WO2018008903A1 - 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달복합체 - Google Patents

이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달복합체 Download PDF

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WO2018008903A1
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obesity
gene delivery
fabp4
delivery complex
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김용희
김형진
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한양대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an adipocyte-targeted nonviral gene transfer complex comprising a sh (FABP4 + FABP5) double plasmid vector and to treating obesity and obesity-derived metabolic syndrome using the same.
  • Gene therapy systems can be broadly classified into viral vector-mediated systems and non-viral vector-mediated systems.
  • Viral vectors made using retroviruses or adenoviruses have the advantage of high transfection efficiency into cells, but have problems with immunogenicity and genes in vivo . Inherent problems such as recombination.
  • various polymeric gene delivery systems have been proposed as alternatives to traditional viral vector-based gene delivery methods.
  • polymeric vectors have the problem of having intracellular trafficking barriers such as endosomal escape and nuclear localization. Therefore, viral vectors have problems such as immune response, self-replicating, and stability in the body, and general polymeric polymer vectors have poor biocompatibility, which results in high cell and biotoxicity and low nucleic acid delivery efficiency. It is known.
  • Gene delivery systems based on synthetic peptides can condense DNA by causing leakage in the endosomal membrane at low pH, and also promote endosomal escape, thereby overcoming the above problems associated with polymeric gene delivery systems. .
  • various synthetic peptides have been developed to promote gene transfer in different cell lines in vitro .
  • problems such as toxicity and serum instability in in vivo applications.
  • transfection transfection
  • studies using electroporation for transfection of adipocytes have been reported, transfection efficiency is only known to be about 10%.
  • the method in an in vivo gene delivery system has not been attempted for adipose tissue selective target delivery.
  • adipocyte targeting sequence ATS
  • specific peptide sequences can be efficiently delivered to adipocytes by binding to prohibitin expressed in mature adipocytes.
  • ATS adipocyte targeting sequence
  • a non-viral adipocyte target gene delivery system has been developed and reported (Korea Patent Publication No. 10-1447901).
  • this document describes a gene transfer complex in which a FABP4 gene encoding a fatty acid binding protein (FABP) is bound to a complex of an ATS sequence and an R9 sequence in the form of shRNA.
  • the present invention is to solve the problems of the prior art, by using a gene delivery target for fat cells to deliver the gene for the treatment of obesity and obesity-derived metabolic syndrome, in treating obesity-related diseases, excellent obesity treatment effect without cytotoxicity
  • a gene delivery target for fat cells to deliver the gene for the treatment of obesity and obesity-derived metabolic syndrome, in treating obesity-related diseases, excellent obesity treatment effect without cytotoxicity
  • an adipocyte-targeted nonviral gene delivery complex comprising a double plasmid vector capable of exerting.
  • Adipocyte target sequence R9 (arginine) peptides
  • a gene delivery complex comprising a double plasmid vector comprising obesity and obesity derived metabolic syndrome therapeutic genes
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene provides a gene transfer complex, characterized in that the base sequence for inhibiting the expression of the FABP4 gene and gene of FABP5.
  • the base sequence may be DNA or RNAi.
  • the RNAi may be siRNA or shRNA.
  • the double plasmid vector may have a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the weight ratio of the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene: the adipocyte target sequence and the R9 peptide may be 1: 1 to 1: 4.
  • the weight ratio of the obesity and obesity-derived metabolic syndrome therapeutic gene: the adipocyte target sequence and the R9 peptide may be 1: 2.
  • the adipocyte target sequence may be an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the R9 (arginine) peptide may have a structure of Cys- (D-R) 9-Cys.
  • the adipocytes may be differentiated mature obese adipocytes.
  • a dual plasmid vector capable of simultaneously inhibiting the FABP4 gene and FABP5 gene was prepared for the treatment of obesity-related diseases, and by binding to a specific carrier that specifically delivers adipocytes, a gene delivery complex was provided.
  • a gene delivery complex was provided.
  • Figure 1a is a graph showing the results of gel inhibition analysis according to the weight ratio of sh (FABP4 + FABP5) plasmid and ATS-9R.
  • Figure 1b is a diagram showing the size of the complex according to the weight ratio of the sh (FABP4 + FABP5) plasmid and ATS-9R.
  • Figure 2a is a graph showing the results measured by RT-PCR FABP4 mRNA level relative to GAPDH.
  • Figure 2b is a graph showing the results measured by RT-PCR FABP5 mRNA level relative to GAPDH.
  • Figure 3a is a graph showing the weight observed over time in each dose group administered shFABP4 / ATS9R, shFABP5 / ATS9R, shFABP4 / ATS9R + shFABP5 / ATS9R and sh (FABP4 / FABP5) / ATS9R.
  • Figure 3b is a graph showing the change in blood glucose over time in each administration group administered shFABP4 / ATS9R, shFABP5 / ATS9R, shFABP4 / ATS9R + shFABP5 / ATS9R and sh (FABP4 / FABP5) / ATS9R.
  • Figure 3c shows the toxicity and inflammatory response through Western blot by extracting the adipose tissue of each administration group administered shFABP4 / ATS9R, shFABP5 / ATS9R, shFABP4 / ATS9R + shFABP5 / ATS9R and sh (FABP4 / FABP5) / ATS9R
  • Figure is a diagram.
  • Figure 3d shows the results of confirming the percentage of FABP4 and FABP5 gene expression in the adipose tissue of each dose group administered shFABP4 / ATS9R, shFABP5 / ATS9R, shFABP4 / ATS9R + shFABP5 / ATS9R and sh (FABP4 / FABP5) / ATS9R It is a graph.
  • Gene means any nucleic acid sequence or portion thereof that has a functional role in protein coding or transcription or in the regulation of other gene expression.
  • the gene may consist of any nucleic acid encoding a functional protein or only a portion of a nucleic acid encoding or expressing a protein.
  • Nucleic acid sequences may include gene abnormalities in exons, introns, initiation or termination regions, promoter sequences, other regulatory sequences, or unique sequences adjacent to genes.
  • nucleotide or “nucleic acid” refers to nucleotide polymers of all lengths, including ribonucleotides as well as deoxyribonucleotides. This term refers only to the primary structure of a molecule and therefore to double or single chain DNA or RNA.
  • a label, methylation, "caps” known in the art one or more naturally occurring nucleotide substitutions, debonding (eg methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate) Including attachments (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-Llysine, etc.), inserts (eg, Having a chelate (e.g., a metal element, a radioactive metal element, boron, a metal oxide element, etc.), an alkyl compound, a modified bond (e.g., alpha anomeric nucleic acid, etc.) Having, also refers to internucleotide modifications, including unmodified polynucleotides.
  • debonding eg methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate
  • attachments eg, phospho
  • nucleic acid moieties provided by the present invention are regulatory elements derived from fragments of the genome and short oligonucleotide binders or a series of oligonucleotides, microorganisms or viral operons or eukaryotic genes. Will be aggregated into unique nucleotides that provide a synthetic nucleic acid that can be expressed in a recombinant transcriptional unit comprising a.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of carrying another nucleic acid to which it is associated.
  • expression vector includes plasmids, cosmids or phages capable of synthesizing the protein encoded by each recombinant gene carried by the vector. Preferred vectors are those capable of self replication and expression of the associated nucleic acid.
  • Transfection refers to a method of expressing genotype in a cell by introducing nucleic acid (DNA, PNA, etc.) directly into the culture animal cell.
  • nucleic acid DNA, PNA, etc.
  • the cell wall is often removed and introduced into the protoplast. It is common to introduce the introduced nucleic acid by introducing the target gene into a medium such as a plasmid.
  • the introduced gene is stabilized in the cell, it is often inserted into the chromosome.
