KR102510154B1 - 비만유래 2형 당뇨 예방 및 치료를 위한 내장지방 대식세포 표적 비바이러스성 유전자／전달체 복합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비만유래 2형 당뇨 예방 및 치료를 위한 내장지방 대식세포 표적 비바이러스성 유전자/전달체 복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체는 내장지방의 대식세포를 표적으로 하여 체내로 주입 시 안정성 있게 치료 유전자를 전달함으로써 우수한 TACE 억제 효과를 나타내어 비만유래 2형 당뇨의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 비만유래 2형 당뇨 예방 및 치료를 위한 내장지방 대식세포 표적 비바이러스성 유전자/전달체 복합체에 관한 것이다.
비만유래 대사 증후군은 2형 당뇨와 고지혈증 등을 포함하는 질환으로 현 사회의 서구화에 따라 중요한 문제점으로 대두하고 있으며 최근의 연구들은 이러한 비만 유래 대사 증후군의 주요 원인이 비만 유래 염증임을 주장하였다. 비만 유래 만성 염증의 주요한 기관으로서 지방조직은 비만의 진행 정도에 따라 많은 수의 면역세포를 포함하게 되고 그 중 대식세포 (Macrophage)는 염증 형태로 편향되어 지방조직의 염증 상태를 주도하게 된다. 따라서, 비만유래 2형 당뇨 질환의 내장지방에서 종양괴사인자-알파 전환 효소 (TNF-α Converting Enzyme, TACE)의 발현이 증가하고, 그 결과 과다로 증가한 TACE로 인해 TNF-α 염증성 매개물질 농도가 증가하여 염증 신호 체계가 활성화되어 비만유래 염증이 악화된다. 따라서 TACE 발현을 억제하면 비만유래 염증의 예방 및 치료가 가능하다. 그러나 TACE 발현을 억제하는 shTACE 치료유전자 자체로는 인체 내에서의 안정성이 낮고 인체로의 적용에 한계가 있다. 따라서, 성공적인 유전자치료를 위해 치료유전자는 세포막과 핵막을 통과한 뒤 핵 내에서 효율적으로 발현되어야 한다. 이를 위해, 유전자 전달체를 이용하여 치료유전자의 인체 내 안정성 및 전달 효과를 향상시킬 필요가 있다.
또한, 비만유래 2형 당뇨 치료의 목적으로, 오프-타겟팅 (Off-targeting)으로 인한 부작용을 줄이기 위해서는 비만과 관련된 내장지방 표적으로 치료유전자를 전달해야 한다. 특히 내장지방 내 염증 반응과 관련된 내장지방의 대식세포를 표적으로 하는 전달체를 사용하여 더욱더 선택적으로 내장지방의 대식세포에서의 TACE 발현을 억제해야 한다.
S.E. Kahn, R.L. et al. Nature 444 (2006) 840e846.
C.N. Lumeng, A.R. et al. J. Clin. Invest. 121 (2011) 2111e2117.
H. Xu, G.T. et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 1793e1801.
M. Serino et al., Diabetes 56 (2007) 2541e2546.
본 발명의 목적은 TACE 발현을 억제하는 shRNA의 체내 안정성과 전달 효율을 개선하기 위해 유전자 전달체와 복합체를 형성하여 사용하는 비만유래 2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 내장지방의 대식세포를 표적으로 하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 SEQ ID NOS: 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 shRNA; 및
SEQ ID NO: 6의 내장지방의 대식세포 표적서열 및 R9(아르기닌) 펩타이드를 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 유전자/전달체 복합체를 포함하는 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 내장지방의 대식세포 표적용 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체는 내장지방의 대식세포를 표적으로 하여 체내로 주입 시 안정성 있게 치료 유전자를 전달함으로써 우수한 TACE 억제 효과를 나타내어 비만유래 2형 당뇨의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
도 1은 마우스 비만화에 따른 지방조직의 염증성 매개물질 (사이토카인) 유전자 (TNF-α, IL-1
, IL-6, MCP-1, CD11c) 발현량을 비교한 결과이다.
도 2는 마우스 비만화에 따른 지방조직의 TACE 유전자 발현량을 비교한 결과이다.
도 3은 마우스 유래 대식세포 (Raw 264.7 세포주)에서 세포막 (Plasma membrane)과 세포질 (Cytosol)을 분리한 후 프로히비틴(Prohibitin) 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 정성적으로 측정한 결과이다.
도 4는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 중량 비율에 따른 복합체 형성 여부를 전기영동으로 확인한 결과이다 [Naked: ATS-R9 전달체 무처리, 0.5:1은 ATS-R9:shTACE=0.5:1을 의미함, 1:1은 ATS-R9:shTACE=1:1을 의미함, 2:1은 ATS-R9:shTACE=2:1을 의미함, 3:1은 ATS-R9:shTACE=3:1을 의미함, 4:1은 ATS-R9:shTACE=4:1을 의미함].
도 5는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 중량 비율에 따른 제타 포텐셜과 나노 입자 크기를 나타낸 결과이다. [w/w 0.5는 ATS-R9:shTACE=0.5:1 을 의미함, w/w 1은 ATS-R9:shTACE=1:1 을 의미함, w/w 2는 ATS-R9:shTACE=2:1 을 의미함, w/w 3은 ATS-R9:shTACE=3:1 을 의미함, w/w 4는 ATS-R9:shTACE=4:1 을 의미함].
