WO2024010344A1 - 유전자 및 지방세포 표적 유전자 전달체 복합체를 포함하는 비만 및 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 마이크로구조체 - Google Patents
유전자 및 지방세포 표적 유전자 전달체 복합체를 포함하는 비만 및 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 마이크로구조체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유전자 및 지방세포 표적 유전자 전달체 복합체를 포함하는 비만 및 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 마이크로구조체에 관한 것으로서, 상기 유전자 및 지방세포 표적 유전자 전달체를 이용하여 FABP4와 FABP5 발현을 억제할 수 있으므로, 우수한 비만 및 비만유래 제2형 당뇨병의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 유전자와 지방세포 표적 유전자 전달체 복합체를 포함하는 비만 및 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 마이크로구조체에 관한 것이다.
기존 비만 치료제는 지방 흡수와 식욕 억제에 맞춰져 있어, 지방변과 정신질환에 대한 부작용이 있다. 이러한 부작용을 극복하기 위해 나온 약물도 복용을 멈추면 체중이 바로 회복되는 한계가 있다. 또한, 기존 비만치료제는 주사제형으로 주사공포증의 단점 뿐만 아니라 장기 치료 시 약물의 안정성, 매번 병원을 방문해야 된다는 단점이 있다.
약물을 신체에 전달하는 투여경로 중 경구형, 주사형, 경피형 등이 있다. 경구형 투여는 환자의 복약순응도를 높일 수 있는 편리한 투여로 유효성분은 캡슐, 정제, 시럽 형태로 신체에 전달할 수 있으나, 간에서의 초회통과대사(first-pass metabolism) 등으로 인해 유효성분은 불활성화될 수도 있으며 실제로 바이오 의약품의 흡수율이 낮다고 보고된 바 있다. 주사형은 약물 및 치료제 등의 정확하고 빠른 약효 발현을 위해 사용되며, 피부 장벽을 뚫어서 인체에 투여하고 있다. 주사형으로 전달되는 유효성분의 활성은 잘 유지된다는 장점이 있으나, 감염의 위험, 부정확한 투여용량, 주사공포증, 고통 등의 단점이 있다.
기존 경구형과 주사형 경로투여의 한계를 극복하기 위해서 최소 침투 마이크로니들을 포함한 다양한 마이크로구조체 기반 경피형 약물전달 시스템이 개발되었다. 마이크로구조체는 주로 생분해성 (Biodegradable/dissolving), 솔리드(solid), 코팅(coating), 할로우(hollow) 형태로 제작된다. 생분해성 마이크로구조체는 고분자와 active ingredient(API / 화장품 또는 의약품)를 포함한 다양한 물질을 미세바늘 형태로 제형화하여 피부에 삽입 후 체액에 의해 용해되어 탑재된 물질을 통증 없이 전달하는 경피 전달시스템이다.
본 연구 발명에서 타겟하는 FABP4, FABP5는 지방조직에 위치하는데, FABP4가 손실됐을 때 FABP5는 FABP4를 대체한다. 이는 지방산 흡수와 지방 방울 크기와 관련된 요소로, 비만 모델링 시 지방방울 크기와 지방산의 반입 및 저장에 관여하는 FABP4, FABP5의 발현이 증가한다. 이와 더불어, 인슐린 저항성 증가로 비만유래 제2형 당뇨병까지 유발될 수 있다.
본 발명은 FABP4, FABP5에 대한 유전자 발현을 억제하는 RNAi 시스템을 이용한다. 플라스미드 기반 short hairpin RNA, sh(FABP4/5)를 이용하여, 비만 및 비만유래 제2형 당뇨병 치료를 도모한다. 분화된 지방세포 핵막과 세포막에 과발현된 prohibitin 수용체에 특이적으로 결합하는 PBP-9R 펩타이드를 이용하여, 비바이러스성 유전자/전달체 개발하였다.
또한, 기존 유전자 기반 지방세포 표적 비만치료제는 주사형으로 개발되어 주삿바늘의 통증, 환자의 거부감, 주사 적용 교육의 필요성 등으로 인해 환자가 치료를 중단할 가능성이 높아 본 발명에서 기존 주사제의 문제점을 극복하는 최소침습 마이크로구조체에 유전자 기반 지방세포 표적 비만 치료제를 탑재하여 효능을 입증하였다.
기존 비만 치료 약물은 지방 흡수와 식욕 억제에 초점이 맞춰져 있었으나, 본 발명은 지방세포 표적 비 바이러스성 유전자/전달체로 지방 축적과 관련된 유전자를 억제함으로써 근본적인 비만 및 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 치료에 기여할 수 있다. 기존 주사제형 비만 치료제는 고통과 주사의 거부감 등으로 치료 효과 및 만족도가 낮았으며 본 발명을 통해 최소침습 플랫폼인 마이크로구조체를 이용하여 환자의 적용 편의성을 극대화하여 치료 효과를 높이고자 한다.
일 양상은 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자 및 지방세포 표적 전달체를 포함하는 복합체를 포함하는 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 마이크로구조체를 포함하는, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 패치를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 (a) 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자를 제조하는 단계; (b) 지방세포 표적 전달체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (a)의 유전자 및 (b)의 전달체를 포함하는 복합체를 포함하는 마이크로구조체를 제조하는 단계;를 포함하는, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자 및 지방세포 표적 전달체를 포함하는 복합체를 포함하는, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비만"은 단순히 체중이 많이 나가는 것이 아니라 체지방이 과도하게 축적된 상태를 말한다. 겉으로 정상체중으로 보여도 체지방 비율이 높으면 비만이라고 할 수 있다는 의미이다. 보통 비만을 판정하는 방법은 체질량지수 (BMI)를 이용하게 되는데 23~24.9인 경우에 과체중, 25~29.9까지를 경도비만으로 판정하며, 30~34.9는 중등도비만, 35 이상일 경우는 고도비만으로 판정하고 있다. 비만은 한가지 원인보다는 여러 원인이 복합적으로 작용하여 발생하는데, 서구화된 식습관을 포함하여 잘못된 식습관과 활동량 감소, 정서적 요인, 유전적 요인 등을 들 수 있으며 이렇게 발생한 비만은 결국 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관 질환 및 동맥경화증 등의 질환의 발생 위험을 높이게 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '당뇨'는 포도당-비관용(intolerance)을 초래하는 인슐린의 상대적 또는 절대적 부족으로 특징되는 만성질환을 의미한다. 본 발명의 용어 당뇨는 모든 종류의 당뇨병을 포함하며, 예를 들어, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨 및 유전성 당뇨를 포함한다. 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨병으로서, β-세포의 파괴에 의해 주로 초래된다. 제2형 당뇨는 인슐린 비의존성 당뇨병으로서, 식사 후 불충분한 인슐린 분비에 의해 초래되거나 또는 인슐린 내성에 의해 초래된다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 당뇨는 제2형 당뇨병일 수 있으며, 구체적으로 비만 유래 제2형 당뇨병일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자는 FABP4 (Fatty Acid-Binding Protein 4, aP2) 또는 FABP5 (Fatty Acid-Binding Protein 5)를 표적하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자는 FABP4 (Fatty Acid-Binding Protein 4, aP2) 또는 FABP5 (Fatty Acid-Binding Protein 5)를 표적으로 하여 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 펩타이드 모방체 (mimic), 기질유사체, 앱타머, 항체, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자는 FABP4 또는 FABP5 유전자의 mRNA와 결합하는 siRNA 또는 shRNA 또는 FABP4 또는 FABP5 단백질의 발현을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA, miRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 분화된 지방세포의 핵막과 세포막에 과발현되는 prohibitin에 결합하는 PBP (Prohibitin binding protein)의 특성과 비만의 근본적이고 장기치료를 위해 shRNA 형태를 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료에 이용하기 위해, FABP4(Fatty Acid-Binding Protein 4, aP2), FABP5(Fatty Acid-Binding Protein 5)를 표적으로 하여 억제하는 sh(FABP4/5)유전자를 사용할 수 있다.