  • a cell into which a nucleic acid has been introduced is called a transfectant. Since the transfection efficiency is very low, various methods have been developed to increase the efficiency. Among them, calcium phosphate coprecipitation and DEAE-textlan treatment. Electroporation, redistribution (fusion of liposomes with cells that make DNA complexes).
  • amino acid and amino acid residue refer to natural amino acids, unnatural amino acids, and modified amino acids. Unless stated otherwise, all references to amino acids include references to both D and L stereoisomers (where the structure allows such stereoisomeric forms), either generically or by name.
  • Natural amino acids include alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) and Valine (Val) is included.
  • Non-natural amino acids include modified amino acid residues that are chemically modified on the N-terminal amino group or side chain group, or that are reversibly or irreversibly chemically blocked, such as N-methylated D and L amino acids or side chain functional groups as another functional group. Chemically modified residues are included.
  • a “carrier or carrier” is a generic term for a polymeric material that is responsible for the transport of a carrier when an active substance in an organism is present in combination with another substance or when the substance is transported through a cell membrane.
  • carriers include, but are not limited to, buffers such as phosphate, citrate and other organic acids, antioxidants such as ascorbic acid, low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues), proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins, polyvinylpyrrolidone Hydrophilic polymers such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine, amino acids such as monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins, chelating agents such as EDTA, sugar alcohols such as mannitol or sorbitol, sodium Salt-forming counterions, and / or nonionic surfactants such as TWEEN, polyethylene glycol (PEG) and PLURONICS®
  • Treatment is an approach for obtaining beneficial or desired results, including clinical results.
  • Treatment or “mitigation” of a disease, disorder or condition is a progression of progression with less and / or lesser extent of the condition, disorder or disease state and / or undesirable clinical signs compared to not treating the disorder. Means slowing down or getting longer.
  • weight loss for example at least 5% weight loss, is an example of desirable treatment outcomes.
  • beneficial or desirable clinical outcomes include reducing or ameliorating one or more symptoms, reducing the extent of the disease, or stabilizing (ie, not worsening) the condition.
  • Treatment may also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment.
  • treatment does not need to occur by administration of a single dose and often occurs upon administration of a series of doses.
  • a therapeutically effective amount, an amount sufficient to alleviate, or an amount sufficient to treat a disease, disorder or condition may be administered in one or more administrations.
  • disorder is any condition that would benefit from treatment with molecules identified using the transgenic animal model of the present invention. This includes chronic and acute diseases or conditions, including pathological conditions that make mammals susceptible to mysterious diseases. Examples of diseases to be addressed herein include, but are not limited to, obesity, metabolic syndrome symptoms, and the like.
  • a “therapeutically effective amount” means an active compound in a composition that will elicit a biological or medical response in a tissue, system, subject or human being sought by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, which includes alleviating the symptoms of the disorder to be treated. Means the amount.
  • a “prophylactically effective amount” is pursued by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician to prevent the development of obesity or obesity-related disorders, conditions or diseases in a subject at risk of obesity or obesity-related disorders, conditions or diseases, The amount of active compound in a composition that will elicit a biological or medical response in a tissue, system, subject or human.
  • Gene therapy refers to treating a genetic disease by correcting a mutated gene or treating a disease by controlling protein expression using a gene or RNAi. That is, a method of treating a disease by transplanting a normal gene to a patient's cell from outside and changing the phenotype of the cell. Gene therapy requires the study of gene vectors and systems that introduce genes into the body.
  • “About” means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for reference quantities, levels, values, numbers, frequencies, percentages, dimensions, sizes, quantities, weights, or lengths. , Amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by about 3, 2 or 1%.
  • the present invention seeks to improve the unsatisfactory therapeutic effect of conventional therapeutic agents for obesity-related diseases, and in particular, adipocytes comprising the ATS sequence, R9 sequence and shFABP4 gene as reported by the present inventors. An attempt was made to improve the problem of the target gene delivery system.
  • the expression of FABP4 gene in target adipocytes is reduced, thereby reducing the amount of FABP4 protein in the cells.
  • the reduction in FABP4 protein which plays a key role in the import and storage of fatty acids into adipocytes, can be expected to achieve obesity treatment effects, but in practice, satisfactory levels of obesity treatment effects are not achieved.
  • the expression of FABP5 gene which plays a key role in inducing obesity in addition to FABP4, is increased as a compensation mechanism for the reduction of the expression level of FABP4 gene. It was found that it is essential to simultaneously reduce the amount of gene expression.
  • the existing gene delivery system is a gene delivery system that delivers only one gene, in order to suppress two genes at the same time, it is a principle that a double gene delivery system is required for each gene.
  • the present invention intends to use a dual plasmid vector to solve this problem. That is, in the present invention, when two genes to be suppressed are inserted into one plasmid and the plasmid is delivered to a target cell, the inhibition of the two genes can be simultaneously achieved.
  • Adipocyte target sequence R9 (arginine) peptides
  • a gene delivery complex comprising a double plasmid vector comprising obesity and obesity derived metabolic syndrome therapeutic genes
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene provides a gene transfer complex, characterized in that the base sequence for inhibiting the expression of the FABP4 gene and gene of FABP5.
  • the adipocyte targeting sequence (ATS) and the R9 (arginine) peptide play a role of specifically delivering a therapeutic gene to adipocytes.
  • the gene delivery complex according to the present invention is a non-viral gene delivery complex comprising ATS and poly (oligo-arginine), particularly R9 (arginine) peptide, wherein the ATS-R9 sequence is a prohibitin in adipocytes. ) Allows specific delivery of therapeutic genes to adipocytes.
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome therapeutic gene delivered by the complex of the present invention can insert any gene that is desired to be expressed in a target fat cell, and includes DNA and RNA and synthetic homologs thereof.
  • genes encoding polypeptides enzymes, hormones, growth factors, cytokines, receptors, structural proteins, etc.
  • antisense RNA ribozymes, decoy, RNA causing RNA interference, and the like are exemplified.
  • gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, anti-gomere and the like can be mentioned.
  • oligonucleotides may be present or synthesized in nature and may exist in various sizes, from oligonucleotides to chromosomes, in size. These genes come from humans, animals, plants, bacteria, viruses and the like. These can be obtained using methods known in the art.
  • Polypeptides encoded by the gene may include various hormones, tissue-adhesive antigens, cell adhesion proteins, cytokines, various antibodies, cell receptors, intracellular or extracellular enzymes and fragments thereof.
  • tissue-adhesive antigens such as IL-4, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, etc.
  • cytokines various antibodies, cell receptors, intracellular or extracellular enzymes and fragments thereof.
  • obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene expression regulators such as transcriptional promoters, enhancers, silencers, operators, terminators, attenuators and other expression regulators and the like can be included.
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene preferably comprises a gene encoding a polypeptide associated with the treatment or diagnosis of obesity and obesity-derived metabolic syndrome.
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene is preferably RNA interference (RNAi) having a gene therapy effect on obesity diseases.
  • RNA interference is a natural mechanism that involves specifically down-regulating the expression of a gene of interest by double helix short interfering RNA (siRNA).
  • siRNA siRNA or miRNA (microRNA) or small hairpin RNA (shRNA).
  • shRNA sh (FABP4 + FABP5) capable of simultaneously inhibiting the expression of the FABP4 gene and the FABP5 gene may be used. Effective dosages and schedules for the administration of RNAi can be determined empirically and can be readily determined by one skilled in the art. Single or multiple doses may be used.
  • the weight ratio of the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene and the remaining components constituting the gene delivery complex according to the present invention may also affect the efficiency of obesity treatment.
  • Bar weight ratio of the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene: the adipocyte target sequence and the R9 peptide may be 1: 1 to 1: 4, more preferably 1: 2.
  • the gene delivery complex according to the present invention includes ATS and R9 (arginine) peptides, which is a structure in which R9 (arginine) binds to an adipocyte target sequence (ATS) (ATS-R9).