도 6은 기존 ATS 펩타이드의 마우스 지방조직 대식세포 표면 부착 능력을 검증한 결과이다.
도 7은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 지방조직 대식세포 유입을 유세포분석으로 검증한 결과이다.
도 8은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 유래 대식세포 shTACE 유전자 전달 능력을 TACE 발현 정도를 mRNA 수준으로 측정하여 검증한 결과이다.
도 9는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 유래 대식세포 shTACE 유전자 전달에 따른 항염증 효과를 TNF-α 양을 측정하여 검증한 결과이다.
도 10은 형광이 표지된 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 기관 분포 정도를 형광 이미지로 측정한 결과이다 [Liver: 간, Spleen: 비장, Kidney: 신장, Lung: 폐, Heart: 심장, SubWAT: 피하 백색지방, EpiWAT: 내장 백색지방].
도 11은 형광이 표지된 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 기관 분포를 정량화한 결과이다 [Liver: 간, Spleen: 비장, Kidney: 신장, Lung: 폐, Heart: 심장, SubWAT: 피하 백색지방, EpiWAT: 내장 백색지, Blood: 혈액].
도 12는 형광이 표지된 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 기관 대식세포 내로의 유입을 유세포분석하여 정량화한 결과이다.
도 13은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 항염증 효과에 따른 인슐린 저항성 개선을 혈중 글루코스 정량을 통해 확인한 결과이다.
도 14는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 항염증 효과에 따른 글루코스 저항성 개선을 혈중 글루코스 정량을 통해 확인한 결과이다.
도 15는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 내장 지방조직 대식세포 TACE 유전자 mRNA 억제 효과 및 TACE 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 16은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 피하 지방조직 대식세포 TACE 유전자 mRNA 억제 효과 및 TACE 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 17은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 내장 지방조직 염증성 매개물질 (사이토카인) 유전자 (TNF-α, IL-1
, IL-6, MCP-1, CD11c) mRNA 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 18은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 피하 지방조직 염증성 매개물질 (사이토카인) 유전자 (TNF-α, IL-1
, IL-6, MCP-1, CD11c) mRNA 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 19는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 지방조직 항염증 효과에 따른 전신성 염증 억제 효과를 혈중 염증성 매개물질 (사이토카인) 정량을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 마우스 비만화에 따른 지방조직의 TACE 유전자 발현량을 비교한 결과이다.
도 3은 마우스 유래 대식세포 (Raw 264.7 세포주)에서 세포막 (Plasma membrane)과 세포질 (Cytosol)을 분리한 후 프로히비틴(Prohibitin) 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 정성적으로 측정한 결과이다.
도 4는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 중량 비율에 따른 복합체 형성 여부를 전기영동으로 확인한 결과이다 [Naked: ATS-R9 전달체 무처리, 0.5:1은 ATS-R9:shTACE=0.5:1을 의미함, 1:1은 ATS-R9:shTACE=1:1을 의미함, 2:1은 ATS-R9:shTACE=2:1을 의미함, 3:1은 ATS-R9:shTACE=3:1을 의미함, 4:1은 ATS-R9:shTACE=4:1을 의미함].
도 5는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 중량 비율에 따른 제타 포텐셜과 나노 입자 크기를 나타낸 결과이다. [w/w 0.5는 ATS-R9:shTACE=0.5:1 을 의미함, w/w 1은 ATS-R9:shTACE=1:1 을 의미함, w/w 2는 ATS-R9:shTACE=2:1 을 의미함, w/w 3은 ATS-R9:shTACE=3:1 을 의미함, w/w 4는 ATS-R9:shTACE=4:1 을 의미함].
도 6은 기존 ATS 펩타이드의 마우스 지방조직 대식세포 표면 부착 능력을 검증한 결과이다.
도 7은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 지방조직 대식세포 유입을 유세포분석으로 검증한 결과이다.
도 8은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 유래 대식세포 shTACE 유전자 전달 능력을 TACE 발현 정도를 mRNA 수준으로 측정하여 검증한 결과이다.
도 9는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 유래 대식세포 shTACE 유전자 전달에 따른 항염증 효과를 TNF-α 양을 측정하여 검증한 결과이다.
도 10은 형광이 표지된 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 기관 분포 정도를 형광 이미지로 측정한 결과이다 [Liver: 간, Spleen: 비장, Kidney: 신장, Lung: 폐, Heart: 심장, SubWAT: 피하 백색지방, EpiWAT: 내장 백색지방].
도 11은 형광이 표지된 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 기관 분포를 정량화한 결과이다 [Liver: 간, Spleen: 비장, Kidney: 신장, Lung: 폐, Heart: 심장, SubWAT: 피하 백색지방, EpiWAT: 내장 백색지, Blood: 혈액].
도 12는 형광이 표지된 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 마우스 기관 대식세포 내로의 유입을 유세포분석하여 정량화한 결과이다.
도 13은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 항염증 효과에 따른 인슐린 저항성 개선을 혈중 글루코스 정량을 통해 확인한 결과이다.