이러한 유전자 자체는 인산 구조로 인해 음전하를 나타내기 때문에 유전자 자체로는 전기적 반발로 음전하를 나타내는 세포막을 관통하기 쉽지 않다. 따라서 유전자는 양전하를 나타내는 물질과 반응하여 복합체를 형성한 뒤 전체 전하가 양전하를 나타내야 세포 안으로 좀 더 쉽게 들어가고, 세포 내에서 유전자의 발현을 향상시킬 수 있다. 이처럼 유전자를 세포 안으로의 전달을 높여주는 물질을 유전자 전달체(Carrier)라 부른다. 유전자의 향상된 전달과 높은 발현을 위해 유전자와 결합하여 유전자의 전달을 도와주는 물질을 의미하며, 이러한 유전자 전달체는 주로 양전하를 띄는 물질이며, 음전하의 유전자와 양전하의 유전자 전달체 간의 전기적 상호작용으로 유전자/전달체 복합체를 형성한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 전달체는 독성이 없는 비바이러스 펩타이드 전달체일 수 있다. 이를 이용하여, 체내의 유전자 분해효소의 작용을 막고, 전달 효율을 향상시켜, off-target effect 감소시킬 수 있다. 일 구체예에서, 지방세포 표적 전달체는 PBP-9R 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전자 및 전달체를 포함하는 복합체는 상기 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자와 지방세포 표적 전달체가 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 또는 1:10의 무게비로 포함되어 형성될 수 있다. 상기 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자와 지방세포 표적 전달체가 상기 무게비로 포함되는 경우 안정적으로 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전자 및 전달체를 포함하는 복합체의 크기는 100 내지 1,000 nm, 100 내지 800 nm, 100 내지 600 nm, 100 내지 500 nm 또는 200 내지 400 nm일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 마이크로구조체는 마이크로니들 형태일 수 있으며, 일 구체예로, 인터로킹 마이크로구조체 (interlocking microneedles, LMNs) 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 마이크로구조체는 생체적합성 고분자를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산(Hyaluronic acid), 소듐-카르복시메틸 셀룰로오스(Na-CMC, Sodium carboxymethyl cellulose), 비닐피롤리돈-비닐아세테이트 공중합체, 폴리비닐알코올(Poly vinyl alcohol), 및 폴리비닐피릴리돈(Poly vinyl pyrrolidone) 등의 수용성 고분자; 자일로즈(Xylose), 수크로스(Sucrose), 말토오스(Maltose), 락토오스(Lactose), 트레할로스(Trehalose) 등의 당류; 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산(Hyaluronic acid)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전자 및 전달체를 포함하는 복합체와 생체적합성 고분자를 혼합한 마이크로구조체는 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 마이크로구조체는 생체 내에서 용해되는 생체적합성 고분자를 포함하고 있어 피부 내에서 마이크로구조체 내에 포함된 물질을 소량씩 방출하여 장시간 효과를 지속할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 마이크로구조체는 피부 내에서 용해되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 마이크로구조체를 형성하는 물질이 생체 내에서 용해되어 마이크로구조체에 포함된 유전자와 전달체의 복합체가 피부 내로 효과적으로 방출될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 마이크로구조체는 이를 형성하는 상기 성분들 이외에 가소제, 계면활성제, 보존제, 항염제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 가소제(plasticizer)로는, 예를 들어, 에틸렌 글리콜(Ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 디프로필렌 글리콜(Dipropylene glycole), 부틸렌 글리콜(Butylene glycol), 글리세린(Glycerine) 등의 폴리올이 단독으로 또는 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 미세바늘의 길이는 특정 크기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자 및 지방세포 표적 전달체를 포함하는 복합체는 마이크로구조체 총 중량 대비 1.4 내지 87 중량%, 2.7 내지 65 중량% 또는 5.4 내지 43 중량% 포함될 수 있다. 상기 복합체가 마이크로구조체 총 중량 대비 1.4 중량% 미만으로 포함될 경우 유효한 효과를 발휘하지 못할 수 있으며, 87 중량% 초과로 포함될 경우 마이크로구조체의 물성 및 내구성이 감소할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 마이크로구조체에 의해 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 마이크로구조체에 의해 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로구조체를 포함하는, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 패치를 제공한다.
본 발명에서 상기 패치는 상기 마이크로구조체가 하나 이상 부착되어 있으며 상기 마이크로구조체가 부착되어 있는 면이 피부에 부착될 수 있도록 제작된 시트를 의미할 수 있다. 상기 시트의 크기는 특정 크기에 한정되는 것은 아니며, 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자 및 지방세포 표적 전달체를 포함하는 복합체의 양 또는 부착 부위에 따라 적절하게 조절할 수 있다. 또한, 피부에 부착할 수 있는 시트의 면에는 하나 이상, 바람직하게는 다수의 마이크로 니들이 부착될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 패치는 마이크로 니들을 1 내지 10100개, 1 내지 1050개, 1 내지 1020개 또는 1 내지 1010개로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 패치는 마이크로구조체를 500:1, 250:1, 200:1, 150:1, 100:1, 5:1, 1:1, 1:5 또는 1:10의 종횡비로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 패치는 마이크로구조체로 베이스 필름과 복수 개의 마이크로 니들을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 패치는 베이스 플림과 마이크로 니들을 500:1, 250:1, 200:1, 150:1, 100:1, 5:1, 1:1, 1:5 또는 1:10의 비율로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 패치는 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용일 수 있으며, 유전자 및 전달체를 포함하는 복합체를 지방 세포에 바로 직접적으로 전달할 수 있어 전달 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 패치는 피부 국소 도포용일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자를 제조하는 단계;
(b) 지방세포 표적 전달체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (a)의 유전자 및 (b)의 전달체를 포함하는 복합체를 포함하는 마이크로구조체를 제조하는 단계;를 포함하는, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (c) 단계는 (i) 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자 및 지방세포 표적 전달체를 포함하는 복합체를 포함하는 마이크로구조체를 형성하는 물질을 몰드에 채워 혼합하는 단계; 및 (ii) 상기 몰드를 건조한 후 분리하는 단계;로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 마이크로구조체는 마이크로몰딩 기법으로 제작될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 마이크로구조체는 용해성 인터로킹 마이크로구조체 형성할 수 있다.
다만, 상기 마이크로구조체 제조 방법은 예시이며, 본 발명의 연구 분야에서 이용될 수 있는 마이크로구조체 제조 방법이라면 제한 없이 이용될 수 있다.
본 발명의 마이크로구조체를 이용하여 FABP4와 FABP5 발현을 억제해, 비만 및 비만유래 제2형 당뇨병 치료가 가능하며, RNAi 기법 중, shRNA(sh(FABP4/5))를 사용하여, 장기간 발현을 유도할 수 있다.
또한, 유전자 만으로는 짧은 반감기와 표적 능력이 낮기에 효능에 한계가 있으므로, 지방세포 표적 펩타이드를 이용해 세포막과 핵막을 투과하여 shRNA 안정성의 향상 및 투과, 발현을 도왔으며, 지방세포 표면의 prohibitin 수용체에 결합하여, 선택적으로 지방세포 표적 효과를 향상시켰다.
또한, 본 발명의 용해성 마이크로구조체 제작을 위해 사용한 히알루론산으로 인한 분화된 지방세포에서의 유전자 효능 변화가 없는 것을 확인하였다.
본 발명의 마이크로구조체와 기존 주사제를 비교할 시, 치료기간을 포함한 8주동안 상온에서의 장기적인 안정성이 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 비만 모델링한 마우스에 SA-OP(self-assembled oligopeptoplex)와 히알루론산을 혼합하여 제작한 마이크로구조체를 부착한 결과, 기존 주사제와 비교할 시 72시간동안 내장지방에 표적 효과가 유지되는 것을 확인하였다.
도 1a는 sh(FABP4/5)유전자와 PBP9R 전달체의 안정도를 전기영동으로 확인한 결과이다. 중량비 1:3로 제작하여, 산성용액에서 시간별로 측정하였다. 도 1b는 sh(FABP4/5)유전자와 PBP9R 전달체의 안정도를 나노 입자 크기로 확인한 결과이다. 중량비 1:3로 제작하여, 산성용액에서 시간별로 DLS(Dynamic light scattering)를 활용해 나노 입자 크기를 측정하였다.
도 2는 sh(FABP4/5)유전자와 PBP9R 전달체의 혈청 내 안정도를 전기영동으로 확인한 결과이다 (상단의 +는 shRNA의 유무, 하단의 +는 전달체의 유무를 의미, incubation time (h)는 mouse serum 배양 시간을 의미).
도 3은 sh(FABP4/5)유전자와 PBP-9R 전달체를 마이크로몰딩 기법을 이용하여, 용해성 인터로킹 마이크로구조체 형성한다. 그 후, proteinase K를 이용하여, 복합체 내 유전자의 안정도를 전기영동으로 확인한 결과이다 (HA: hyaluronic acid, 히알루론산을 의미한다. MN: 마이크로구조체를 의미한다).
도 4a는 현미경을 이용해 용해성 인터로킹 마이크로구조체의 성상을 확인한 결과이다. 도 4b는 본 발명의 마이크로구조체의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지이다.
도 5a는 마우스 피부에 마이크로구조체를 적용한 후, 현미경으로 확인한 것과 적용한 후 H&E 염색을 통해 투과 두께를 확인한 결과이다. 도 5b는 마이크로구조체의 강도를 수치적인 물리적 특성으로 나타내기 위해 부러지는 힘을 측정한 결과이다. (HA-LMN: 하일루론산만으로 만든 용해성 인터로킹 마이크로구조체를 의미한다.) 도 5c는 HA(LMN) 및 SA-OP(LMN)의 용해 결과이다. 마우스에 적용한 지 1시간 후에 용해성 인터로킹 마이크로구조체가 완전히 용해되었다.
도 6a는 LMN 적용 후 C57BL/6 마우스 피부에 대한 경피 수분 손실 분석 결과이다. 도 6b는 SA-OP 복합체를 탑재한 용해성 인터로킹 마이크로구조체를 체온과 같은 환경에서 돼지 피부에 적용하여 유전자 방출량을 시간대별로 확인한 결과이다.
도 7은 FITC 형광이 결합된 PBP9R를 이용하여, 마이크로구조체와 용액 상태의 결합 능력을 유세포분석 (도 7a) 및 공초점현미경 (도 7b)으로 검증한 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 SA-OP 복합체 용액과 이를 탑재한 마이크로구조체의 FABP4, FABP5에 대한 유전자 침묵 효과를 RT-qPCR (도 8a) 및 western blot (도 8b)으로 비교한 결과이다.
도 9는 FABP4, FABP5 인자 억제로 인한 효과를 검증하기 위해 인슐린 저항성 관련 인자인 leptin, adiponectin를 선정하고, SA-OP 복합체 용액과 이를 탑재한 마이크로구조체의 leptin, adiponectin mRNA 발현양을 RT-qPCR로 비교한 결과이다.
도 10은 C57BL/6의 식이 유발 비만 모델을 이용하여, 시간대별로 피하 주사와 마이크로구조체 적용 시 조직 내 형광 강도를 측정비교한 결과이다. (vWAT: 백색지방(내장지방), sWAT: 백색지방(피하지방))
도 11a은 C57BL/6 마우스에게 14주 동안 60% HFD를 공급하고 6주 동안 주 3회(0.5 mg/kg of sh(FABP4/5)) 복합체를 투여하며, 매주 몸무게를 측정한 결과이다 도 11b는 6주간 치료가 끝난 후 7주째 인슐린 저항성과 8주째 글루코스 저항성을 측정한 결과이다.
