WO2019132579A2 - 세포질 침투 항체에 융합된 rna 분해효소를 포함하는 면역독소 - Google Patents

세포질 침투 항체에 융합된 rna 분해효소를 포함하는 면역독소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타겟 세포의 세포질로 침투하는 세포질 침투 항체에 RNA 분해효소 (리보뉴클레아제, ribonuclease, RNase)을 융합한 형태의 재조합 면역독소의 개발에 관한 것으로, 구체적으로 타겟 세포의 막단백질을 통해 내재환 된 후에 엔도좀 탈출능에 의해 세포질 (cytosol)로 침투하는 세포질 침투 항체 (Cytotransmab, CT)와 세포질 침투능이 부재한 인간 유래 RNase를 융합하여, 타겟 세포의 세포질로 RNase를 전달할 수 있는 새로운 재조합 세포질 침투항체-RNase (Cytotransmab-RNase, CT-RNase, CT-R) 면역독소, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포질 침투항체-RNase 면역독소는 타겟 종양세포의 세포질에 침투하여 RNase 활성에 의한 세포독성을 보여 종양 성장을 억제하고 세포사멸을 유도하는 특성을 보여, 종양 치료 및 예방을 위한 약학 조성물로 활용될 수 있다.

Description

세포질 침투 항체에 융합된 RNA 분해효소를 포함하는 면역독소
본 발명은 세포질 침투 항체에 RNA 분해효소 (리보뉴클레아제, ribonuclease, RNase)가 융합된 형태의 세포질 침투항체-RNase (Cytotransmab-RNase, CT-RNase, CT-R)를 포함하는 면역독소에 관한 것이다.
구체적으로 표적하는 세포의 막단백질을 통해 세포 내로 내재화된 후에 엔도좀 탈출능에 의해 세포질 (cytosol)로 침투하는 세포질 침투 항체 (Cytotransmab, CT)와 세포질 침투능이 없는 인간 유래 RNase가 융합된 세포질 침투항체-RNase (Cytotransmab-RNase, CT-RNase, CT-R)를 포함하는 면역독소 이의 제조 방법, 면역독소를 세포질 침투항체가 표적하는 타겟 세포의 세포질로 전달하는 방법, 전달된 RNase 활성에 의해 세포 성장 억제 및 사멸을 유도함으로써 각종 질병을 치료하는 용도에 관한 것이다.
종양 및 다양한 질환에 대해 항체를 이용하는 치료제 및 치료 전략이 연구되고 있다. 단일클론항체(Monoclonal antibody, mAb)는 종양 또는 질병 관련 항원에 높은 특이성 및 친화성으로 결합하여, 활성물질 또는 억제물질로서 작용하고, 최종적으로 종양 및 질병을 치료할 수 있는 치료용 단백질이다.
그러나, 이러한 단일클론항체만으로는 실제 환자에게 충분한 효과를 거의 나타내지 못해, 주로 소분자 의약품 또는 방사선 치료를 병용하는 전략으로 실제 환자에게 투여되고 있다. 이를 극복하기 위한 새로운 전략으로, 항체의 높은 특이성을 기반으로 보다 높은 활성을 위해 독성분자를 결합하는 다양한 형태의 치료제 예를 들면 항체-약물 결합체 (Antibody-Drug Conjugate, ADC), 재조합 면역독소 (Recombinant Immunotoxin, RIT) 등이 개발되고 있다.
재조합 면역독소는 항체 또는 항체의 단편에 세포독성 단백질(toxin)을 융합한 형태로, 항체를 이용하여 질병 특이적으로 약물을 전달하고, 융합한 세포독성 단백질을 이용하여 높은 세포독성을 보일 수 있다. 이에 사용되는 세포독성 단백질은 주로 세균 또는 식물원으로부터 유래한 세포독성 단백질 도메인 예를 들면, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 A (PE), 디프테리아 독소 (Diphtheria toxin), 겔로닌 (Gelonin) 등이 사용되고 있다. 일반적인 세균 또는 식물원으로부터 유래한 세포독소 단백질은 크게 3가지 도메인으로 구성되어 있다. 세포내제화를 위해 특정 슈퍼패밀리 수용체를 인지할 수 있는 도메인 (Receptor binding domain), 엔도좀을 탈출하여 세포질에 위치하게 하는 도메인 (Translocation domain), 그리고 세포질에서 실제 활성을 나타내는 도메인 (Catalytic domain) 으로 이루어져 있다. 재조합 면역독소가 독성을 나타내기 위해서는 독성을 나타내는 물질이 활성을 보일 수 있도록 세포질까지 전달되는 단계가 매우 중요하다. 일반적인 항체는 엔도좀을 탈출하여 세포질로 이동하는 특성을 갖고 있지 않으므로, 세포독소 단백질 도메인 중 엔도좀 탈출능을 가지는 도메인을 사용한다. 또한 세포질에 위치하여 세포독성을 보이는 활성 도메인을 포함하여 재조합 면역독소를 제작하였다.
하지만, 임상실험 단계에서 실제 사람에게 투여하였을 때, 외래 유래 물질인 세포독소 단백질 도메인에 의한 높은 면역원성 (immunogenicity) 및 비특이적인 독성을 포함하는 한계를 갖는다. 이러한 높은 면역원성의 한계를 극복하기 위해, 최근에는 세균 또는 식물원으로부터 유래한 세포독성 단백질이 아닌, 인간 유래의 세포독성 물질을 사용하여 재조합 면역독소를 개발하는 연구가 시도되고 있다. 이 때 연구되고 있는 물질로는 인간 RNA 분해효소, 그랜자임 (Granzyme), 인간 전-세포사멸 단백질 (proapoptotic protein) 등이 있다. 하지만, 상기 인간 RNA 분해효소, 그랜자임 (Granzyme), 인간 전-세포사멸 단백질 (proapoptotic protein) 등이 항체에 융합된 면역톡신의 경우에는, 항체가 결합하는 세포표면 수용체에 결합하여 내재화(receptor-mediated endocytosis) 후에, 엔도좀에서 세포질로의 탈출능 (endosomal escape capacity)이 없어, 실제 세포 독성을 보이지 않는다.