도 14는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 항염증 효과에 따른 글루코스 저항성 개선을 혈중 글루코스 정량을 통해 확인한 결과이다.
도 15는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 내장 지방조직 대식세포 TACE 유전자 mRNA 억제 효과 및 TACE 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 16은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 피하 지방조직 대식세포 TACE 유전자 mRNA 억제 효과 및 TACE 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 17은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 내장 지방조직 염증성 매개물질 (사이토카인) 유전자 (TNF-α, IL-1
도 18은 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 피하 지방조직 염증성 매개물질 (사이토카인) 유전자 (TNF-α, IL-1
도 19는 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 처리 후 지방조직 항염증 효과에 따른 전신성 염증 억제 효과를 혈중 염증성 매개물질 (사이토카인) 정량을 통해 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 SEQ ID NOS: 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 shRNA; 및
SEQ ID NO: 6의 내장지방의 대식세포 표적서열 및 R9(아르기닌) 펩타이드를 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 유전자/전달체 복합체를 포함하는 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 내장지방의 대식세포 표적용 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체는 shTACE 및 유전자 전달체의 복합체로 이루어져 있으며, 상기 유전자 전달체는 내장지방의 대식세포를 표적으로 하는 표적 서열과 R9(아르기닌) 펩타이드를 포함하고 있다.
상기 shTACE는 인간 또는 마우스 유래의 TACE의 발현을 억제하는 shRNA로서, SEQ ID NOS: 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 shTACE는 플라스미드 벡터에 포함된 형태로 유전자 전달체와 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는, shTACE를 포함하는 플라스미드 벡터는 SEQ ID NOS: 7 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.
이러한 유전자 자체는 인산 구조로 인해 음전하를 나타내기 때문에 유전자 자체로는 전기적 반발로 음전하를 나타내는 세포막을 관통하기 쉽지 않다. 따라서 유전자는 양전하를 나타내는 물질과 반응하여 복합체를 형성한 뒤 전체 전하가 양전하를 나타내야 세포 안으로 좀 더 쉽게 들어가고, 세포 내에서 유전자의 발현을 향상시킬 수 있다. 이처럼 유전자를 세포 안으로의 전달을 높여주는 물질을 유전자 전달체(Carrier)라 부른다. 유전자의 향상된 전달과 높은 발현을 위해 유전자와 결합하여 유전자의 전달을 도와주는 물질을 의미하며, 이러한 유전자 전달체는 주로 양전하를 띄는 물질이며, 음전하의 유전자와 양전하의 유전자 전달체 간의 전기적 상호작용으로 유전자/전달체 복합체를 형성한다.
상기 내장지방의 대식세포를 표적으로 하는 표적 서열은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 지방조직에 프로히비틴 (Prohibitin)이 많이 발현된다고 알려져 있고, 본 서열은 이 프로히비틴과 결합함이 밝혀져 있다. 기존 연구에서는 본 서열이 백색지방세포의 프로히비틴과 결합하여 지방세포 특이적으로 유전자를 전달한다고 밝혀졌다. 이에 추가로 본 발명에서는 동일한 서열이 내장지방세포 내 대식세포까지도 표적이 가능하다는 것을 밝힘에 의의가 있다. 내장지방 내 대식세포는 비만유래 대사증후군 염증 반응에 중요한 역할을 하고 있다. 이 내장지방 내 대식세포 역시 프로히비틴을 발현하고 있으므로, 동일한 서열이 프로히비틴과 결합하여 대식세포 내로 들어간다고 볼 수 있다(도 3 참조).
당 분야에서 알려진 유전자 전달체를 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 비바이러스성 유전자 전달체인 R9(아르기닌) 펩타이드를 사용하여 shTACE의 낮은 안정성을 극복할 수 있다. 상기 R9(아르기닌) 펩타이드는 이황화결합으로 중합된 폴리(올리고아르기닌) (Disulfide-linked poly(oligo-arginine)의 아세트산 염일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 이황화결합으로 중합된 폴리(올리고아르기닌)은 이황화물로 가교된 말단 시스테인을 포함하는 9개의 아르기닌(arginine) 올리고머로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 이황화결합으로 중합된 폴리(올리고아르기닌)은 'Cys-(9Arg)-Cys'의 반복단위를 포함할 수 있으며, 상기 반복단위 양 말단 시스테인 내 티올기의 이황화 가교에 의해 중합된 것이다.
먼저, ‘Cys-(9Arg)-Cys’단량체 펩타이드는 고상(固相) Fmoc 펩타이드 합성법을 이용할 수 있으며, 이는 정해진 서열 순서에 맞게 각각의 아미노산을 하나씩 신장하는 합성법으로 α-아미노기가 Fmoc(Fluoreonylmethoxycarbonyl, 9-풀루오레닐메톡시카르보닐)기로 보호된 아미노산을 사용한다. 펩타이드 사슬의 신장이 끝나면 TFA(Trifluoroacetic acid)로 처리하여 유리 형태의 펩타이드를 얻는다. 그 후 TFA 염 형태의 Cys-(9Arg)-Cys’단량체 펩타이드를 아세트산(Acetate) 염 형태로 치환한다. AG1-X8 레진을 매개로 한 이온교환 크로마토그래피 방법을 통해 염 형태를 아세트산 염으로 치환한다.