도 12a는 6주간 치료 후, 인슐린, 글루코스 저항성 측정이 끝난 후, 해부하여 내장지방의 FABP4, FABP5 단백질 발현양과 mRNA 양을 확인한 결과이다. 도 12b는 내장지방의 leptin, adiponectin mRNA 양을 확인한 결과이다. 도 12c는 혈청에서의 염증성 인자를 확인한 결과이다.
도 13은 6주간 치료 후, 혈청에서 지방대사와 관련된 TG, FFA를 측정한 결과이다.
도 14는 6주간 치료 후, 마우스의 간을 H&E 염색을 통해 조직병리학적 분석한 결과이다.
도 15는 장기 저장된 SA-OP(LMN)의 물리화학적 특성을 확인한 도이다. 도 15a는 SA-OP가 장기 저장을 위해 LMN에 어떻게 보존되는지에 대한 개략도이다. 용액의 SA-OP는 유전자와 펩타이드에 의해 생성된 선천적 전하 때문에 며칠 후에 서로 상호 작용하고 응집체를 형성할 수 있으나, LMN의 HA 백본은 SA-OP가 서로 상호 작용하고 나노 입자 형태를 보존하는 것을 방지함을 확인하였다. 도 15b는 SA-OP 제작 4주 후 집계에 대한 광학 측정 결과이다. 도 15c는 동적 광산란에 의해 평가된 SA-OP의 크기 분포를 나타낸 도이다. 도 15d는 저장 4주 후 SA-OP(LMN)의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지이다. 도 15e는 저장 4주 후(왼쪽) 및 저장 4주 동안(오른쪽) SA-OP(LMN) 내부의 유전자 및 펩티드의 형광 강도를 확인한 도이다. 도 15f는 다양한 보관 시점에서 SA-OP(LMN)의 파단력 분석 결과이다.
도 16은 보관 기간 4주 동안의 SA-OP(LMN)의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지이다 (sh(FABP4/5)(각 기간의 하단, 적색) 및 PBP9R(각 기간의 상단, 녹색)).
도 17은 장기간 보관된 SA-OP의 체외 세포 흡수 및 치료 효과를 확인한 도이다. 도 17a는 다양한 시점에서 SA-OP(SOL) 및 SA-OP(LMN)의 sh(FABP4/5)-Cy5.5에 대한 히스토그램 플롯을 나타낸 도이다. 도 17b는 상이한 시점에서 sh(FABP4/5)-Cy5.5의 상대 평균 형광 강도 분석 결과이다. 데이터는 평균 ± SD, n = 3으로 표현하였다. 도 17c는 각 시점에서 PBP9R-FITC의 상대 평균 형광 강도 분석 결과이다. 데이터는 평균 ± SD, n = 4로 표현하였다. 도 17d는 솔루션 및 LMN에서 장기간 보관된 SA-OP의 이중 유전자 침묵 효과를 나타낸 도이다. 도 17e는 3T3-L1 세포에서 처리 후 leptin, adiponectin mRNA 수준 분석 결과이다. 데이터는 평균 ± SD, n = 3으로 표현하였다.
도 18은 다양한 시점에서 SA-OP(SOL) 및 SA-OP(LMN)의 PBP9R-FITC에 대한 히스토그램 플롯을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 및 실험예
제조예1: 유전자 sh(FABP4/5) 제조
두 가지 shRNA 발현을 유도하는 플라스미드는 이중 RNA PolⅢ 카세트 벡터인 psiRNA-DUO(InvivoGen, USA)를 사용하였으며, 구체적인 제작 과정은 다음과 같다.
동결된 플라스미드를 함유하는 튜브를 회전시켜서 DNA를 침전시키고, 1ug/ul의 플라스미드 용액을 얻기 위해 얻어진 DNA를 20ul 살균수에 재현탁하였다. 재현탁된 플라스미드를 온도 -20℃ 조건에서 저장하였다. 이를 재현탁된 E.coli에 형질전환함으로써 플라스미드 증폭 과정을 수행하였다.
psiRNA-DUO 플라스미드를 제한효소인 BbsⅠ(NEB, 2 units enzyme/ug plasmid DNA)으로 처리하고, 0.7% 저융점 아가로오스 겔을 사용하여 큰 단편(3180 bp)을 용리시킨 후, 정제된 DNA 단편을 희석시켜 0.1 ug/ul의 용액을 습득하였다 (Gus 카세트). 또한 psiRNA-DUO 플라스미드를 Acc65Ⅰ 및 HindⅢ로 NEB 효소, NEBuffer 2, BSA와 함께 처리하고, 큰 단편(3150 bp)를 0.7% 저융점 아가로오스 겔을 사용하여 용리시킨다음, 정제된 DNA 단편을 희석시켜 0.1ug/ul의 용액을 수득하였다 (LacZ 카세트).
psiRNA-DUO 내로 sh(FABP4/5)를 클로닝하기 위해 psiRNA-DUO를 Acc65Ⅰ, HindⅢ 및 BbsⅠ으로 동시에 처리하고, 두 가지 psiRNA-DUO 절편들(HindⅢ/BbsⅠ 및 BbsⅠ/Acc65Ⅰ)과 두 가지 shRNA 인서트들과 함께 라이게이션하는 과정을 이용하거나, 또는 첫 번째 shRNA 인서트를 클로닝한 후, 나머지 두 번째 shRNA 인서트를 클로닝 하는 과정을 이용하였다. (Catalog # ksirna4-gz3).
구체적인 염기서열은 다음과 같다.
cctgcaggcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc
cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat
tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat
catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat
gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc
gctattacca tgatgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac
tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttgactagta
aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt
aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcagc
ttcgaggggc tcgcatctct ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc cgccatccac
gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact gcgtccgccg
tctaggtaag tttaaagctc aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc ccttggagcc
tacctagact cagccggctc tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa ctctacgtct
ttgtttcgtt ttctgttctg cgccgttaca gatccaagcc accatggttt ctaagggaga
agaactcttt actggtgttg tcccaattct ggttgagctg gatggtgatg tgaatggcca
caaattctct gtgtctggtg aaggtgaagg agatgcaact tatggaaagc tgactctgaa
gttcatttgt acaacaggaa agctgccagt gccttggcca actctggtga ccaccctgac
ttatggtgtt caatgtttca gcagataccc tgaccacatg aagcagcatg acttctttaa
atctgcaatg ccagaaggtt atgttcagga gaggacaatc ttctttaagg atgatggaaa
ttataagaca agggcagaag tgaagtttga aggtgataca ctggttaaca gaattgagct
gaaaggcatt gattttaagg aagatggaaa cattctgggt cacaagctgg agtacaacta
taattctcac aatgtttaca ttatggcaga taagcagagg aatggaatta aggctaattt
caagattaga cacaacattg aggatggatc tgtccaactg gcagaccatt accagcagaa
cacccctatt ggtgatggcc cagttctcct cccagataat cactatctca gcactcaatc
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agcagcagga attactctgg gaatggatga gctgtacaag ggtaagtcac tgactgtcta
tgcctgggaa agggtgggca ggagatgggg cagtgcagga aaagtggcac tatgaaccca
ctagtttgac aattaatcat aagcatagta taatacaact cactatagca attgtactaa
ccttcttctc tttcctctcc tgacaggagg agccatcatg gccaaactca cttctgcagt
cccagtcctc acagcaaggg atgttgcagg ggctgtagag ttctggactg acagattagg
attctccaga gactttgttg aagatgattt tgctggtgtt gtcagagatg atgtcaccct
cttcatctca gcagttcagg accaagttgt ccctgacaac acccttgctt gggtctgggt
cagaggccta gatgagcttt atgcagaatg gtcagaagta gtcagcacaa atttcaggga
tgcctctggc ccagccatga cagaaattgg tgaacaacct tggggaaggg aatttgccct
cagagaccct gctggaaatt gtgtccattt tgtagctgag gaacaggact aaagctagaa
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt
tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt
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aacagcccct gatgcctatg ccttattcat ccctcagaaa aggattcaag tagaggcttg
atttggaggt taaagttttg ctatgctgta ttttaattaa cgttctgcag tatttagcat
gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac agctggaaat caagtctgtt
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cgttgaactg cgtgatgcgg atcaacaggt ggttgcaact ggacaaggca ctagcgggac
tttgcaagtg gtgaatccgc acctctggca accgggtgaa ggttatctct atgaactgtg
cgtcacagcc aaaagccaga cagagtgtga tatctacccg cttcgcgtcg gcatccggtc
agtggcagtg aagggcgaac agttcctgat taaccacaaa ccgttctact ttactggctt
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cgctgaagag atgctcgact gggcagatga acatggcatc gtggtgattg atgaaactgc
tgctgtcggc tttaacctct ctttaggcat tggtttcgaa gcgggcaaca agccgaaaga
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agagctgata gcgcgtgaca aaaaccaccc aagcgtggtg atgtggagta ttgccaacga
accggatacc cgtccgcaag gtgcacggga atatttcgcg ccactggcgg aagcaacgcg
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cgataccatc agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac cgttattacg gatggtatgt
ccaaagcggc gatttggaaa cggcagagaa ggtactggaa aaagaacttc tggcctggca
ggagaaactg catcagccga ttatcatcac cgaatacggc gtggatacgt tagccgggct
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tcaccgcgtc tttgatcgcg tcagcgccgt cgtcggtgaa caggtatgga atttcgccga
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cggtgaaaaa ccgcagcagg gaggcaaaca ataatagcta gaggaagact ttttggaaaa
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caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgttc ttaatcgata ctagtgctgc
agtatttagc atgccccacc catctgcaag gcattctgga tagtgtcaaa acagccggaa
atcaagtccg tttatctcaa actttagcat tttgggaata aatgatattt gctatgctgg
ttaaattaga ttttagttaa atttcctgct gaagctctag tacgataagt aacttgacct
aagtgtaaag ttgagatttc cttcaggttt atatagcttg tgcgccgcct gggtacctga
ggtttttcaa aagtagttga caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac
gactcactat aggagggcca ccatggaccc tgttgtgctg caaaggagag actgggagaa
ccctggagtg acccagctca acagactggc tgcccaccct ccctttgcct cttggaggaa
ctctgaggaa gccaggacag acaggcccag ccagcagctc aggtctctca atggagagtg
gaggtttgcc tggttccctg cccctgaagc tgtgcctgag tcttggctgg agtgtgacct
cccagaggct gacactgtgt aaccctaagc ttctagactt aattaa (서열번호 1)
제조예2: 지방세포 표적 가능한 펩타이드 기반 전달체(PBP-9R) 제조
지방세포에 대한 선택적 표적이 가능한 PBP 펩타이드 서열(adipocyte-targeting sequence)와 양전하로 세포 내 유입의 용이성을 증대시키는 9개의 D-form 아르기닌 서열(RRRRRRRRR,9R)로 구성된다. 펩타이드 전달체의 단량체는 'C-PBP-RRRRRRRRR-C'(Cys Lys Gly Gly Arg Ala Lys Asp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys)로 구성된다 (서열번호 2). 분자량은 2341로, Peptron사에서 구입하였다. 동결건조된 펩타이드를 탈이온수에 녹인 후, -20℃ 조건에서 저장하였다.