예를 들어, RNA 분해효소의 경우 엔도좀 탈출능이 없는 일반적인 항체와 융합하여 재조합 면역독소로 제작되어 세포 독성을 보인다는 보고가 있어 왔다 (Borriello M et al.(2011) British journal of cancer 104;1716-1723; S.M. Rybak et al.(2009) Current pharmaceutical design 15;2665-2675). 하지만, 최근 연구에서, 일반 세포 표면 막단백질에 결합하는 항체와 융합된 RNA 분해효소 면역톡신의 경우는 전혀 세포독성을 보이지 않음을 확인하였다 (Thomas Schirrmann et al. (2014) mAbs 6;367-380). 즉, 종양특이 막단백질을 (예, Carbonic anhydrase 9, Mesothelin)을 인지하여 내재화하는 항체에 RNase를 융합한 항체-RNase 융합 면역톡신의 경우, 항체가 세포표면의 막단백질에 결합한 후에, 세포에 내재화가 일어나지만, 항체 또는 RNase가 엔도좀으로부터 세포질로 나오는 엔도좀 탈출능이 부재하여, 실제로 RNase에 의한 세포독성이 없음을 보고 하였다 (Thomas Schirrmann et al. (2014) mAbs 6;367-380). 특히 인간 유래 RNase는 스스로 세포 침투능 또는 엔도좀 탈출능이 없다. 따라서, 기존 연구는 항체-RNase 융합 면역 톡신이 세포질에서 작용을 하려면, 항체가 세포질 침투하는 능과 더불어 엔도좀 탈출능이 있어, RNase를 세포질로 전달할 수 있는 능력이 있어야 함을 보여주고 있다.
또한 기존의 재조합 면역독소는 대장균에서의 생산이 용이하고 세포독성 단백질과 함께 엔도좀을 탈출하기에 용이하도록, 주로 분자량이 적은 단일사슬항체단편 (single chain variable fragment, scFv) 에 독소를 융합하여 생산하였다. 이러한 형태는 발현 및 정제에는 영향이 없으나 인체에 투여하였을 때, Fc 부분의 부재로 낮은 생체내 반감기를 가진다는 단점이 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 세포 내부로 침투하여 세포질에 분포하는 세포질 침투 항체, 바람직하게는 완전 IgG 형태의 세포질 침투항체(Cytotransmab) (Choi et al. (2014) mAbs 6;1402-1414; Kim et al. (2016) Journal of controlled release 235;165-175)를 이용하여 인간 유래 세포독성 단백질을 이에 융합할 경우, 인간 유래 세포독성 단백질을 매우 효율적으로 타겟 세포의 세포질로 전달할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
나아가, 본 출원의 발명자들은 세포질 침투 항체와 인간 유래 세포독성 RNase 단백질이 융합된 형태의 면역독소가 예측할 수 없는 현저한 효과를 보임을 확인하였으며, 세포질 침투 항체와 RNase 단백질의 융합을 위해 사용되는 링커에 대한 지속적인 연구를 통해, 최적의 독성을 보이는 세포질 침투항체-RNase 면역독소를 개발하고, 이의 항암 활성을 확인하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위하여 공지의 기술에 대한 발명자의 해석을 더하여 작성된 것이며, 이에 상기 내용은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 효율적으로 세포내에 침투하여 타겟 세포에 독성을 나타내는 면역독소를 제공하는데 있다.
구체적으로 본 발명은 세포질 침투 항체에 RNA 분해효소(RNase)를 융합하여, 타겟하는 세포의 세포질로 RNA 분해효소를 효과적으로 전달하는 데 목적이 있다. 나아가, 본 발명은 세포질 내로 전달된 RNase 활성에 의한 세포 성장 억제 및 사멸을 유도하는 재조합 세포질 침투항체-RNase 면역독소와 이의 제조 방법 및 용도를 제공한다.
바람직하게는 본 발명에서는 RNase는 세균, 식물, 또는 타 동물유래가 아닌, 인간 유래 RNA 분해효소를 사용하여 세포질 침투항체-RNase의 면역원성을 최소화해서, 기존 면역 톡신에서 문제가 되는 면역원성 발생을 회피할 수 있다.
또한 본 발명은 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소가 세포 내부에서 절단될 수 있는 링커를 통해 연결된 형태의 면역독소를 제공한다. 상기 세포 내부에서 절단될 수 있는 링커를 사용함으로써, 세포질 침투항체-RNase가 세포 내재화된 이후에 RNase가 세포질 침투항체로부터 분리되어, 세포질내에서의 RNase 활성을 높일 수 있는 유리한 효과를 나타낸다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소가 융합된 면역독소를 제공한다.
상기 면역독소에 있어, RNA 분해효소는 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단 또는 경쇄 C-말단 위치에 융합될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소는 엔도좀 내에서 절단되는 특성을 가진 링커를 통해 융합되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 링커는 엔도좀내의 카텝신 (cathepsin)에 의해 인지되어 절단되는 GFLG 서열을 포함하는 GSGFLG 서열일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소는 엔도좀 내에서 절단되지 않으면서 구조적 유연성을 가진 링커를 사용할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 비절단 링커는 AAASSG 와 같은 서열을 갖는 링커를 사용할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 RNA 분해효소는 인간에서 유래한 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 RNA 분해효소는 세포질내에서 RNA 분해효소 억제제를 회피하기 위한 돌연변이가 도입된 것일 수 있다.