'Cys-(9Arg)-Cys' 단량체의 아세트산염을 시스테인끼리의 이황화결합을 통한 산화 중합반응을 진행하고, 그 결과 고분자의 유전자 전달체를 형성한다.
본 발명에서 사용된 유전자 전달체의 경우, 기존 유전자 전달체와 달리 유전자 전달체의 기본 염 형태를 TFA 염에서 아세트산 염 형태로 변경한 것에 특징이 있다. 이는 체내로 주입할 때 발생할 수 있는 부작용을 최소화시키고, 기존 유전자 전달체 보다 체내에서의 능력을 더욱 더 향상시켰다.
상기 shTACE 및 상기 유전자 전달체는 전기적 상호작용으로 복합체를 형성하며, 우수한 치료 효과를 지닌 유전자/전달체 복합체(Peptoplex)를 형성하기 위해서는 복합체를 형성하는 유전자와 유전자 전달체의 최적 비율이 필요하다. 비율에는 중량 비율(weight ratio), 전하 비율(charge ratio), 질소/인 비율(N/P ratio) 등 여러 종류가 있으나, 본 발명에서는 중량 비율(weight ratio)를 사용한다.
본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체는 shTACE와 유전자 전달체가 1: 1.5~8 또는 1:2~4의 중량 비율로 형성되는 것이 바람직하다. 상기 범위 내인 경우 안정적으로 복합체를 형성할 수 있고, 복합체의 크기는 100 내지 200 nm, 더 구체적으로 120 내지 150 nm일 수 있다.
상기 본 발명의 유전자/전달체 복합체는 shTACE 및 비바이러스성 유전자 전달체를 혼합하고 인큐베이션하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.
상기 인큐베이션은 20 내지 40 ℃에서 20 내지 40분간 실시하는 것이 최적의 유전자/전달체 복합체를 형성하기 위한 이유로 바람직하다. 40 ℃ 초과의 고온에서 DNA는 염기끼리의 상호작용이 해소되고 그 결과 DNA는 변성된다. 전달체는 펩타이드의 중합반응으로 이루어져 있고, 이 또한 고온에서는 변성되므로 40 ℃ 이하의 온도에서 진행하는 것이 바람직하며, 복합체를 세포에 처리할 때에는 체온과 비슷한 온도에서 복합체 형성을 진행하는 것이 바람직하다. 한편, 인큐베이션 시간이 40분을 넘어가면 유전자와 전달체가 침전물을 형성하므로, 40분을 넘기지 않는 것이 바람직하다. 또한, 전기적 인력으로 유전자와 전달체의 혼합 후 복합체의 안정한 상태를 유지하기 위해 최소 20분 정도 인큐베이션 하는 것이 바람직하다.
shTACE(Short hairpin silencing TACE) 유전자[TACE shRNA, SEQ ID NOS: 1 내지 5]는 음전하를, 이황화결합으로 중합된 폴리(올리고아르기닌)의 아세트산염 전달체(PAs-s)는 양전하를 띄고 있다. 이 둘을 혼합하고 상온에서 20분 내지 40분 정도 인큐베이션하면 정전기적 인력으로 유전자/전달체 복합체를 형성할 수 있다. 복합체 형성 후 최종 부피를 그룹별로 동일하게 3DW, PBS 등으로 맞춰준다.
유전자/전달체 복합체의 최적의 중량 비율을 구하기 위해서는 먼저 유전자와 유전자 전달체 각각의 농도를 구해야 한다. 자외선 흡수 복사량은 DNA 양에 비례하므로, 자외선 분광광도계로 유전자 농도를 측정한다. 유전자/전달체 복합체의 침전을 막기 위해 보통 유전자 농도를 1 mg/mL 이하로 만드는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 본 발명의 약학적 조성물은 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 국소 투여 시에 본 발명의 조성물은 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 에어로졸, 협측, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막 내, 비강, 안구, 경구, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여될 수 있다.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 유효성분은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술 분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중 kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중 kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 여러 번 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 유전자 전달체 복합체는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관 (intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식이 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> 치료유전자/전달체 복합체의 제조
(치료유전자 shTACE 제조)
RNA 간섭 시스템으로 TACE 발현을 억제하는 마우스 shRNA (shTACE)를 포함하는 플라스미드 벡터는 총 6669개의 염기쌍으로 구성되어 있고, U6 프로모터를 지니고 있다. 벡터에 19개의 염기서열 ACACCTGCTGCAATAGTGA을 삽입하여 TACE만 선택적으로 발현을 억제하도록 제작되었다. 벡터의 증식과 발현을 위해 SV40 origin 및 pUC origin을 사용하였다. 암피실린 (Ampicillin) 저항성 유전자를 삽입하였고, 형질 도입 (Transfection) 후 shTACE 발현이 안정한 세포를 분리하기 위해 퓨로마이신 (Puromycin)을 셀렉션 마커로 사용하였다. eGFP 리포터 유전자를 이용해 벡터가 제대로 삽입되었는지에 대한 여부를 판단하도록 벡터가 제작되었다. 벡터 내 헤어핀 루프 (Hairpin loop)의 서열은 TCAAGAG이다. 이렇게 제조된 마우스 shTACE 벡터의 서열은 SEQ ID NO: 7에 기재하였다.