제조예3: 마이크로몰딩기법을 이용하여, 나노입자의 마이크로구조체 형성
지방세포 표적 펩타이드 기반 유전자/전달체 복합체에 대해 20%(w/v)의 히알루론산을 혼합하여, 나노입자를 형성하였다. 마이크로몰딩을 이용하여, 마스터 템플릿을 이용해 제작한 PDMS 몰드에 로딩하였다. 그 후 원심분리기 또는 진공 장치를 이용해 나노입자를 탑재한 마이크로구조체 생성하였다. 상온 건조 후, 용해성 인터로킹 마이크로구조체가 형성됨을 확인하였다.
제조예 2: 지방세포 표적 가능한 펩타이드 기반 전달체(PBP-9R) 제조
지방세포에 대한 선택적 표적이 가능한 PBP 펩타이드 서열(adipocyte-targeting sequence)와 양전하로 세포 내 유입의 용이성을 증대시키는 9개의 D-form 아르기닌 서열(RRRRRRRRR,9R)로 구성된다. 펩타이드 전달체의 단량체는 'C-PBP-RRRRRRRRR-C'(Cys Lys Gly Gly Arg Ala Lys Asp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys)로 구성된다 (서열번호 2). 분자량은 2341로, Peptron사에서 구입하였다. 동결건조된 펩타이드를 탈이온수에 녹인 후, -20℃ 조건에서 저장하였다.
제조예 3-1: 마이크로몰딩기법을 이용한 나노입자의 마이크로구조체 형성
지방세포 표적 펩타이드 기반 유전자/전달체 복합체에 대해 20%(w/v)의 히알루론산을 혼합하여, 나노입자를 형성하였다. 마이크로몰딩을 이용하여, 마스터 템플릿을 이용해 제작한 PDMS 몰드에 로딩하였다. 그 후 원심분리기 또는 진공 장치를 이용해 나노입자를 탑재한 마이크로구조체 생성하였다. 상온 건조 후, 용해성 인터로킹 마이크로구조체가 형성됨을 확인하였다.
제조예 3-2: 용해성 마이크로구조체 어레이 몰드 및 어레이의 제작
인터로킹 마이크로구조체는 14 x 14 어레이 형태로 제작되었다. 인터로킹 마이크로구조체의 구조는 높이 700 um, 밑면 직경 250 um, 중간 직경 400 um이다. 용해되지 않는 HTL 수지는 3D 프린팅된 금형의 백본 매트릭스로 사용되었다. 3D 프린팅된 금형을 사용하여 네거티브 금형인 Polydimethylsiloxane(PDMS, SYLGARD쪠 184 Silicone Elastomer, DOW Corning)을 10:1 비율로 제작하여 네거티브 금형을 제작한 다음 80℃에서 1시간 동안 어닐링하였다. 다음으로, 마이크로구조체 PDMS 몰드를 10초(mid) 동안 플라즈마 처리하였다. 플라즈마 처리는 친수성 표면을 생성하여 HA(20%) 용액이 PDMS 마이크로구조체 몰드 캐비티에 들어가게 하여 제조하였다.
실험예 1. 실험 방법
(1) 마이크로구조체의 기계적 시험
Zwick Roell Z0.5 Materials Testing Machine(Zwick Roell)을 이용하여 마이크로구조체를 녹이는 기계적 강도 시험을 수행하였다. 히알루론산을 용해성 마이크로구조체 제조에 사용하였다. 미세바늘 끝이 위로 향하도록 알루미늄판 위에 미세바늘을 설치하였다. 10mm/초의 속도를 일정하게 가하여 마이크로구조체의 끝을 압박하였다. 미리 설정된 힘 3N에 도달할 때까지 거리와 힘을 재료 시험기에 기록하였다.
(2) 미세바늘의 피부 삽입 시험
미세바늘 어레이가 피부를 관통할 수 있는지 알아보기 위해 비만 마우스에서 채집한 쥐 피부에 미세바늘 어레이를 5분간 압착하였다. 조직학적 표본의 침투를 확인하기 위해 비만 마우스에서 마우스 피부 샘플을 채취하였다. 각 피부에 미세바늘을 5분 동안 누른 후 피부 샘플을 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음 절편 전에 파라핀 블록에 포매하였다. 파라핀 절편을 헤마톡실린과 에오신(H & E)으로 염색하였다.
(3) 3T3-L1 지방세포 분화
3T3-L1 세포는 ATCC에서 구입하였다. 고혈당 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)은 WelGENE에서 구입하였다. 1% 페니실린-스트렙토마이신(100U/ml) 및 10% FBS(WelGENE)가 포함된 DMEM을 세포 배양에 사용하였다. 3T3-L1 세포를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 주 3회 배양한 후 1 uM Dexamethasone, 0.5 mM IBMX 및 10 ug/ml 인슐린(MDI 용액)을 이용하여 72시간 동안 분화를 유도하였다. 배지를 제거하고 10ug/ml 인슐린을 함유하는 완전 배지로 보충하였다. 미디어는 2일마다 변경하였다.
(4) CCK-8 검정
성숙한 지방세포를 6-웰 플레이트에서 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음 히알루론산 용액 유무에 관계없이 다양한 양의 SA-OP로 세포를 처리한 다음 CCK-8 용액을 30분 동안 첨가하였다. 대조군과 비교한 상대적인 세포생존율은 UV/vis 분광광도계(Infinite 200 PRO microplate Reader, TECAN)로 450 nm에서 측정하였다.
(5) 유세포 분석
sh(FABP4/5)/FITC-PBP9R (peptron, Korea)을 상온에서 30분간 준비하였다. sh(FABP4/5)/FITC-PBP9R 을 sh(FABP4/5)/FITC-PBP9R 탑재 마이크로니들과 비교하기 위해 세포 흡수를 측정하였다. FITC-PBP-9R은 유동 세포측정법에 의한 세포 흡수의 평균 형광 강도를 측정하는 데 사용하였다. 1, 4, 24 및 48시간 형질주입 후, 성숙 지방세포를 트립신 처리하여 취하고, FACS 완충액(PBS 중 2% FBS 및 0.02% 아지드화나트륨)을 함유하는 FBS에서 단일 세포 현탁액을 제조하였다. sh(FABP4/5)/FITC-PBP-9R의 세포 흡수를 FACSCalibur(BD Biosciences)를 사용하여 평가하고 데이터를 CellQuest Pro를 사용하여 분석하였다. 지방세포는 전방 및 측면 산란에 의해 게이팅되었고 각 샘플은 10,000 이벤트에서 측정하였다. sh(FABP4/5)/FITC-PBP-9R의 내재화는 공초점 현미경을 사용하여 수행하였다. 지방세포를 6웰 플레이트의 유리 커버슬립에 시딩한 후 분화 및 성숙시켰다. 1, 6, 12 및 24시간 형질주입 후, 세포를 PBS 및 3DW로 세척하고 각각 핵을 염색하기 위해 DAPI Fluoromount-G(Southern Biotech)를 사용하여 장착하였다. 각 이미지는 TCS SP5 Carl Zeiss 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica, 한양대학교)을 사용하여 가시화하였다.