상기 세포질 침투 항체는 세포막의 막단백질 등을 통한 세포막 함입을 통해 세포 내로 내재화된 후에 엔도좀 탈출 과정을 거쳐 세포질 내에 위치하는 것일 수 있다.
상기 세포질 침투 항체의 중쇄가변영역의 서열은 서열번호 1 내지 5 중 선택된 어느 하나일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포질 침투 항체의 경쇄가변영역의 서열은 서열번호 6 내지 8 중 선택된 어느 하나일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포질 침투 항체는 종양세포에서 과발현된 EpCAM, EGFR, integrin αvβ3/αvβ5 중 선택된 어느 하나 이상을 특이적으로 인식하는 것일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포질 침투 항체에 융합된 RNA 분해효소의 서열은 서열번호 9 내지 11 중 선택된 어느 하나일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소가 융합된 면역독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 상기 숙주세포를 배양하여 생산된 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소가 융합된 면역독소를 회수하는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소가 융합된 면역독소의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소가 융합된 면역독소의 제조방법은, 바람직하게는
세포질 침투능을 가지는 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄와 상기 중쇄의 C- 말단에 인간 RNA 분해효소가 융합된 아미노산을 코딩하는 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 엔도좀 탈출 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
상기 세포질 침투능을 가지는 인간 항체의 경쇄가변영역(VL) 및 경쇄불변영역(CL)이 포함된 경쇄와 상기 경쇄 C- 말단에 인간 RNA 분해효소가 융합된 아미노산을 코딩하는 핵산을 클로닝한 세포질 침투 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
상기 제조된 중쇄 및 경쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환 하여 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투 항체와 인간 RNA 분해효소가 융합된 면역독소를 발현하는 단계; 및
상기 발현된 면역독소를 정제 및 회수하는 단계를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 세포질 침투 항체에 RNA 분해효소가 융합된 면역독소를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 RNA 분해효소의 작용으로 인해 예방 및 치료가능한 모든 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 질환은 암이지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 암은 EpCAM, EGFR, integrin αvβ3/αvβ5 중 선택된 어느 하나 이상이 과발현된 암종인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 세포질 침투 항제에 융합된 형태로 RNA 분해효소를 세포질 내부로 전달하는 방법을 제공한다.
상기 세포질 침투 항체는 세포내로 내재화한 이후에 엔도좀을 탈출하여 세포질 내에 위치함으로써 상기 RNA 분해효소를 세포질 내부로 전달하는 것을 특징으로 한다.
도 1 은 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소가 세포 내재화 되어 세포질에 위치하기까지의 전체적인 과정 및 작용기전을 나타낸 전반적인 모식도이다.
도 2a 는 세포질 침투능을 가지는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
도 2b 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 HCT116 에서 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소를 농도별로 37 ℃에서 48시간, 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
도 3a 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 LoVo 를 이종이식한 쥐에서 종양 조직 EpCAM 특이적 세포질 침투항체 CT-ep41 과 재조합 면역독소 CT-ep41-R 와의 종양 성장 억제 효과를 10 mg/kg의 농도로 정맥주사, 3일 간격으로 총 8회 투여하여 비교한 실험 결과이다.
도 3b 는 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 CT-ep41-R 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 3c 는 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 CT-ep41-R 의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
도 4a 는 엔도좀 탈출능이 향상된 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
도 4b 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 HCT116 에 엔도좀 탈출능이 향상된 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소를 농도별로 37 ℃에서 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
도 5 는 재조합 면역독소를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 단백질의 소수성을 평가할 수 있는 Zenix 컬럼으로 분석하였을 때 280 nm에서의 mAU값을 나타낸 그래프이다.
도 6a 는 물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 또는 경쇄 C-말단에 서로 다른 2개의 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
도 6b 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 SW480 에 물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 또는 경쇄 C-말단에 서로 다른 2개의 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소를 농도별로 37 ℃에서 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
도 6c 는 세포질 침투항체와 재조합 면역독소를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 단백질의 소수성을 평가할 수 있는 Zenix 컬럼으로 분석하였을 때 280 nm에서의 mAU값을 나타낸 그래프이다.
도 7a 는 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체 2종의 중쇄 C-말단에 절단성 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
도 7b 는 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체 2종과 이의 중쇄 C-말단에 절단성 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 7c 는 발현 수율을 향상시킨 세포질 침투항체 및 재조합 면역독소를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 단백질의 소수성을 평가할 수 있는 Zenix 컬럼으로 분석하였을 때 280 nm에서의 mAU값을 나타낸 그래프이다.
도 8 은 EpCAM 과발현 대장암 세포주 HCT116, DLD-1, SW480 및 EpCAM 미발현 세포주 HeLa 에 발현 수율 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체 2종의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소를 농도별로 37 ℃에서 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 CTG 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
도 9 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 SW480 에 발현 수율 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 세포질 침투능을 공초점 현미경 (confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
도 10a 는 야생형 인간 RNA 분해효소와 발현 수율 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 융합된 억제제 회피 인간 RNA 분해효소의 RNA 분해효소 억제제 유무에 따른 RNA 분해 활성을 측정한 결과이다.
도 10b 는 야생형 인간 RNA 분해효소의 RNA 분해효소 억제제 유무에 따른 RNA 분해 활성을 측정한 결과이다.
도 10c 는 발현 수율 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 융합된 억제제 회피 인간 RNA 분해효소의 RNA 분해효소 억제제 유무에 따른 RNA 분해 활성을 측정한 결과이다.
도 11a 는 체내 지속성을 향상시키기 위해 LALA-PG 돌연변이를 도입한 종양 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
도 11b 는 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP의 약동학을 BALB/c 누드 마우스에서 확인한 결과이다.