한편, 본 발명의 유전자치료제 시스템의 치료 효과는 마우스 동물 실험을 통해 검증되었다.
본 시스템을 임상으로 적용하기 위해서는 인간세포주에서의 실험이 선행되어야 한다. 인체 유래 세포에서 본 유전자치료제의 무독성, 항염증효과 등을 검증해야 하며, 이때에는 마우스 shTACE 유전자 대신 인간 shTACE 유전자를 사용해야 한다. 인간 shTACE 벡터의 여러 서열 중 ATS-R9 전달체와 가장 TACE를 최대로 억제하는 벡터 서열이 최적의 유전자치료제 복합체가 될 수 있고, 이렇게 가능한 인간 shTACE 벡터 후보 4개 서열은 SEQ ID NOS: 8 내지 11에 기재하였다.
(내장지방의 대식세포를 표적으로 하는 유전자 전달체 (ATS-R9)의 제조)
내장지방의 대식세포 표적 가능한 펩타이드 전달체는 내장지방의 대식세포 선택적 표적 가능한 ATS 펩타이드 서열 (CKGGRAKDC)과 세포 내 도입을 용이하게 해주는 9개의 아르기닌 서열 (RRRRRRRRR, R9)로 구성되어 있다. 펩타이드 전달체의 단량체는 'C-KGGRAKD-RRRRRRRRR-C'이다.
고상 (固相) Fmoc (Fluoreonylmethoxycarbonyl) 펩타이드 합성법을 이용하여 'C-KGGRAKD-RRRRRRRRR-C' 단량체 펩타이드를 합성하였다. 이는 정해진 서열 순서에 맞게 각각의 아미노산을 하나씩 신장하는 합성법으로 *j아미노기가 Fmoc (Fluoreonylmethoxycarbonyl, 9-풀루오레닐메톡시카르보닐) 기로 보호된 아미노산을 사용하였다. 펩타이드 사슬의 신장이 끝나면 TFA (Trifluoroacetic acid)로 처리하여 유리 형태의 펩타이드를 얻었다.
(아가로스 겔 전기영동)
1 ㎍의 shTACE 치료유전자를 다양한 양 (0.5, 1, 2, 3, 4 ㎍)의 ATS-R9 전달체와 혼합하여 상온에서 30분 인큐베이션하여 유전자/전달체 복합체를 형성하였다. 그 후 0.5×TBE 완충용액의 0.8% (wt/vol) 아가로즈 젤에서 100 V로 20분 동안 전기영동하여 복합체 형성 여부를 확인하였다.
(유전자/전달체 복합체의 표면전하 및 크기 측정)
5 ㎍의 shTACE 치료유전자를 다양한 무게비율에서 (Weight ratio 0.5, 1, 2, 3, 4)의 shTACE/ATS-R9 복합체를 형성 후 전체 부피를 800 ㎕로 맞추었다. 복합체를 Zeta sizer-ZS (Malvern) 기계를 통해 복합체의 표면전하와 크기를 측정하였다.
(Primary adipose tissue macrophage (지방조직의 대식세포)에 대한 ATS 펩타이드의 결합능 분석)
8주 동안 High fat을 섭취한 비만 마우스 실험동물을 해부 후 부정소쪽의 지방조직 (Epididymal WAT, 내장지방의 한 종류)을 얻었다. 1 mg/mL 농도의 콜라게네이즈를 처리하여 지방조직 중 stromal vascular fraction (SVF)를 얻었다. 얻은 SVF에 경쟁적 결합능 분석 실험을 위해 Free-ATS 펩타이드를 상온에서 30분 동안 먼저 처리하였다. 그 후 FITC 형광이 결합된 ATS 펩타이드 (FITC-ATS, 10 ㎍/mL) 또는 FITC 형광이 결합된 표적능이 없는 펩타이드 (FITC-NTS, 10 ㎍/mL)와 상온에서 30분 반응하고 대식세포와 결합 정도를 FACS로 분석하였다. 또한 FITC 형광과 결합한 유전자/전다라체 복합체 (FITC-ATS-R9/shRNA)를 4시간 동안 반응하여 지방조직의 대식세포로의 복합체 도입 정도를 FACS로 분석하였다.
(세포 배양)
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)와 FBS (Fetal bovine serum)을 WelGENE (한국)으로부터 구입하였다. RAW 264.7 마우스 유래 대식세포 (Mouse macrophage)를 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 이틀에 한 번씩 계대배양하였다. 10% FBS, 페니실린 (100 IU/mL) 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL) 보충된 완전 배지에서 37℃, 5% CO2 대기 조건에서 배양하였다.