  • Adipocyte targeting sequence (ATS) may be a known ATS sequence, but may be composed of an amino acid sequence represented by [Nature medicine, 2004 June], preferably SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. .
  • SEQ ID NO: 2 CKGGRAKDC
  • the ATS-R9 binds to prohibitin in adipocytes, and prohibitin supports adipocytes. It is an overexpressed receptor in endothelial cells of blood vessels, and is an ATS receptor present in both mature adipocytes and progenitor adipocytes. Prohibitin plays a particularly important role in obesity, which is highly expressed in blood vessels of adipose tissue and is distributed to the plasma membrane in the nucleus and mitochondria compared to before differentiation in differentiated adipocytes. Suggests a potential biomarker for this.
  • the prohibitin is less distributed in the plasma membrane in the progenitor cells and relatively higher in the nucleus and mitochondria, but in the differentiated adipocytes, the prohibitin, which is located in the nucleus and the mitochondria, moves to the plasma membrane and is higher. Expressed. That is, prohibitin is overexpressed as the differentiation progresses.
  • the ATS-R9 of the present invention is placed into adipocytes via a prohibitin-mediated mechanism. That is, ATS plays an important role in adipocyte targeting, and the degree of target gene expression depends on the level of prohibitin expression in adipocytes.
  • ATS-R9 of the present invention has a function of directly targeting differentiated mature obese adipocytes.
  • the targeting ability to mature mast fat cells 9 to 11 days of differentiation start is the best, and in the present invention "mature fat cells” and “obesity fat cells” are used interchangeably in terms having the same meaning.
  • the R9 (arginine) peptide may have a structure of Cys- (DR) 9-Cys, such ATS-R9 complex is i) prohibits inherent in adipocytes Interaction with chitin shows good transfection and gene expression efficiency; ii) improve the transgene expression efficiency of the delivered gene; iii) having a positive zeta potential value while binding to DNA to form a nanoscale complex, which facilitates passage through the cell membrane; iv) has very low cytotoxicity.
  • psiRNA-DUO InvivoGen, USA
  • DNA was precipitated by spinning the tube containing the frozen plasmid, and the obtained DNA was resuspended in 20 ⁇ l of sterile water to obtain 1 ⁇ g / ⁇ l of plasmid solution, and the resuspended plasmid was stored at -20 ° C. It was. Plasmid amplification was performed by transforming the resuspended E. coli to increase yield.
  • the psiRNA-DUO plasmid was then treated with the restriction enzyme Bbs I (NEB, 2 units enzyme / ⁇ g plasmid DNA), eluting large fragments (3180 bp) using a 0.7% low melting agarose gel and then purified DNA fragments were diluted to give a 0.1 ⁇ g / ⁇ l solution (Gus cassette).
  • Bbs I restriction enzyme / ⁇ g plasmid DNA
  • psiRNA-DUO plasmids were treated with Acc 65I and Hind III (with NEB enzyme, NEBuffer 2 + BSA), and large fragments (3150 bp) were eluted using 0.7% low melting agarose gel and then purified DNA fragments were diluted to give a 0.1 ⁇ g / ⁇ l solution (LacZ cassette).
  • psiRNA-DUO was simultaneously treated with Acc65 I, Hind III and Bbs I, and two psiRNA-DUO fragments (Hind III / Bbs I and Bbs I / Acc65 I).
  • a two step procedure of ligation with two shRNA inserts or a first step of cloning the first shRNA insert and then a second step of cloning the remaining shRNA insert.
  • Detailed cloning procedures can be found in the psiRNA-DUO instruction manual from InvivoGen (Catalog # ksirna4-gz3).
  • a gel retardation assay was used to optimize the ratio of the sh (FABP4 + FABP5) plasmid to ATS-9R, and 1 ⁇ g of DNA, deionized water and ATS-9R at various weight ratios were used for 30 minutes.
  • Oligo-peptoplexes were prepared by incubating at room temperature. The average diameter and surface zeta potential of the oligo-peptoplexes were measured using Zetasizer-Nano ZS (Malven Instruments, UK) DLS.
  • FIGs 1a and 1b shows the results of gel inhibition assay and the size of the complex according to the weight ratio of the sh (FABP4 + FABP5) plasmid and ATS-9R, Referring to Figure 1b, sh (FABP4 + FABP5) plasmid: of ATS-9R It can be seen that the optimum size is derived when the weight ratio is 1: 2.
  • Example 3 The gene delivery complex according to the present invention Transfected FABP4 and fat cells FABP5 Expression level confirmation
  • Figures 2a and 2b shows the measurement results, and referring to Figures 2a and 2b, when in vitro experiments in the treatment of real double cells plasmid sh (FABP4 / FABP5) + ATS9R in the mature adipocytes of FABP4, FABP5 It can be seen that the amount of mRNA decreases. In addition, when the FABP4 was reduced (shFABP4 + ATS9R) group was confirmed that the amount of FABP5 mRNA increases, it can be seen that the simultaneous inhibition of FABP4 and FABP5 in order to achieve the optimal anti-obesity treatment effect.
  • C57BL6 / 6N mice were fed a 60 kcal high-fat diet and bred for 2 to 3 months, then only mice weighing more than 45 g were screened twice a week using IP injection methods shFABP4 / ATS9R, shFABP5 / ATS9R, shFABP4 / ATS9R + shFABP5 / ATS9R and the gene delivery complex sh (FABP4 / FABP5) / ATS9R according to the invention were administered.
  • Figure 3a shows a graph of the weight of each group administered over time, referring to Figure 3a, the weight loss effect was not great in the other groups, but in the case of the group administered the gene delivery complex according to the present invention after 8 weeks About 20% weight loss was found.
  • Figure 3b is a graph showing the change in blood glucose with time for each administration group, referring to Figure 3b it can be seen that in the group administered with the gene delivery complex according to the present invention showed a significant blood glucose reduction effect.
  • Figure 3d shows the results of each gene expression rate (%), referring to Figure 3d, it was found that significantly decreased the expression rate of FABP4 and FABP5 gene in the group treated with sh (FABP4 / FABP5) + ATS9R compared to other groups. Can be.
  • the gene delivery complex according to the present invention is configured to deliver FABP4 and FABP5 genes, which are specific to obesity-related therapeutic genes, to the adipocytes, and at the same time, suppression of these genes is achieved to achieve excellent obesity treatment effect without cytotoxicity. As such, it is expected to be useful in gene therapy techniques for treating obesity and obesity-derived metabolic syndrome.
  • Adipocyte targeting non-viral gene delivery composite comprising dual plasmid vector

Abstract

본 발명은 sh(FABP4 + FABP5) 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달 복합체 및 이를 이용한 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 지방세포 표적 서열; R9 (아르기닌) 펩타이드; 및 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자를 포함하는 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 전달 복합체로서, 상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자는 FABP4 유전자 및 FABP5의 유전자의 발현을 억제하는 염기 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 비만 관련 질환의 치료를 위해서 FABP4 유전자 및 FABP5 유전자를 동시에 억제할 수 있는 이중 플라스미드 벡터를 제작하였으며, 이를 지방세포에 특이적으로 전달하는 소정 전달체에 결합시켜 유전자 전달 복합체를 제공함으로써, 지방세포만을 대상으로 세포 독성 없이 우수한 비만 치료 효과를 달성할 수 있다.

Description

이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달복합체
본 발명은 sh(FABP4 + FABP5) 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달 복합체 및 이를 이용한 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료에 관한 것이다.
통상적인 단백질 치료의 대안으로서 다양한 유전자 치료 기법이 개발되어 왔으나 해결해야 하는 여러 문제점들이 존재하는 바, 그 중 하나는 최소 세포독성을 가지고 원형질막 (동물세포) 및 핵막을 통한 효율적인 유전자 유입 (influx)을 달성해야 한다는 점이다.