도 12a 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 HCT116과 EpCAM 미발현 대장암 세포주 Colo320DM 를 이종이식한 쥐에서 종양 조직 EpCAM 특이적 세포질 재조합 면역독소 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 의 종양 성장 억제 효과를 10 mg/kg의 농도로 정맥주사, 일주일에 2번, 총 6회 또는 5회 투여하여 확인한 실험 결과이다.
도 12b 는 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 12c 는 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
도 13a 는 EGF 를 경쇄가변영역 N-말단에 융합하여 종양 EGFR 특이적인 재조합 면역독소 구축 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
도 13b 는 EGFR 과발현 폐암 세포주 A549 에 EGF 를 경쇄가변영역 N-말단에 융합하여 종양 EGFR 특이적인 재조합 면역독소를 농도별로 37 도에서 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서 “세포질 침투 항체”는 본 발명의 발명자들의 선행 특허들(한국 특허출원공개 제2016-0011598호 및 한국 특허출원공개 제2018-0129514호) 등에 기재된 바와 같이, 중쇄가변영역 및/또는 경쇄가변영역의 CDR3에 엔도좀 탈출능 모티프를 포함는 항체 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하며, CDR3 서열에 의해 엔도좀 산성 pH 조건에서 항체의 특성변화가 일어나고, 항체가 그로 인해 엔도좀에서 세포질로 탈출하는 특징을 갖는 모든 항체를 의미한다.
하나의 실시예에서, 하기 일반식으로 표시되는 서열을 CDR3에 포함하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역을 포함하고,
X1-X2-X3-Z1
여기서, X1-X2-X3는 엔도좀 탈출능 모티프이고, X1-X2-X3 각각은 트립토판(W), 타이로신(Y), 히스티딘(H) 및 페닐알라닌 (F) 으로 구성된 군에서 선택되며, 상기 X1, X2 및 X3 중 하나 이상은 Tryptophan(W)을 포함한다.
Z1 은 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L), 히스티딘 (H), 아스파라긴산 (D) 및 글루탐산 (E)으로 이루어진 그룹에서 선택되고,
상기 Z1을 포함하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역이 엔도좀 산성 pH 조건에서 항체의 특성변화가 일어나고,
상기 항체의 특성 변화를 통해 항체가 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
"엔도좀 탈출"은 세포 내재화를 통해서 능동적으로 살아있는 세포에 침투한 후 산성조건에서 엔도좀을 벗어나 세포질에 위치하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "엔도좀 탈출 모티프"는 산성조건에서 엔도좀 탈출을 유도하는 특징을 가지는 특정 아미노산 서열을 포함하는 1차 구조, 이에 의해 형성된 3차 구조를 포함하며, "엔도좀 탈출능 모티프" 또는 "엔도좀 탈출능 보유 모티프"와 혼용할 수 있다. "엔도좀 탈출 모티프"를 포함하는 경쇄 가변영역 (VL) 또는 중쇄 가변영역 (VH)을 포함하는 항체는 "세포질 침투"가 가능하며, "세포질 침투 항체"는 세포 내재화에 의해 세포 내부로 침투한 항체가 산성조건에서 엔도좀에서 세포질로 탈출된 것을 의미하며, "세포질 침투능을 가진 항체"와 혼용할 수 있다.
본 발명에 따른 엔도좀 탈출 구조 모티프에 있어서, 상기 엔도좀 탈출 구조 모티프는 경쇄가변영역, 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역에 위치할 수 있다. 본 발명에 따른 엔도좀 탈출 구조 모티프에 있어서, 상기 X1-X2-X3는 WWH, WYW, YWW, WYH 또는 YWH 아미노산으로 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 X1-X2-X3는 경쇄가변영역의 N 말단으로부터 92, 93 및 94 번째 아미노산에 위치할 수 있다. 상기 X1-X2-X3는 중쇄가변영역의 N 말단으로부터 96, 97 및 98 번째 아미노산에 위치할 수 있다. 또한, 상기 X1-X2-X3는 경쇄가변영역의 N 말단으로부터 92, 93 및 94 번째 아미노산, 및 중쇄가변영역의 N 말단으로부터 96, 97 및 98 번째 아미노산에 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 엔도좀 탈출 구조 모티프에 있어서, 상기 엔도좀 탈출 구조 모티프는 중쇄가변영역에 위치하고, 상기 CDR3는 GWYWMDL, GWYWFDL, GWYWGFDL, YWYWMDL 및 GWWWMDL로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 엔도좀 탈출 모티프를 포함한 경쇄 가변영역의 CDR3는 QHYWYWMYT를 포함할 수 있다.
본 발명에서 엔도좀 탈출 모티프 X1-X2-X3-Z1을 구성하는 Z1은 카밧 (Kabat) 넘버링에 따라 경쇄 가변영역의 95번 또는 중쇄가변영역의 102번 아미노산에 위치할 수 있으며, 소수성을 띄는 아미노산인 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L), 음전하를 띄는 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E), 양전하를 띄는 아미노산인 히스티딘 (H)으로, 본 발명에 따른 세포질 침투 항체의 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역은 엔도좀의 산성 pH조건에서 1번째 아미노산이 음전하를 띄는 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)과 경쇄 가변영역의 95번 또는 중쇄 가변영역의 102번 아미노산의 Z1이 상호작용하여 특성 변화를 유도하여 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 보유할 수 있다.