(6) RNA 분리 및 qPCR(in vitro)
SA-OP 복합 용액 및 미세바늘의 형질감염을 위해 48시간 후, RNeasy mini kit(Qiagen)을 사용하여 각 그룹의 성숙한 지방세포로부터 총 RNA를 분리하였다. RT-qPCR용 cDNA 샘플은 iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)를 사용하여 얻었고 샘플은 Thermo Fisher 7500 Fast Real-Time PCR System(Thermo Fischer)을 사용하여 SYBR Green(Bioline)으로 측정하였다. FABP4, FABP5, 아디포넥틴, 렙틴에서 GAPDH로의 상대적인 mRNA 수준은 △△Ct 방법을 사용하여 계산하였다. 각 프라이머는 바이오니아에서 구입하였다. 특정 프라이머 서열 목록은 표 1과 같다.
| Forward | Reverse | |
| Mouse GADPH | CATCACTGCCACCCAGAAGACTG (서열번호 11) | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG (서열번호 12) |
| Mouse FABP4 | TGAAATCACCGCAGACGACAGG (서열번호 3) | GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC (서열번호 4) |
| Mouse FABP5 | TGGTTTACCCAGGATCATTCC (서열번호 5) | CCTGAAGAATACCAGAGAGCTT (서열번호 6) |
| Mouse Leptin | TGAGTTTGTCCAAGATGGACC (서열번호 7) | GCCATCCAGGCTCTCTGG (서열번호 8) |
| Mouse Adiponectin | CAATGTACCCATTCGCTTTACT (서열번호 9) | CATACACCTGGAGCCAGACT (서열번호 10) |
(7) 단백질 분리 및 웨스턴 블롯(In vitro)성숙한 지방세포를 SA-OP 복합 용액 및 미세바늘로 48시간 동안 처리하였다. 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 함유하는 RIPA 완충액에 의해 용해시킨 후 볼텍서를 거치었다. 15분 동안 얼음 배양 후, 세포 현탁액을 4℃에서 15분 동안 14,800 rpm으로 원심분리하였다. 단백질 농도는 상층액을 사용하여 BCA 분석으로 평가하였다. 샘플을 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하고 SDS-PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 수행한 후 겔을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Bio-Rad)으로 옮겼다. FABP4, FABP5 및 하우스키핑 유전자(β-actin)를 포함하는 항체를 PVDF 멤브레인에서 밤새 처리하였다. PVDF 멤브레인의 샘플에 대한 항체 결합은 화학발광(ECL, Millipore)에 의해 시각화되었으며 이는 ChemiDoc™ XRS + 시스템(Bio-Rad)에 의해 검출하였다.
(8) 단백질 분리 및 ELISA(
In vitro
)
성숙한 지방세포를 SA-OP 복합 용액 및 미세바늘로 48시간 동안 처리하였다. 세포 배지에서 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 MCP-1의 단백질 농도를 ELISA(Invitrogen)로 측정하였다. 성숙한 지방세포를 1 X lysis buffer로 용해시켜 볼텍서를 거친 후 단백질 농도를 BCA assay로 측정하여 세포수를 조절하였다.
(9) 식이유도 비만 마우스 모델
비만 및 대사증후군 모델을 위해 오리엔트바이오로부터 6주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 입수하였다. 실험용 쥐의 사용은 한양대학교 동물실험실무위원회(2020-0961)의 승인을 받았다. 마우스는 4개 그룹 중 하나에 무작위로 할당하였다 (그룹당 n = 5). C57BL/6 마우스는 처음 1주 동안 정상적인 음식을 섭취하였다 (Central Lab Animal, Inc). 그런 다음 음식에 고지방식이 10%(칼로리의 60%는 지방)와 혼합하였다. 전체 식단에서 HFD의 비율은 6주 동안 점차적으로 증가했으며, 그 후 마우스는 8주 동안 HFD만 먹였다. 생쥐는 20주 후에 비만이 되었고 인슐린 저항성이 생겼으며 대략적인 체중은 50g, 포도당 수치는 >200mg/dL이었다.
(10) ITT 및 GTT
비만 및 인슐린 저항성 모델을 검증하기 위해 Accu-Chek Active 모델 GC 키트(RocheDiagonostics GmbH)를 사용하여 금식 후 6시간 후에 초기 혈당 수치를 측정하였다. 인슐린(0.75 Units/kg)을 복강내 주사하였다. 인슐린 내성 검사(ITT)를 위해 주사 후 0분, 30분, 60분, 90분 및 120분에 꼬리 정맥의 혈액 샘플을 수집하였다. S.C. 및 MN을 통해 SA-OP 복합체로 6주간 치료한 후 비만 및 대사 증후군 모델에 적용하였다. 초기 혈당 수치는 혈당 측정기를 사용하여 금식 후 6시간 후에 측정하였다. 인슐린(0.75 Unit/kg) 또는 포도당(2g/kg)을 복강내 주사하였다. 인슐린 내성 테스트를 위해 주사 후 0, 30, 60, 90 및 120분에 꼬리 정맥의 혈액 샘플을 수집하였다. 포도당 내성 검사(GTT)를 위해 주사 후 0, 15, 30-, 60-, 90- 및 120분에 꼬리 정맥의 혈액 샘플을 수집하였다.
(11) 생체 분포
비만 및 인슐린 저항성 모델 후, 마우스에 sh(FABP4/5)/FITC-PBP-9R을 S.C. 및 MN을 통해 주사하였다. FITC 형광 강도는 FOBI(CELLGENTEK, South Korea)를 사용하여 간, 신장, 비장, 심장, 폐, vWAT및 sWAT에서 측정하였으며, 1, 6, 24, 48, 72시간에 해부하였다. 강도는 소프트웨어로 분석하고 무지개 색상으로 시각화하였다.
(11) RNA 분리 및 qPCR(In vitro)
6주 처리 후, 마우스를 희생시키고, PBS로 관류시킨 후 조직을 수확하였다. 그런 다음 조직을 균질화하고 RNeasy 미니 키트를 사용하여 각 조직에서 총 RNA를 분리하고 iScript cDNA 합성 키트를 통해 합성하여 cDNA를 얻었다. 샘플은 Thermo Fisher 7500 Fast Real-Time PCR 시스템을 사용하여 측정하였다. FABP4, FABP5, 아디포넥틴, 렙틴에서 GAPDH로의 상대적인 mRNA 수준은 △△Ct 방법을 사용하여 계산하였다.
(12) 단백질 분리 및 웨스턴 블롯(In vitro)
sh(FABP4/5)/PBP-9R을 6주 동안 주 3회 복부 지방 패드에 투여하였다. 좌심실을 통해 5ml PBS를 관류한 후 조직을 수확하고 균질화하기 전에 얼음에서 배양하였다. 그런 다음 조직을 0.1mM PMSF 프로테아제 억제제가 포함된 Reporter 용해 1X 완충액으로 균질화하였다. 균질화된 조직 샘플을 4℃에서 15분 동안 14,800rpm에서 원심분리하였다. 상층액을 취한 후 샘플을 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고 SDS-PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 수행한 후 겔을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Bio-Rad)으로 옮겼다. FABP4, FABP5 및 하우스키핑 유전자(β-actin)에 대한 항체를 PVDF 멤브레인에서 밤새 처리하였다. PVDF 막의 샘플에 대한 항체 결합은 화학발광(ECL, Millipore, USA)으로 가시화되었고 이는 ChemiDocTM XRS + 시스템(Bio-Rad)에 의해 검출하였다.
(13) 면역조직화학(IHC)에 의한 조직의 생체 외 분석
지방 조직을 수확하고 1 x PBS에서 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음 절편 전에 파라핀 블록에 포매하였다. 8um에서 절편한 후, 블록을 탈파라핀화하고 점차적으로 에탄올에 재수화하였다. 부고환 지방 조직에서 항-FABP4 및 항-FABP5 항체를 밤새 배양하였다. Alexa488-접합된 항-토끼 항체를 2시간 동안 배양하였다. Dako Fluorescence Mounting Medium(DAKO, 덴마크)을 사용하여 스테인드 슬라이드에 커버슬립을 장착하고 AxioScan.Z1(Zeiss, 독일)로 스캔하였다.
(14) 단백질 분리 및 ELISA(In vivo)
DIO 모델링 후 sh(FABP4/5)/PBP-9R을 S.C. 및 MN을 통해 복부 지방 패드에 주 3회 6주 동안 주입하였다. 처리된 마우스의 우심실에서 전혈 샘플을 수집하였다. 추출된 혈액 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 뚜껑을 열고 응고시켰다. 그런 다음 샘플을 4℃에서 20분 동안 1500g에서 원심분리하였다. 샘플을 0.1mM PMSF 프로테아제 억제제와 함께 급속 냉동고에 보관하였다. TNF-α, IL-6, IL-1β 및 MCP-1과 같은 염증성 사이토카인 단백질 발현 수준을 각각의 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
(15) 간 기능 검사(LFT) 및 간의 조직병리학
혈액 시료를 3000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리한 후, 혈청을 통해 Triglyceride Assay Kit, Free Fatty Acid Assay Kit(abcam)를 이용하여 TG 및 FFA의 함량을 측정하였다. 지질 대사의 영향을 확인하였다. 그런 다음 약물 관련 간 독성을 확인하기 위해 혈청 샘플을 사용하여 AST 및 ALT를 측정하였다. 처리된 마우스로부터 간 조직 샘플을 채취하여 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 파라핀 블록에 포매하였다. 각 블록을 H & E로 구분하고 염색하였다.
(16) 통계 분석
모든 체외 연구에서 최소 3개의 replicate를 사용하였다. 생체 내 연구에서 통계적 유의성을 달성하기 위해 그룹당 n=5를 사용하였다. Windows용 GraphPad Prism 버전 8.0(GraphPad 소프트웨어)을 통계 분석에 사용하였다. 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 두 그룹 간의 비교의 통계적 유의성을 계산했으며 0.05 미만의 P-값을 유의한 것으로 간주하였다. 다른 모든 실험은 하위 그룹 간의 다중 비교를 위해 Bonferroni의 보정 및 양면 테스트를 통한 양방향 분산 분석을 사용하여 분석하였다.
실험예 2: 산성 용액 내 시간별 안정도 측정을 위한 아가로스 겔 전기영동 및 복합체의 크기 측정
1ug의 sh(FABP4/5)를 1:3 무게비를 이용하여, PBP-9R과 복합체를 형성하였다 (상온에서 30분). 시간별(1,6,24,72시간) 안정도를 측정하기 위해 각 해당하는 시간만큼 HA(20%) 용액에서 incubation을 실시하였다. 0.5X TBE 완충용액의 0.8%(w/v) 아가로스 겔에서 100V 20분 동안 전기영동을 내려 복합체의 pH, 시간별 안정도를 확인하였다. sh(FABP4/5)유전자를 PBP-9R 복합체를 상온에서 30분 간 incubation하여 복합체를 형성하였다. 시간별(1,6,24,72시간) 안정도를 측정하기 위해 각 해당하는 시간만큼 HA(20%) 용액에서 incubation을 실시하였다. 그 후 3차 증류수로 전체 부피를 800 μl로 맞추고, Zeta sizer-ZS (Malvern) 기계를 통해 복합체의 크기를 측정하였다.