유전자 치료 시스템은 크게 바이러스성 벡터-매개 시스템 및 비바이러스성 벡터-매개 시스템으로 분류될 수 있다. 레트로바이러스 (retrovirus) 또는 아데노바이러스 (adenovirus) 등을 이용하여 만든 바이러스성 벡터는 세포 내로의 높은 형질 주입 (트랜스펙션, transfection) 효율을 갖는다는 장점이 있으나, in vivo에서 면역원성의 문제 및 유전자 재조합과 같은 내재적 문제점 등을 갖는다. 이러한 바이러스성 벡터의 안정성 문제를 극복하기 위하여, 다양한 중합체성 유전자 전달 시스템이 전통적인 바이러스성 벡터-기재 유전자 전달 방법에 대한 대안으로서 제안되었다. 그러나, 중합체성 벡터는 엔도좀 탈출 (endosomal escape) 및 핵 편재화 (nuclear localization)와 같은 세포내 트래피킹 (trafficking) 장벽을 갖는다는 문제점이 있다. 따라서, 바이러스성 벡터의 경우 면역반응, 자가복제, 체내 안정성과 같은 문제점을 갖고, 일반적인 중합체성 고분자 벡터의 경우 생체 적합성이 떨어지고 이로 인하여 세포 및 생체 독성이 크고 핵산 전달 효율이 낮다는 문제점을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 합성 펩타이드에 기초한 유전자 전달 시스템은, 낮은 pH에서 엔도좀 막 내에서의 누출을 야기시킴으로써 DNA를 응축시키고, 또한 엔도좀 탈출을 촉진하므로 중합체성 유전자 전달 시스템과 관련된 상기 문제점들을 극복할 수 있다. 이러한 이유로, 다양한 합성 펩타이드가 in vitro에서 여러 세포주에서의 유전자 전달을 촉진하는 것으로 개발되어 왔다. 그러나, 이 역시 in vivo 적용에 있어서 독성 및 혈청 불안정성 등의 문제점이 존재한다.
이와 관련하여 짧은 양이온성 펩타이드를 이용한 벡터에 대한 연구가 진행되고 있으나, 이 경우 세포외 공간에서 DNA가 불안정하다는 문제점이 있으며, 또한 DNA와의 복합체의 안정성 및 유전자 발현의 수준 등이 불충분하다는 문제점이 존재한다. 더 나아가, 특정 세포로의 타겟팅 능력을 보유하여 DNA의 표적 세포 내로의 유입 및 복합체로부터의 DNA의 유리를 원활히 하여 목적 유전자 발현의 수준을 높일 수 있는, 특정 세포 특이적인 유전자 전달 벡터의 개발이 필요하다.
한편, 표적 세포가 지방세포, 특히 성숙된 비만 지방세포인 경우에는, 이러한 세포가 최종적으로 분화된 세포이므로 형질주입 (트랜스펙션)이 매우 어렵다는 문제점이 존재한다. 지방세포에 대한 형질주입을 위해서 전기천공법을 사용한 연구도 보고된 바 있으나, 트랜스펙션 효율은 겨우 약 10% 정도로 알려져 있다. 게다가, in vivo 유전자 전달 시스템에서의 상기 방법은 지방 조직 선택적 표적 전달이 시도된 바 없다.
관련해서, 본 발명자들은 지방세포 표적 서열 (adipocyte targeting sequence, ATS) 및 특정 펩타이드 서열의 복합체가 성숙 지방 세포 내에서 발현되어 있는 프로히비틴과 결합함으로써, 효과적으로 지방세포로 유전자를 전달할 수 있다는 점에 기초하여, 비바이러스성 지방세포 표적 유전자 전달 시스템을 개발하여 보고한 바 있다 (대한민국 등록특허공보 제10-1447901호). 예를 들어, 상기 문헌에서는, ATS 서열 및 R9 서열의 복합체에 지방산 결합 단백질 (fatty acid binding protein, FABP)을 암호화하는 FABP4 유전자를 shRNA의 형태로 결합시킨 유전자 전달 복합체를 서술하고 있다.
관련하여, 현재까지 9종의 FABP 유전자들이 보고된 바 있으며, 그 중에서도 FABP4는 지방세포 내에서 지방산의 반입 및 저장에 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 전술한 특허문헌 1에서도 shFABP4 유전자를 포함하는 유전자 전달 복합체를 제조한 다음, 지방세포 내에서 FABP4의 발현을 억제함으로써 비만 치료 효과를 달성하고자 하였으나, 충분한 체중 감소 효과를 관찰할 수 없었다. 따라서, 비바이러스성 지방세포 표적 유전자 전달 시스템을 사용하여 효율적인 비만 치료 효과를 달성할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자, 지방 세포를 표적으로 하는 유전자 전달체를 사용하여 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료용 유전자를 전달함으로써 비만 관련 질환을 치료함에 있어서, 세포 독성 없이 우수한 비만 치료 효과를 발휘할 수 있는 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달 복합체를 제공하고자 한다.
본 발명의 상기 과제를 해결하기 위해서,
지방세포 표적 서열; R9 (아르기닌) 펩타이드; 및
비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자를 포함하는 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 전달 복합체로서,
상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자는 FABP4 유전자 및 FABP5의 유전자의 발현을 억제하는 염기 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 염기 서열은 DNA 또는 RNAi일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 상기 RNAi는 siRNA 또는 shRNA일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 이중 플라스미드 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자 : 상기 지방세포 표적 서열 및 상기 R9 펩타이드의 중량비는 1:1 내지 1:4일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자 : 상기 지방세포 표적 서열 및 상기 R9 펩타이드의 중량비는 1:2일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 지방세포 표적 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 R9 (아르기닌) 펩타이드는 Cys-(D-R)9-Cys의 구조를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 지방세포는 분화된 성숙 비만 지방세포일 수 있다.
본 발명에 따르면, 비만 관련 질환의 치료를 위해서 FABP4 유전자 및 FABP5 유전자를 동시에 억제할 수 있는 이중 플라스미드 벡터를 제작하였으며, 이를 지방세포에 특이적으로 전달하는 소정 전달체에 결합시켜 유전자 전달 복합체를 제공함으로써, 지방세포만을 대상으로 세포 독성 없이 우수한 비만 치료 효과를 달성할 수 있다.
도 1a는 sh(FABP4 + FABP5) 플라스미드와 ATS-9R의 중량비에 따른 겔 저지 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 1b는 sh(FABP4 + FABP5) 플라스미드와 ATS-9R의 중량비에 따른 복합체의 크기를 도시한 도면이다.
도 2a는 GAPDH에 대한 상대적인 FABP4 mRNA 수준을 RT-PCR을 통해서 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 2b는 GAPDH에 대한 상대적인 FABP5 mRNA 수준을 RT-PCR을 통해서 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3a는 shFABP4/ATS9R, shFABP5/ATS9R, shFABP4/ATS9R + shFABP5/ATS9R 및 sh(FABP4/FABP5)/ATS9R를 투여한 각 투여군에서 시간에 따른 몸무게를 관찰한 그래프를 도시한 그래프이다.
도 3b는 shFABP4/ATS9R, shFABP5/ATS9R, shFABP4/ATS9R + shFABP5/ATS9R 및 sh(FABP4/FABP5)/ATS9R를 투여한 각 투여군에서 시간에 따른 혈당 변화를 관찰한 그래프를 도시한 그래프이다.
도 3c는 shFABP4/ATS9R, shFABP5/ATS9R, shFABP4/ATS9R + shFABP5/ATS9R 및 sh(FABP4/FABP5)/ATS9R를 투여한 각 투여군의 지방 조직을 적출하여 독성 및 염증반응을 웨스턴블랏을 통해서 검사한 결과를 도시한 도면이다.