(TACE mRNA 측정: RNA 분리 및 Real-time PCR)
세포 배양 플레이트 (Cell culture plate)의 한 웰 (well) 당 세포 4Х104 개수의 마우스 유래 대식세포 (RAW 264.7)를 24시간 동안 배양하였다. 대식세포에 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체를 24시간 동안 처리했다. 그 후 RNeasy Lipid tissue Mini kit (Qiagen)를 이용하여 세포를 균일하게 깨준 뒤 RNA만을 분리하였다. 분리한 RNA는 역전사효소 (Reverse transcriptase)와 반응시켜 그룹별 RNA 1 ㎍ 각각에 대한 상보적인 cDNA를 합성하였다. 그 후 Cyber premix Ex taq RT-PCR kit를 이용하여 대조군인 내재 유전자 GAPDH에 대한 상대적인 TACE mRNA 양을 Real-time PCR을 통해 측정하였다 (TACE에 대한 Forward primer 와 Reverse primer은 각각 5'-GTACGTCGATGCAGAGCAAA-3' 과 5'-AAACCAGAACAGACCCAACG-3' 이다).
(수용성 (염증성) TNF-α의 ELISA 측정)
세포 배양 플레이트 (Cell culture plate)의 한 웰 (well) 당 세포 4Х104 개수의 마우스 유래 대식세포 (RAW 264.7)를 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 한 웰 (well) 당 100 ng/mL의 LPS (Lipopolysaccharide)를 처리해서 대식세포 활성화 시켜 염증 상태를 유도하였다. 활성화된 대식세포, 즉 염증상태의 대식세포에 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체를 48시간 동안 처리했다. 그 후 각각의 웰에서 세포의 배지를 얻어 4℃, 13000 rpm 원심분리를 통해 배지의 상층액을 샘플로 이용하였다. 배지 샘플로부터 수용성 TNF-α 염증성 매개물질 (사이토카인) 양을 샌드위치 ELISA를 통해 측정하였다.
(유전자/전달체 복합체 주입)
비만 및 비만유래 2형 당뇨 실험동물 모델링을 완성한 후 일주일에 두 번씩 총 4주 동안 15 ㎍의 shTACE 치료유전자와 최적 중량 비율 1:3로 45 ㎍의 ATS-R9 전달체로 형성된 유전자/전달체 복합체(shTACE/ATS-R9 복합체)를 복강 내 주입하였다. 실험동물에 처리한 유전자/전달체 복합체는 약 0.3 mg/kg였다.
(생체 내 분포 확인)
8주 동안 High fat을 섭취한 비만 마우스 실험동물에 Cy5.5 형광과 결합한 유전자/전달체 복합체 (Cy5.5-ATS-R9/shRNA)를 복강 내로 주입하였다. 유전자/전달체 복합체 주입 후 12시간 또는 24시간 후, 마우스 실험동물은 해부되어 부정소쪽의 지방조직 (Epididymal WAT, 내장지방의 한 종류), 피하지방, 간, 비장, 심장, 폐, 신장을 얻었다. 조직의 전체 형광 이미지는 Image Station (Kodak)을 통해 측정하였다. 또한, 조직을 균질하게 갈아서 조직 내의 상대적인 형광 값을 정량적으로도 측정하였다. 또한, 8주 동안 High fat을 섭취한 비만 마우스 실험동물에 FITC 형광과 결합한 유전자/전달체 복합체 (FITC-ATS-R9/shRNA)를 복강 내로 주입하였다. 유전자/전달체 복합체 주입 4시간 후 지방조직, 간, 비장 내의 대식세포 및 대식세포가 아닌 세포를 구분한 뒤 (Anti-F4/80 항체 이용) 각각 세포에서의 유전자/전달체 복합체 도입 정도를 FACS로 분석하였다.
(인슐린 저항성 테스트 (Insulin tolerance test, ITT) 및 글루코스 저항성 테스트 (Glucose tolerance test, GTT))
마우스 실험동물을 6시간 (ITT 진행 시) 또는 16시간 (GTT 진행 시) 공복을 유지한 채 초기 혈당값을 Accu-Chek Active model GC kit를 이용하여 측정하였다. 그러고 바로 인슐린 (0.75 U/kg, ITT 진행 시) 또는 글루코스 (3 g/kg, GTT 진행 시)를 복강 내 주입하였다. 그 후 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 시간 간격으로 혈당을 측정하였다.
(엑스 비보 샘플링)
유전자/전달체 복합체의 처리가 완료된 후 비만유래 2형 당뇨 마우스 실험동물은 해부되어 부정소쪽의 지방조직 (Epididymal WAT, 내장지방의 한 종류)과 피하지방을 얻었다. 지방조직 샘플은 물리적으로 분쇄한 뒤 1 mg/mL 농도의 콜라게네이즈 처리하였고, 400 g에서 10분 원심분리를 진행하여 SVF를 얻었다. 획득한 SVF 샘플에서 TACE 단백질 발현 양을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다. 또한, 획득한 SVF 샘플을 균질하게 깬 뒤 RNA를 얻어 TACE, TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, CD11b, CD11c, Prohibitin 등의 발현 양을 mRNA 수준으로 정량적으로 측정했다. 마지막으로 혈중 TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1 염증성 매개물질은 ELISA를 통해 정량적으로 측정했다.
