben等人，Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene,Neuromuscl.Disord.10：283-291,2000)。已研發另外兩種小鼠模型來解決免疫反應問題：在一種小鼠模型中靶向外顯子6缺失以維持肝中之GAA功能，同時在其他組織中保持疾病表型，且一種係SCID小鼠中之GAA敲除小鼠模型，其在投與hGAA後不產生抗hGAA抗體(Raben等人，Induction of tolerance to a recombinant human enzyme,acid alpha-glucosidase,in enzyme deficient knockout mice,Transgenic Research,12：171-178,2003；Xu等人，Improved efficacy of gene therapy approaches for Pompe Disease using a new,immune-deficient GSD-II mouse model,Gene Therapy,11：15890-1598,2004)。最近，已研發雙重KO小鼠，其使GAA缺失與肝醣合酶1缺失配對以幫助測定降低之肝醣產生之效應(Xu等人，Impaired organization and function of myofilaments in single muscle fibers from a mouse model of Pompe Disease,J Appl Physiol 108：1383-1388,2010)。

f. 福布斯-柯裡氏病及安德森病及馮吉爾克病及拉弗拉病及龐貝氏病

因此，在某些實施例中，本發明涵蓋在任何一或多個動物模型(例如本文所述之小鼠模型)中使用本文所揭示之本發明GAA構築體(例如，本發明包含成熟GAA之嵌合多肽，例如包含GAA多肽部分及內化性部分之嵌合多肽)調查疾病表型之改良之方法。舉例而言，可在經標的嵌合多肽治療之實驗動物中檢查多個參數，且可將該等動物與對照進行比較。可評價以評估潛在效能之實例性參數包括(但不限於)：壽命之延長；肝醣清除之增加、肝醣累積之減少及改良之肌肉強度(例如在曠野及掛明線範例中)、改良之心臟功能、改良之肝功能、改良之腎功能或肝大小之降低。肝醣清除之增加及肝醣累積之減少可藉由(例如)來自經治療或未經治療之動物模型之生檢(例如，肌肉、肝或神經元)中之過碘酸雪夫氏染色來評價。在某些實施例中，本發明提供在患有前述任一病況之個體中減少細胞質肝醣累積之方法。

此外，確定用於測定本文所述之任一嵌合多肽之有效劑量、清除速率、分佈體積及半衰期之完整藥物動力學研究。可在諸如大鼠、犬及靈長類動物等較大動物中檢查最終產物之PK/PD/TK。

上述模型係用於評價標的嵌合多肽及/或調配物之活性及有效性之適宜動物模型系統之實例。該等模型與GSDI、GSD II、GSD III、GSD IV及拉弗拉病之症狀具有關聯，且因此分別提供用於研究馮吉爾克病、龐貝氏病、福布斯-柯裡氏病、安德森病及/或拉弗拉病之適當模型。在任何一或多個該等模型中評價標的嵌合多肽及/或調配物之活性，且將結果與在野生型對照動物及未經該等嵌合多肽治療之動物(或僅經GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素治療)中觀察者相比較。類似地，可使用培養中之細胞(例如，自前述突變體小鼠或其他動物中之任一者製備之細胞)以及野生型細胞(例如纖維母細胞、肌母細胞或肝細胞)來評估標的嵌合多肽。亦可使用來自患病個體之細胞。另外，無細胞系統可用於評價(例如)標的嵌合多肽之酶活性。用於測試本文所揭示之嵌合多肽之活性之活體外分析之實例將係用或不用嵌合多肽治療龐貝氏病、馮吉爾克病、福布斯-柯裡氏病、拉弗拉病及/或安德森病細胞，然後在培育時期後，針對肝醣之存在藉由(例如)使用過碘酸雪夫氏(PAS)染色對細胞進行染色。用於測試本文所揭示之嵌合多肽(例如包含GAA多肽之嵌合多肽)之活性之活體外分析之另一實例將係細胞或無細胞分析，其中評價嵌合多肽水解作為受質之4-甲基傘形酮基-α-D-葡萄糖苷之能力。亦可在經處理或未經處理細胞中監測細胞增殖、形態及細胞死亡。

本發明嵌合多肽具有多種用途，包括活體外及活體內用途。活體內用途不僅包括治療性用途，且亦包括在例如前述任一動物模型中之診斷及研究用途。舉例而言，本發明嵌合多肽可用作研究試劑並遞送至動物以理解GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素在健康或患病動物中之生物活性、定位及運輸、蛋白質-蛋白質相互作用、酶活性及對動物生理學之影響。

嵌合多肽亦可在活體外用於評估(例如)GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素在培養中之細胞(包括培養中之健康、患病(但並非GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素缺失細胞)及GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素缺失細胞)中之生物活性、定位及運輸、蛋白質-蛋白質相互作用及酶活性。本發明涵蓋，本發明嵌合多肽可用於將GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素遞送至細胞(包括培養中之細胞)之細胞質、溶酶體及/或自噬液泡。

嵌合多肽(例如GAA嵌合多肽)可進一步用於在其中不缺失諸如GAA等蛋白質之系統中、例如在拉弗拉病中鑑別蛋白質-蛋白質相互作用。嵌合多肽可進一步用於理解在某些細胞類型但可能並非所有其中存在症狀之細胞類型中減少肝醣累積之相對益處。嵌合多肽可用於尤其在其中內源GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素並未突變之環境中鑑別GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL及/或馬啉素之受質。嵌合多肽可用於評估GAA、拉弗拉蛋白、α-澱粉酶、AGL 及/或馬啉素及嵌合多肽在健康細胞以及其中由於不同潛在原因導致肝醣累積之患病細胞中之運輸。

X. 套組

在某些實施例中，本發明亦提供醫藥包裝或套組，其包含一或多個填充有至少一種本發明嵌合多肽之容器。視情況，該(等)容器可附帶有呈監管醫藥品或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告，該公告反映(a)該機構已批准用於人類投與之製造、使用或銷售，(b)使用說明，或二者。

在某些實施例中，該套組包括促進遞送標的嵌合多肽之其他材料。舉例而言，套組可包括導管、管道、輸注袋、注射器及諸如此類中之一或多者。在某些實施例中，將嵌合多肽以凍乾形式包裝，且該套組包括至少兩個容器：一個容器包含凍乾嵌合多肽且一個容器包含適宜量之水、緩衝液(例如，HEPES緩衝液)或適於重構凍乾材料之其他液體。

上文適用於本文所述之嵌合多肽、組合物及方法中之任一者。本發明明確涵蓋該等嵌合多肽、組合物及方法(單獨或組合)之特徵與針對本章節中所述各種套組所述之特徵之任一組合。

例證

現大概闡述本發明，參照以下實例將更易於理解本發明，該等實例僅出於闡釋本發明之某些態樣及實施例之目的而被包括，且不欲限制本發明。舉例而言，本文所揭示之具體構築體及實驗設計代表用於驗證適當功能之實例性工具及方法。因此，將易於瞭解，所揭示之任一特定構築體及實驗計劃可在本發明範圍內被取代。

實例1：3E10 mAb-GAA及3E10 Fab-GAA融合構築體之生成

根據Hacker等人，2013,Protein Expr Purif.92：67中所述之方案來表現代表性嵌合多肽。特定而言，重組製備包含GAA多肽部分及內化性部分之嵌合多肽。在此實驗中，包含GAA多肽之GAA多肽融合至包含SEQ ID NO：10中所述輕鏈可變結構域及SEQ ID NO：9中所述重鏈可變結構域之全長鼠類單株3E10抗體(內化性部分)或融合至此3E10抗體之Fab(參見圖1)。特定而言，在此實例中，具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽融合至鼠類3E10 Fab片段之重鏈恆定區之C-末端或融合至全長鼠類3E10單株抗體(mAb)之重鏈恆定區之C-末端。在此實例中，內化性部分之重鏈包含鼠類3E10抗體，其包含前述VH及包含CH1、鉸鏈、CH2及CH3區域之鼠類重鏈恆定結構域(在全長抗體情形中)或包含CH1及上鉸鏈區之重鏈恆定結構域，例如來自IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG4抗體之恆定結構域區域。在任一情形中，將表現重組重鏈之核苷酸序列及編碼包含前述3E10 VL之輕鏈之核苷酸序列插入單獨載體中且短暫轉染至CHO-DG44細胞中，以產生重組嵌合蛋白質。類似地，編碼重鏈及輕鏈之核苷酸序列可自單一載體表現。該等嵌合構築體示意性顯示於圖1中。

在此實例中，使用連接體序列將GAA多肽融合至Fab或mAb重鏈，且該連接體具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列。此提供其中內化性部分係全長抗體之嵌合多肽以及其中內化性部分係抗原結合片段(此處係Fab)之嵌合多肽之實例。亦涵蓋其中GAA部分包含本文所述之任一GAA多肽或由其組成之嵌合多肽且係以類似方式製備，以及涵蓋其中內化性部分係本文所述之任一內化性部分之嵌合多肽且係以類似方式製備，及所有適宜組合。

實例2：mu3E10 mAb-GAA及3E10 Fab-GAA之生成及表徵

重組製備包含GAA多肽部分及內化性部分之嵌合多肽。此處，內化性部分係全長抗體或Fab，包含如SEQ ID NO：9中所述之重鏈可變結構域及如SEQ ID NO：10中所述之輕鏈可變結構域。對於3E10 mAb及3E10 Fab蛋白質二者，使用具有SEQ ID NO：35之胺基酸序列之輕鏈，其包括信號序列(SEQ ID NO：33)。然而，應認識到，該信號序列裂解且不存於最終蛋白質產物中。對於3E10 mAb及3E10 Fab蛋白質二者，藉助撓性gly-ser連接體(SEQ ID NO：30)將具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽融合(例如，將該等蛋白質製為融合蛋白)至3E10 mAb或3E10 Fab重鏈之C-末端部分。3E10 mAb重鏈由SEQ ID NO：37之胺基酸序列(SEQ ID NO：36之信號序列+SEQ ID NO：9之VH序列)及以下恆定結構域方案組成：鼠類IgG2a CH1-muIgG1鉸鏈-muIgG1 CH2-CH3。mu3E10 Fab重鏈由SEQ ID NO：37之胺基酸序列(SEQ ID NO：36之信號序列+SEQ ID NO：9之VH序列)及以下恆定結構域方案組成：鼠類IgG2a CH1-muIgG1上鉸鏈。SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：36之信號序列不存於成熟mu3E10 mAb或mu3E10 Fab蛋白質中(例如，該信號序列不存於最終抗體產物中，而在產生期間裂解)。

對於其中內化性部分係全長抗體之嵌合多肽及其中內化性部分係Fab之嵌合多肽二者，將表現重組重鏈及輕鏈之核苷酸序列短暫轉染至CHOExpress^TM細胞中，以產生重組嵌合蛋白質。3E10 mAb及3E10 Fab嵌合多肽二者皆顯示自經轉染CHOExpress^TM細胞之強表現及分泌。

在類似實驗中，亦使用CHOExpress^TM細胞表現系統生成3E10 Fab-GAA融合蛋白之人類化形式。特定而言，人類化3E10 Fab-GAA係藉由短暫CHO細胞表現來表現且在CaptureSelect IgG-CH1親和基質上純化。在單獨實驗中，人類化Fab-GAA係在Capture Select CH1親和基質上純化，之後藉由SP陽離子交換進一步純化。人類化Fab包含人類化3E10 V_H及V_L及人類恆定區。

對於若干個代表性批次，使用SEC-HPLC來評價人類化Fab-GAA 蛋白之純度。簡言之，SEC-HPLC係作為純度測定方法藉由使用Tosoh G3000swxl,7.8×300mm,5μm管柱及由0.1M矽藻土(Citrate)、0.1M NaCl pH 4.5組成之移動相來實施以測定主要前峰及後峰純度。將測試樣品於移動相中稀釋至2mg/mL之最終濃度並注射10uL。管柱流速為0.5mL/min且將該管柱保持在恆定的25℃。藉由280nm下之吸光度來檢測溶析峰。如圖2中所示，以如藉由SEC-HPLC所量測大於96%之純度獲得人類化Fab-GAA蛋白。換言之，所存在之人類化Fab-GAA佔存於組合物中之蛋白質之大於95重量%。

對於一個批次，然後將Fab-GAA以3.56mg/ml之濃度調配於包含33mM檸檬酸鹽、150mM NaCl及332mOsm/kg之緩衝液(pH 4.0)中且儲存於-70℃下。在一個實驗中，然後將來自此批次之樣品濃縮至10或15mg/ml，且評價其隨時間之結構及功能穩定性。簡言之，彙集多個小瓶之huFab-GAA(3.66mg/ml)並將其施加至Amicon Ultra 4mL,10k MWCO旋轉過濾器(Millipore目錄號UFC801096)上。將材料以4000×g在5℃下離心約20分鐘，直至獲得10及15mg/ml之目標濃度為止。將樣品在其當前緩衝液中濃縮且不實施緩衝液交換。藉由監測滯留物體積藉由比較濃縮前及濃縮後之重量且假定樣品溶液之密度為1.0來估計目標濃度。藉由UV光譜法在280nm波長下使用1.595之莫耳吸光度來測定蛋白質濃度。經測定，在與初始批次中之Fab-GAA(3.66mg/ml)之結構及活性相比時，將Fab-GAA濃縮至10或15mg/ml對蛋白質結構(如藉由SDS-PAGE分析所測定)不具有任何可觀察影響，且不導致比活性(如使用下文所述之無細胞活性分析所量測)之任何顯著降低。另外，此濃縮融合蛋白之結構完整性及酶活性之保存持續至少7天。

另外，亦使用反轉錄病毒表現系統來表現人類化3E10 Fab-GAA多肽。特定而言，使用自經研發以表現上文所述鼠類3E10 VL之人類化形式及上文所述鼠類3E10 VH之人類化形式之基因構築體製得之反轉錄病毒載體在CHO細胞中表現Fab-GAA蛋白。

無細胞活性分析中之Fab-GAA

使用zeba去鹽旋轉管柱將100mM乙酸(pH 4.9)中之50微克純化Fab-GAA融合物緩衝液交換至1×PBS(pH 7.4)中。將Fab-GAA融合蛋白在PBS(pH 7.4)中在37℃下培育0、1、4、12及24小時並離心，之後移除一個等份用於酶分析。對於每一時間點，在PBS中之前述培育後，將10μl酶移液至90μl之100mM乙酸鈉(pH 4.3)中並在-70℃下儲存直至分析為止。使用基於螢光板之分析使用4-甲基傘形酮基α-D-葡萄糖苷酶(MU-α-Glu)受質來分析每一時間點之樣品。發現在所測試之所有時間點，在pH 7.4下培育後，Fab-GAA活性皆類似。該等資料指示，Fab-GAA融合物在pH 7.4下保留活性長達24小時。使用人類化3E10 Fab-融合蛋白實施類似活性分析實驗。對於人類化Fab-GAA之代表性批次，GAA酶活性經測定為11.61μM/min/μg。