그 결과, 복합체는 낮은 pH에 민감하지 않고, 상온 72시간까지 안정함을 확인하였다 (도 1a, 1b 참조). 이는 복합체를 생체적합성 고분자와 같이 혼합하여 마이크로니들로 만들 수 있음을 의미하는 결과이다.
실험예 3: 혈청 내의 안정도 측정을 위한 아가로스 겔 전기영동
1ug의 sh(FABP4/5)와 1:3 무게비를 이용하여, PBP-9R과 복합체를 형성하였다 (상온에서 30분). sh(FABP4/5) 및 복합체를 각각 마우스 혈청에서 37℃에서 30분 동안 incubation 함. 0.5X TBE 완충용액의 0.8%(w/v) 아가로스 겔에서 100V 20분 동안 전기영동을 내려 유전자 단독과 복합체의 혈청 내 안정도를 비교하였다.
그 결과 복합체는 혈청 내에 48시간동안 안정함을 확인하였다 (도 2 참조). 이는 복합체의 피하 주사, 경피 제형으로 적용할 수 있음을 의미하는 결과이다.
실험예 4: 마이크로구조체 제작 후 안정도 확인을 위한 아가로스 겔 전기영동
sh(FABP4/5)와 1:3 무게비를 이용하여, PBP-9R과 복합체를 형성하였다 (상온에서 30분). 그후, 마이크로몰딩 기법으로 원심분리를 이용해 용해성 인터로킹 마이크로구조체 형성하였다. 그 후, sh(FABP4/5)를 아가로스 겔에 로딩하기 위해 부피를 맞추었다. 복합체 내 유전자가 안전하게 존재하는지 확인하기 위해 proteinase K를 이용하였다. 0.5X TBE 완충용액의 0.8%(w/v) 아가로스 겔에서 100V 20분 동안 전기영동을 내려 위치와 밴드 굵기를 통해 양을 확인하였다.
그 결과 복합체는 마이크로구조체를 제작하고 나서도 안정함을 확인하였다 (도 3 참조). 이는 마이크로구조체를 치료제로 사용할 수 있는 가능성이 있음을 의미하는 결과이다.
실험예 5: 마이크로구조체의 성상 확인
sh(FABP4/5)와 1:3 무게비를 이용하여, PBP-9R과 복합체를 형성하였다 (상온에서 30분). 그후, 마이크로몰딩 기법으로 원심분리를 이용해 용해성 인터로킹 마이크로구조체를 형성하고, 이를 광학현미경과 주사전자현미경을 이용해 성상을 확인하였다 (도 4 참조).
그 결과 마이크로구조체를 제작한 후 니들의 모양이 몰드 모양대로 잘 형성됨을 확인하였다. 이는 비율과 제작방식에 문제없음을 의미하는 결과이다.
실험예 6: 마이크로구조체의 물리적 특성 및 피부 투과 실험
sh(FABP4/5)와 1:3 무게비를 이용하여, PBP-9R과 복합체를 형성하였다 (상온에서 30분). 그후, 마이크로몰딩 기법으로 원심분리를 이용해 용해성 인터로킹 마이크로구조체를 형성하였다. 이를 적출한 비만 마우스 피부에 적용하여, 4% 파라포름알데히드에 고정시켜, H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 통해 현미경으로 촬영하였다.
그 결과, 실질적으로 뚫은 깊이는 400um 정도로, 진피층 일부분까지 투과하는 것을 확인하였다 (도 5a 참조). 이는 마이크로구조체가 마우스 피부의 진피까지 뚫어 약물을 전달할 수 있음을 의미하는 결과이다.
수치적으로 물리적 특성을 파악하기 위해 Zwick Roell Z0.5 Materials Testing Machien(ZwickRoell)을 통해 압축 강도를 측정하였다. 10mm/sec의 속도로 마이크로구조체의 팁을 눌러 변화되는 힘과 이동거리를 그래프로 나타내었다.
그 결과, 마이크로구조체의 강도는 히알루론산의 유무와 관계없이, 1.2N 정도에 해당하는 것을 확인하였다 (도 5b 참조). 이는 마이크로구조체가 피부를 뚫을 충분한 강도가 있음을 의미하는 결과이다.
피부를 관통하는 마이크로구조체는 SA-OP의 지속적인 방출과 체내 흡수를 가능하게 해야한다. 37°C의 제어된 조건에서 마이크로구조체가 얼마 만에 녹는지 측정하였다. 그 결과, 마이크로구조체는 1시간 후에 용해되는 것을 확인하였다 (도 5c 참조).
실험예 7: 경피 수분 손실 측정 및 생체 외 피부 흡수 실험
sh(FABP4/5)와 1:3 무게비를 이용하여, PBP-9R과 복합체를 형성하였다 (상온에서 30분). 그후, 마이크로몰딩 기법으로 원심분리를 이용해 용해성 인터로킹 마이크로구조체를 형성하였다. 이를 마우스 피부에 적용하여, 얼마만에 피부가 회복되는지를 측정하였다. 24시간 후면 피부가 회복되는 것을 확인하였다 (도 6a 참조). 또한 용해성 인터로킹 마이크로구조체를 돼지 피부에 적용하여, Franz diffusion cell 기기를 통해, 시간대별로 샘플링하여 유전자의 방출량을 측정하였다.
그 결과, 24시간동안 약물이 피부를 통해 50% 방출됨을 확인하였다 (도 6b 참조). 이는 마이크로니들의 실질적인 약물 투과율 확인으로, 약물의 적용시간을 정할 수 있는 결과이다.
실험예 8: 용액과 마이크로구조체에서 분화된 3T3-L1 adipocyte(분화된 지방세포)에 대한 PBP-9R 결합능력을 비교 분석
FITC 형광이 결합된 PBP-9R과 sh(FABP4/5)를 상온에서 30분 반응한 후, 마이크로 몰딩기법으로 마이크로구조체를 형성하였다. 마이크로구조체와 용액 각각 같은 복합체 양을 분화된 지방세포에 처리하여, FACS로 분석하였다. 또한 confocal microscopy를 통해 핵 안으로의 침투를 비교하였다.
그 결과, 시간대별로 용액과 마이크로구조체의 지방세포 결합능력 양상이 비슷함을 확인하였다 (도 7a, 7b 참조). 이는 히알루론산과 마이크로니들 제작 과정이 복합체의 지방세포 결합능력에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
실험예 9: FABP4, FABP5 mRNA, protein 측정 (분화된 지방세포 RNA 분리 및 Real-time PCR, protein 분리 및 western blot)
세포 배양 플레이트의 한 well당 8 x 104 개수의 마우스 유래 지방전구세포 (3T3-L1)를 6-well plate에 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 이용해 배양 후, 72시간동안 1uM의 dexamethasone과 0.5mM의 IBMX, 10ug/ml의 insulin을 처리해 분화시켰다. 그 후 10ug/ml insulin이 포함된 배양액으로 계속 지방방울 크기 키웠다. sh(FABP4/5)/PBP-9R 복합체를 6-well plate에 48시간 동안 처리하였다. 그 후 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 세포를 균일하게 깨준 뒤, RNA만을 분리하였다. 분리한 RNA는 iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)로 역전사효소 (Reverse transcriptase)와 반응시켜 그룹별 RNA 1 μg 각각에 대한 상보적인 cDNA를 합성하였다. 그 후 SYBR green(Bioline)을 이용하여 endogenous 대조군인 GAPDH에 대한 상대적인 FABP4, FABP5 mRNA 양을 Real-time PCR을 통해 측정하였다 (도 8a 참조). FABP4에 대한 Forward primer 와 Reverse primer는 각각 5'-TGAAATCACCGCAGACGACAGG-3' (서열번호 3) 과 5'-GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC-3' (서열번호 4)이고, FABP5에 대한 Forward primer 와 Reverse primer는 각각 5'-TGGTTTACCCAGGATCATTCC-3' (서열번호 5) 과 5'-CCTGAAGAATACCAGAGAGCTT-3' (서열번호 6)이다.
6-well plate에 있는 분화된 지방세포에 sh(FABP4/5)/PBP-9R 복합체를 48시간 동안 처리하였다. 그 후 RIPA buffer로 처리하여, 16,800rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리로 단백질 함유 상층액을 얻었다. 단백질 샘플을 Laemmli buffer와 10분 동안 반응 후, 10% SDS-PAGE 전기영동을 내린 후, Polyvinylidene fluoride membrane(Millipore)와 Trans-blot turbo transfer system(Bio-rad), anti-FABP4, FABP5 항체로 FABP4, FABP5 단백질 발현양을 측정하였다 (도 8b 참조).
그 결과, 용액과 마이크로구조체의 유전자 억제 효능이 비슷함을 확인하였다. 이는 히알루론산 유무와 마이크로구조체 제작 과정이 복합체의 유전자 억제 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
실험예 10: leptin, adiponectin mRNA 측정 (분화된 지방세포 RNA 분리 및 Real-time PCR)
세포 배양 플레이트의 한 well당 8 x 104 개수의 마우스 유래 지방전구세포 (3T3-L1)를 6-well plate에 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 이용해 배양 후, 72시간동안 1uM의 dexamethasone과 0.5mM의 IBMX, 10ug/ml의 insulin을 처리해 분화시켰다. 그 후 10ug/ml insulin이 포함된 배양액으로 계속 지방방울 크기 키웠다. sh(FABP4/5)/PBP-9R 복합체를 6-well plate에 48시간 동안 처리하였다. 그 후 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 세포를 균일하게 깨준 뒤, RNA만을 분리하였다. 분리한 RNA는 iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)로 역전사효소 (Reverse transcriptase)와 반응시켜 그룹별 RNA 1 μg 각각에 대한 상보적인 cDNA를 합성하였다.