도 3d는 shFABP4/ATS9R, shFABP5/ATS9R, shFABP4/ATS9R + shFABP5/ATS9R 및 sh(FABP4/FABP5)/ATS9R를 투여한 각 투여군의 지방 조직에서 FABP4 및 FABP5 유전자 발현율(%)을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 하기와 같다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)" 또는 "핵산 (nucleic acid)"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차적 구조만을 의미하고, 따라서 이중 또는 단일 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이것은 또한 변형의 알려진 유형, 예를 들어 당해 분야에서 알려진 표지 (label), 메틸화, "caps", 유사체의 하나 혹은 그 이상의 자연 발생의 뉴클레오티드 치환, 탈결합 (예: methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate 등)과 결합 (예: phosphorothioate, phosphorodithioate 등), 단백질 (예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드(signal peptide), poly-Llysine 등) 등의 부속물을 포함하는 것, 삽입물 (예: 아크리딘, Psolalen 등)을 가지는 것, 킬레이트 (예: 금속원소, 방사성 금속원소, 붕소, 산화 금속원소 등)를 가지는 것, 알킬 화합물을 가지는 것, 변형된 결합 (예: alpha anomeric 핵산 등)을 가지는 것, 또한 폴리뉴클레오티드의 비변형을 포함한 뉴클레오티드간 변형을 의미한다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 부분은 게놈 (genome)의 파편과 짧은 올리고뉴클레오티드 결합자 또는 일련의 올리고뉴클레오티드, 미생물 또는 바이러스 오페론 (operon)이나 진핵세포 유전자로부터 유도된 조절인자 (regulatory element)를 포함하는 재조합 전사 단위로 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공하는 특유의 뉴클레오티드들로 뭉쳐질 것이다.
"벡터 (vector)"라는 용어는 다른 핵산을 그것이 연관된 곳으로 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. "발현 벡터 (expression vector)"라는 용어는 벡터에 의해 운반된 각각의 재조합 유전자에 의해 암호화된 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드 (cosmid) 또는 파지 (phage)를 포함한다. 바람직한 벡터는 연관된 핵산의 자가복제와 발현이 가능한 것이다.
"트랜스펙션 (transfection)"은 배양동물 세포에 핵산 (DNA, PNA 등)을 직접 도입하여 세포 내에서 유전형질을 발현시키는 방법을 의미한다. 대상이 식물 세포일 때는 세포벽을 제거하고 원형질체로 도입하는 경우도 많다. 도입한 핵산은 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 것이 일반적인 방법이다. 도입한 유전자가 세포에서 안정화된 경우는 염색체에 끼어 들어가는 경우가 많다. 핵산을 도입한 세포를 형질 도입체라고 한다. 형질주입 효율이 매우 낮기 때문에 효율을 높이기 위해서 여러 가지 방법을 개발되었는 바, 그 중에서도 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법. 전기천공법, 재분포법 (리포솜이라는 인공막과 DNA복합체를 만들게 하는 세포와 융합시키는 방법) 등이 있다.
"아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 변형된 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산에 대한 모든 언급은, 일반적으로 또는 명칭에 따라 특이적으로, D 및 L 입체이성질체 (구조가 이같은 입체이성질체 형태를 허용하는 경우) 양쪽 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산에는 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린(Val)이 포함된다. 비천연 아미노산에는 N-말단 아미노기 또는 측쇄기 상에서 화학적으로 변형된, 또는 가역적 또는 비가역적으로 화학적으로 차단된 변형 아미노산 잔기, 예를 들어, N-메틸화 D 및 L 아미노산 또는 측쇄 관능기가 또 다른 관능기로 화학적으로 변형된 잔기가 포함된다.
"담체, 캐리어 (carrier) 또는 전달체"는, 생물체 내에 있는 활성물질이 다른 물질과 결합하여 존재하는 경우, 또는 세포막을 통한 물질의 이동인 운반체 수송을 담당하는 고분자 물질을 총칭한다. 담체의 예로는 비제한적으로 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량 폴리펩티드 (약 10 잔기 미만), 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트화제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올, 나트륨과 같은 염-형성 반대이온 (salt-forming counterion), 및/또는 TWEEN, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 PLURONICS　같은 무이온 계면활성제를 포함한다.
"치료"는 임상 결과를 포함하여 이로운 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 질환, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "완화"는, 장애를 치료하지 않는 것과 비교하여, 병태, 장애 또는 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 적어지고/적어지거나 경시적인 진행 추이가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다. 예를 들어, 비만 치료에서, 체중 감소, 예를 들어, 적어도 5％의 체중 감소는 바람직한 치료 결과의 예이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이롭거나 바람직한 임상 결과는, 검출가능 또는 검출불능 여부와 상관없이, 1 가지 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 (부분적 또는 전체적)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 치료는 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 또한 의미할 수 있다. 또한, 치료는 1회 용량의 투여에 의해 발생할 필요가 없고, 일련의 용량의 투여 시에 종종 발생한다. 따라서, 치료상 유효량, 완화에 충분한 양, 또는 질환, 장애 또는 병태의 치료에 충분한 양이 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
"질환 (disorder)"이라는 용어는 본 발명의 유전자도입 동물 모델을 사용하여 동정되는 분자를 이용하여 치료하는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 어떤 상태이다. 이것은 포유류를 의문의 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 조건들을 포함한 만성과 급성 질환들 또는 질병들을 포함한다. 본 명세서에서 다루어질 질병들의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 비만, 대사 증후군 증상 등이다.
"치료상 유효량"은 치료될 장애의 증상의 경감이 포함되는, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.
"예방적 유효량"은 비만 또는 비만 관련 장애, 병태 또는 질환 위험이 있는 대상에서 비만 또는 비만 관련 장애, 병태 또는 질환의 발병을 방지하기 위해, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는, 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.
"유전자 치료 (gene therapy)"는 돌연변이를 일으킨 유전자를 정정하여 유전병을 치료하거나, 유전자 혹은 RNAi를 이용하여 단백질 발현을 조절하여 질병을 치료하는 것을 말한다. 즉, 환자의 세포에 외부에서 정상 유전자를 이식하여 그 세포의 표현형을 변화시킴으로써 병을 치료하는 방법이다. 유전자 치료에는 체내에 유전자를 이입하는 유전자 벡터, 시스템의 연구가 필수적이다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 용어는 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서는 종래 비만 관련 질병에 대한 치료제의 만족스럽지 못한 치료 효과를 개선하고자 하였으며, 특히, 본 발명자들에 의해서 보고된 바 있는 ATS 서열, R9 서열 및 shFABP4 유전자를 포함하는 지방세포 표적 유전자 전달 시스템의 문제점을 개선하고자 하였다.
즉, 상기 지방세포 표적 유전자 전달 시스템에 의해서 표적 지방세포에서 FABP4의 발현을 감소시키는 경우에도 만족스러운 수준의 비만 치료 효과가 관찰되지는 못하였는바, 본 발명자들은 이러한 결과가 표적 지방세포에서의 보상 효과 (compensation effect)에 기인한 것으로 추정하였다.
구체적으로, 상기 유전자 전달 시스템에 의해서 표적 지방세포에 shFABP4 유전자가 전달되면, 표적 지방세포 내의 FABP4 유전자의 발현이 감소되고, 이에 따라서 세포 내 FABP4 단백질의 양이 감소하게 된다. 따라서, 지방세포 내로 지방산을 반입하고 저장하는데 핵심적인 역할을 수행하는 FABP4 단백질의 감소로 인해서 비만 치료 효과가 달성될 것으로 예상할 수 있으나, 실제로는 예상한 만큼 만족스런 수준의 비만 치료 효과가 달성되지는 않는 것으로 관찰되었다. 이는, FABP4와 더불어 비만 유발에 핵심적인 역할을 수행하는 FABP5 유전자의 발현량이 FABP4 유전자의 발현량 감소에 대한 보상기전으로 증가하기 때문인 것으로 판단되었는바, 본 발명자들은 효과적인 비만 치료를 위해서는 FABP4 유전자 및 FABP5 유전자의 발현량을 동시에 감소시키는 것이 필수적이라는 사실을 밝혀 내었다.