在另一實驗中，測試葡萄糖對鼠類Fab-GAA融合物之酶活性之效應。在此實驗中，使用上述MU-α-Glu活性分析來測試不同濃度之葡萄糖(0、1、5及10mM)及pH(pH 4.3或6.0)對Fab-GAA融合蛋白之活性之效應。藉由將樣品與0.1M乙酸鈉(pH 4.3)或0.1M磷酸鈉(pH 6.0)一起培育來測試pH對樣品之效應。將95微升pH 4.3或pH 6.0之MU-α-Glu受質及葡萄糖溶液(0、1、5及10mM)添加至96孔半區平黑底板中。用pH 4.3或6.0緩衝液以1：10稀釋Fab-GAA蛋白樣品，且將5uL稀釋樣品添加至每孔中。在長達1小時中，每30秒取時間點。使用動力學分析之線性部分之斜率來確定活性。發現，葡萄糖以劑量依賴性方式抑制Fab-GAA融合蛋白活性。此外，與在pH 4.3下培育之樣品相比，對於在pH 6.0下培育之樣品，在所測試之所有劑量下，葡萄糖對Fab-GAA融合蛋白活性皆具有更強抑制效應。該等實驗之結果的概述提供於下表1中。抑制百分比係與未經處理樣品(即，0mM葡萄糖)相比來指示。此實驗顯示，包含GAA多肽及內化性部分之嵌合多肽在pH 4.3及pH 6.0二者下具有酶活性，且在葡萄糖存在下維持該活性。後一特徵可用於未來分析研發且指示，該等嵌合多肽可在基於細胞之分析中在培養基中測試，同時保留活性。

龐貝氏病纖維母細胞中之Fab-GAA

亦評價來自龐貝氏病患者之細胞中之鼠類3E10 Fab-GAA之效應。特定而言，將來自龐貝氏病患者之纖維母細胞在37℃下在5% CO2-空氣氣氛中維持在補充有10% FBS、100U青黴素/ml及100g鏈黴素/ml之伊格爾氏(Eagle)最低必需培養基中。對於處理，將Fab-GAA添加至含有2% BSA(Sigma)之新鮮培養基中並將細胞培育24小時，之後用冷DPBS洗滌3次然後收穫。藉由使用抗人類GAA抗體來評價培養基及經處理細胞之細胞溶解物中GAA之存在。如圖3中所顯示，在細胞之培養基中Fab-GAA主要檢測為150kDa條帶(其對應於完整Fab-GAA嵌合蛋白質之預測分子量)，GAA係在經處理細胞溶解物中檢測為三個單獨的150、95及70kDa條帶。150kDa條帶對應於完整Fab-GAA嵌合蛋白質之預測分子量，95kDa條帶對應於GAA之中間形式之預測分子量，且70kDa條帶對應於成熟GAA多肽之預測分子量。不受限於理論，該等結果反映Fab-GAA內化至龐貝氏病患者纖維母細胞中，其中其可被處理為成熟GAA多肽。

亦測試經處理細胞以評價GAA活性並測定Fab-GAA對肝醣降低之效應。特定而言，將冷凍細胞糰粒在蒸餾水中勻漿化並超音處理，且藉由離心移除不溶性蛋白質。經由Bradford分析對所得溶解物之蛋白質含量進行定量。藉由在pH 4.3下使用如上文所述之活性分析量測4-甲基傘形酮基-a-D-葡萄糖苷裂解來評價GAA活性。在投與Fab-GAA蛋白後之GAA活性類似於針對單獨之未偶聯重組人類GAA所觀察到者。

藉由用黑麯黴(Aspergillus niger)澱粉葡萄糖苷酶處理組織提取物及量測所釋放之葡萄糖來測定經處理細胞中之肝醣含量。自該等實驗發現，用Fab-GAA蛋白處理亦能在龐貝氏病患者纖維母細胞中減少肝醣。另外，此肝醣降低對游離甘露糖-6-磷酸(M6P)部分敏感。已知經M6P殘基修飾之蛋白質可由細胞內化並藉助M6P受體靶向至胞內體。預期用游離M6P處理細胞可結合M6P受體，由此導致較少M6P受體可用於結合並內化經M6P殘基轉移後修飾之蛋白質。

使用L6大鼠骨骼肌細胞進一步評價至少一部分Fab-GAA至細胞中之M6P敏感性內化。特定而言，在M6P存在或不存在下用人類Fab-GAA或鼠類Fab-GAA處理L6細胞。在處理後，溶解細胞並評價GAA之含量及條帶化圖案。如圖4中所示，經人類或鼠類Fab-GAA處理之細胞展示在內化後將GAA處理成預測之GAA之中間體及成熟形式。然而，在將Fab-GAA細胞與游離M6P共投與時，總GAA以及預測之GAA之中間體及成熟形式之含量有所減小。在經Fab-GAA處理之C2C12鼠類肌母細胞中亦觀察到類似結果。不受限於理論，該等結果與藉由非M6P依賴性路徑以及經由M6P路徑內化Fab-GAA一致。

藉由單獨的免疫細胞化學實驗進一步確證Fab-GAA之非M6P依賴性內化。特定而言，使龐貝氏病細胞在載玻片上生長過夜，然後與200U/ml鼠類Fab-GAA在5mM M6P存在或不存在下在37℃下於5% CO2中一起培育。在處理24小時後，用DPBS將細胞洗滌4次，之後用4%多聚甲醛在室溫下固定1小時。然後用0.1% Triton X-100將載玻片滲透化處理15分鐘，並用封阻緩衝液(DPBS中之5%山羊血清(16210064-thermo))封阻30分鐘。將載玻片與一級兔抗Lamp2抗體(ab37024)(1：500，於封阻緩衝液中)一起培育1小時，然後與Alexa Fluor偶聯之抗小鼠IgG(H+L)二級抗體(Invitrogen)一起培育。該等實驗顯示在M6P之存在或不存在下在龐貝氏病細胞之細胞質中Fab-GAA之強染色，從而進一步證實，Fab-GAA以非M6P受體依賴性方式進入細胞，且在內化至細胞中後，Fab-GAA並不限於M6P受體區室(例如，胞內體/溶酶體)。

不受限於理論，上述資料與藉由兩種不同機制內化至龐貝氏病纖維母細胞中之Fab-GAA一致：a)藉助3E10 Fab介導之內化，及b)藉助M6P介導之內化。根據此模型，預期藉助3E10 Fab部分內化之Fab-GAA能清除細胞質肝醣，同時預期彼等經由M6P受體內化之Fab-GAA分子能清除胞內體肝醣。此雙管齊下之肝醣清除方法可具有重要治療價值，此乃因人們認為當前可用之用於治療龐貝氏病之藥物(例如Myozyme^®)主要靶向胞吞/溶酶體路徑。實際上，Myozyme^®似乎不治療細胞質中之肝醣累積(Schoser等人，Therapeutic approaches in Glycogen Storage Disease type II(GSDII)/Pompe Disease,Neurotherapeutics,5(4)：569-578,2008)。

用Fab-GAA治療龐貝氏病小鼠

先前已闡述龐貝氏病小鼠模型(B6 129-Gaa^tm1Rabn/J；Jackson Laboratory)，且此模型重述人類龐貝氏病之關鍵特徵。此GAA^-/-模型用於測試人類化Fab-GAA融合蛋白之治療效能。特定而言，用人類化Fab-GAA治療5隻12週齡GAA^-/-小鼠且5隻12週齡GAA^-/-小鼠用作未經治療之對照。在4週研究之過程期間，經治療小鼠接受4次30mg/kg經正規化Fab-GAA之單獨靜脈內注射以達成7.0μM/min活性。在最後一次注射後48小時殺死小鼠，並收集組織用於進一步分析。

評價來自經治療及未經治療之動物之組織的GAA活性及肝醣含量。特定而言，將冷凍動物組織在蒸餾水中勻漿化並超音處理，且藉由離心移除不溶性蛋白質。經由Bradford分析對所得溶解物之蛋白質含量進行定量。藉由量測4-甲基傘形酮基-a-D-葡萄糖苷在pH 4.3下之裂解來評價GAA活性，且發現其在除腎以外所測試之所有組織(肝、心臟、橫膈膜、四頭肌、腓腸肌及脾)中顯著增加。肝醣含量係藉由用黑麯黴澱粉葡萄糖苷酶處理組織提取物並量測所釋放之葡萄糖來測定，如文獻中所述(Amalfitano等人1999,Proc Natl Acad Sci U S A 96(16)：8861-8866及Sun等人，2003,Mol Ther 7(2)：193-201)。經Fab-GAA治療之GAA^-/-小鼠展示肝醣含量在肝中降低64%，在心臟中降低55%，在橫膈膜中降低40%，在四頭肌中降低15%，且在腓腸肌中降低38%。橫膈膜及腓腸肌中之顯著肝醣降低亦藉由取自經治療及未經治療之動物的組織切片之PAS染色來證實。西方墨點法(Western Blot)確認Fab-GAA內化至肝、心臟、脾及腓腸肌中。

某些碳水化合物(例如己糖四糖(Hex₄)在多種肝醣儲積症(包括龐貝氏病)中升高。GAA^-/-小鼠亦展示升高之Hex₄含量，其可在小鼠尿液中量測。例如，參見WO 2009075815。經Fab-GAA治療之GAA^-/-小鼠展示與未經治療之對照相比顯著(p<0.01)降低之尿液Hex₄含量。

實例3：3E10與人類GAA之化學偶聯(mAb3E10* GAA) 化學偶聯

在此實例中，10毫克(10mg)包含含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈可變結構域及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈可變結構域之全長3E10 mAB(例如，scFv，其中VH及VL結構域經由連接體互連)以1/1或1/2莫耳比且使用兩種不同異雙官能試劑(3-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀醯亞胺基酯及反式-4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基酯)直接或間接共價偶聯至GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基67-952之GAA多肽)。此反應將3E10之離胺酸殘基修飾為硫醇且將硫醇反應性馬來醯亞胺基團添加至GAA(Weisbart RH等人，J Immunol.2000年6月1日；164(11)：6020-6)。在去保護後，使每一經修飾蛋白質與彼此反應而產生穩定硫醚鍵。實施化學偶聯，且藉由凝膠過濾層析對產物進行分級。藉由天然及SDS-PAGE在還原性及非還原性環境中評價部分之組成。彙集含有3E10-GAA偶聯物對游離3E10及游離GAA之最大比率之部分並經選擇用於後續研究。

類似地，製得偶聯物，其中3E10之抗原結合部分(例如單鏈Fv片段)或3E10 Fab偶聯至GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽)。其他實例性偶聯物包括其中內化性部分係全長3E10 mAb或其變體或前述之抗原結合片段之偶聯物。前述方法可用於製造化學偶聯物，其包括GAA部分與內化性部分之任一組合，且其僅具有實例性。製造N-末端及C-末端偶聯物二者(例如，其中3E10部分N-末端偶聯至GAA部分之偶聯物及其中3E10部分C-末端偶聯至GAA部分之偶聯物)。此外，本文所詳述之實驗方法可用於評估任一該嵌合多肽或比較針對嵌合多肽之活性。

化學偶聯之3E10及GAA之活體外評價

涵蓋本發明之任一嵌合多肽，其包含GAA多肽部分(例如，包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽)及內化性部分。將標的嵌合多肽添加至(例如)細胞培養物中，且測定蛋白質攝取、蛋白質定位及/ 或GAA酶活性之程度並與對照相比較。類似地，可在無細胞系統中評價GAA酶活性。注意到，在此實例中，儘管內化性部分及GAA部分化學偶聯，但每一個別部分可重組製得(例如，藉由在培養中之細胞中表現編碼多肽之核苷酸序列並純化所表現多肽)。

i)3E10-GAA之酶活性

藉由在50mM乙酸鈉、0.1% BSA(pH 4.3)中測定3E10-GAA催化之合成受質對硝基苯基-D-α-葡萄吡喃糖苷水解之速率來量測GAA酶活性，如McVie等人(Biochemical and Pharmacological Characterization of Different Recombinant Acid α-Glucosidase Preparations Evaluated for the Treatment of Pompe Disease,Mol Genet Metab.,94(4)：448-455,2008)中所述。對所釋放發色團對硝基苯酚以分光光度法在鹼性pH(>10.2)及400nm下進行定量。將1單位GAA定義為在37℃及分析條件下導致每分鐘1μmol受質水解之活性之量。對Fv3E10及GAA、單獨之Fv3E10或單獨之GAA實施一式兩份實驗。如上所述，亦可使用全長3E10-GAA、Fab3E10-GAA、Fab’3E10-GAA或其任一人類化變體實施本文所述之任一實驗。此外，包含任一GAA部分及任一內化性部分之嵌合多肽可以類似方式製得並測試。

ii)3E10-GAA之攝取

首先在COS-7細胞中評價3E10-GAA之攝取。先前研究指示，ENT2參與跨過COS-7細胞膜之3E10運輸(Hansen等人，J.Biol.Chem.,282：20790-20793,2007)，且類似策略可用於測定跨過該膜運輸嵌合3E10-GAA。簡言之，純化嵌合多肽係在含有10%胎牛血清之PBS中製備；對照緩衝液係含有10%胎牛血清之PBS。將50μL對照緩衝液或3E10-GAA添加至COS-7細胞中並培育1小時。抽吸緩衝液，洗滌細胞，在冷凍100%乙醇中固定，並用針對3F10或針對GAA之抗體染色。

為證實肌肉細胞亦攝取3E10-GAA多肽，在肌肉細胞中實施相同實驗。鼠類心肌細胞HL-1細胞系表現ENT2(Naydenova等人，Inosine and equilibrative nucleoside transporter 2 contribute to hypoxic preconditioning in the murine cardiomyocyte HL-1 cell line,Am J Physiol.Heart Circ.Physiol.,294(6)：H2687-2692,2008)，且此細胞系可用於在上述實驗中代替COS-7細胞。

先前已顯示，單獨之3E10(藉由上文所提及之融合瘤產生)能穿透原代大鼠皮質神經元。Weisbart等人，2000,J.Immunology,164：6020-6026。為證實神經元細胞亦攝取3E10-GAA多肽，可使用來自16日齡胎兒Wistar大鼠之大腦半球之大鼠皮質神經元之培養物。簡言之，在無菌條件下解剖半球並以機械方式分離且平鋪於置於6孔塑膠碟(Corning Costar,Cambridge,MA)上之經聚離胺酸塗佈之30mm圓形蓋玻片中。然後在實施內化實驗之前將細胞培養7-10天。

iii.)用3E10-GAA處理福布斯-柯裡氏病細胞

將10至100uM化學偶聯之Fv3E10-GAA多肽、3E10及GAA之未偶聯混合物、單獨之3E10或單獨之GAA施加至來自捲毛尋回犬或人類之半融合、未分化福布斯-柯裡氏病或野生型肌母細胞或肝細胞。藉由在即將添加3E10-GAA之前將硝基苄基巰基嘌呤核糖苷(NBMPR)(一種ENT2特異性抑制劑(Hansen等人，2007,J.Biol.Chem.,282(29)：20790-3))添加至ENT2轉染細胞來驗證3E10-GS3-GAA對ENT2運輸蛋白之特異性。然而，應瞭解，內化性部分(包括3E10或3E10變體)可能亦能經由不同運輸蛋白(例如ENT3)穿過細胞。8至24小時後，收集培養基及細胞用於免疫印跡及RTPCR分析。可對在蓋玻片上生長之福布斯-柯裡氏病及野生型肌母細胞或肝細胞上之上述每一蛋白質應用一式兩份實驗，之後對mAb3E10進行固定並使用針對小鼠κ輕鏈(Jackson Immunoresearch)及GAA之抗體進行免疫組織化學檢測。

a)細胞穿透性3E10及GAA之免疫印跡檢測

將細胞糰粒再懸浮於500ul PBS中，溶解，並收集上清液用於mAb3E10及GAA之免疫印跡分析。未採用表位標注，因此相對於單獨3E10及單獨GAA之對照，經3E10*GAA處理之細胞中同時存在之約248kDa之抗3E10及抗GAA免疫反應條帶(對於全長3E10+GAA，其中GAA部分具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列)之存在構成化學偶聯之3E10*GAA之成功滲透。使用微管蛋白檢測作為載荷對照。

b)細胞穿透性3E10及GAA之免疫螢光

洗滌經處理細胞之蓋玻片，在100%乙醇中固定，再水合，並依次用抗GAA抗體及辣根過氧化酶偶聯之二級抗體檢測3E10及GAA，顯色，並藉由光學顯微術觀看。

c)細胞病理學分析

不受限於理論，儘管安德森病及福布斯-柯裡氏病並非由GAA中之突變引起，但兩種病況之特徵皆為肝醣累積。本發明嵌合多肽適於遞送至細胞中，例如遞送至細胞之細胞質中，以減少肝醣累積(例如，或增加肝醣清除)。因此，儘管安德森病及福布斯-柯裡氏病並非由GAA功能之缺少或損失引起，但提供本發明嵌合多肽可用於治療安德森病及福布斯-柯裡氏病，例如減少肝醣(例如細胞質肝醣)或改良肝醣清除。