<실시예 2> 비만 내장 지방조직 주요 염증 사이토카인 유전자 과발현 확인
기존의 비만 연구에 따르면 인간 비만과 동물 비만에서 내장 지방 염증이 2형 당뇨 및 비만유래 대사질환과 밀접한 관련이 있음이 밝혀졌고 이러한 연구에 기반하여 염증 사이토카인 유전자의 내장 지방조직 우선적 과발현을 확인하기 위해 고지방 사료로 비만을 유도한 쥐와 그렇지 않은 쥐의 피하 지방과 내장 지방 염증 사이토카인 유전자 mRNA양을 RT-PCR을 통해 확인하였다.
피하 지방 대비 내장 지방에서 TNF-α, IL-1β를 포함하는 염증 사이토카인 유전자 과발현을 확인하였고(도 1), 본 발명의 shTACE 치료유전자 복합체의 적용에 앞서 비만 내장 지방조직의 TACE mRNA 양을 측정하였을 때 다른 염증 사이토카인의 발현과 동일하게 내장 지방조직 우선적 과발현을 확인, 치료 타겟 유전자로서의 적합성을 검증하였다(도 2).
또한, 마우스 유래 대식세포 (Raw 264.7 세포주)에서 프로히비틴 발현을 확인하였다. 대식세포에서 세포막 (Plasma membrane)과 세포질 (Cytosol)을 분리하여 프로히비틴 발현을 보았고, 세포막과 세포질 모두에서 프로히비틴 발현을 확인하였다. 이를 통해 프로히비틴과 결합 가능하다고 알려진 본 ATS 서열이 대식세포에 결합 가능할 것이라고 뒷받침해주는 결과이다 (도 3).
<실시예 3> shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 최적화 및 지방조직 대식세포 표적 능력 검증
유전자 전달체 ATS-R9과 shTACE 치료 유전자의 복합체 형성과 최적화를 위해 전기영동 (도 4)과 입자 크기, 표면 전하 (도 5)를 확인하였을 때 1:3의 질량 비 이상에서 안정적으로 유전자와 복합체를 형성하고 150 nm 크기를 형성하는 것을 확인하였다.
형광 (FITC)이 표지된 ATS 펩타이드를 사용하여 지방조직의 대식세포 (F4/80+ 세포)에 대한 부착을 확인하였을 때 Non-Targeting Sequence (NTS) 대비 높은 부착능을 보였으며 형광이 표지되지 않은 Free-ATS와 함께 처리한 경우 형광의 감소를 보임으로서 표적 수용체 특이적인 세포 부착을 검증하였다 (도 6).
이러한 지방조직의 대식세포 표적 능력 기반으로 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 지방조직 F4/80+ 대식세포 유입 능력을 확인하였을 때 shTACE/NTS-R9 복합체 대비 70% 이상의 세포 유입을 확인하였다 (도 7).
<실시예 4> shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 항염증 효과 검증
shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 TACE 유전자 억제와 그에 따른 항염증 효과를 확인하기 위해 마우스 유래 대식세포 (Raw264.7)에 처리하였고 TACE 유전자 mRNA를 RT-PCR 통해 정량한 결과, 감소함을 확인하였다 (도 8).
이러한 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 TACE 유전자 억제가 실제 염증 반응을 억제하는지 확인하기 위해 LPS (Lipopolysaccharide)에 의한 마우스 유래 대식세포의 염증반응을 TNF-α ELISA를 통해 정량하였고 비처리군 대비 TACE 억제군에서 50% 감소함을 확인하였다 (도 9).
<실시예 5> shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 내장 지방조직 대식세포 표적 능력 검증
shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 내장 지방조직 특이적 유전자 전달 능력을 검증하기 위해 형광 (Cy5.5)이 표지된 유전자 (30 ㎍)/전달체 (90 ㎍) 복합체를 복강내 투여하였다. 12시간, 24시간 뒤 주요 장기와 내장 지방, 피하 지방을 적출하여 Cy5.5 형광을 이미징 하였고 (도 10), 정량하였을 때 내장 지방조직 내 높은 축적을 확인하였다 (도 11).
shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 지방조직 내 대식세포 표적 능력을 검증하기 위해 복강내 투여 3-4시간 후 지방조직 대식세포 유입을 유세포 분석 (Flowcytometry)을 통해 확인하였다 (도 12).
<실시예 6> shTACE/ATS-R9 유전자/전달체의 항염증 효과, 그에 따른 2형 당뇨의 개선 효과 검증
2형 당뇨는 비만 유래 만성 염증으로 인해 체내의 인슐린 수용체 감응성이 감소함으로써 인슐린에 대한 반응이 감소, 혈중의 글루코스가 지속적으로 높게 유지된다. shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체의 비만 염증 및 2형 당뇨 치료효과를 검증하기 위해 유전자 (0.35 mg/kg dose)/전달체 복합체를 4주간 8회 복강 투여하였고 마지막 투여 1주일 후 인슐린 저항성과 글루코스 저항성을 시험하였다.
PBS 투여 그룹과 음성 대조군 유전자/전달체 복합체 투여군 대비 shTACE 유전자/전달체 복합체 투여군에서 높은 인슐린 반응성을 확인할 수 있었고 (도 13), 글루코스 투여에 대한 반응성 또한 향상되었다 (도 14).