한편, 기존 유전자 전달 시스템은 하나의 유전자만을 전달하는 유전자 전달 시스템인 관계로, 두 가지 유전자를 동시에 억제시키기 위해서는, 각각의 유전자들에 대해서 두 배의 유전자 전달체를 필요한 것이 원칙이다. 그러나, 특정 유전자들의 전달을 위해서 유전자 전달체의 양을 증가시킬 경우, 세포 독성 야기의 문제점이 있으며, 따라서 본 발명에서는 이러한 문제점의 해결을 위해서 이중 플라스미드 벡터 (dual plasmid vector)를 사용하고자 하였다. 즉, 본 발명에서는 억제 대상이 되는 두 가지 유전자를 하나의 플라스미드 내에 삽입하여 해당 플라스미드를 대상 세포에 전달하는 경우, 두 가지 유전자의 억제가 동시에 달성될 수 있도록 한 것이다.
이에, 본 발명에서는,
지방세포 표적 서열; R9 (아르기닌) 펩타이드; 및
비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자를 포함하는 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 전달 복합체로서,
상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자는 FABP4 유전자 및 FABP5의 유전자의 발현을 억제하는 염기 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체를 제공한다.
하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체를 사용하여 FABP4 유전자 및 FABP5 유전자를 동시에 억제함으로써, 단일 유전자 억제에 의한 것보다 더욱 탁월한 비만 치료 효과를 거둘 수 있었으며, 비만 조직 내의 염증 감소 효과도 거둘 수 있었다.
본 발명에 따른 유전자 전달 복합체에 있어서, 상기 지방세포 표적 서열 (adipocyte targeting sequence, ATS) 및 R9 (아르기닌) 펩타이드는 치료 유전자를 지방세포에 특이적으로 전달하는 역할을 수행한다. 즉, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 ATS 및 폴리(올리고-아르기닌), 특히 R9 (아르기닌) 펩타이드를 포함하는 비바이러스성 유전자 전달 복합체로서, 상기 ATS-R9 서열은 지방 세포 내의 프로히비틴 (prohibitin)과 결합함으로써 지방 세포에 특이적으로 치료 유전자를 전달할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 유전자 전달 복합체의 구성 성분들 중, 상기 ATS 및 R9 (아르기닌) 펩타이드에 관련된 세부내용들은 본 발명자들에 의한 선행기술인 대한민국 특허출원번호 제10-2013-0041402호에 그 내용이 상세히 서술되어 있으며, 해당 내용은 그 전체로서 본 발명 명세서에 통합된다.
본 발명의 복합체가 전달하는 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자로는 표적이 되는 지방 세포 내에서 발현시키는 것이 바람직한 임의의 유전자를 삽입할 수 있고, DNA와 RNA 및 이들의 합성 동종체를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 (효소, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 리셉터, 구조 단백질 등), 안티센스 RNA, 리보자임, 디코이, RNA 간섭을 일으키는 RNA 등을 코딩하는 유전자를 예로 들 수 있다. 구체적으로는, gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, 안티고미어 등을 들 수 있다. 이들은 자연에 존재하거나 합성될 수 있으며, 크기에 있어서 올리고뉴클레오티드에서 크로모좀까지 다양한 크기로 존재할 수 있다. 이들 유전자는 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등으로부터 기원된다. 이들은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 획득될 수 있다.
상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에는 각종 호르몬, 조직접합성 항원, 세포 부착 단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포 내 또는 세포 외 효소 및 이들의 절편 등을 포함할 수 있다. 또한, 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자 발현 조절 인자, 예를 들면 전사 프로모터, 인헨서, 사일렌서, 오퍼레이터, 터미네이터, 어테뉴에이터 및 기타 발현조절인자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자로는 바람직하게는 비만 및 비만 유래 대사 증후군의 치료 또는 진단과 관련된 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함한다. 특히, 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자는 비만 질환에 대한 유전자 치료효과를 가지는 RNA 간섭 (RNAi)인 것이 바람직하다.
RNA 간섭 (RNAi)은 이중 나선의 짧은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 대상 유전자의 발현을 특이적으로 하향 조절시키는 것을 포함하는 자연적인 기작이다. RNAi를 매개하는 RNAi 시약의 타입에 대한 예로는 예를 들어, siRNA 또는 miRNA (마이크로RNA) 또는 소형 헤어핀 RNA (shRNA)가 있다. 구체적으로, 상기 shRNA로는, FABP4 유전자 및 FABP5의 유전자의 발현을 동시에 억제할 수 있는 sh(FABP4+FABP5)가 사용될 수 있다. 상기 RNAi의 투여에 효과적인 투여량 및 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 단일 또는 다중 투여량을 사용할 수 있다.
한편, 상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자와, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체를 구성하는 나머지 구성 성분, 즉 상기 지방세포 표적 서열 및 상기 R9 펩타이드의 중량비 역시 비만 치료의 효율에 영향을 미칠 수 있는바, 상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자 : 상기 지방세포 표적 서열 및 상기 R9 펩타이드의 중량비는 1:1 내지 1:4, 더욱 바람직하게는 1:2일 수 있다. 상기 지방세포 표적 서열 및 상기 R9 펩타이드의 중량 함량이 상기 범위 미만인 경우에는 상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자와 잘 결합하지 못하는 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 복합체의 크기가 너무 커져서 세포 내로의 유입이 불가능해지는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 ATS 및 R9 (아르기닌) 펩타이드를 포함하는바, 이는 R9 (아르기닌)이 지방세포 표적 서열(ATS)과 결합하고 있는 구조이다 (ATS-R9). 지방세포 표적 서열 (adipocyte targeting sequence, ATS)은 공지의 ATS 서열을 이용하는 것도 가능하지만 [Nature medicine, 2004 June], 바람직하게는 하기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.
서열번호 2: CKGGRAKDC
본 발명자들에 의한 선행기술인 대한민국 특허출원번호 제10-2013-0041402호에도 개시된 바와 같이, 상기 ATS-R9은 지방 세포 내 프로히비틴 (prohibitin)과 결합하는 바, 프로히비틴은 지방세포를 지지하는 혈관의 내피세포에서 과발현되는 수용체로서, 성숙 지방세포 및 전구 지방세포 모두에 존재하는 ATS 수용체이다. 프로히비틴은 특히 비만에서 중요한 역할을 하는데, 지방 조직 혈관에서 높게 발현되고, 분화된 지방세포에서 분화 전과 비교하여 핵 및 마이토콘드리아에서 원형질막으로 이동하여 분포하는 특성은 프로히비틴이 비만에 대한 잠재적인 바이오마커가 될 수 있음을 시사한다. 상기 프로히비틴은 전구 지방세포에서 원형질막에 적게 분포하며 상대적으로 핵 및 마이토콘드리아에 높게 위치하지만, 분화된 지방세포에서는 핵 및 마이토콘드리아에 위치하던 프로히비틴이 원형질막으로 이동하여 높게 발현된다. 즉, 프로히비틴은 분화가 진행됨에 따라 과발현된다. 본 발명의 ATS-R9는 프로히비틴-매개 메커니즘을 통해 지방 세포 내로 위치하게 된다. 즉, 지방세포 타겟팅에서는 ATS가 중요한 역할을 하고, 목적 유전자 발현 정도는 지방세포 내에서의 프로히비틴 발현 수준에 의존적이다.
특히, 상기 프로히비틴은 분화 전 지방세포보다 분화 후 성숙 지방세포에서 과다 발현되므로, 본 발명의 ATS-R9는 분화된 성숙 비만 지방세포를 직접적으로 타겟팅하는 기능을 가진다. 구체적으로, 분화 개시 9 내지 11일 된 성숙된 비만 지방세포에 대한 타겟팅능이 가장 우수하며, 본 발명에서 "성숙 지방세포"와 "비만 지방세포"는 동일한 의미를 가지는 용어로 혼용되어 사용되고 있다.