將洗滌經處理細胞之蓋玻片，在100%乙醇中或在10%福馬林中固定，再水合，且將使用碘酸雪夫氏(PAS)染色檢測肝醣。與未經處理之安德森病及/或福布斯-柯裡氏病細胞相比，經處理安德森病及/或福布斯-柯裡氏病細胞中降低之PAS染色指示，該處理有效減少該等細胞中之肝醣累積。

iv.)用3E10-GAA處理安德森病細胞

將10至100uM化學偶聯之Fv3E10-GAA多肽、3E10與GAA之未偶聯混合物、單獨之3E10或單獨之GAA施加至來自挪威森林貓或人類之半融合、未分化安德森病或野生型肌母細胞或肝細胞。藉由在即將添加3E10-GAA之前將硝基苄基巰基嘌呤核糖苷(NBMPR)(ENT2特異性抑制劑(Hansen等人，2007,J.Biol.Chem.,282(29)：20790-3))添加至ENT2轉染細胞來驗證3E10-GS3-GAA對ENT2運輸蛋白之特異性。8至24小時後，收集培養基及細胞用於免疫印跡及RTPCR分析。一式兩份實驗將上述每一蛋白質施加至在蓋玻片上生長之安德森病及野生型肌母細胞或肝細胞，之後對mAb3E10進行固定且使用針對小鼠κ輕鏈(Jackson Immunoresearch)及GAA之抗體進行免疫組織化學檢測。

a)細胞穿透性3E10及GAA之免疫印跡檢測

將細胞糰粒再懸浮於500ul PBS中，溶解，並收集上清液用於mAb3E10及GAA之免疫印跡分析。未採用表位標注，因此相對於單獨3E10及單獨GAA之對照，經3E10* GAA處理之細胞中同時存在之約248kDa之抗3E10及抗GAA免疫反應條帶(對於全長3E10+具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA)之存在構成化學偶聯之3E10*GAA之成功滲透。使用微管蛋白檢測作為載荷對照。

b)細胞穿透性3E10及GAA之免疫螢光

c)細胞病理學分析

洗滌經處理細胞之蓋玻片，在100%乙醇中或在10%福馬林中固定，再水合，並使用碘酸雪夫氏(PAS)染色檢測肝醣。與未經處理之安德森病細胞相比，經處理安德森病細胞中降低之PAS染色指示，該處理有效降低該等細胞中之肝醣累積。

v.)用3E10-GAA處理馮吉爾克病細胞

根據Kuijpers,2003,101(12)：5021-4及Nikolai等人，2002,Blood,99(2)中所述之方案，將10至100uM之化學偶聯之Fv3E10-GAA多肽、3E10與GAA之未偶聯混合物、單獨之3E10或單獨之GAA施加至來自GSD1b患者及健康對照之嗜中性球培養物。可藉由在即將添加3E10-GAA之前將硝基苄基巰基嘌呤核糖苷(NBMPR)(ENT2特異性抑制劑(Hansen等人，2007,J.Biol.Chem.,282(29)：20790-3))添加至ENT2轉染細胞來驗證3E10-GAA對ENT2運輸蛋白之特異性。8至24小時後，收集培養基及細胞用於免疫印跡及RT-PCR分析。在平行實驗中，在培養/處理後8、16或24小時檢查細胞形態並針對細胞凋亡及肝醣標記物染色。

在替代性實驗中，培養並用或不用Fv3E10-GAA多肽、3E10與GAA之未偶聯混合物、單獨之3E10或單獨之GAA處理來自經改造而缺失G6Pase-α或G6PT活性之小鼠之嗜中性球及/或纖維母細胞及/或肝細胞(Lei等人，1996,Nat Genet.,13：203-209；Chen等人，2003,Hum Mol Genet,12：2547-2558；Kim等人，2007,FEBS Lett.,581(20)：3833-38)。可使用業內已知之分析來評價3E10-GAA多肽對所培養細胞之肝醣含量及/或對存活、形態、細胞凋亡及增殖之效應。

a)細胞穿透性3E10及GAA之免疫印跡檢測

將細胞糰粒再懸浮於500ul PBS中，溶解，並收集上清液用於mAb3E10及GAA之免疫印跡分析。未採用表位標注，因此相對於單獨3E10及單獨GAA之對照，經3E10* GAA處理之細胞中同時存在之約248kDa之抗3E10及抗GAA免疫反應條帶(對於全長3E10+具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA)之存在構成化學偶聯之3E10*GAA之成功滲透。可使用微管蛋白檢測作為載荷對照。

b)細胞穿透性3E10及GAA之免疫螢光

c)細胞病理學分析

在平行實驗中，評價經GSD-Ia處理及未經處理之細胞之細胞凋亡形態及/或細胞凋亡標記物，此與Kuijpers,2003,101(12)：5021-4及Nikolai等人，2002,Blood,99(2)中所述之實驗類似。

vi.)用3E10-GAA處理拉弗拉病細胞

將10至100uM之化學偶聯之3E10-GAA多肽、3E10與GAA之未偶聯混合物、單獨之3E10或單獨之GAA施加至以類似於Aguado等人，Hum Mol Genet,19(14)：2867-76中所述之方式培養的來自人類拉弗拉病患者之纖維母細胞。可藉由在即將添加3E10-GAA之前將硝基苄基巰基嘌昤核糖苷(NBMPR)(ENT2特異性抑制劑(Hansen等人，2007,J.Biol.Chem.,282(29)：20790-3))添加至ENT2轉染細胞來驗證3E10-GAA對ENT2運輸蛋白之特異性。8至24小時後，收集培養基及細胞用於免疫印跡及RT-PCR分析。在平行實驗中，在培養/處理後8、16或24小時檢查細胞形態並針對細胞凋亡及肝醣標記物染色。

在替代性實驗中，培養並用或不用3E10-GAA多肽、3E10與GAA之未偶聯混合物、單獨之3E10或單獨之GAA處理來自經改造而缺失G6Pase-α或G6PT活性之小鼠之嗜中性球(Lei等人，1996,Nat Genet.,13：203-209；Chen等人，2003,Hum Mol Genet,12：2547-2558；Kim等人，2007,FEBS Lett.,581(20)：3833-38)。可使用業內已知之分析評價3E10-GAA多肽對拉弗拉體(Lafora Body)形成、肝醣含量及對所培養細胞之存活、形態、細胞凋亡及增殖之效應。

a)細胞穿透性3E10及GAA之免疫印跡檢測

將細胞糰粒再懸浮於500ul PBS中，溶解，並收集上清液用於mAb3E10及GAA及LC3-II(自體吞噬之標記物)之免疫印跡分析。未採用表位標注，因此相對於單獨3E10及單獨GAA之對照，經3E10*GAA處理之細胞中同時存在之約248kDa之抗3E10及抗GAA免疫反應條帶(對於全長3E10+具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA)之存在構成化學偶聯之3E10*GAA之成功滲透。使用微管蛋白檢測作為載荷對照。與未經處理之細胞相比，若經3E10-GAA處理之拉弗拉病細胞中LC3-II含量升高，則此指示，在經處理細胞中可發生自噬功能之改良。亦可以類似於Aguado等人所述之方式評價經處理及未經處理細胞中之總蛋白質降解，以確定在經處理細胞中是否發生自噬功能之改良。

b)細胞穿透性3E10及GAA之免疫螢光

洗滌經處理細胞之蓋玻片，在100%乙醇中固定，再水合，並依次用抗GAA抗體及辣根過氧化酶偶聯之二級抗體檢測3E10及GAA，顯色，並藉由光學顯微術觀看。在平行實驗中，在細胞中使用LC3抗體以與Aguado等人中所述類似之方式檢測自噬液泡。與未經處理之對照細胞相比，經處理細胞中LC3染色之量之增加指示，在經處理細胞中可發生自噬功能之改良。

c)細胞病理學分析

在平行實驗中，在介於1、2、3、4、7或10天範圍內或更長時間段中在培養物中評價經處理及未經處理之拉弗拉病細胞，且評價拉弗拉體之存在或不存在及/或監測細胞存活。

實例4 fv 3E10及人類GAA之遺傳構築體(Fv3E10-GS3-GAA)

生成編碼Fv3E10及GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽)之遺傳融合物(fv3E10-GS3-GAA，包含藉由例如GS3連接體融合至GAA之mAb 3E10之scFv)之哺乳動物表現載體。注意，在實例中，使用「Fv3E10」來指3E10之scFv。注意，該等遺傳融合物亦稱為重組偶聯物或重組產生之偶聯物。該等係包含GAA多肽及內化性部分(此處為scFv)之嵌合多肽之其他實例。可類似地使用其他連接體。此外，亦可使用其中3E10部分與GAA部分直接融合之無連接體融合物。類似地，可製得與全長抗體或Fab之一部分之融合物。對於化學偶聯物，涵蓋包含本發明之任一嵌合多肽之重組融合物。重組產生之嵌合多肽可包含根據本發明之GAA多肽部分(例如，包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽)及根據本發明之內化性部分。

類似地製得包含GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽)及內化性部分之其他重組產生之偶聯物用於後續測試。對於非限制性實例：(a)GAA-GS3-3E10，(b)3E10-GS3-GAA，(c)GAA-GS3-Fv3E10，(d)GAA-3E10，(e)3E10-GAA，(f)GAA-Fv3E1()。注意，在整個實例中，縮寫Fv用於指3E10之單鏈Fv。類似地，mAb 3E10及3E10可互換使用。該等及其他嵌合多肽可使用例如本文所詳述之分析來測試。亦涵蓋其中嵌合多肽包含GAA多肽(例如具有SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之GAA多肽)之其他多肽且可類似地製造並測試。

產生人類GAA之cDNA并在活體外確認活性 i)GAA之cDNA之合成

編碼人類GAA之全長前體形式之全長3.6kb人類GAA cDNA(hGAA cDNA)可參見http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez，例如在基因庫登錄號NM_000152.3下。此cDNA序列及其他轉錄物變體係全文併入本文中。此一人類cDNA序列中大致對應於編碼GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽)之區域之一部分在本文中用於生成重組構築體。然而，亦涵蓋可使用全長cDNA。

將GAA cDNA連同促進選殖至適當表現載體中之兩側限制位點一起合成並藉由Genscript或基因序列之其他合格製造商來測序。為使表現最大化，針對哺乳動物及畢赤酵母表現對GAA cDNA進行密碼子優化。在哺乳動物或畢赤酵母對於給定胺基酸偏好不同密碼子之事件中，使用次佳候選者以統一該偏好。將所得cDNA選殖至基於CMV之哺乳動物表現盒中，且質體pCMV-GAA之大規模製備係使用Qiagen Mega無內毒素質體純化套組來實施。為避免對3E10-GAA蛋白之免疫反應變複雜，在某些實施例中不包括表位或純化標識。然而，亦可製造並測試確實包括該等標識之偶聯物。

ii)活體外細胞轉染

評價GAA在轉染細胞中之功能之策略闡述於上文中。使用市售轉染試劑將10微克質體pCMV(模擬物)或pCMV-GAA轉染至1)COS-7細胞、2)HL-1細胞、3)來自野生型人類、小鼠或犬之肌纖維及/或肝細胞及4)來自福布斯-柯裡氏病人類、小鼠或犬之肌纖維及/或肝細胞中。在平行實驗中，使用市售轉染試劑將10微克質體pCMV(模擬物)或pCMV-GAA轉染至1)COS-7細胞、2)HL-1細胞、3)來自野生型人類、挪威森林貓及/或小鼠之肌纖維及/或肝細胞及4)來自安德森病人類、挪威森林貓或小鼠之肌纖維及/或肝細胞中。類似地，本文所述之任一對照或患病馮吉爾克病及/或拉弗拉病細胞可用於該等轉染實驗中並監測實例2中所指示之參數。為追蹤轉染效率，使用編碼諸如β-半乳糖苷酶或GFP等適宜報導基因之質體實施一式兩份轉染。48小時後，藉由離心沈澱轉染細胞，再懸浮於500μl PBS中用於蛋白質及免疫印跡分析。

iii)使用AAV cDNA構築體之病毒感染

根據Sun等人(Enhanced Efficacy of an AAV Vector Encoding Chimeric,Highly-Secreted Acid α-glucosidase in Glycogen Storage Disease Type II,Mol Ther.,14(6)：822-830,2006)中所述之方法，將上述構築體選殖至腺病毒載體質體中。該等構築體提供一種在細胞中測試cDNA構築體及/或使用活體內構築體進行基因療法之手段。

簡言之，用AAV載體質體、AAV包裝質體p5E18-VD 2/8和pAdHelper(Stratagene,La Jolla,CA)轉染293細胞。在感染後48小時收穫細胞溶解物，冷凍-解凍3次，並藉由蔗糖墊造粒及之後的2個氯化銫梯度離心步驟來分離。將AAV原液針對Hanks緩衝液之3次變化透析，並將等份儲存於-80℃下。藉由DNA酶I消化、DNA提取及南方墨點法(Southern blot)分析來測定含有載體DNA之顆粒數。所有病毒載體原液皆係根據NIH出版之生物危害安全等級2準則來處置。

如上文實例2中所述在(1)COS-7細胞、(2)HL-1細胞及(3)福布斯-柯裡氏病及/或安德森病患者細胞中來分析嵌合GAA之攝取。使COS-7細胞、HL-1細胞或來自福布斯-柯裡氏病及/或安德森病患者之肌細胞及/或肝細胞在含有10%FBS之培養基中生長，並用產生活性為300nmol/hr/ml之嵌合hGAA之經轉染293細胞之培養基培育40小時。如上所述分析所培養患者肌細胞及/或肝細胞中之GAA活性及肝醣。

iii)經轉染人類GAA之免疫印跡檢測，及GAA介導之肝醣水解之分析.