본 발명에서 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산이 상기 Z1과 엔도좀 산성 pH 조건에서 상호작용하여 특성변화유도를 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
또한 pH 7.4에서 엔도좀의 산성조건 pH 5.5로 변경됨에 따라 상기 엔도좀 탈출 모티프 Z1과 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산 상호작용이 변하게 된다. 즉, Z1이 소수성을 띄는 아미노산인 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L) 또는 음전하를 띄는 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)으로 구성 시, 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)과 상호작용에서 음전하를 띄는 아미노산 곁가지의 카르복실산이 상기 산성조건에서 일정부분 수소화되어 (protonation) 소수성을 띄는 특징에 의한 소수성 상호작용 (Hydrophobic interaction)을 한다.
또한 상기 엔도좀 탈출 모티프 Z1과 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역 1번 아미노산과의 pH 의존적 특성 변화 유도 중 Z1이 소수성을 띄는 아미노산인 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L)과 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역 1번 아미노산인 음전하를 띠는 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E) 상호작용의 경우, 중성 pH 조건에서 상호작용이 없으나, pH가 낮아짐에 따라 음전하를 띠는 아미노산의 수소화에 따른 소수성 결합 (Hydrophobic interaction)을 통해서 두 아미노산 간의 거리가 가까워지게 되어 단백질 구조 및 기능의 변화를 유도하는 현상인 탄포드 트랜지션 (Tanford transition) 과정을 포함할 수 있다.
Z1이 히스티딘 (H)로 구성 시 pH 7.4에서 pH 5.5로 변경됨에 따라 아미노산 곁가지의 순전하 (Net charge)가 양전하를 띄게 되며, 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)과 정전기적 상호작용 (Electrostatic interaction)을 한다.
구체적으로, 상기 세포질 침투 항체의 중쇄가변영역은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 세포질 침투 항체의 경쇄가변영역은 서열번호 6 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 세포질 침투 항체는 상기 중쇄가변영역과 경쇄가변영역의 임의의 조합에 의하여 제조될 수 있다.
본 특허에서 사용한 세포질 침투 항체의 중쇄가변영역의 서열정보는 아래와 같다.
Figure PCTKR2018016844-appb-T000001
본 특허에서 사용한 세포질 침투 항체의 경쇄가변영역의 서열정보는 아래와 같다:
Figure PCTKR2018016844-appb-T000002
또한 본 발명에 의한 세포질 침투 항체는 종양 조직 특이적인 세포질 침투를 위해 종양 조직에 과발현되는 수용체를 표적하는 원형펩타이드 (cyclic peptide) 또는 자연적 리간드가 융합된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양상에서, 상기 세포질 침투 항체에 융합한 원형펩타이드 또는 자연적 리간드는 하기와 같다.
1) EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule) 수용체 표적 원형 펩타이드 Ep133 (출원번호: US20150246945A1)
2) EGFR 수용체의 리간드 EGF m28 돌연변이 (Jennifer L. Lahti et al. (2011), FEBS letter 585;1135-1139)
3) Integrin αvβ3/αvβ5 표적 원형 펩타이드 RGD10 (Peter Holig et al. (2004) Protein Eng Des Sel 17;433-441)
상기 펩타이드 또는 리간드의 서열정보는 다음과 같다:
Figure PCTKR2018016844-appb-T000003
본 발명에 있어서 “RNA 분해효소”, “RNA 분해효소 단백질” 및 “RNase”는 동일한 의미로 사용되며, 인간에서 분비되는 RNA 내부분해효소인 RNase 1 (human pancreatic RNase 1, hpRNase)가 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
인간 유래 RNase (hpRNase)는 다른 RNase처럼 단일사슬 RNA나 이중사슬 RNA 내에 존재하는 피리미딘 염기의 3’말단에 위치한 포스포디에스터결합을 절단하는 활성을 특징으로 하는 RNA 분해효소 A 슈퍼 패밀리에 속한다. 하지만, 인간 유래 RNase (hpRNase)는 스스로 세포질 침투능이 부재하여 단독으로는 세포독성을 보이지가 않는다. 따라서 hpRNase를 타겟 질환세포의 세포질에 전달할 수 있으면, 세포질에 존재하는 다양한 RNA을 가수분해하여 세포독성을 유도할 수 있다.
상기 RNA 분해효소는 인간 세포 유래 angiogenin(RNase5), Eosinophil cationic protein(ECP/RNase3), eosinophil-derived neurotoxin(EDN/RNase2) (Rosenberg, H. F et al. (2008) J Leukoc Biol. 83;1079-1087.) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상에서, 상기 세포질 침투 항체에 융합한 인간 유래 RNA 분해효소는 서열번호 9 내지 11 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열일 수 있으며, 면역독소로 이용하기에 적합하도록 활성을 높이기 위해 자연계에 존재하는 형태와 달리 일부 돌연변이를 포함할 수 있으며, 예시로는 아래와 같은 돌연변이를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
1) 효소의 안정성을 향상시키기 위해 C-말단에 존재하는 6개의 아미노산을 제거(ΔSVEDST)한 돌연변이 (Bal HP et al. (1997) Eur J Biochem 245;465-469; Menzel C et al. (2008) Blood 111;3830-3837).
2) 이를 포함하며, 세포질에 존재하는 RNA 분해효소 억제제를 회피하기 위한 R39D, N67D, N88A, G89D, R91D 돌연변이 (R. Jeremy Johnson et al. (2007) Journal of molecular biology 368;434-449).
3) RNA 분해효소의 활성 부위인 H12, H119 를 알라닌으로 치환하여 비활성화된 형태로 만든 비활성 RNA 분해효소 (Donald Gagne et al., (2013) FEBS journal 280;5596-5607)
상기 RNA 분해효소 돌연변이의 서열정보는 하기와 같다.