또한, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체에 있어서, 상기 R9 (아르기닌) 펩타이드는 Cys-(D-R)9-Cys의 구조를 갖는 것일 수 있으며, 이러한 ATS-R9 복합체는 i) 지방 세포에 내재하는 프로히비틴과의 상호작용에 의해서 우수한 트랜스펙션 및 유전자 발현 효율을 나타내고; ii) 전달된 유전자의 발현 효율 (transgene expression efficiency)을 향상시키며; iii) DNA와 결합하여 나노 크기의 복합체를 형성하면서 양의 제타 포텐셜 값을 갖는바, 용이하게 세포막을 통과할 수 있도록 하고; iv) 매우 낮은 세포 독성을 갖는다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
세포 배양, 펩타이드 준비, 세포 염색, 공초점 현미경 관찰, 경쟁 분석, 겔 지연 분석, 제타 포텐셜 및 크기 측정, in vitro 트랜스펙션 효율 측정, in vitro 세포독성 분석, 마우스 모델에서의 비만 유도, in vivo 지방 표적화, 전구 지방 세포의 분화, 지방세포로의 내재화 능력 평가, 분화 정도에 따른 지방세포 표적화능의 확인, 다양한 세포들에서의 프로히비틴 발현 확인, 및 제조된 올리고-펩토플렉스의 물리적 및 생물학적 특성 측정 등은 대한민국 특허출원번호 제10-2013-0041402호에 기재된 바와 동일한 방법에 의해서 수행하였으며, 상기 특허출원의 내용은 전체로서 본 명세서에 통합된다.
실시예 1. sh ( FABP4 + FABP5 ) 이중 플라스미드 벡터의 제작
sh(FABP4 + FABP5) 이중 플라스미드 벡터를 제작하기 위해서, 두 가지 shRNA들의 발현을 위한 이중 RNA PolIII 카세트 벡터인 psiRNA-DUO (InvivoGen, USA)를 사용하였으며, 구체적 제작 과정은 하기와 같다.
동결된 플라스미드를 함유하는 튜브를 회전시켜서 DNA를 침전시켰으며, 1 ㎍/㎕의 플라스미드 용액을 얻기 위해서 상기 얻어진 DNA를 20 ㎕의 살균수에 재현탁하였고, 재현탁된 플라스미드를 -20℃에서 저장하였다. 수율을 높이기 위해서 상기 재현탁된 E. coli에 형질전환시킴으로써 플라스미드 증폭 과정을 수행하였다.
이어서, psiRNA-DUO 플라스미드를 제한효소인 Bbs I (NEB, 2 units enzyme/μg plasmid DNA)으로 처리하고, 0.7% 저융점 아가로오스 겔을 사용하여 큰 단편 (3180 bp)을 용리시킨 다음, 정제된 DNA 단편을 희석시켜 0.1 ㎍/㎕의 용액을 수득하였다 (Gus 카세트). 또한, psiRNA-DUO 플라스미드를 Acc 65I 및 Hind III (with NEB 효소, NEBuffer 2 + BSA 사용)로 처리하고, 큰 단편 (3150 bp)을 0.7% 저융점 아가로오스 겔을 사용하여 용리시킨 다음, 정제된 DNA 단편을 희석시켜 0.1 ㎍/㎕의 용액을 수득하였다 (LacZ 카세트).
psiRNA-DUO 내로 sh(FABP4 + FABP5)를 클로닝하기 위해서는 psiRNA-DUO를 Acc65 I, Hind III 및 Bbs I으로 동시에 처리하고, 두 가지 psiRNA-DUO 절편들 (Hind III/Bbs I 및 Bbs I/Acc65 I)과 두 가지 shRNA 인써어트들과 함께 라이게이션하는 1 스텝 과정을 사용하거나, 또는 첫 번째 shRNA 인써어트를 클로닝한 다음, 나머지 두 번째 shRNA 인써어트를 클로닝하는 2 스텝 과정을 사용하였다. 클로닝 상세과정은 InvivoGen사로부터의 psiRNA-DUO 사용 매뉴얼을 참고할 수 있다 (Catalog # ksirna4-gz3).
실시예 2. sh ( FABP4 + FABP5 ) 플라스미드와 ATS-9R의 함량비 최적화
sh(FABP4 + FABP5) 플라스미드와 ATS-9R의 함량비를 최적화하기 위해서 겔 저지 분석방법 (gel retardation assay)을 사용하였는바, 1 ㎍의 DNA, 탈이온수 및 ATS-9R을 다양한 중량비로 30분 동안 상온에서 배양하여 올리고-펩토플렉스 (oligo-peptoplex)를 제작하였다. 상기 올리고-펩토플렉스의 평균 직경 및 표면 제타 포텐셜을 Zetasizer-Nano ZS(Malven Instruments,UK) DLS를 사용하여 측정하였다. 도 1a 및 1b에는 sh(FABP4 + FABP5) 플라스미드와 ATS-9R의 중량비에 따른 겔 저지 분석 결과 및 복합체의 크기를 도시하였으며, 도 1b를 참조하면, sh(FABP4 + FABP5) 플라스미드 : ATS-9R의 중량비가 1:2인 경우에 최적의 크기가 도출됨을 알 수 있다.
실시예 3. 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체가 트랜스펙션된 지방 세포의 FABP4 및 FABP5 발현량 확인
마우스 유래 비만 세포인 3T3-L1세포를 지방세포로 분화시킨 다음, 분화된 지방세포에 scrambled shFABP4+ATS9R, shFABP4+ATS9R, shFABP5+ATS9R, sh(FABP4/FABP5)+ATS9R를 처리하고 48 시간 후에 세포에서 RNA만을 RNeasy Lipid tissue Mini 키트 (Qiagen)를 이용하여 분리하고 cDNA를 합성하였다. 그 후, Cyber premix EX taq RT-PCR 키트를 이용하여 내생 대조군 (endogenous control)인 GAPDH에 대한 상대적인 FABP4, FABP5 mRNA 수준을 RT-PCR을 통해서 측정하였다. 도 2a 및 2b에는 측정 결과를 도시하였으며, 도 2a 및 2b를 참조하면, 인 비트로 실험을 통한 성숙 지방세포에서 실제적으로 이중 플라스미드 벡터인 sh(FABP4/FABP5)+ATS9R을 처리하였을 때 FABP4, FABP5의 mRNA양이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한, FABP4를 감소시켰을 때 (shFABP4+ATS9R)군에서 FABP5 mRNA의 양이 증가하는 것을 확인한바, 최적의 비만 억제 치료 효과를 거두기 위해서는 FABP4 및 FABP5를 동시에 억제해야 한다는 사실을 알 수 있다.
실시예 4. 동물 실험을 통한 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체의 비만 치료 효과 확인
C57BL6/6N 마우스를 60 kcal 고지방 다이어트 사료를 먹이고 2~3달 정도 사육한 후, 몸무게가 45g 이상 나가는 마우스만 선별하여 일주일에 2번씩 IP 주사법으로 shFABP4/ATS9R, shFABP5/ATS9R, shFABP4/ATS9R + shFABP5/ATS9R 및 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체인 sh(FABP4/FABP5)/ATS9R를 투여하였다.
먼저, 각 투여군 별로 시간에 따른 몸무게 변화를 관찰하였다. 도 3a에는 각 투여군 별로 시간에 따른 몸무게를 관찰한 그래프를 도시하였으며, 도 3a를 참조하면 나머지 군들에서는 체중 감소 효과가 크지 않았지만, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체를 투여한 군의 경우에는 8주 후에 약 20%의 몸무게 감소효과가 나타남을 확인할 수 있었다.