利用實例2中所述之相同程序。

產生並驗證遺傳偶聯至GAA(例如，包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽之)cDNA Fv3E10 i)Fv3E10之cDNA之合成

編碼連接至3E10重鏈(SEQ ID NO：9-10)之小鼠Fv3E10可變輕鏈之cDNA在VH CDR1中含有增強Fv片段之細胞穿透能力之突變(Zack等人，1996,J Immunol,157(5)：2082-8)。3E10 cDNA兩側為促進與對應於GAA多肽(例如，包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之GAA多肽)之胺基酸序列之cDNA編碼序列同框選殖之限制位點。合成構築體並藉由Genscript或基因序列之其他合格製造商來測序。為使表現最大化，針對哺乳動物及畢赤酵母表現對3E10cDNA進行密碼子優化。在哺乳動物或畢赤酵母對於給定胺基酸偏好不同密碼子之事件中，使用次佳候選者以統一該偏好。將所得cDNA選殖至哺乳動物表現盒中，且質體pCMV-3E10-GAA之大規模製備係使用Qiagen Mega無內毒素質體純化套組來實施。在以下細胞中測試構築體：1)COS-7細胞、2)HL-1細胞、3)來自野生型人類及/或捲毛尋回犬之肌纖維及/或肝細胞及4)來自福布斯-柯裡氏病人類及/或捲毛尋回犬之肌纖維及/或肝細胞。亦在平行實驗中在以下細胞中測試構築體：1)COS-7細胞，2)HL-1細胞，3)來自野生型人類、小鼠及/或挪威森林貓之肌纖維及/或肝細胞及4)來自安德森病人類、小鼠及/或挪威森林貓之肌纖維及/或肝細胞。

ii)細胞轉染

測試3E10-GS3-GAA遺傳融合物之表現及肝醣水解之策略闡述於上文中。轉染程序與上文針對人類GAA cDNA之轉染所述者相同。如上所述分析經轉染細胞之hGAA表現及肝醣水解。

遺傳偶聯至GAA之重組3E10之產生

i)用於畢赤酵母之蛋白質表現載體之構築。畢赤酵母之質體構築、轉染、群落選擇及培養根據製造商說明書使用套組及手冊(Invitrogen)。將如上所述產生並驗證之遺傳偶聯之3E10-GS3-GAA之cDNA選殖至兩個替代性質體中；PICZ用於細胞內表現且PICZalpha用於分泌表現。自每一質體之蛋白質表現係藉由AOX1啟動子來驅動。用Zeocin選擇經轉染畢赤酵母並測試菌落中重組3E10-GS3-GAA之表現。選擇高表現者並規模化以供純化。

ii)重組3E10-GS3-GAA之純化

將與mAb 3E10 Fv之cDNA融合物連接至酵母表現載體pPICZA，隨後將其電穿孔至巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)X-33品系中。用Zeocin(Invitrogen,Carlsbad,CA)選擇菌落並用抗his6抗體(Qiagen Inc,Valencia,CA)鑑別。使X-33細胞在含有經緩衝甘油/甲醇培養基之帶擋板的搖瓶中生長，且根據製造商方案用0.5%甲醇誘導蛋白質合成(EasySelect Pichia Expression Kit,Invitrogen,Carlsbad,CA)。藉由在20,000lbs/in2下兩次通過弗氏細胞壓碎器(French Cell Press)來溶解細胞，並藉由在Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen,Valencia,CA)上之固定金屬離子親和層析(IMAC)自溶解於9M胍HCl及2% NP40中之細胞糰粒純化重組蛋白質。結合蛋白質溶析於含有300mM NaCl、500mM咪唑及25%甘油之50mM NaH2PO4中。將溶析部分之樣品在4-20%梯度SDSPAGE(NuSep Ltd,Frenchs Forest,Australia)中電泳，且藉由西方墨點法在硝基纖維素膜上鑑別重組蛋白質，其係用載物特異性小鼠抗體且之後用針對小鼠IgG之鹼性磷酸酶偶聯之山羊抗體來顯影。藉由生色受質、氯化氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸對甲苯胺鹽來量測鹼性磷酸酶活性。在含有GelCode藍色染色試劑之SDS-PAGE凝膠中鑑別蛋白質(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)。將溶析蛋白質濃縮，用胎牛血清重構至5%，且在30,000 MWCO旋轉過濾器(Millipore公司，Billerica,MA)中針對含有5%甘油之McCoy培養基(Mediatech公司，Herndon,VA)交換透析100倍。儘管在此實例中闡釋畢赤酵母表現系統，但蛋白質亦可在其他表現系統中產生，包括哺乳動物表現系統，例如CHO細胞。用於在CHO細胞中表現蛋白質之載體及方法(包括契約製造服務)可自例如Lonza獲得。

iii)品質評價及調配

使用針對3E10及GAA之免疫印跡來驗證重組蛋白質之大小及身份，之後用銀染色來鑑別3E10、GAA及3E10-GS3-GAA之製劑之間的相對純度。在緩衝液中調配重組材料並濃縮(約0.5mg/ml)。

iv)重組材料之活體外評價

使用實例2中所詳述之任何一或多種分析來評估3E10-GS3-GAA蛋白之活性。將細胞滲透及/或酶活性與適宜對照相比較。此外，使用上述方法來確定緩和GAA缺失所需之3E10-GS3-GAA蛋白之量。哺乳動物細胞衍生及畢赤酵母衍生之重組3E10-GS3-GAA中之GAA活性之量可對(例如)以下細胞測試：(1)來自福布斯-柯裡氏病及/或安德森病患者及對照患者之肝細胞及/或肌細胞，(2)自野生型及福布斯-柯裡氏病捲毛尋回犬分離之肝細胞及/或肌細胞，(3)自野生型及安德森病挪威森林貓分離之肝細胞及/或肌細胞，(4)來自野生型及/或GSD-Ia及/或GSD-Ib小鼠及/或馮吉爾克病患者及/或對照患者之嗜中性球、纖維母細胞及/或肝細胞；及/或(5)來自野生型及拉弗拉病小鼠及/或來自拉弗拉病患者及對照患者之纖維母細胞。

實例5 在福布斯-柯裡氏病捲毛尋回犬中對靶向肌肉之GAA之活體內評價 用於評估之福布斯-柯裡氏病犬模型之選擇

福布斯-柯裡氏病捲毛尋回犬以多種方式重述人類福布斯-柯裡氏病(Yi等人2012)。該等犬不製造功能性AGL蛋白質(Yi等人，2012)。為控制GAA之超生理含量是否係有益治療，將3E10-GAA投與福布斯-柯裡氏病犬。

GAA劑量之選擇

憑經驗確定遞送至福布斯-柯裡氏病犬之化學或遺傳偶聯至GAA之3E10(例如，全長mAb 3E10、Fab-3E10或Fv-3E10)之評估劑量。為使針對3E10-GS3-GAA之中和免疫反應之混淆效應最小化且使顯示治療性效應之能力最大化，評價在一週內遞送之兩個高劑量之5mg/kg之3E10-GS3-GAA，之後評價疾病終點之變化。亦監測抗3E10-GAA抗體之產生。在確立靜脈內3E10*GAA或3E10-GS3-GAA導致肝醣分支缺陷或異常肝醣儲積之改良後，開始在其他模型(例如，靈長類動物)中之後續活體內評價，隨後評價肝醣去支缺陷之變化，如藉由免疫組織化學(例如，PAS染色)所測定。

材料及方法 i)化學及遺傳偶聯之3E10-GAA之注射

在緩衝液中調配並稀釋3E10*GAA或3E10-GS3-GAA，該緩衝液與靜脈內注射劑(例如無菌鹽水溶液或50mM Tris-HCl,pH 7.4,0.15M NaCl之緩衝溶液)一致。給予每隻犬之3E10*GAA或3E10-GS3-GAA之量係如下計算：劑量(mg/kg)×犬體重(kg)×原液濃度(mg/ml)=原液體積(ml)/犬，用媒劑補足至100ul。

ii)血液收集

在殺死動物用於組織解剖時藉由心臟穿刺收集血液。移除血清並在-80℃下冷凍。為使解凍及處置之效應最小化，在血液中循環之3E10*GAA或3E10-GS3-GAA之所有分析皆係在同一天實施。

iii)組織收集及準備

分開所取樣組織用於免疫印跡、肝醣分析、福馬林固定之石蠟包埋之組織塊及OCT中之冷凍切片。將心、肝、肺、脾、腎、四頭肌、EDL、比目魚肌、橫膈膜及二頭肌組織(50-100mg)細分並在塑膠管中冷凍用於進一步處理以供免疫印跡及肝醣分析。細分心臟、肝、肺、脾、腎、四頭肌、EDL、比目魚肌、橫膈膜及二頭肌之其他樣品，在OCT組織切片培養基中冷凍，或在4℃下在3%戊二醛甲醛固定中固定24至48小時，並包埋於Epon樹脂中或固定於10% NBF中，且處理為石蠟塊。

iv)組織學評估

以1μm切割Epon樹脂包埋樣品並以用於肝醣染色之PAS-Richardson氏染色劑進行染色。與對照治療之福布斯-柯裡氏病犬相比，經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之福布斯-柯裡氏病犬之組織(例如，肌肉或肝)中降低之肝醣累積程度指示，3E10*GAA或3E10-GS3-GAA能在活體內減少肝醣含量。

以1μm切割石蠟包埋樣品並用H&E或三色染色劑染色。與對照治療之福布斯-柯裡氏病犬相比，來自經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之福布斯-柯裡氏病犬之肝樣品中降低之纖維化或肌肉樣品中降低之肌原纖維之磨損指示，3E10*GAA或3E10-GS3-GAA能在該等犬中減少肝及/或肌肉缺陷。

v)免疫螢光

使用多株或單株抗GAA抗體、例如以下文獻中所用之抗體來檢測外源遞送之GAA：Chen等人，Am J Hum Genet.1987 Dec；41(6)：1002-15或Parker等人(2007)。AMP活化之蛋白激酶不與來自大鼠肝之肝醣α顆粒結合。Biochem.Biophys.Res.Commun.362：811-815。切割10微米冷凍切片並將其置於Superfrost Plus顯微鏡載玻片上。

vi)免疫印跡

使用免疫印跡在經3E10-GAA治療之肌肉及肝組織中檢測3E10及GAA免疫反應性材料。3E10及GAA之蛋白質分離及免疫印跡檢測係根據常規免疫印跡方法來實施。用此蛋白質之特異性抗體檢測GAA。印跡蛋白質之抗體檢測使用NBT/BCIP作為受質。對照包括媒劑及經治療之福布斯-柯裡氏病犬以及媒劑及經治療之同型接合野生型犬。

vii)循環3E10-GAA之分析

研發對人類3E10-GAA具有特異性之ELISA並使用可得抗人類GAA抗體及辣根過氧化酶偶聯之抗小鼠二級抗體(Jackson Immunoresearch)加以驗證。稀釋重組3E10-GAA並用於生成標準曲線。自血清稀釋液(正規化至ng/ml血清)或組織提取物(正規化至ng/mg 組織)測定3E10-GAA含量。對照包括媒劑及經治療之野生型及福布斯-柯裡氏病犬。

viii)抗3E10-GAA抗體反應之監測

將用於注射福布斯-柯裡氏病犬之純化3E10-GAA以1ug/ml平鋪至高結合96孔ELISA板之塗佈緩衝液(Pierce Biotech)中，使其塗佈過夜，在TBS中之1%脫脂奶粉(Biorad)中封阻30分鐘，並在TBS中沖洗三次。將來自注射媒劑及3E10-GAA之動物之2倍血清稀釋液加載至孔中，將其在37℃下培育30分鐘，洗滌三次，與辣根過氧化酶(HRP)偶聯之兔抗犬IgA、IgG及IgM一起培育，將其在37℃下培育30分鐘，並洗滌三次。用TMB液體受質檢測犬抗3E10-GAA抗體並在405nm下在ELISA讀板器中讀取。多株兔抗犬GAA抗體及之後的HRP偶聯之山羊抗兔用作陽性對照抗體反應。在405nm下大於媒劑治療之福布斯-柯裡氏病犬之任一吸光度構成陽性抗3E10-GAA抗體反應。對照包括媒劑及經治療之野生型犬及福布斯-柯裡氏病犬。

ix)評價血清酶含量

在研究持續時間內，每1至3週自每隻犬之隱靜脈或頸靜脈收集血液。測試樣品中之丙胺酸胺基轉移酶、天冬胺酸鹽胺基轉移酶、鹼性磷酸酶及/或肌酸磷酸激酶之含量。一或多種該等酶之升高含量之降低指示細胞質肝醣累積之一些病理性效應之降低。

x)組織肝醣分析

使用Yi等人(2012)中所述之方案以酶方式分析組織肝醣含量。將冷凍肝或肌肉組織(50-100mg)在冰冷去離子水中勻漿化(20ml水/g組織)並使用超音波發生器超音處理三次達20秒，脈衝之間間隔30秒。藉由在4℃下以12,000g離心20分鐘使勻漿物澄清。將上清液(20ul)與55ul水混合，煮沸3分鐘並冷卻至室溫。添加澱粉葡萄糖苷酶(Sigma)溶液(25ul，以1：50稀釋至0.1M乙酸鉀緩衝液中，pH 5.5)並將反應物在37℃下培育90分鐘。將樣品煮沸3分鐘以終止反應，並在臺式微量離心機中以最高速度離心3分鐘。將上清液(30ul)與1ml無限葡萄糖(Infinity Glucose)試劑(Thermo Scientific)混合且在室溫下靜置至少10分鐘。在340nm下使用UV-1700分光光度計量測吸光度。使用無澱粉葡萄糖苷酶之反應用於每一樣品之背景校正。在使用無限葡萄糖試劑(在反應中0-120uM最終葡萄糖濃度)之反應中使用標準葡萄糖溶液生成標準曲線。

xi)存活評價

在存活研究中監測在上述實驗中未殺死之彼等經治療及未經治療之患病及對照犬。特定而言，記錄動物之疾病狀態、治療條件及死亡日期。基於此研究之結果製備存活曲線。

xii)統計學分析

成對比較採用司徒登氏t測試(Student's t-test)。多組之間之比較採用ANOVA。在兩種情形中，將p值<0.05視為在統計學上顯著。

類似地使用前述實驗方案來評估其他嵌合多肽。藉助非限制性實例，使用此方案來評估具有GAA部分(或其片段)及內化性部分之化學偶聯物及融合蛋白。

實例6 在安德森病小鼠中對靶向肌肉之GAA之活體內評價 用於評估之安德森病小鼠模型之選擇

已研發安德森病之少年期及成年發作模型。舉例而言，生成安德森病之少年期及成年發作小鼠模型，其在GBE基因之內含子7中含有激酶-新黴素盒，產生降低之GBE表現。此少年期及成年發作小鼠模型展示進行性神經肌肉功能障礙、肌肉細胞及肝細胞中之異常肝醣累積及壽命縮短(Akman等人，2011)。

GAA劑量之選擇

憑經驗確定遞送至安德森病小鼠之化學或遺傳偶聯至GAA之 3E10(例如，全長mAb 3E10、Fab-3E10或Fv-3E10)之評估劑量。為使針對3E10-GS3-GAA之中和免疫反應之混淆效應最小化且使顯示治療性效應之能力最大化，評價在一週內遞送之兩個高劑量之5mg/kg之3E10-GS3-GAA，之後評價疾病終點之變化。亦監測抗3E10-GAA抗體之產生。在確立靜脈內3E10*GAA或3E10-GS3-GAA導致異常肝醣儲積之改良後，開始在其他模型(例如，靈長類動物)中之後續活體內評價，隨後評價肝醣清除之變化，如藉由免疫組織化學(例如，PAS染色)所測定。對3E10*GAA或3E10-GS3-GAA之陽性評估將證明產生實施更徹底的藥理學及毒理學評價所需之量之GLP級材料，且由此確定IND前研究之劑量及投藥範圍。