Figure PCTKR2018016844-appb-T000004
또한 본 발명에 의한 RNA 분해효소는 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단 또는 경쇄 C-말단에 비절단 또는 절단 링커를 이용하여 융합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 항체 각 도메인, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
본 발명에 있어서 연결자 펩타이드 링커는 (peptide linker)는 항체와 RNase를 유전적으로 융합하는데 쓰이는 것을 의미한다. 상기 연결자 펩타이드 는 다양한 서열과 길이를 가질 수 있으며, 구조적으로 유연성 (flexibility) 및 단단함 (rigidity)이 다르거나, 무작위 (random loop) 또는 나선구조 (helical structure)의 2차 구조적 특징을 가질 수 있다 (Chen X et al. (2013) Advanced Drug Delivery Reviews 65:1357-1369). 상기 펩타이드 링커는 단백질 가수분해 효소에 의해 잘리지 않으면서 구조적 유연성을 부여하는 AAGSSG, GGGGS, (GGGGS)3, GSGSGS 서열 링커를 사용할 수 있다. 또한 상기 펩타이드 링커는 단백질 가수분해 효소 (protease) 에 의해 절단되는 링커 (cleavable linker)를 사용할 수 있다. 예를 들어 퓨린(furin), 카텝신(cathepsin) 효소 등에 의해 절단되는 링커를 사용할 수 있다. 카텝신에 의해 절단되는 링커는 카텝신 효소가 인식하는 보존된 모티프 G-F-L-G↓ (↓ 는 잘리는 위치) 또는 G-F-K-G↓ (↓ 는 절단되는 위치) 서열을 포함할 수 있다. 퓨린에 의해 잘리는 링커는 퓨린이 인식하는 보존된 모티프 서열 -R-X-R/K-R↓- (↓ 는 절단되는 위치를, X는 20종의 아미노산을 의미) 서열을 포함할 수 있다 (Chen X et al. (2013) Advanced Drug Delivery Reviews 65:1357-1369).
또한 본 발명은 세포질 침투항체와 RNase를 연결할 때, 세포 내 단백질 가수분해효소에 의해 잘리는 링커를 사용하여, 세포질 침투항체-RNase 면역독소가 세포내로 들어간 후에 엔도좀에서 절단될 수 있는 링커를 사용하여 RNase 활성에 의한 세포 성장 억제 및 사멸 효과를 증대시킬 수 있는 링커를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양상에서, 상기 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소의 융합에 이용될 수 있는 링커는 하기와 같다.
1) 비절단 AAASSG 링커
2) 엔도좀 cathepsin 효소 특이적 절단 서열인 GFLG을 포함하는 GSGFLG 링커
본 발명에 있어서 “(재조합) 면역독소”는 본 발명에 따른 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소가 융합된 융합단백질을 의미한다. 또한, 본 발명에 따른 면역독소는 일부 아미노산 서열이 변형된 것들로서, 본 발명에 따른 면역독소와 실질적인 동일성을 나타내는 것들을 포함하는 의미로 사용된다. 상기 변형은 아미노산 잔기의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 면역독소를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양상에서는 상기 재조합 면역독소를 이용하여 암 또는 종양 세포의 성장을 억제시키는 방법 및 암 또는 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 조성물이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 세포질 침투 항체와 인간 RNA 분해효소가 융합된 형태의 면역독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)”또는 “핵산”은 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 세포질 침투 항체와 인간 RNA 분해효소가 융합된 형태의 재조합 면역독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(Complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(Stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드는 변형될 것일 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 세포내부로 침투하여 세포질에 분포하는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체와 인간 RNA 분해효소가 융합된 형태의 면역독소의 제조방법의 일예는 아래와 같다.
(1) 세포질 침투능을 가지는 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄와 상기 중쇄의 C- 말단에 인간 RNA 분해효소가 융합된 아미노산을 코딩하는 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 엔도좀 탈출 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 세포질 침투능을 가지는 인간 항체의 경쇄가변영역(VL) 및 경쇄불변영역(CL)이 포함된 경쇄와 상기 경쇄 C- 말단에 인간 RNA 분해효소가 융합된 아미노산을 코딩하는 핵산을 클로닝한 세포질 침투 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 제조된 중쇄 및 경쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환 하여 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투 항체와 인간 RNA 분해효소가 융합된 면역독소를 발현하는 단계; 및
(4) 상기 발현된 면역독소를 정제 및 회수하는 단계.
상기 제조방법에 의해 중쇄와 인간 RNA 분해효소를 발현하는 벡터와 경쇄를 발현하는 벡터를 발현하여 세포내부로 침투하여 세포질에 분포하는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체와 인간 RNA 분해효소가 융합된 형태의 재조합 면역독소를 발현할 수 있다. 벡터는 경쇄와 중쇄를 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 본 발명에서 제공하는 경쇄가변영역(VL), 및 경쇄불변영역(CL), 중쇄가변영역(VH), 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3), 및 인간 RNA 분해효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의해 종양조직 특이적으로 세포내부로 침투하고 세포질에 분포한 후 세포독성 단백질 RNA 분해효소에 의해 세포독성을 보이는 재조합 면역독소의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
발명의 효과
본 발명에 따른 세포질 침투항체-RNase (Cytotransmab-RNase, CT-RNase, CT-R) 면역독소는, 단독으로 세포질 침투능이 없는 RNase를 타겟 세포의 세포질로 전달할 수 있다. 기존에 세포질 침투능이 없는 항체는 RNase를 세포질로 전달할 수가 없다.
본 발명에 따른 세포질 침투항체-RNase (Cytotransmab-RNase, CT-RNase, CT-R) 면역독소는 타겟 세포의 세포질로 RNase를 전달하여 RNase 활성에 의한 세포독성을 보여, 타겟 세포 특이적 세포 성장억제 및 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 타겟세포 특이적 세포질 침투항체-RNase 면역독소는 발현 수율, 물성 및 엔도좀 탈출능이 개량된 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역이 조합된 재조합 면역독소는 종양조직 특이적으로 RNA 분해효소를 세포질로 전달하여 비특이적 세포독성을 보이지 않는다.