다음으로, ITT 분석을 통해 각 투여군 별로 시간에 따른 혈당(Blood glucose) 변화를 관찰하였다. 도 3b에는 각 투여군 별로 시간에 따른 혈당 변화를 관찰한 그래프를 도시하였으며, 도 3b를 참조하면 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체를 투여한 군의 경우 유의적인 혈당 감소 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.
다음으로, 마우스의 지방 조직을 적출하여 독성 및 염증반응을 웨스턴블랏을 통해서 검사하였으며, 구체적으로, pH 8.0의 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.1% 소듐 데옥시콜레이트, 1% Triton X-100 및 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 RIPA 완충용액에 용균을 진행하고, 그 후 15분 동안 4℃에서 배양한 다음, 4℃에서 원심분리를 14,000 g 속도로 15분 동안 진행한 뒤 상층액을 샘플로 사용하였다. 샘플은 SDS-PAGE로 전기영동을 수행하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF)에 옮겨서 웨스턴블랏을 진행하였다. 도 3c에는 웨스턴블랏 결과를 도시하였으며, 도 3c를 참조하면, 다른 군들에 비해서 sh(FABP4/FABP5)+ATS9R을 처리한 군에서 염증 지표인 TNF-α가 감소하는 것을 알 수 있다.
다음으로, 마우스의 지방 조직에서 각 투여군 별로 FABP4 및 FABP5 유전자 발현율(%)을 관찰하였다. 도 3d에는 각 유전자 발현율(%) 결과를 도시하였으며, 도 3d를 참조하면, 다른 군들에 비해서 sh(FABP4/FABP5)+ATS9R을 처리한 군에서 FABP4 및 FABP5 유전자 발현율이 유의적으로 감소하는 것을 알 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 지방세포에 특이적으로 비만 관련 치료 유전자인 FABP4 유전자 및 FABP5 유전자를 전달함과 동시에 이들 유전자의 억제가 동시에 달성될 수 있도록 구성되어 세포 독성 없이 우수한 비만 치료 효과를 달성할 수 있는바, 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료를 위한 유전자 치료 기법에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
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<120> Adipocyte targeting non-viral gene delivery composite comprising dual plasmid vector
<130> PCT2017-008
<150> KR 10-2016-0084631
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<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 6046
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Vector
<400> 1
cctgcaggcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 60
cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 120
tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 180
catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 240
gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 300
gctattacca tgatgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 360
tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttgactagta 420
aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 480
aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcagc 540
ttcgaggggc tcgcatctct ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc cgccatccac 600
gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact gcgtccgccg 660
tctaggtaag tttaaagctc aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc ccttggagcc 720
tacctagact cagccggctc tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa ctctacgtct 780
ttgtttcgtt ttctgttctg cgccgttaca gatccaagcc accatggttt ctaagggaga 840
agaactcttt actggtgttg tcccaattct ggttgagctg gatggtgatg tgaatggcca 900
caaattctct gtgtctggtg aaggtgaagg agatgcaact tatggaaagc tgactctgaa 960
gttcatttgt acaacaggaa agctgccagt gccttggcca actctggtga ccaccctgac 1020
ttatggtgtt caatgtttca gcagataccc tgaccacatg aagcagcatg acttctttaa 1080
atctgcaatg ccagaaggtt atgttcagga gaggacaatc ttctttaagg atgatggaaa 1140
ttataagaca agggcagaag tgaagtttga aggtgataca ctggttaaca gaattgagct 1200
gaaaggcatt gattttaagg aagatggaaa cattctgggt cacaagctgg agtacaacta 1260
taattctcac aatgtttaca ttatggcaga taagcagagg aatggaatta aggctaattt 1320
caagattaga cacaacattg aggatggatc tgtccaactg gcagaccatt accagcagaa 1380
cacccctatt ggtgatggcc cagttctcct cccagataat cactatctca gcactcaatc 1440
tgctctgtcc aaagacccta atgagaaaag agaccacatg gtcctcctgg agtttgtgac 1500
agcagcagga attactctgg gaatggatga gctgtacaag ggtaagtcac tgactgtcta 1560
tgcctgggaa agggtgggca ggagatgggg cagtgcagga aaagtggcac tatgaaccca 1620
ctagtttgac aattaatcat aagcatagta taatacaact cactatagca attgtactaa 1680
ccttcttctc tttcctctcc tgacaggagg agccatcatg gccaaactca cttctgcagt 1740
cccagtcctc acagcaaggg atgttgcagg ggctgtagag ttctggactg acagattagg 1800
attctccaga gactttgttg aagatgattt tgctggtgtt gtcagagatg atgtcaccct 1860
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cagaggccta gatgagcttt atgcagaatg gtcagaagta gtcagcacaa atttcaggga 1980
tgcctctggc ccagccatga cagaaattgg tgaacaacct tggggaaggg aatttgccct 2040
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tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt 2280
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acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca aacagctaat gcacattggc 2400
aacagcccct gatgcctatg ccttattcat ccctcagaaa aggattcaag tagaggcttg 2460
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ttggtgggaa agcgcgttac aagaaagccg ggcaattgct gtgccaggca gttttaacga 3000
tcagttcgcc gatgcagata ttcgtaatta tgcgggcaac gtctggtatc agcgcgaagt 3060
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tgtgaacaac gaactgaact ggcagactat cccgccggga atggtgatta ccgacgaaaa 3300
cggcaagaaa aagcagtctt acttccatga tttctttaac tatgccggaa tccatcgcag 3360
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actgtacagc gaagaggcag tcaacgggga aactcagcaa gcgcacttac aggcgattaa 4020
agagctgata gcgcgtgaca aaaaccaccc aagcgtggtg atgtggagta ttgccaacga 4080
accggatacc cgtccgcaag gtgcacggga atatttcgcg ccactggcgg aagcaacgcg 4140
taaactcgac ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg acgctcacac 4200
cgataccatc agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac cgttattacg gatggtatgt 4260
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ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4920
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 4980
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 5040
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 5100
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 5160
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 5220
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 5280
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 5340
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 5400
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgttc ttaatcgata ctagtgctgc 5460
agtatttagc atgccccacc catctgcaag gcattctgga tagtgtcaaa acagccggaa 5520
atcaagtccg tttatctcaa actttagcat tttgggaata aatgatattt gctatgctgg 5580
ttaaattaga ttttagttaa atttcctgct gaagctctag tacgataagt aacttgacct 5640
aagtgtaaag ttgagatttc cttcaggttt atatagcttg tgcgccgcct gggtacctga 5700
ggtttttcaa aagtagttga caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac 5760
gactcactat aggagggcca ccatggaccc tgttgtgctg caaaggagag actgggagaa 5820
ccctggagtg acccagctca acagactggc tgcccaccct ccctttgcct cttggaggaa 5880
ctctgaggaa gccaggacag acaggcccag ccagcagctc aggtctctca atggagagtg 5940
gaggtttgcc tggttccctg cccctgaagc tgtgcctgag tcttggctgg agtgtgacct 6000
cccagaggct gacactgtgt aaccctaagc ttctagactt aattaa 6046
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 2
Cys Lys Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys
1 5

Claims (9)

  1. 지방세포 표적 서열; R9 (아르기닌) 펩타이드; 및
    비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자를 포함하는 이중 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 전달 복합체로서,
    상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자는 FABP4 유전자 및 FABP5의 유전자의 발현을 억제하는 염기 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 염기 서열은 DNA 또는 RNAi인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 RNAi는 siRNA 또는 shRNA인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 이중 플라스미드 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자 : 상기 지방세포 표적 서열 및 상기 R9 펩타이드의 중량비는 1:1 내지 1:4인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자 : 상기 지방세포 표적 서열 및 상기 R9 펩타이드의 중량비는 1:2인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 지방세포 표적 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 R9 (아르기닌) 펩타이드는 Cys-(D-R)9-Cys의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 지방세포는 분화된 성숙 비만 지방세포인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
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