材料及方法 i)化學及遺傳偶聯之3E10-GAA之注射

在緩衝液中調配並稀釋3E10*GAA或3E10-GS3-GAA，該緩衝液與靜脈內注射劑(例如無菌鹽水溶液或50mM Tris-HCl,pH 7.4,0.15M NaCl之緩衝溶液)一致。如下計算給予每隻小鼠之3E10*GAA或3E10-GS3-GAA之量：劑量(mg/kg)×小鼠體重(kg)×原液濃度(mg/ml)=原液體積(ml)/小鼠，用媒劑補足至100ul。

ii)血液收集

iii)組織收集及準備

iv)組織學評估

以1μm切割Epon樹脂包埋樣品並以用於肝醣染色之PAS-Richardson氏染色劑進行染色。與對照治療之安德森病小鼠相比，經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之安德森病小鼠之組織(例如，肌肉或肝)中降低之肝醣累積程度指示，3E10*GAA或3E10-GS3-GAA能在活體內減少肝醣含量。

v)免疫螢光

vi)免疫印跡

使用免疫印跡在經3E10-GAA治療之肌肉及肝組織中檢測3E10及GAA免疫反應性材料。3E10及GAA之蛋白質分離及免疫印跡檢測係根據常規免疫印跡方法來實施。用此蛋白質之特異性抗體檢測GAA。印跡蛋白質之抗體檢測使用NBT/BCIP作為受質。對照包括媒劑及經治療之安德森病小鼠以及媒劑及經治療之同型接合野生型小鼠。

vii)循環3E10-GAA之分析

研發對人類3E10-GAA具有特異性之ELISA並使用可得抗人類GAA抗體及辣根過氧化酶偶聯之抗小鼠二級抗體(Jackson Immunoresearch)加以驗證。稀釋重組3E10-GAA並用於生成標準曲線。自血清稀釋液(正規化至ng/ml血清)或組織提取物(正規化至ng/mg組織)測定3E10-GAA含量。對照包括媒劑及經治療之野生型及安德森病小鼠。

viii)抗3E10-GAA抗體反應之監測

將用於注射安德森病小鼠之純化3E10-GAA以1ug/ml平鋪至高結合96孔ELISA板之塗佈緩衝液(Pierce Biotech)中，使其塗佈過夜，在TBS中之1%脫脂奶粉(Biorad)中封阻30分鐘，並在TBS中沖洗三次。將來自注射媒劑及3E10-GAA之動物之2倍血清稀釋液加載至孔中，將其在37℃下培育30分鐘，洗滌三次，與辣根過氧化酶(HRP)偶聯之兔抗小鼠IgA、IgG及IgM一起培育，將其在37℃下培育30分鐘，並洗滌三次。用TMB液體受質檢測小鼠抗3E10-GAA抗體並在405nm下在ELISA讀板器中讀取。多株兔抗小鼠GAA抗體及之後的HRP偶聯之山羊抗兔用作陽性對照抗體反應。在405nm下大於媒劑治療之安德森病小鼠之任一吸光度構成陽性抗3E10-GAA抗體反應。對照包括媒劑及經治療之野生型小鼠及安德森病小鼠。

ix)組織肝醣分析

使用Akman(2011)中所述之方案分析組織肝醣含量。將冷凍肌肉及肝組織樣品(約30-60mg)在200μl之30%(wt/vol)KOH中煮沸30min，不時振盪。在冷卻後，添加67μl之0.25m Na2SO4及535μl乙醇。隨後，將樣品在4℃下以14500g離心20min以收集肝醣。將肝醣糰粒懸浮於水(100μl)中，添加200μl乙醇並使用如上所述之離心來收穫肝醣。重複此乙醇沈澱步驟，且將肝醣糰粒在Speed-Vac中乾燥。將乾燥肝醣糰粒懸浮於100μl澱粉葡萄糖苷酶[0.3mg/ml，於0.2m乙酸鈉(pH 4.8)中]中並在37℃下培育3h以消化肝醣。為測定樣品中之葡萄糖濃度，將經消化肝醣之等份(5μl)添加至95μl含有以下之溶液中：0.3m三乙醇胺(pH 7.6)、0.4mm MgCl2、0.9mm NADP、1mm ATP及0.1μg葡萄糖-6-磷酸去氫酶/ml。在添加0.1μg己糖激酶之前及之後，在340nm下讀取吸光度。

xi)存活評價

在存活研究中監測在上述實驗中未殺死之彼等經治療及未經治療之患病及對照小鼠。特定而言，記錄動物之疾病狀態、治療條件及死亡日期。基於此研究之結果製備存活曲線。

xii)統計學分析

成對比較採用司徒登氏t測試。多組之間之比較採用ANOVA。在兩種情形中，將p值<0.05視為在統計學上顯著。

實例7 在馮古爾克病小鼠中對靶向肌肉之GAA之活體內評價 用於評估之馮吉爾克病小鼠模型之選擇

發現經改造而缺失G6Pase-α之小鼠可模擬GSD-Ia之人類情形(Kim等人，2007,FEBS Lett.,581(20)：3833-38)。特定而言，該等小鼠表現血糖穩態紊亂之代謝異常特徵且亦展示顆粒球群落刺激因子(G-CSF)及細胞介素誘導之嗜中性球化學吸引劑(KC)之顯著增加之含量。本文所揭示之任一嵌合多肽亦可在馮吉爾克病之任何其他已知動物模型中測試。舉例而言，本文所述之任一嵌合多肽可替代性地在小鼠模型中測試，類似於彼等闡述於Lei等人，1996,Nat Genet.,13：203-209；Chen等人，2003,Hum Mol Genet,12：2547-2558中者。

GAA劑量之選擇

憑經驗確定遞送至GSD-Ia小鼠之化學或遺傳偶聯至GAA之3E10(例如，全長mAb 3E10、Fab-3E10或Fv-3E10)之評估劑量。為使針對3E10-GS3-GAA之中和免疫反應之混淆效應最小化且使顯示治療性效應之能力最大化，評價在一週內遞送之兩個高劑量之5mg/kg之3E10-GS3-GAA，之後評價疾病終點之變化。亦監測抗3E10-GAA抗體之產生。在確立靜脈內3E10*GAA或3E10-GS3-GAA導致小鼠腎或肝中之異常肝醣儲積之改良及/或嗜中性球減少症之改良後，開始在其他模型(例如，靈長類動物)中之後續活體內評價，隨後評價肝醣清除之變化，如藉由免疫組織化學(例如，PAS染色)所測定。

材料及方法 i)化學及遺傳偶聯之3E10-GAA之注射

將3E10*GAA或3E10-GS3-GAA在緩衝液中調配並稀釋，該緩衝液與靜脈內注射劑(例如無菌鹽水溶液或50mM Tris-HCl,pH 7.4,0.15M NaCl之緩衝溶液)一致。如下計算給予每隻小鼠之3E10*GAA或3E10-GS3-GAA之量：劑量(mg/kg)×小鼠體重(kg)×原液濃度(mg/ml)=原液體積(ml)/小鼠，用媒劑補足至100ul。

ii)血液收集及分析

使用含有EDTA之CAPIJECT管(TerumoMedical Co.,Elkton,MD)以類似於Kim等人，2007,FEBS Lett,581(20)：3833-3838中所述之方式自小鼠尾靜脈收集血樣。如先前所述在Hema 3(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA.)染色之塗片上實施末梢血細胞之手動200個細胞之白血球分類計數。使用Quantikine ELISA套組(R&D Systems公司，Minneapolis,MN)對細胞介素顆粒球群落刺激因子(G-CSF)及細胞介素誘導之嗜中性球化學吸引劑(KC)進行定量。若來自經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之GSD-Ia小鼠之血樣中的G-CSF及/或KC含量降低，則指示，該治療有效降低該等細胞介素在GSD-Ia小鼠血液中之含量。另外，亦在血樣中評價嗜中性球計數。Kim等人，2007。若與年齡匹配之未經治療之對照小鼠相比，嗜中性球計數在經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之三週齡或更老小鼠中降低，則此指示，該治療有效降低GSD-Ia小鼠中之嗜中性球增多症。

iii)組織收集及準備

分開所取樣組織用於免疫印跡、肝醣分析、福馬林固定之石蠟包埋之組織塊及OCT中之冷凍切片。將心、肝、肺、脾、腎、四頭肌、EDL、比目魚肌、橫膈膜及二頭肌組織(50-100mg)細分並在塑膠管中冷凍用於進一步處理以供免疫印跡及肝醣分析。細分心臟、肝、肺、脾、腎、四頭肌、EDL、比目魚肌、橫膈膜及二頭肌之其他樣品，在OCT組織切片培養基中冷凍，或在4℃下在3%戊二醛甲醛固定中固定24至48小時，並包埋於Epon樹脂中或固定於10% NBF中，且處理為石蠟塊。對於蘇木素及伊紅(H&E)染色，將組織保存在10%中性緩衝福馬林中，包埋於石蠟中，且以4-6微米厚度切片。Kim等人，2007,FEBS Lett,581(20)：3833-3838。

iv)組織學評估

以1μm切割Epon樹脂包埋樣品並以用於肝醣染色之PAS-Richardson氏染色劑進行染色。與對照治療之GSD-Ia病小鼠相比，經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之GSD-Ia病小鼠之組織(例如，肌肉或肝)中降低之肝醣累積程度指示，3E10*GAA或3E10-GS3-GAA能在活體內減少肝醣含量。

v)免疫螢光

使用多株或單株抗GAA抗體、例如以下文獻中所用之抗體來檢測外源遞送之GAA：Chen等人，Am J Hum Genet.1987 Dec；41(6)：1002-15或Parker等人(2007)。切割10微米冷凍切片並將其置於Superfrost Plus顯微鏡載玻片上。

vi)免疫印跡

使用免疫印跡在經3E10-GAA處理之肌肉及肝組織中檢測3E10及GAA免疫反應性材料。根據常規免疫印跡方法來實施3E10及GAA之蛋白質分離及免疫印跡檢測。用對此蛋白質具有特異性之抗體檢測GAA。印跡蛋白質之抗體檢測使用NBT/BCIP作為受質。對照包括媒劑及經治療之GSD-Ia病小鼠以及媒劑及經治療之同型接合野生型小鼠。

vii)循環3E10-GAA之分析

研發對人類3E10-GAA具有特異性之ELISA並使用可得抗人類GAA抗體及辣根過氧化酶偶聯之抗小鼠二級抗體(Jackson Immunoresearch)加以驗證。稀釋重組3E10-GAA並用於生成標準曲線。自血清稀釋液(正規化至ng/ml血清)或組織提取物(正規化至ng/mg組織)測定3E10-GAA含量。對照包括媒劑及經治療之野生型及GSD-Ia小鼠。

viii)抗3E10-GAA抗體反應之監測

將用於注射GSD-Ia小鼠之純化3E10-GAA以1ug/ml平鋪至高結合96孔ELISA板之塗佈緩衝液(Pierce Biotech)中，使其塗佈過夜，在TBS中之1%脫脂奶粉(Biorad)中封阻30分鐘，並在TBS中沖洗三次。將來自注射媒劑及3E10-GAA之動物之2倍血清稀釋液加載至孔中，將其在37℃下培育30分鐘，洗滌三次，與辣根過氧化酶(HRP)偶聯之兔抗小鼠IgA、IgG及IgM一起培育，將其在37℃下培育30分鐘，並洗滌三次。用TMB液體受質檢測小鼠抗3E10-GAA抗體並在405nm下在ELISA讀板器中讀取。多株兔抗小鼠GAA抗體及之後的HRP偶聯之山羊抗兔用作陽性對照抗體反應。在405nm下大於媒劑治療之GSD-Ia小鼠之任一吸光度構成陽性抗3E10-GAA抗體反應。對照包括媒劑及經治療之野生型小鼠及GSD-Ia小鼠。

ix)組織肝醣分析

xii)統計學分析

實例8 在拉弗拉病小鼠中對靶向肌肉之GAA之活體內評價 用於評估之拉弗拉病小鼠模型之選擇

經改造而缺失馬啉素之小鼠展示類似於在拉弗拉病之人類情形中所觀察之表型。特定而言，馬啉素^-/-小鼠以年齡依賴性方式呈現神經退化、增加之突觸興奮性及經受肌陣攣發作之傾向。Valles-Ortega等人，2011,EMBO Mol Med,3(11)：667-681。另外，該等小鼠累積填充肝醣之包涵體，該等包涵體在海馬體及小腦中最豐富，但亦發現於骨骼肌及心肌細胞中。Valles-Ortega等人。亦發現與在健康對照小鼠之細胞中觀察之肝醣相比，肝醣在馬啉素^-/-小鼠之細胞中較少分支。Valles-Ortega等人。在此小鼠模型中亦闡述升高程度之肝醣過磷酸化。Turnbull等人，2010,Ann Neurol,68(6)：925-33。可用於本文所述活體內實驗中之替代性小鼠模型包括Ganesh等人，2002,Hum Mol Genet,11(11)：1251-62中所述之拉弗拉蛋白^-/-小鼠模型。

GAA劑量之選擇

憑經驗確定遞送至GSD-Ia小鼠之化學或遺傳偶聯至GAA之3E10 (例如，全長mAb 3E10、Fab-3E10或Fv-3E10)之評估劑量。為使針對3E10-GS3-GAA之中和免疫反應之混淆效應最小化且使顯示治療性效應之能力最大化，評價在一週內遞送之兩個高劑量之5mg/kg之3E10-GS3-GAA，之後評價疾病終點之變化。亦監測抗3E10-GAA抗體之產生。在確立靜脈內3E10*GAA或3E10-GS3-GAA導致小鼠腎或肝中之異常肝醣儲積之改良後，開始在其他模型(例如，靈長類動物)中之後續活體內評價，隨後評價肝醣清除之變化，如藉由免疫組織化學(例如，PAS染色)所測定。