본 발명에 따른 세포질 침투항체-RNase 면역독소는 발현 수율, 물성 및 엔도좀 탈출능이 개량된 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역이 조합된 재조합 면역독소는 높은 생산 수율을 통해 치료 약물로 개발이 용이하며, 종양조직 특이적으로 세포질 내부로 RNA 분해효소를 전달하여 효과적인 항암 활성을 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 세포질 침투항체-RNase 면역독소 개념은 RNA 분해효소 외에도, 세포질로 전달되었을 때 높은 세포독성을 보이는 단백질을 전달하여 다양한 질병 치료 및 예방을 위한 약학 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 세포질 침투항체와 RNase를 연결할 때, 세포 내 단백질 가수분해효소에 의해 잘리는 링커를 사용하여, 세포질 침투항체-RNase 면역독소가 세포내로 들어간 후에 엔도좀에서 잘릴 수 있는 링커를 사용하여 RNase 활성에 의한 세포 성장 억제 및 사멸 효과를 증대시킬 수 있다.
본 발명에 따른 세포질 침투 항체-RNase 면역독소는 세균, 식물, 또는 타 동물유래가 아닌, 인간 유래 RNA 분해효소를 융합하여 세포질 침투항체-RNase의 면역원성을 최소화해서, 기존 면역 톡신에서 문제가 되는 면역원성 발생을 회피할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포질 침투 항체 (Cytotransmab) 와 인간유래 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 CT-ep41-R의 발현 및 정제.
본 연구진은 세포질 침투 항체를 이용하여, 종양세포의 세포질로 세포독성 단백질을 전달하여, 높은 세포독성을 나타있는 재조합 면역독소로 개발하기 위해 연구를 진행하였다. 이 때, 선정한 세포독성 단백질은 28 kDa 의 분자량을 가지는 인간 RNA 분해효소이며, 중쇄 C-말단에 융합하여 재조합 면역독소를 구축하고자 하였다. 이 때, 효소의 안정성을 향상시키기 위해 C-말단에 존재하는 6개의 아미노산을 제거(ΔSVEDST)한 돌연변이를 사용하였다 (Bal HP et al. (1997) Eur J Biochem 245:465-9; Menzel C et al.(2008) Blood 111:3830-7). 세포질 침투 항체에 의해 세포질로 전달된 재조합 면역독소는 세포질에 있는 RNA 분해효소 억제제를 회피하여 세포 내 위치하는 RNA 를 분해하고, 최종적으로 세포 사멸을 유도하는 작용기전을 예상하였다. 세포질 침투 항체는 서열번호 1의 중쇄가변영역의 서열을 포함하고, 서열번호 6의 경쇄가변영역의 서열을 포함하는 항체 CT-ep41이다.
도 1은 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소가 세포 내재화 되어 세포질에 위치하기까지의 전체적인 과정 및 작용기전을 나타낸 전반적인 모식도이다.
먼저, 세포질 침투능을 가지는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합하여, 세포독성을 나타낼 수 있는 재조합 면역독소를 발현 및 정제하였다.
도 2a 는 세포질 침투능을 가지는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다. 항체 CT-ep41에서 중쇄가변영역의 서열은 서열번호 1이고, 경쇄가변영역의 서열은 서열번호 6이며, 경쇄 N말단에 서열번호 12의 펩타이드가 융합되어 있는 형태이다.
또한 CT-ep41-R은 상기 CT-ep41 항체 중쇄 C말단에 서열번호 9의 RNA 분해효소가 융합된 형태이다.
구체적으로는, 완전 IgG 형태의 단일클론항체 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 형태로 생산하기 위한 중쇄 발현벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 항체의 중쇄 가변영역(인간화 HT0 VH, 서열번호 1에 해당한다)과 중쇄불변영역 (CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄의 C-말단에 AAASSG 링커를 이용하여 인간 RNA 분해효소를 융합하고 이를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
또한, 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 EpCAM 표적 원형펩타이드가 융합된 세포질 침투 경쇄 가변영역(hT4-ep41 VL, 서열번호 6에 해당한다)과 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
상기 경쇄, 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 200mL 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 파종하여, 150 rpm, 8 % CO2에서 배양하였다. 각각의 단일클론항체 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 중쇄 125μg, 경쇄 125μg 총 250μg (2.5 μg/ml)으로 희석하여, PEI 750 μg (7.5 μg/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150 rpm, 8% CO2에서 배양 후, 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일 동안 배양하였다.
표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
하기 표 5는 다양한 형태의 세포질 침투 항체 및 재조합 면역독소의 생산 수율을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2018016844-appb-T000005
재조합 면역독소의 생산 수율이 세포질 침투 항체와 비교하여 소폭 감소하는 결과를 확인하였다.
실시예 2. 세포질 침투 항체 (Cytotransmab) 와 인간 유래 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 CT-ep41-R 의 세포 성장 억제 평가.
도 2b 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 HCT116 에서 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소를 농도별로 37 도에서 48시간, 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
구체적으로는, 구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 당 3×103 개의 HCT116을 각각 10 % FBS가 포함된 배지 0.2 ml에 희석하여 24 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후 10 nM, 100 nM, 1 μM의 CT-41, CT-ep41, CT-ep41(AAA), CT-41-R, CT-ep41-R, CT-ep41(AAA)-R 를 48, 72시간 처리한 후, WST solution (Dojindo) 10 μl 넣고 450 nm 흡광도를 측정하였다.