이러한 인슐린 저항성의 개선이 치료 유전자 전달에 의한 항염증 효과 때문임을 검증하기 위해 마우스의 지방조직을 적출하여 TACE를 포함한 염증 사이토카인 유전자 mRNA 발현량을 측정하였고 내장지방에서 TACE 유전자 (도 15)와 TNF-α 및 염증 사이토카인 유전자 (도 18) mRNA 발현의 감소를 확인할 수 있었다.
또한, 내장 지방조직 대비 피하 지방조직에서는 TACE 유전자와 항염증 사이토카인 유전자 발현이 크게 억제되지 않음을 확인하였고 (도 16), 치료 유전자 전달에 의한 치료 효과가 내장지방 염증 억제에 의한 것으로 확인하였다 (도 17).
<실시예 7> shTACE/ATS-R9 유전자/전달체의 전신성 염증 억제 효과 검증
비만에 의한 2형 당뇨 및 대사질환은 지방조직 염증에 의한 전신성 만성 염증으로부터 야기된다. 따라서 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체의 지방조직 염증 억제가 전신성 염증 억제를 통해 2형 당뇨를 개선한 것임을 확인하기 위해 혈중 염증 사이토카인을 ELISA로 정량하였고 shTACE/ATS-R9 유전자/전달체 복합체 투여군에서 TNF-α, IL-1β를 포함한 4종의 염증 사이토카인이 감소함을 확인하였다 (도 19).
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University)
<120> Visceral adipose tissue macrophage-targeted gene/carrier complex
for preventing or treating obesity-induced type II diabetes
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cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 960
tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 1020
ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaata tttaacgcga 1080
attttaacaa aatattaacg tttacaattt cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 1140
ctgtgcggta tttcacaccg catacgcgga tctgcgcagc accatggcct gaaataacct 1200
ctgaaagagg aacttggtta ggaaccttct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt 1260
gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 1320
atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 1380
tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc 1440
cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta 1500
tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 1560
tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc ttgattcttc tgacacaaca gtctcgaact 1620
taaggctaga gccaccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga 1680
cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca 1740
caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac 1800
gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt 1860
ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat 1920
ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc 1980
gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca 2040
gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg 2100
ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg 2160
cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgaacctggt gcatgacccg 2220
caagcccggt gcctgagttt aacgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac 2280
gatggccgca ataaaatatc tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgga 2340
tcgatagcga taaggatcga tccgcgcatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 2400
cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 2460
tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 2520
gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 2580
tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 2640
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 2700
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 2760
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 2820
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 2880
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaccg 2940
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 3000
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 3060
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 3120
tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 3180
gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 3240
ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 3300
aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 3360
acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 3420
tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 3480
cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 3540
gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 3600
taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 3660
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 3720
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 3780
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 3840
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 3900
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 3960
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 4020
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 4080
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 4140
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 4200
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 4260
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 4320
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 4380
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 4440
tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 4500
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 4560
aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagag cttgcaattc 4620
gcgcgttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 4680
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 4740
gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtag 4800
tacgaggccc tttcactcat tagatgcatg tcgttacata acttacggta aatggcccgc 4860
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 4920
taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 4980
acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 5040
gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 5100
agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 5160
atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 5220
atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 5280
ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 5340
gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 5400
gacaccggga ccgatccagc ctccggactc tagcctaggc cgcggaccat gtccggcttg 5460
aacgacatct tcgaggccca gaagatcgag tggcacgagg aaaagcttcg aaccatggtg 5520
agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 5580
gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 5640
ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 5700
accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 5760
gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 5820
gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 5880
cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 5940
gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 6000
aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 6060
taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 6120
agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 6180
gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtagctcgag 6240
tgcggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 6300
atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa agcaggctgc gatcgctcgg 6360
gcaggaagag ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt 6420
tagagagata attagaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg 6480
acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga 6540
ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttgggtttat atatcttgtg 6600
gaaaggacga ggatccgcca ttgtgtggat aagaaatttc aagagaattt cttatccaca 6660
caatggtttt ttg 6673
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for TACE
<400> 12
gtacgtcgat gcagagcaaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for TACE
<400> 13
aaaccagaac agacccaacg 20
Claims (8)
- 종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 SEQ ID NOS: 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 shRNA; 및
SEQ ID NO: 6의 내장지방의 대식세포 표적서열 및 R9(아르기닌) 펩타이드를 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 유전자/전달체 복합체를 포함하는 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
shRNA는 플라스미드 벡터에 포함된 형태인, 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물. - 제2항에 있어서,
shRNA를 포함하는 플라스미드 벡터는 SEQ ID NOS: 7 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 염기서열을 포함하는, 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
R9(아르기닌) 펩타이드는 Cys-(9Arg)-Cys의 반복단위를 포함하고, 이황화결합으로 중합된 폴리(올리고아르기닌)의 아세트산염인, 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
TACE의 발현을 억제하는 shRNA와 유전자 전달체는 1: 1.5 내지 8의 중량비로 포함되는, 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
유전자/전달체 복합체는 shRNA 및 유전자 전달체의 정전기적 인력을 통해 형성된 것인, 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
조성물은 구강, 에어로졸, 협측, 피부, 흡입, 근육내, 정맥내, 복막 내, 비강, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여되는, 비만유래 2형 당뇨 예방 또는 치료용 조성물. - 삭제
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