材料及方法 i)化學及遺傳偶聯之3E10-GAA之注射

ii)血液收集

iii)組織收集及準備

分開所取樣組織用於免疫印跡、肝醣分析、福馬林固定之石蠟包埋之組織塊及OCT中之冷凍切片。將心、肝、肺、脾、腎、四頭肌、EDL、比目魚肌、橫膈膜及二頭肌組織(50-100mg)細分並在塑膠管中冷凍用於進一步處理以供免疫印跡及肝醣分析。細分心臟、肝、肺、脾、腎、四頭肌、EDL、比目魚肌、橫膈膜及二頭肌之其他樣品，在OCT組織切片培養基中冷凍，或在4℃下在3%戊二醛甲醛固定中固定24至48小時，並包埋於Epon樹脂中或固定於10% NBF中，且處理為石蠟塊。將一些樣品在30%KOH中勻漿化15min並使用Valles-Ortega等人所述之基於澱粉葡萄糖苷酶之分析測定肝醣含量。另外，使用Valles-Ortega等人所述之方法在勻漿化樣品中評價肝醣分支。與未經治療之對照小鼠相比，來自經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之小鼠之樣品中肝醣累積之降低及肝醣分支之增加指示，嵌合多肽能在小鼠細胞中清除肝醣並改良肝醣分支。

iv)組織學評估

以1μm切割Epon樹脂包埋樣品並以用於肝醣染色之PAS-Richardson氏染色劑進行染色。與對照治療之拉弗拉病小鼠相比，經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之拉弗拉病小鼠之組織(例如，肌肉或肝)中降低之肝醣累積程度指示，3E10*GAA或3E10-GS3-GAA能在活體內減少肝醣含量。

v)免疫螢光

vi)免疫印跡

在經3E10-GAA處理之肌肉及肝組織中使用免疫印跡來檢測3E10及GAA免疫反應性材料。根據常規免疫印跡方法來實施3E10及GAA之蛋白質分離及免疫印跡檢測。用對此蛋白質具有特異性之抗體檢測GAA。印跡蛋白質之抗體檢測使用NBT/BCIP作為受質。對照包括媒劑及經治療之拉弗拉病小鼠以及媒劑及經治療之同型接合野生型小鼠。

vii)循環3E10-GAA之分析

viii)抗3E10-GAA抗體反應之監測

將用於注射GSD-Ia小鼠之純化3E10-GAA以1ug/ml平鋪至高結合96孔ELISA板之塗佈緩衝液(Pierce Biotech)中，使其塗佈過夜，在TBS中之1%脫脂奶粉(Biorad)中封阻30分鐘，並在TBS中沖洗三次。將來自注射媒劑及3E10-GAA之動物之2倍血清稀釋液加載至孔中，將其在37℃下培育30分鐘，洗滌三次，與辣根過氧化酶(HRP)偶聯之兔抗小鼠IgA、IgG及IgM一起培育，將其在37℃下培育30分鐘，並洗滌三次。用TMB液體受質檢測小鼠抗3E10-GAA抗體並在405nm下在ELISA讀板器中讀取。多株兔抗小鼠GAA抗體及之後的HRP偶聯之山羊抗兔用作陽性對照抗體反應。在405nm下大於媒劑治療之拉弗拉病小鼠之任一吸光度構成陽性抗3E10-GAA抗體反應。對照包括媒劑及經治療之野生型小鼠及拉弗拉病小鼠。

ix)組織肝醣分析

x)癲癇發作評價

在小鼠之C57BL6品系中生成Valles-Ortega等人所述之馬啉素^-/-小鼠，該品系通常抵抗癲癇發作。然而，儘管在野生型C57BL6小鼠中投與紅藻胺酸不誘導任何癲癇發作，但經紅藻胺酸治療之馬啉素^-/-小鼠展示陣攣性海馬體癲癇發作。Valles-Ortega等人。用紅藻胺酸且用或不用3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療馬啉素^-/-小鼠。若與經紅藻胺酸但不經任何嵌合多肽治療之馬啉素^-/-小鼠相比，經紅藻胺酸及3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之小鼠展示降低之癲癇發作，則此指示，該等嵌合多肽有效治療在馬啉素^-/-小鼠中觀察到之一些神經缺陷。

xi)神經退化分析

在經或未經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之馬啉素^-/-小鼠之海馬體中評價小清蛋白陽性中間神經元之總數。Valles-Ortega等人。若經3E10*GAA或3E10-GS3-GAA治療之小鼠之海馬體展示小清蛋白陽性神經退化少於未經治療之小鼠之海馬體，則此指示，該等嵌合多肽有效降低馬啉素^-/-小鼠中之神經退化。

xii)統計學分析

將類似地使用前述實驗方案(前述實例中之任何一個或一個以上)來評估本發明其他嵌合多肽。藉助非限制性實例，使用此方案來評估具有GAA部分(或其片段)及內化性部分之化學偶聯物及重組偶聯物。在某些實施例中，嵌合多肽包含內化性部分，其係抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，內化性部分係Fab或Fab’。以類似方式製造並分析具有如本文所述之任何GAA部分及如本文所述之任何內化性部分之任何嵌合多肽。

與上述彼等類似之實例係使用本文所揭示之任何其他嵌合多肽(例如，包含拉弗拉蛋白多肽部分之嵌合多肽，或包含馬啉素多肽部分之嵌合多肽，或包含α-澱粉酶多肽部分之嵌合多肽，或包含AGL多肽部分之嵌合多肽)來實施。舉例而言，製造並分析包含如本文所述之任一拉弗拉蛋白多肽及如本文所述之任一內化性部分之嵌合多肽。在另一實例中，製造並測試包含本文所述之任一AGL多肽及如本文所述之任一內化性部分之嵌合多肽。在另一實例中，製造並測試包含如本文所述之任一馬啉素多肽及如本文所述之任一內化性部分之嵌合多肽。在另一實例中，製造並測試包含如本文所述之任一α-澱粉酶多肽及如本文所述之任一內化性部分之嵌合多肽。

實例性序列

SEQ ID NO：1=全長不成熟GAA胺基酸序列(952個胺基酸；信號序列以粗體/下劃線指示)

SEQ ID NO：2=全長不成熟GAA胺基酸序列(957個胺基酸；信號序列以粗體/下劃線指示)

(基因庫登錄號EAW89583.1)

SEQ ID NO：3=實例性成熟GAA胺基酸序列(對應於SEQ ID NO：1之殘基123-782；成熟GAA多肽之一個實施例)

SEQ ID NO：4=實例性成熟GAA胺基酸序列(對應於SEQ ID NO：1之殘基288-782；成熟GAA多肽之一個實施例)

SEQ ID NO：5=GS3連接體

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO：6=連接體

GSTSGSGKSSEGKG

SEQ ID NO：7=His標識

HHHHHHH

SEQ ID NO：8=c-Myc標識

EQKLISEEDL

SEQ ID NO：9=實例性3E10可變重鏈(具有D31N取代之V_H；見實例)

SEQ ID NO：10=3E10可變輕鏈(V_L)

SEQ ID NO：11=實例性嵌合多肽Fv3E10-GAA(123-782)

SEQ ID NO：12=實例性嵌合多肽Fv3E10-GAA(288-782)

SEQ ID NO：13-3E10 VH之重鏈可變結構域CDR1(如同VH係參照SEQ ID NO：9來定義)，根據Kabat系統

NYGMH

SEQ ID NO：14-3E10 VH之重鏈可變結構域CDR2(如同VH係參照SEQ ID NO：9來定義)，根據Kabat系統

YISSGSSTIYYADTVKG

SEQ ID NO：15-3E10 VH之重鏈可變結構域CDR3(如同VH係參照SEQ ID NO：9來定義)，根據Kabat系統

RGLLLDY

SEQ ID NO：16-3E10 VL之輕鏈可變結構域CDR1(如同VL係參照SEQ ID NO：10來定義)，根據Kabat系統

RASKSVSTSSYSYMH

SEQ ID NO：17-3E10 VL之輕鏈可變結構域CDR2(如同VL係參照SEQ ID NO：10來定義)，根據Kabat系統

YASYLES

SEQ ID NO：18-3E10 VL之輕鏈可變結構域CDR3(如同VL係參照SEQ ID NO：10來定義)，根據Kabat系統

QHSREFPWT

SEQ ID NO：19

AGIH

SEQ ID NO：20

SAGIH

SEQ ID NO：21-包含成熟GAA之實例性GAA多肽(殘基61-952；GAA多肽之一個實施例)

SEQ ID NO：22-包含成熟GAA之實例性GAA多肽(殘基67-952；GAA多肽之一個實施例)

SEQ ID NO：23-包含成熟GAA之實例性GAA多肽(殘基70-952；GAA多肽之一個實施例)

SEQ ID NO：24-實例性3E10 V_H之重鏈可變(VH)結構域CDR1(如同VH係參照SEQ ID NO：9來定義)，根據IMGT系統

GFTFSNYG

SEQ ID NO：25-實例性3E10 V_H之重鏈可變(VH)結構域CDR2(如同VH係參照SEQ ID NO：9來定義)，根據IMGT系統

ISSGSSTI

SEQ ID NO：26-實例性3E10 V_H之重鏈可變(VH)結構域CDR3(如同VH係參照SEQ ID NO：9來定義)，根據IMGT系統

ARRGLLLDY

SEQ ID NO：27-實例性3E10 V_L之輕鏈可變(VL)結構域CDR1(如同VL係參照SEQ ID NO：10來定義)，根據IMGT系統

KSVSTSSYSY

SEQ ID NO：28-實例性3E10 V_L之輕鏈可變(VL)結構域CDR2(如同VL係參照SEQ ID NO：10來定義)，根據IMGT系統

YAS

SEQ ID NO：29-實例性3E10 V_L之輕鏈可變(VL)結構域CDR3(如同VL係參照SEQ ID NO：10來定義)，根據IMGT系統

QHSREFPWT

SEQ ID NO：30-連接體序列

GGSGGGSGGGSGG

SEQ ID NO：31-完整連接體區域(GAA之殘基57-78)

HILLHDFLLVPRELSGSSPVLEETHPAH

SEQ ID NO：32-牛GAA前體蛋白(基因庫登錄號NP_776338.1)

SEQ ID NO：33-實例性信號序列

MSVPTQVLGLLLLWLTDARC

SEQ ID NO：34-鼠類κ恆定結構域(CL)

SEQ ID NO：35-mu3E10輕鏈序列(VL+CL)+信號序列

加下劃線序列對應於鼠類信號序列；粗體序列對應於鼠類κ恆定結構域

SEQ ID NO：36-實例性信號序列

MEWSWVFLFFLSVTTGVHS

SEQ ID NO：37-mu3E10可變重鏈序列(VH)+信號序列

加下劃線序列對應於鼠類信號序列

SEQ ID NO：38-人類拉弗拉蛋白(EPM2A)同種型a(基因庫登錄號NM_005670.3)

SEQ ID NO：39-人類拉弗拉蛋白(EPM2A)同種型b(基因庫登錄號NM_001018041.1)

SEQ ID NO：40-人類AGL蛋白質同種型1之胺基酸序列(基因庫登錄號NP_000019.2)

SEQ ID NO：41-人類AGL蛋白質同種型2之胺基酸序列(基因庫登錄號NM_000645.2)

SEQ ID NO：42-人類AGL蛋白質同種型3之胺基酸序列(基因庫登錄號NM_000646.2)

SEQ ID NO：43-人類馬啉素胺基酸序列(基因庫登錄號AY324850.1)

SEQ ID NO：44-人類胰腺α澱粉酶胺基酸序列(基因庫登錄號：NP_000690.1)

SEQ ID NO：45-人類唾液α澱粉酶胺基酸序列(基因庫登錄號：AAI44453.1)

SEQ ID NO：46-某些本發明抗體之重鏈可變結構域CDR2，根據如藉由Kabat所定義之CDR

YISSGSSTIYYADSVKG

SEQ ID NO：47-某些本發明抗體之輕鏈可變結構域CDR1，根據如藉由Kabat所定義之CDR

RASKSVSTSSYSYLA

SEQ ID NO：48-某些本發明抗體之輕鏈可變結構域CDR2，根據如藉由Kabat所定義之CDR

YASYLQS

以引用方式併入

本文所提及之所有出版物及專利皆係全部內容以引用方式併入本文中，如同明確且個別地指示每一個別出版物或專利以引用方式併入一般。

儘管已論述本發明之具體實施例，但上文說明書具有闡釋性而非限制性。彼等熟習此項技術者可在審閱本說明書及下文之申請專利範圍後瞭解本發明之多個變化形式。本發明的完整範圍應參照申請專利範圍連同其等效內容之完整範圍及說明書連同該等變化形式來確定。