그 후 SYBR green(Bioline)을 이용하여 endogenous 대조군인 GAPDH에 대한 상대적인 leptin, adiponectin mRNA 양을 Real-time PCR을 통해 측정하였다 (도 9 참조). leptin에 대한 Forward primer와 Reverse primer는 각각 5'-TGAGTTTGTCCAAGATGGACC-3'(서열번호 7) 과 5'-GCCATCCAGGCTCTCTGG-3' (서열번호 8)이고, adiponectin에 대한 Forward primer와 Reverse primer는 각각 5'-CAATGTACCCATTCGCTTTACT-3' (서열번호 9)과 5'-CATACACCTGGAGCCAGACT-3'(서열번호 10)이다.
그 결과, 용액과 마이크로구조체의 유전자 억제로 인한 효과가 비슷함을 확인하였다. 이는 히알루론산 유무와 마이크로구조체 제작 과정이 복합체의 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
실험예 11:
Ex vivo
biodistribution
6주령 C57BL/6 마우스를 60% 고지방 식이를 14주동안 먹여, 식이 유발 비만 모델을 만들었다. FITC 형광이 결합된 PBP-9R과 sh(FABP4/5)를 상온에서 30분 반응한 후, 마이크로 몰딩기법으로 마이크로 구조체 형성하였다. 용액은 피하 주사로 적용, 마이크로구조체도 복부에 적용하여, 시간대별(1시간, 4시간, 24시간, 48시간, 72시간) 해부하였다. 그 후, FOBI(CELLGENTEK)로 촬영하여, 형광 강도를 분석하였다 (도 10 참조).
SA-OP(SOL)는 풍부한 프로히비틴 단백질을 발현하는 내장 백색 지방 조직(vWAT)에서 접종 1시간 후 형광 강도가 높아지면서 전신 순환에 빠르게 진입했다. 최대 형광 강도는 vWAT에서 접종 4시간 후로 측정되었으며, SA-OP 신호는 이후 감소하고 궁극적으로 72시간 후에 사라졌다. 대조적으로 마이크로구조체에서 방출된 SA-OP는 마이크로구조체의 용해에 의한 지속 적인 방출로 인해 뚜렷한 생체분포 패턴을 나타냈다. SA-OP가 탑재된 마이크로구조체의 형광 강도는 vWAT에서 점차 증가하여 24시간에 최대값에 도달하였다. 또한 축적된 SA-OP는 vWAT에서 더 오래 지속되어 48시간에서 유의미한 값을 나타냈다.
그 결과, 용액과 마이크로구조체의 내장지방 표적 효과가 비슷함을 확인하였다. 이는 히알루론산 유무와 마이크로구조체 제작 과정이 복합체의 내장지방 표적 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
실험예 12: 몸무게 감소 및 인슐린 저항성, 글루코스 저항성 개선 확인
6주령 C57BL/6 마우스를 60% 고지방 식이를 14주동안 먹여, 식이 유발 비만 모델을 만들었다. PBP-9R과 sh(FABP4/5)를 상온에서 30분 반응한 후, 마이크로 몰딩기법으로 마이크로구조체를 형성하였다. 용액은 피하 주사로 적용, 마이크로구조체도 복부에 6주동안 적용하였다. 몸무게 매일매일 측정 후, 일주일 단위로 분석하였다 (도 11a 참조).
6시간 동안 금식하여 인슐린을 복부 적용 후, 0, 30, 60, 90, 120 분 간격으로 Accu-Chek Active model GC kit(RocheDiagnostics GmbH)를 이용하여 꼬리 정맥의 혈당을 측정하였다. 일주일 후, 6시간 동안 금식하여 글루코스를 복부 적용 후, 0, 15, 30, 60, 90, 120 분 간격으로 Accu-Chek Active model GC kit를 이용하여 꼬리 정맥의 혈당을 측정하였다 (도 11b 참조).
그 결과, 용액과 마이크로구조체의 몸무게 감소효과, 인슐린 저항성 및 글루코스 저항성 완화효과가 비슷함을 확인하였다. 이는 히알루론산 유무와 마이크로구조체 제작 과정이 복합체의 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
실험예 13:
Ex vivo
샘플링 후, 내장지방의 protein 분리 및 western blot, RNA 분리 및 Real-time PCR, 혈청 분리 및 ELISA
6주령 C57BL/6 마우스를 60% 고지방 식이를 14주동안 먹여, 식이 유발 비만 모델을 만들었다. PBP-9R과 sh(FABP4/5)를 상온에서 30분 반응한 후, 마이크로 몰딩기법으로 마이크로구조체를 형성하였다. 용액은 피하 주사로 적용, 마이크로구조체도 복부에 6주동안 적용하였다. 실험동물을 해부하여 내장지방과 혈청을 얻었다. 장기 조직 샘플은 물리적으로 분쇄한 뒤 Reporter lysis 5X buffer(Promega)와 0.1mM PMSF(Protease inhibitor)를 처리하였고, 16,800rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리로 단백질 함유 상층액을 얻었다. 단백질 샘플을 Laemmli buffer와 10분 동안 반응 후, 10% SDS-PAGE 전기영동을 내린 후, Polyvinylidene fluoride membrane(Millipore)와 Trans-blot turbo transfer system(Bio-rad), anti-FABP4, FABP5 항체로 FABP4, FABP5 단백질 발현양을 측정하였다. 또한 일부 장기 샘플을 RLT buffer(Qiagen)으로 균질하게 깬 뒤 RNA를 얻어 iScript cDNA synthesis kit로 cDNA를 합성하여, endogenous 대조군인 GAPDH에 대한 상대적인 FABP4, FABP5 mRNA 양을 Real-time PCR을 통해 측정하였다. FABP4에 대한 Forward primer 와 Reverse primer은 각각 5'-TGAAATCACCGCAGACGACAGG-3' (서열번호 3)과 5'-GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC-3' (서열번호 4)이고, FABP5에 대한 Forward primer 와 Reverse primer은 각각 5'-TGGTTTACCCAGGATCATTCC-3' (서열번호 5)과 5'-CCTGAAGAATACCAGAGAGCTT-3' (서열번호 6)이다 (도 12a 참조).
그 결과, 용액과 마이크로구조체의 내장지방에서 유전자 억제 효능이 비슷함을 확인하였다. 이는 히알루론산 유무와 마이크로구조체 제작 과정이 복합체의 유전자 억제 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
또한, 인슐린 저항성 관련 인자인 leptin, adiponectin mRNA 양도 Real-time PCR을 통해 측정하였다. Leptin에 대한 Forward primer와 Reverse primer는 각각 5'-TGAGTTTGTCCAAGATGGACC-3'(서열번호 7)과 5'-GCCATCCAGGCTCTCTGG-3'(서열번호 8)이고, adiponectin에 대한 Forward primer와 Reverse primer는 각각 5'-CAATGTACCCATTCGCTTTACT-3' (서열번호 9)과 5'-CATACACCTGGAGCCAGACT-3'(서열번호 10)이다.
그 결과, 용액과 마이크로구조체의 내장지방에서 유전자 억제로 인한 효과가 비슷함을 확인하였다 (도 12b 참조). 이는 히알루론산 유무와 마이크로구조체 제작 과정이 복합체의 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
마지막으로 채혈 후, 30분 동안 상온에서 incubation하여 blood clot을 형성하고, 1500g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여, 혈청을 분리하고 혈중 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 MCP-1을 ELISA로 분석하였다 (도 12c 참조).
그 결과, 동물에서 유전자 억제로 인한 염증성 인자 감소 효과가 용액과 마이크로구조체에서 비슷한 경향성을 보이는 것을 확인하였다. 이는 히알루론산 유무와 마이크로구조체 제작 과정이 복합체의 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
실험예 14: 혈청 분리 및 지방흡수 매커니즘 관련 인자 확인
치료를 마친 C57BL/6 마우스의 꼬리정맥에서 채혈 후, 30분 동안 상온에서 incubation하여 blood clot을 형성하고, 1500g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 혈청을 분리하고 혈중 TG(Triglyceride), FFA(Free Fatty Acid)을 Triglyceride Assay Kit, Free Fatty Acid Assay Kit로 측정하였다.
그 결과, 동물에서 유전자 억제로 인한 지방간 관련 인자 감소 효과가 용액과 마이크로구조체에서 비슷한 경향성을 보이는 것을 확인하였다 (도 13 참조). 이는 히알루론산 유무와 마이크로구조체 제작 과정이 복합체의 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
실험예 15:
Ex vivo
샘플링 후, 간에서의 지방방울 크기 확인
치료를 마친 C57BL/6 마우스의 간 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정시켜, H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 통해 현미경으로 촬영하였다.
그 결과, 동물에서 유전자 억제로 인한 지방간 억제 효과가 용액과 마이크로구조체에서 비슷한 경향성을 보이는 것을 확인하였다 (도 14 참조). 이는 히알루론산과 마이크로니들 제작 과정이 복합체의 효능에 영향을 미치지 않음을 의미하는 결과이다.
실험예 16: SA-OP 탑재된 마이크로구조체의 장기간 보관 기능
복합체를 개별적으로 분리하여 응집을 방지할 것으로 예상되는 생분해성 히알루론산(HA) 폴리머로 구성된 SA-OP 탑재 마이크로구조체의 보관 안정성을 확인하였다 (도 15a 참조). 구체적으로, SA-OP(SOL) 및 SA-OP(LMN)를 4℃에서 4주간 보관하여 여러 측면에서 안정성을 평가하였다.