<110> 美商維理恩治療公司

<120> 用於治療肝醣儲積症及肝醣代謝病症之方法及組合物

<130> 106199-0009-TW1

<140>

<141>

<150> PCT/US15/35680

<151> 2015-06-12

<150> 62/096,735

<151> 2014-12-24

<150> 62/042,689

<151> 2014-08-27

<150> 62/012,151

<151> 2014-06-13

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 952

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 957

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 660

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 495

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 5

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 6

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成7×His標識

<400> 7

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成c-Myc標識

<400> 8

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 9

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 10

<210> 11

<211> 931

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 11

<210> 12

<211> 766

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 12

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 14

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 16

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 17

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 18

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 19

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 20

<210> 21

<211> 892

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 21

<210> 22

<211> 886

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 22

<210> 23

<211> 883

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 23

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 24

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 26

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 27

<210> 28

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 28

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 29

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 30

<210> 31

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 31

<210> 32

<211> 937

<212> PRT

<213> 歐洲牛

<400> 32

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 33

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠屬

<400> 34

<210> 35

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 35

<210> 36

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 36

<210> 37

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 37

<210> 38

<211> 331

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

<210> 39

<211> 317

<212> PRT

<213> 智人

<400> 39

<210> 40

<211> 1532

<212> PRT

<213> 智人

<400> 40

<210> 41

<211> 1515

<212> PRT

<213> 智人

<400> 41

<210> 42

<211> 1516

<212> PRT

<213> 智人

<400> 42

<210> 43

<211> 395

<212> PRT

<213> 智人

<400> 43

<210> 44

<211> 511

<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

<210> 45

<211> 511

<212> PRT

<213> 智人

<400> 45

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 46

<210> 47

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 47

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 48

Claims

一種治療有需要之個體之安德森病(Andersen Disease)之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有安德森病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含投與嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。
如請求項1或2之方法，其中該個體患有圍產期形式之安德森病。
如請求項1或2之方法，其中該個體患有先天形式之安德森病。
如請求項1或2之方法，其中該個體患有少年期形式之安德森病。
如請求項1或2之方法，其中該個體患有成年形式之安德森病。
一種治療有需要之個體之馮吉爾克病(von Gierke Disease)之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有馮吉爾克病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使肝細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
如請求項7或8之方法，其中該個體在編碼葡萄糖-6-磷酸酶之基因中具有突變。
如請求項7或8之方法，其中該個體在編碼SLC37A4之基因中具有突變。
一種治療有需要之個體之拉弗拉病(Lafora Disease)之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有拉弗拉病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA或由其組成之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
如請求項11或12之方法，其中該個體在EPM2A基因中具有突變。
如請求項11或12之方法，其中該個體在EPM2B基因中具有突變。
如請求項1及3至14中任一項之方法，其中該有需要之個體係在開始用該嵌合多肽治療之前具有病理性細胞質肝醣累積之個體。
如請求項1至15中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含SEQ ID NO：1或2中所述之該GAA多肽。
如請求項1至15中任一項之方法，其中該嵌合多肽不包含SEQ ID NO：1或2之殘基1至56中所述之GAA多肽之部分。
如請求項1至15中任一項之方法，其中該嵌合多肽不包含SEQ ID NO：1或2之殘基1至57中所述之GAA多肽之部分。
如請求項1至15或17至18中任一項之方法，其中該嵌合多肽缺少GAA完整連接體區域之至少一部分，其中該完整連接體區域對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸57至78。
如請求項1至15或17至19中任一項之方法，其中該嵌合多肽缺少該GAA完整連接體區域之至少一部分，其中該完整連接體區域對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸57至78。
如請求項1至15或17至20中任一項之方法，其中該GAA多肽及該嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1至60之鄰接胺基酸序列。
如請求項1至15或17至21中任一項之方法，其中該嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
如請求項1至15或17至22中任一項之方法，其中該GAA多肽及該嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1至66之鄰接胺基酸序列。
如請求項1至15或17至23中任一項之方法，其中該嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
如請求項1至15或17至24中任一項之方法，其中該GAA多肽及該嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1至69之鄰接胺基酸序列。
如請求項1至15或17至25中任一項之方法，其中該嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：23之序列。
如請求項1至15或17至26中任一項之方法，其中該成熟GAA多肽之分子量為約70至76千道爾頓。
如請求項1至15或17至27中任一項之方法，其中該成熟GAA多肽之分子量為約70千道爾頓。
如請求項1至15或17至28中任一項之方法，其中該成熟GAA多肽之分子量為約76千道爾頓。
如請求項1至15或17至29中任一項之方法，其中該成熟GAA多肽係由選自SEQ ID NO：1之殘基122至782或SEQ ID NO：2之殘基204至782之胺基酸序列組成。
如請求項1至30中任一項之方法，其中該嵌合多肽具有酸性α-葡萄糖苷酶活性。
一種治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)拉弗拉蛋白多肽及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有拉弗拉病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)拉弗拉蛋白多肽及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
如請求項32或33之方法，其中該個體在EPM2A基因中具有突變。
如請求項32或33之方法，其中該個體在EPM2B基因中具有突變。
如請求項32至35中任一項之方法，其中該拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少80%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項32至36中任一項之方法，其中該拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項32至36中任一項之方法，其中該拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
一種治療有需要之個體之安德森病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有安德森病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含投與嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分。
如請求項39或40之方法，其中該個體患有圍產期形式之安德森病。
如請求項39或40之方法，其中該個體患有先天形式之安德森病。
如請求項39或40之方法，其中該個體患有少年期形式之安德森病。
如請求項39或40之方法，其中該個體患有成年形式之安德森病。
一種治療有需要之個體之龐貝氏病(Pompe Disease)之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有龐貝氏病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使肌肉細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
一種治療有需要之個體之馮吉爾克病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有馮吉爾克病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使肝細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
如請求項47或48之方法，其中該個體在編碼葡萄糖-6-磷酸酶之基因中具有突變。
如請求項47或48之方法，其中該個體在編碼SLC37A4之基因中具有突變。
一種治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有拉弗拉病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含：(i)澱粉葡萄糖苷酶(AGL)多肽及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
如請求項51或52之方法，其中該個體在EPM2A基因中具有突變。
如請求項51或52之方法，其中該個體在EPM2B基因中具有突變。
如請求項39至54中任一項之方法，其中該AGL多肽包含與SEQ ID NO：40-42中之任一者至少90%一致之胺基酸序列，且其中該嵌合多肽具有澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性及4-α-葡糖轉移酶活性。
如請求項39至55中任一項之方法，其中該AGL多肽包含與SEQ ID NO：40-42中之任一者至少95%一致之胺基酸序列，且其中該嵌合多肽具有澱粉-1,6-葡萄糖苷酶活性及4-α-葡糖轉移酶活性。
一種治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)馬啉素多肽及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有拉弗拉病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含 (i)馬啉素多肽及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
如請求項57或58之方法，其中該個體在EPM2A基因中具有突變。
如請求項57或58之方法，其中該個體在EPM2B基因中具有突變。
如請求項57至60中任一項之方法，其中該馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少80%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項57至61中任一項之方法，其中該馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項57至62中任一項之方法，其中該馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
一種治療有需要之個體之拉弗拉病之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)α-澱粉酶多肽及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有拉弗拉病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)α-澱粉酶多肽及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
如請求項64或65之方法，其中該個體在EPM2A基因中具有突變。
如請求項64或65之方法，其中該個體在EPM2B基因中具有突變。
如請求項64至67中任一項之方法，其中該α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少80%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項64至68中任一項之方法，其中該α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項64至69中任一項之方法，其中該α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
一種治療有需要之個體之福布斯-柯裡氏病(Forbes-Cori Disease)之方法，其包含投與包含以下之嵌合多肽：(i)α-澱粉酶多肽及(ii)促進遞送至細胞中之內化性部分。
一種在患有福布斯-柯裡氏病之個體之細胞之細胞質中減少肝醣累積之方法，其包含使神經元細胞與嵌合多肽接觸，該嵌合多肽包含(i)α-澱粉酶多肽及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分。
如請求項71或72之方法，其中該個體在EPM2A基因中具有突變。
如請求項71至73之方法，其中該個體在EPM2B基因中具有突變。
如請求項71至74中任一項之方法，其中該α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少80%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項71至75中任一項之方法，其中該α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項71至76中任一項之方法，其中該α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項1至77中任一項之方法，其中該內化性部分促進將嵌合多肽遞送至細胞中。
如請求項1至78中任一項之方法，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至細胞之細胞質中。
如請求項1至79中任一項之方法，其中該嵌合多肽能被自噬液泡吸收。
如請求項1至80中任一項之方法，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肌肉細胞中。
如請求項1至81中任一項之方法，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肝細胞中。
如請求項1至82中任一項之方法，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽運輸至神經元中。
如請求項1至83中任一項之方法，其中該嵌合多肽減少細胞質肝醣累積。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該GAA多肽經糖基化。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該GAA多肽未經糖基化。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該GAA多肽之糖基化模式與天然人類GAA不同。
如請求項1至87中任一項之方法，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至細胞之細胞質中。
如請求項1至85及87至88中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含經M6P殘基修飾之N-連接寡糖鏈。
如請求項1至89中任一項之方法，其中該嵌合多肽進一步包含一或多個多肽部分，其增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與、產生或純化中之一或多者。
如請求項1至90中任一項之方法，其中該內化性部分包含可經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)運輸蛋白穿過細胞膜及/或以小於100nM之K_D結合DNA之抗體或抗原結合片段。
如請求項91之方法，其中該抗體係單株抗體或其片段。
如請求項91或92之方法，其中該抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留細胞穿透活性之變體或其結合與3E10相同之表位之變體，或具有與3E10實質上相同之細胞穿透活性且結合與3E10相同之表位之抗體或前述任一者之抗原結合片段。
如請求項91至93中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留3E10之細胞穿透活性之變體或3E10或該3E10變體之抗原結合片段。
如請求項1至94中任一項之方法，其中該內化性部分包含結合DNA之抗體或抗原結合片段(例如，抗DNA抗體)。
如請求項91至95中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段係嵌合、人類化或完全人類抗體或抗原結合片段。
如請求項91至96中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：9至少95%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項91至97中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：10至少95%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項91至98中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項91至99中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO 13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列；該等CDR符合Kabat。
如請求項91至99中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO 24之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列；該等CDR符合IMGT系統。
如請求項91至99或101中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16或47之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。
如請求項91至99或101中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。
如請求項91至103中任一項之方法，其中該內化性部分係scFv。
如請求項91至103中任一項之方法，其中該內化性部分係Fab。
如請求項91至103中任一項之方法，其中該內化性部分係抗體。
如請求項105之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端融合至GAA多肽之N-末端。
如請求項106之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端融合至GAA多肽之N-末端。
如請求項107之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該GAA多肽之N-末端。
如請求項108之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該GAA多肽之N-末端。
如請求項109或110之方法，其中該連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
如請求項105之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端融合至拉弗拉蛋白多肽之N-末端。
如請求項106之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端融合至拉弗拉蛋白多肽之N-末端。
如請求項112之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該拉弗拉蛋白多肽之N-末端。
如請求項113之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該拉弗拉蛋白多肽之N-末端。
如請求項114或115之方法，其中該連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
如請求項105之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端融合至AGL多肽之N-末端。
如請求項106之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端融合至AGL多肽之N-末端。
如請求項117之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該AGL多肽之N-末端。
如請求項118之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該AGL多肽之N-末端。
如請求項119或120之方法，其中該連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
如請求項105之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端融合至馬啉素多肽之N-末端。
如請求項106之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端融合至馬啉素多肽之N-末端。
如請求項122之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該馬啉素多肽之N-末端。
如請求項123之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該馬啉素多肽之N-末端。
如請求項124或125之方法，其中該連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
如請求項105之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端融合至α-澱粉酶多肽之N-末端。
如請求項106之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端融合至α-澱粉酶多肽之N-末端。
如請求項127之方法，其中該Fab之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該α-澱粉酶多肽之N-末端。
如請求項128之方法，其中該抗體之重鏈之C-末端藉助連接體融合至該α-澱粉酶多肽之N-末端。
如請求項127或128之方法，其中該連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
如請求項1至133中任一項之方法，其中該內化性部分能以小於100nM之K_D結合DNA。
如請求項1至132中任一項之方法，其中該內化性部分以小於50nM之K_D結合DNA。
如請求項1至90中任一項之方法，其中該內化性部分包含歸向肽。
如請求項1至31、85至87或107至111中任一項之方法，其中該嵌合多肽係GAA多肽與該內化性部分之化學偶聯物。
如請求項1至31、85至87或107至111中任一項之方法，其中該嵌合多肽係包含該GAA多肽及該內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。
如請求項32至38或112至116中任一項之方法，其中該嵌合多肽係拉弗拉蛋白多肽與該內化性部分之化學偶聯物。
如請求項32至38或112至116中任一項之方法，其中該嵌合多肽係包含該拉弗拉蛋白多肽及該內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。
如請求項39至56或117至121中任一項之方法，其中該嵌合多肽係AGL多肽與該內化性部分之化學偶聯物。
如請求項39至56或117至121中任一項之方法，其中該嵌合多肽係包含該AGL多肽及該內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。
如請求項57至63或122至126中任一項之方法，其中該嵌合多肽係馬啉素多肽與該內化性部分之化學偶聯物。
如請求項57至63或122至126中任一項之方法，其中該嵌合多肽係包含該馬啉素多肽及該內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。
如請求項65至77或127至132中任一項之方法，其中該嵌合多肽係α-澱粉酶多肽與該內化性部分之化學偶聯物。
如請求項65至77或127至132中任一項之方法，其中該嵌合多肽係包含該α-澱粉酶多肽及該內化性部分之重組共轉譯融合蛋白。
如請求項1至144中任一項之方法，其中該內化性部分經由平衡核苷運輸蛋白1(ENT1)、ENT2、ENT3或ENT4運輸蛋白穿過細胞膜。
如請求項145之方法，其中該內化性部分可經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)運輸蛋白穿過細胞膜。
如請求項1至146中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含融合蛋白。
如請求項147之方法，其中該嵌合多肽係在原核或真核細胞中產生。
如請求項148之方法，其中該真核細胞選自酵母細胞、禽類細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
如請求項1至31、85至87、107至111或135至136中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含將該GAA多肽直接或間接偶聯或接合至該內化性部分之連接體。
如請求項1至31、85至87、107至111或135至136中任一項之方法，其中該嵌合多肽不包括將該GAA多肽互連至該內化性部分之連接體。
如請求項150之方法，其中該連接體係可裂解連接體。
如請求項150至152中任一項之方法，其中該內化性部分位於該GAA多肽之N-末端。
如請求項150至152中任一項之方法，其中該內化性部分偶聯或接合至該GAA多肽之內部胺基酸。
如請求項32至38、112至118或127至138中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含將該拉弗拉蛋白多肽直接或間接偶聯或接合至該內化性部分之連接體。
如請求項32至38、112至118或127至138中任一項之方法，其中該嵌合多肽不包括將該拉弗拉蛋白多肽互連至該內化性部分之連接體。