보관 중인 LMN에서 SA-OP의 분포를 시각화하기 위해 shRNA를 Cy5.5 형광과 접합하고 PBP9R을 FITC와 접합하였다. SA-OP(SOL)의 응집현상은 보관 2주 후 관찰되었으며, 응집현상은 4주차에 더욱 두드러졌다 (도 15b 참조). 또한 마이크로구조체에 탑재된 SA-OP와 수용액에 저장된 SA-OP의 변형을 알아보기 위해 동적 광산란을 이용하여 재용해 후 마이크로구조체 내의 나노입자 크기를 측정하였다. SA-OP(SOL)로부터 응집된 나노입자의 백분율은 매개된 정전기적 상호작용으로서 크기-분포 그래프에서 관찰되었다 (도 15c 참조). 그러나 LMN의 SA-OP는 원래 물리적 특성을 유지하여 200-300nm에서 가장 높은 분포를 나타내었다 (도 15c 참조).
또한, 보관 4주 미만의 LMN에서 SA-OP의 분포를 형광이 결합된 SA-OP와 함께 공초점 레이저 현미경을 사용하여 분석하였다. 형광이 결합된 SA-OP는 LMN의 팁에서 베이스까지 고르게 분포되었으며 이 패턴은 시간이 지남에 따라 유지되었다 (도 15d, 15e 및 도 16 참조). SA-OP(LMN) 내부의 유전자 및 펩타이드의 형광 강도도 그래프에서 용해성 인터로킹 마이크로구조체의 모양을 나타내면서 CLSM 이미지의 Z 스택을 따라 고르게 분포되었다 (도 15e 참조). 또한, 4주 동안 유지된 유전자 및 펩타이드의 형광 강도의 통합 값은 SA-OP가 미세바늘의 HA 백본에 포획되어 이화학적 특성을 유지할 수 있음을 나타낸다 (도 15e 참조). 또한 장기간 보관된 LMN이 피부에 효율적으로 침투하여 SA-OP를 전달할 수 있음을 확인하기 위해 기계적 안정성 평가를 수행하였다 (도 15f 참조). 힘-변위 테스트는 4주 후에도 LMN에서 기계적 안정성의 손실이 없음을 입증하였다. 이러한 결과는 용해성 LMN이 변형 없이 유전 물질로 제작된 후 4°C에서 보관될 수 있음을 나타낸다.
이는 마이크로구조체의 HA 기반 백본이 SA-OP가 서로 상호 작용하는 것을 방지하고 마이크로구조체가 용해될 때까지 복합체를 안정화함을 나타낸다. 또한, 전반적으로 SA-OP가 탑재된 마이크로구조체의 장기 보관 기능은 장기간 캡슐화된 유전자/펩티드 복합체를 보존할 수 있는 가능성을 보여주므로 액체 형태의 보관에 비해 상당한 이점을 제공할 수 있다.
장기간 보관된 SA-OP(LMN)가 지방세포 표적 특성 및 유전자 전달 효능을 유지하는지 여부를 추가로 조사하기 위해 sh(FABP4/5)-Cy5.5 및 PBP9R-FITC를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 형광 결합 SA-OP를 여러 시점에서 4℃에 보관한 다음 성숙한 3T3-L1 지방세포에 밤새 처리하였다. SA-OP(SOL)의 경우, sh(FABP4/5)의 평균 형광 강도(MFI)가 보관 후 2주 및 4주에 각각 21.44% 및 64.72%로 크게 감소하였다 (도 17a 및 17b 참조). 반대로 SA-OP(LMN)는 4주 시점에서 SA-OP(SOL)보다 MFI 값이 39.33% 더 높은 유전자 전달 효능을 보였다.
또한, PBP9R-FITC의 MFI 값은 SA-OP(LMN)가 해당 SA-OP(SOL) 그룹에 비해 더 높은 전달체 전달을 표시함을 나타낸다 (도 17c 및 도 18 참조). 장기간 보관된 SA-OP의 유전자 전달 효능 이상의 치료 효과를 확인하기 위해 각 시료를 성숙 지방세포에 처리하고 48시간 후 RNA를 분리하였다. 합성된 cDNA의 qPCR 분석은 유전자 침묵 표적 (FABP4 및 FABP5)의 SA-OP(LMN)가 SA-OP(SOL)와 비교하여 4주에 각각 60.25% 및 42.89% 더 낮은 FABP4 및 42.89% mRNA 수준을 초래하는 것으로 나타났다 (도 17d 참조).
또한, 비만 지방세포 바이오마커인 렙틴은 SA-OP(LMN) 그룹에서 4주에 49.18% 감소한 반면 SA-OP(SOL) 그룹에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 17e 참조). 또한 항염증(ADIPOQ) 유전자의 mRNA 수준은 보관 4주 후에도 각각 91.04% 및 70.97% 증가하였다 (도 17e 참조).
결론적으로 용해성 인터로킹 마이크로구조체는 유전 물질과 전달체의 물리화학적 특성과 치료 효과를 보존함으로써 장기적인 안정성을 나타냄을 확인하였다.
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University)
<120> Microstructure comprising a gene and adipocyte-targeted gene delivery system complex for prevention and treatment of obesity and obesity-derived type 2 diabetes
<210> 1
<211> 6046
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> sh(FABP4/5) plasmid
<400>
cctgcaggcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc
cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat
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cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt
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atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac
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ctctgaggaa gccaggacag acaggcccag ccagcagctc aggtctctca atggagagtg
gaggtttgcc tggttccctg cccctgaagc tgtgcctgag tcttggctgg agtgtgacct
cccagaggct gacactgtgt aaccctaagc ttctagactt aattaa
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATS-9R
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Cys Lys Gly Gly Arg Ala Lys Asp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
Arg Cys
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<210> 5
<211> 21
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<220>
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<400> 5
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<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FABP5 Reverse primer
<400> 6
cctgaagaat accagagagc tt
<210> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leptin Forward primer
<400> 7
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leptin Reverse primer
<400> 8
gccatccagg ctctctgg
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<213> Artificial Sequence
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<223> adiponectin Forward primer
<400> 9
caatgtaccc attcgcttta ct
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adiponectin Reverse primer
<400> 10
catacacctg gagccagact
Claims (10)
- 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자 및 지방세포 표적 전달체를 포함하는 복합체를 포함하는 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자는 FABP4 (Fatty Acid-Binding Protein 4, aP2) 또는 FABP5 (Fatty Acid-Binding Protein 5)을 표적하는 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 지방세포 표적 전달체는 ATS-9R 펩타이드인 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체.
- 청구항 3에 있어서, 상기 ATS-9R 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체.
- 청구항 1에 있어서, 생체적합성 고분자를 더 포함하는 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체.
- 청구항 5에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산인 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로구조체는 피부 내에서 용해되는 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체.
- 청구항 1 내지 7 중 하나의 마이크로구조체를 포함하는, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 패치.
- 청구항 1에 있어서, 상기 패치는 베이스 플림과 복수 개의 마이크로 니들을 포함하는 것인, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 패치.
- (a) 비만 또는 비만유래 제2형 당뇨병 치료 유전자를 제조하는 단계;(b) 지방세포 표적 전달체를 제조하는 단계; 및(c) 상기 (a)의 유전자 및 (b)의 전달체를 포함하는 복합체를 포함하는 마이크로구조체를 제조하는 단계;를 포함하는, 비만 또는 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 마이크로구조체의 제조 방법.
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| KR20220081838 | 2022-07-04 | ||
| KR1020230086716A KR20240005606A (ko) | 2022-07-04 | 2023-07-04 | 유전자 및 지방세포 표적 유전자 전달체 복합체를 포함하는비만 및 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 마이크로구조체 |
| KR10-2023-0086716 | 2023-07-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024010344A1 true WO2024010344A1 (ko) | 2024-01-11 |
Family
ID=89453828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2023/009447 WO2024010344A1 (ko) | 2022-07-04 | 2023-07-04 | 유전자 및 지방세포 표적 유전자 전달체 복합체를 포함하는 비만 및 비만 유래 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 마이크로구조체 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2024010344A1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140051648A (ko) * | 2012-10-23 | 2014-05-02 | 연세대학교 산학협력단 | 히알루론산을 이용한 생분해성 마이크로니들 제조방법 |
| KR101447901B1 (ko) * | 2013-04-16 | 2014-10-16 | 한양대학교 산학협력단 | 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달체 |
| KR20180004918A (ko) * | 2016-07-05 | 2018-01-15 | 한양대학교 산학협력단 | 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달 복합체 |
| KR20190114295A (ko) * | 2018-03-29 | 2019-10-10 | 한양대학교 산학협력단 | 비만유래 2형 당뇨 예방 및 치료를 위한 내장지방 대식세포 표적 비바이러스성 유전자／전달체 복합체 |
-
2023
- 2023-07-04 WO PCT/KR2023/009447 patent/WO2024010344A1/ko unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140051648A (ko) * | 2012-10-23 | 2014-05-02 | 연세대학교 산학협력단 | 히알루론산을 이용한 생분해성 마이크로니들 제조방법 |
| KR101447901B1 (ko) * | 2013-04-16 | 2014-10-16 | 한양대학교 산학협력단 | 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달체 |
| KR20180004918A (ko) * | 2016-07-05 | 2018-01-15 | 한양대학교 산학협력단 | 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달 복합체 |
| KR20190114295A (ko) * | 2018-03-29 | 2019-10-10 | 한양대학교 산학협력단 | 비만유래 2형 당뇨 예방 및 치료를 위한 내장지방 대식세포 표적 비바이러스성 유전자／전달체 복합체 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHANG YUQI, YU JICHENG, WEN DI, CHEN GUOJUN, GU ZHEN: "The potential of a microneedle patch for reducing obesity", EXPERT OPINION ON DRUG DELIVERY, INFORMA HEALTHCARE, GB, vol. 15, no. 5, 4 May 2018 (2018-05-04), GB , pages 431 - 433, XP093126957, ISSN: 1742-5247, DOI: 10.1080/17425247.2018.1449831 * |
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