如請求項155之方法，其中該連接體係可裂解連接體。
如請求項155至157中任一項之方法，其中該內化性部分位於該拉弗拉蛋白多肽之N-末端。
如請求項155至157中任一項之方法，其中該內化性部分偶聯或接合至該拉弗拉蛋白多肽之內部胺基酸。
如請求項39至56、117至121或139至140中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含將該AGL多肽直接或間接偶聯或接合至該內化性部分之連接體。
如請求項39至56、117至121或139至140中任一項之方法，其中該嵌合多肽不包括將該AGL多肽互連至該內化性部分之連接體。
如請求項160之方法，其中該連接體係可裂解連接體。
如請求項160至162中任一項之方法，其中該內化性部分位於該 AGL多肽之N-末端。
如請求項160至162中任一項之方法，其中該內化性部分偶聯或接合至該AGL多肽之內部胺基酸。
如請求項57至63、122至126或141至142中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含將該馬啉素多肽直接或間接偶聯或接合至該內化性部分之連接體。
如請求項57至63、122至126或141至142中任一項之方法，其中該嵌合多肽不包括將該馬啉素多肽互連至該內化性部分之連接體。
如請求項165之方法，其中該連接體係可裂解連接體。
如請求項165至167中任一項之方法，其中該內化性部分位於該馬啉素多肽之N-末端。
如請求項165至168中任一項之方法，其中該內化性部分偶聯或接合至該馬啉素多肽之內部胺基酸。
如請求項65至77、127至132或143至149中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含將該α-澱粉酶多肽直接或間接偶聯或接合至該內化性部分之連接體。
如請求項65至77、127至132或143至149中任一項之方法，其中該嵌合多肽不包括將該α-澱粉酶多肽互連至該內化性部分之連接體。
如請求項170之方法，其中該連接體係可裂解連接體。
如請求項170至172中任一項之方法，其中該內化性部分位於該α-澱粉酶多肽之N-末端。
如請求項170至173中任一項之方法，其中該內化性部分偶聯或接合至該α-澱粉酶多肽之內部胺基酸。
如請求項1至174中任一項之方法，其中該嵌合多肽係非經腸投與。
如請求項1至174中任一項之方法，其中該嵌合多肽係靜脈內投與。
如請求項1至174中任一項之方法，其中該嵌合多肽係肌內投與。
如請求項1至174中任一項之方法，其中該嵌合多肽係皮下投與。
如請求項1至176中任一項之方法，其中該嵌合多肽係經由濃注注射或輸注靜脈內投與。
如請求項1至176中任一項之方法，其中該嵌合多肽係經由肝門靜脈投與。
如請求項1至176中任一項之方法，其中該嵌合多肽係顱內或鞘內投與。
如請求項1至15及17至181中任一項之方法，其中該嵌合多肽具有酸性α-葡萄糖苷酶活性，且其中該嵌合多肽不包含約110千道爾頓之GAA前體多肽。
如請求項1至182中任一項之方法，其中該嵌合多肽具有酸性葡萄糖苷酶活性。
如請求項1至183中任一項之方法，其中該方法包含投與有效量之該嵌合多肽。
如請求項1至184中任一項之方法，其中該方法減少或清除肝醣累積及/或增加肝醣累積，且該肝醣包含葡聚糖。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少90%之存於該組合物中之該GAA多肽互連至內化性部分。
如請求項186之組合物，其中至少95%之存於該組合物中之該GAA多肽互連至內化性部分。
如請求項187之組合物，其中至少97%之存於該組合物中之該GAA多肽互連至內化性部分。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分，其中大於85%之存於該組合物中之該GAA多肽具有實質上相同的胺基酸序列。
如請求項189之組合物，其中至少90%之存於該組合物中之該GAA多肽具有實質上相同的胺基酸序列。
如請求項189或190之組合物，其中大於90%之存於該組合物中之該GAA多肽具有相同的與內化性部分之互連。
如請求項189至191中任一項之組合物，其中至少95%之存於該組合物中之該GAA多肽互連至內化性部分。
如請求項186至192中任一項之組合物，其中大於85%之存於該組合物中之該GAA多肽具有大致相同的分子量。
如請求項186至193中任一項之組合物，其中大於90%之存於該組合物中之該GAA多肽在GAA多肽部分之N-末端相差小於5、4、3、2或1個殘基。
如請求項186至194中任一項之組合物，其中該組合物實質上不含不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。
如請求項186至195中任一項之組合物，其中該組合物包含小於5重量%之不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少85%之該組合物中之該等嵌合多肽包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。
如請求項197之組合物，其中至少90%之該組合物中之該等嵌合多肽包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。
如請求項198之組合物，其中至少95%之該組合物中之該等嵌合多肽包含相差小於5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少85%之存於該組合物中之該GAA包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。
如請求項200之組合物，其中至少90%之該組合物中之該GAA包含相差小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。
如請求項201之組合物，其中至少95%之該組合物中之該GAA包含相差小於5、4、3、2或1個胺基酸殘基之胺基酸序列。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分，其中該組合物實質上不含不包括其他鄰接GAA序列及/或不互連至內化性部分之成熟GAA。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該等嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞之細胞質中之內化性部分，其中至少91%之存於該組合物中之該GAA多肽互連至內化性部分。
如請求項204之組合物，其中至少95%之該組合物中之該GAA多肽互連至內化性部分。
如請求項204之組合物，其中至少98%之該組合物中之該GAA多肽互連至該內化性部分。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少85%之存於該組合物中之該等嵌合多肽具有相同胺基酸序列。
如請求項207之組合物，其中至少90%之該組合物中之該等嵌合多肽具有相同胺基酸序列。
如請求項207之組合物，其中至少95%之該組合物中之該等嵌合多肽具有相同胺基酸序列。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分，其中至少85%之存於該組合物中之該GAA具有相同胺基酸序列。
如請求項210之組合物，其中至少90%之存於該組合物中之該GAA具有相同胺基酸序列。
如請求項210之組合物，其中至少95%之存於該組合物中之該GAA具有相同胺基酸序列。
一種包含與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑調配在一起之嵌合多肽之組合物，該嵌合多肽包含(i)酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)多肽(例如，包含成熟GAA之GAA多肽)及(ii)促進運輸至細胞中之內化性部分，其中小於10%之存於該組合物中之該GAA係成熟GAA多肽。
如請求項213之組合物，其中小於5%之存於該組合物中之該GAA係成熟GAA多肽。
如請求項214之組合物，其中小於2%之存於該組合物中之該GAA係成熟GAA多肽。
如請求項186至215中任一項之組合物，其中該GAA多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
如請求項186至215中任一項之組合物，其中該嵌合多肽包含免疫球蛋白或表位標識。
如請求項217之組合物，其中該免疫球蛋白或表位標識用於該嵌合多肽之純化。
如請求項186至218中任一項之組合物，其中該嵌合多肽包含GAA多肽，且其中該GAA多肽不包含SEQ ID NO：1或2之殘基1 至56所述之GAA多肽之部分。
如請求項219之組合物，其中該嵌合多肽不包含SEQ ID NO：1或2之殘基1至57中所述之GAA多肽之部分。
如請求項186至220中任一項之組合物，其中該嵌合多肽缺少該GAA完整連接體區域之至少一部分，其中該完整連接體區域對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸57至78。
如請求項186至220中任一項之組合物，其中該嵌合多肽缺少該GAA完整連接體區域之至少一部分，其中該完整連接體區域對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸57至78。
如請求項186至222中任一項之組合物，其中該GAA多肽及該嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1至60之鄰接胺基酸序列。
如請求項186至223中任一項之組合物，其中該嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
如請求項186至215中任一項之組合物，其中該GAA多肽及該嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1至66之鄰接胺基酸序列。
如請求項186至225中任一項之組合物，其中該嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
如請求項186至223中任一項之組合物，其中該GAA多肽及該嵌合多肽皆不包含對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸1至69之鄰接胺基酸序列。
如請求項186至227中任一項之組合物，其中該嵌合多肽或GAA多肽包含SEQ ID NO：23之序列。
如請求項186至223中任一項之組合物，其中該嵌合多肽包含SEQ ID NO：1或2中所述之該GAA多肽。
如請求項186至229中任一項之組合物，其中該嵌合多肽具有酸性α-葡萄糖苷酶活性。
如請求項186至230中任一項之組合物，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至細胞中。
如請求項186至231中任一項之組合物，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至細胞之細胞質中。
如請求項186至232中任一項之組合物，其中該嵌合多肽能被自噬液泡吸收。
如請求項186至233中任一項之組合物，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肌肉細胞中。
如請求項186至235中任一項之組合物，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肝細胞中。
如請求項186至235中任一項之組合物，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽運輸至神經元中。
如請求項186至236中任一項之組合物，其中該嵌合多肽減少細胞質肝醣累積。
如請求項186至237中任一項之組合物，其中該GAA多肽經糖基化。
如請求項186至237中任一項之組合物，其中該GAA多肽未經糖基化。
如請求項186至237中任一項之組合物，其中該GAA多肽之糖基化模式與天然人類GAA不同。
如請求項186至240中任一項之組合物，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至細胞之細胞質中。
如請求項186至241中任一項之組合物，其中該嵌合多肽包含經M6P殘基修飾之N-連接寡糖鏈。
如請求項186至242中任一項之組合物，其中該嵌合多肽進一步包含一或多個多肽部分，其增強活體內穩定性、活體內半衰期、攝取/投與、產生或純化中之一或多者。
如請求項186至243中任一項之組合物，其中該內化性部分包含可經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)運輸蛋白穿過細胞膜及/或以小於100nM之K_D結合DNA之抗體或抗原結合片段。
如請求項244之組合物，其中該抗體係單株抗體或其片段。
如請求項244或245之組合物，其中該抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留細胞穿透活性之變體或其結合與3E10相同之表位之變體，或具有與3E10實質上相同之細胞穿透活性且結合與3E10相同之表位之抗體或前述任一者之抗原結合片段。
如請求項244至246中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留3E10之細胞穿透活性之變體或3E10或該3E10變體之抗原結合片段。
如請求項244至247中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段係嵌合、人類化或完全人類抗體或抗原結合片段。
如請求項244至248中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：9至少95%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項244至249中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：10至少95%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項244至250中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項244至251中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO 13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列；該等CDR符合Kabat。
如請求項244至251中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO 24之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列；該等CDR符合IMGT系統。
如請求項244至251中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16或47之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。
如請求項244至251中任一項之組合物，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。
如請求項244至255中任一項之組合物，其中該內化性部分係scFv。
如請求項244至256中任一項之組合物，其中該內化性部分係Fab。
如請求項244至256中任一項之組合物，其中該內化性部分係抗體。
如請求項257之組合物，其中該GAA多肽之N-末端融合至該Fab之重鏈之C-末端。
如請求項258之組合物，其中該GAA多肽之N-末端融合至該抗體之重鏈之C-末端。
如請求項257之組合物，其中該GAA多肽之N-末端藉助連接體融合至該Fab之重鏈之C-末端。
如請求項258之組合物，其中該GAA多肽之N-末端藉助連接體融合至該抗體之重鏈之C-末端。
如請求項261或262之組合物，其中該連接體包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
如請求項186至262中任一項之組合物，其中該內化性部分能以小於100nM之K_D結合DNA。
如請求項186至264中任一項之組合物，其中該內化性部分以小於50nM之K_D結合DNA。
如請求項186至265中任一項之組合物，其中該組合物實質上不含熱原。
如請求項186至266中任一項之組合物，其中該組合物係於瓶子中。
如請求項186至267中任一項之組合物，其中該組合物係於注射器中。
如請求項186至268中任一項之組合物，其中該組合物在投與之前經儲存。
一種治療龐貝氏病、福布斯-柯裡氏病、安德森病、馮吉爾克病或拉弗拉病中之一或多者之方法，其包含將如請求項186至269中任一項之組合物投與患有龐貝氏病、福布斯-柯裡氏病、安德森病、馮吉爾克病或拉弗拉病之患者。
一種將GAA活性遞送至細胞中之方法，其包含使細胞與如請求項186至269中任一項之組合物接觸。
如請求項271之方法，其中將該GAA活性遞送至該等細胞之細胞質中。
如請求項271或272之方法，其中該細胞係在活體外，且其中該活體外細胞來自患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病之個體。
如請求項271或272之方法，其中該細胞係在個體中，且其中該個體患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。
一種在有需要之個體中減少肝醣累積之方法，其包含投與如請求項186至269中任一項之組合物。
如請求項275之方法，其中該有需要之個體患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。
一種嵌合多肽，其包含：(i)拉弗拉蛋白多肽及(ii)內化性部分。
如請求項277之嵌合多肽，其中該拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項277之嵌合多肽，其中該拉弗拉蛋白多肽包含與SEQ ID NO：38或39至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項277至279中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽具有葡聚糖磷酸酶活性。
如請求項277至280中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽具有蛋白質磷酸酶活性。
如請求項277至281中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽能結合碳水化合物。
如請求項277至282中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽能與馬啉素形成複合物。
如請求項277至283中任一項之嵌合多肽，其中該拉弗拉蛋白多肽化學偶聯至該內化性部分。
如請求項277至284中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含含有該拉弗拉蛋白多肽及該內化性部分之融合蛋白。
如請求項277至285中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含融合蛋白。
如請求項286之嵌合多肽，其中該融合蛋白包含連接體。
如請求項277至285中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含連接體。
如請求項287或288之嵌合多肽，其中該連接體將該馬啉素多肽偶聯或接合至該內化性部分。
如請求項277至286中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽不包括將該拉弗拉蛋白多肽互連至該內化性部分之連接體。
如請求項287至289中任一項之嵌合多肽，其中該連接體係可裂解連接體。
如請求項287至291中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分直接或間接偶聯或接合至該拉弗拉蛋白多肽之N-末端或C-末端胺基酸。
如請求項287至291中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分直接或間接偶聯或接合至該拉弗拉蛋白多肽之內部胺基酸。
一種嵌合多肽，其包含：(i)馬啉素多肽及(ii)內化性部分。
如請求項294之嵌合多肽，其中該馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項294之嵌合多肽，其中該馬啉素多肽包含與SEQ ID NO：43至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項294至296中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽具有E3泛蛋白連接酶活性。
如請求項294至297中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽能與拉弗拉蛋白形成複合物。
如請求項294至298中任一項之嵌合多肽，其中該馬啉素多肽化學偶聯至該內化性部分。
如請求項294至299中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含含有該馬啉素多肽及該內化性部分之融合蛋白。
如請求項294至300中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含融合蛋白。
如請求項301之嵌合多肽，其中該融合蛋白包含連接體。
如請求項294至300中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含連接體。
如請求項302或303之嵌合多肽，其中該連接體將該馬啉素多肽偶聯或接合至該內化性部分。
如請求項294至304中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽不包括將該馬啉素多肽互連至該內化性部分之連接體。
如請求項302至304中任一項之嵌合多肽，其中該連接體係可裂解連接體。
一種嵌合多肽，其包含：(i)α-澱粉酶多肽及(ii)內化性部分。
如請求項307之嵌合多肽，其中該α-澱粉酶多肽係胰腺α-澱粉酶。
如請求項307之嵌合多肽，其中該α-澱粉酶多肽係唾液α-澱粉酶。
如請求項307之嵌合多肽，其中該α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少90%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項307之嵌合多肽，其中該α-澱粉酶多肽包含與SEQ ID NO：44或45至少95%一致之胺基酸序列或其生物活性片段。
如請求項307至311中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽具有α-1,4-葡萄糖苷鍵水解活性。
如請求項307至312中任一項之嵌合多肽，其中該α-澱粉酶多肽化學偶聯至該內化性部分。
如請求項307至313中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含含有該α-澱粉酶多肽及該內化性部分之融合蛋白。
如請求項307至314中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含融合蛋白。
如請求項315之嵌合多肽，其中該融合蛋白包含連接體。
如請求項307至314中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含連接體。
如請求項316至317之嵌合多肽，其中該連接體將該α-澱粉酶多肽偶聯或接合至該內化性部分。
如請求項307至315中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽不包括將該α-澱粉酶多肽互連至該內化性部分之連接體。
如請求項316至318中任一項之嵌合多肽，其中該連接體係可裂解連接體。
如請求項307至315中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分直接或間接偶聯或接合至該α-澱粉酶多肽之N-末端或C-末端胺基酸。
如請求項307至315中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分直接或間接偶聯或接合至該α-澱粉酶多肽之內部胺基酸。
如請求項302至306中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分直接或間接偶聯或接合至該馬啉素多肽之N-末端或C-末端胺基酸。
如請求項302至306中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分直接或間接偶聯或接合至該馬啉素多肽之內部胺基酸。
如請求項172至221中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽經由平衡核苷運輸蛋白(ENT)運輸蛋白遞送至細胞中。
如請求項277至325中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽經由ENT2遞送至細胞中。
如請求項277至326中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肌肉細胞中。
如請求項277至327中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至肌肉細胞、肝細胞及纖維母細胞中之一或多者中。
如請求項277至328中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分促進將該嵌合多肽遞送至神經元細胞中。
如請求項277至329中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分包含抗體或抗原結合片段。
如請求項330之嵌合多肽，其中該抗體係單株抗體或其片段。
如請求項331之嵌合多肽，其中該抗體係單株抗體3E10或其抗原結合片段。
如請求項277至329中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分包含歸向肽。
如請求項277至333中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分經由平衡核苷運輸蛋白2(ENT2)運輸蛋白穿過細胞膜。
如請求項330至332中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段選自：單株抗體3E10或其保留細胞穿透活性之變體或其結合與3E10相同之表位之變體，或具有與3E10實質上相同之細胞穿透活性且結合與3E10相同之表位之抗體或前述任一者之抗原結合片段。
如請求項28至332中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段係單株抗體3E10或其保留細胞穿透活性之變體或3E10或該3E10變體之抗原結合片段。
如請求項330至332或335至336之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段係嵌合、人類化或完全人類抗體或抗原結合片段。
如請求項330至332或335至337中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：9至少95%一致之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項330至332或335至338中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO：10至少95%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項330至332或335至339中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈可變結構域或其人類化變體及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈可變結構域或其人類化變體。
如請求項330至332或335至340中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO 13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列；該等CDR符合Kabat。
如請求項330至332或335至340中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO 24之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；VL CDR1，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列；該等CDR符合IMGT系統。
如請求項330至332或335至340中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16或47之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。
如請求項330至332或335至340中任一項之嵌合多肽，其中該抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列；VH CDR2，其具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列；VH CDR3，其具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列，VL CDR1，其具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列；VL CDR2，其具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及VL CDR3，其具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該等CDR符合Kabat。
如請求項277至344中任一項之嵌合多肽，其中該嵌合多肽係重組產生。
如請求項345之嵌合多肽，其中該嵌合多肽係在原核或真核細胞中產生。
如請求項346之嵌合多肽，其中該真核細胞選自酵母細胞、禽類細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
如請求項346之嵌合多肽，其中該原核細胞係細菌細胞。
如請求項277至348中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分係scFv。
如請求項277至348中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分係Fab。
如請求項277至348中任一項之嵌合多肽，其中該內化性部分係抗體。
一種核酸構築體，其包含編碼呈融合蛋白之如請求項277至351中任一項之嵌合多肽之核苷酸序列。
一種載體，其包含如請求項352之核酸構築體。
一種宿主細胞，其包含如請求項353之載體。
一種將活性遞送至細胞中之方法，其包含使細胞與如請求項277至351中任一項之嵌合多肽接觸。
如請求項355之方法，其中將該活性遞送至該等細胞之細胞質中。
如請求項355或356之方法，其中該細胞係在活體外，且其中該活體外細胞來自患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病之個體。
如請求項355或356之方法，其中該細胞係在個體中，且其中該個體患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。
如請求項358之方法，其中該個體患有拉弗拉病。
一種在細胞中減少肝醣累積之方法，其包含使該細胞與如請求項277至351中任一項之嵌合多肽接觸。
如請求項360之方法，其中該細胞係來自患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病之個體或該等疾病之動物模型之細胞。
如請求項360或361之方法，其中該細胞係在患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病之個體或該等疾病之動物模型中，且使該細胞接觸包含將該嵌合多肽投與該個體。
一種在有需要之個體中減少肝醣累積之方法，其包含投與如請求項277至351中任一項之嵌合多肽。
如請求項363之方法，其中該有需要之個體患有福布斯-柯裡氏病、安德森病、龐貝氏病、拉弗拉病或馮吉爾克病。
如請求項364之方法，其中該有需要之個體患有拉弗拉病。