CT-ep41-R 은 농도 의존적인 세포 성장 억제를 보였으나, EpCAM 표적 펩타이드가 융합되지 않은 CT-41-R과 CT-ep41-R에서 경쇄가변영역에 존재하는 엔도좀 탈출 모티프를 알라닌으로 치환하여 엔도좀 탈출능을 없앤 CT-ep41(AAA)-R 은 고농도 조건에서도 유의미한 세포 성장 억제를 보이지 않았음을 확인하였다.
실시예 3. 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 CT-ep41-R 의 종양 성장 저해능 확인.
도 3a 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 LoVo 를 이종이식한 쥐에서 종양 조직 EpCAM 특이적 세포질 침투항체 CT-ep41 과 재조합 면역독소 CT-ep41-R 와의 종양 성장 억제 효과를 10 mg/kg의 농도로 정맥주사, 3일 간격으로 총 8회 투여하여 비교한 실험 결과이다.
도 3b 는 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 CT-ep41-R 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 3c 는 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 CT-ep41-R 의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
구체적으로는, in vivo 상에서 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 CT-ep41-R 의 종양 성장 저해를 확인 하기 위하여, BALB/c 누드 마우스에 EpCAM 과발현 인간 대장암 세포주인 LoVo 를 마우스 당 2×106 개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 12일 후 종양의 부피가 약 80~100 mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 대조군 CT-ep41, 실험군 CT-ep41-R 를 10 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 3일 간격으로 총 7 회 정맥 주사 하였고, 캘리퍼 (Caliper)를 이용하여 24일간 종양 부피를 측정하였다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 대조군인 CT-ep41 에 비해 CT-ep41-R 는 암세포 성장이 억제 된 것을 확인하였다. 정량적인 종양 성장 억제율 (Tumor growth inhibition)은 CT-ep41 대비 33.3 %로 확인 되였다.
도 3b에서는 적출된 종양의 무게로 종양 성장 억제율을 구한 결과, 35.3 % 로 확인 되였다.
또한, 도 3c에서 나타난 바와 같이, 재조합 면역독소 CT-ep41-R 실험군 마우스의 체중의 변화가 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 다른 독성은 없음을 확인 하였다.
실시예 4. 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체 (Cytotransmab) 와 다양한 형태의 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 발현 및 정제.
재조합 면역독소가 더 높은 세포독성을 보이기 위해서는 세포질로 전달되는 RNA 분해효소의 양이 많아야 한다. 따라서, 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체를 개발하여 그 항체 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합하고자 하여, 최종적으로 세포질에 위치하는 RNA 분해효소의 양을 늘리고자 하였다. 이 때, 개발한 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체인 CT01-ep41 은 선행 특허에 기술되어 있다. (특허출원공개 제10-2018-0129514호)
구체적으로 항체 CT01-ep41에서 중쇄가변영역의 서열은 서열번호 2이고, 경쇄가변영역의 서열은 서열번호 6이다.
또한, 인간 RNA 분해효소의 활성을 향상시키기 위하여, RNA 분해효소의 돌연변이 형태를 조사하였다. 세포질에는 인간 유래 RNA 분해효소에 대한 저해제가 존재하고 있고, 이를 회피하기 위해 R39D, N67D, N88A, G89D, R91D 돌연변이를 도입하였을 때, 세포독성이 향상되었음이 문헌에 보고되어 있다 (R. Jeremy Johnson et al., (2007) Journal of molecular biology 368;434-449). 따라서, 본 연구진은 억제제 회피 돌연변이가 도입된 RNA 분해효소를 세포질 침투 항체 중쇄 C-말단에 융합(CT-ep41-RIE, CT01-ep41-RIE)하였다. 상기 RNA 분해효소는 서열번호 10이다.
마지막으로, RNA 분해효소의 활성 부위인 H12, H119 를 알라닌으로 치환하여 비활성화된 형태로 만든 비활성 RNA 분해효소 (Donald Gagne et al., (2013) FEBS journal 280;5596-5607)의 서열변호는 11이며, 역시 세포질 침투 항체 중쇄 C-말단에 융합하였다 (CT-ep41-R*).
도 4a 는 엔도좀 탈출능이 향상된 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
구체적으로는, 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 중쇄가변영역 (인간화 HT0-01 VH, 서열번호 2 해당한다) 을 포함하는 중쇄 C-말단에 비활성화 및 억제제 회피 RNA 분해효소가 융합되도록 또는 엔도좀 탈출능 모티프가 부여된 중쇄가변영역을 포함하는 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합되도록 동물발현 벡터에 클로닝하고, EpCAM 표적 원형펩타이드가 융합된 세포질 침투 인간화 항체 경쇄가변영역 (서열번호 6)을 포함하는 경쇄 발현백터와 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 개별클론을 발현하였고, 상기 실시예 1와 동일하게 정제하였다.
하기 표 6은 다양한 형태의 세포질 침투 항체 및 재조합 면역독소의 생산 수율을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2018016844-appb-T000006
CT01-ep41-R 의 생산 수율이 CT-ep41-R, CT-ep41-R*, CT-ep41-RIE 과 비교하여 50 % 정도 낮은 결과를 확인하였다.
실시예 5. 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체 (Cytotransmab) 와 다양한 형태의 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 세포 성장 억제 평가.
도 4b 은 EpCAM 과발현 대장암 세포주 HCT116 에 엔도좀 탈출능이 향상된 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소를 농도별로 37 ℃에서 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 당 3×103 개의 HCT116을 각각 10 % FBS가 포함된 배지 0.2 ml에 희석하여 24 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후 10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM의 CT-41, CT01-ep41, CT-ep41-R, CT01-ep41-R, CT-ep41-R* (Inactive form), CT-ep41-RIE (Inhibitor evasion) 를 72시간 처리한 후, WST solution (Dojindo) 10 μl 넣고 450 nm 흡광도를 측정하였다.
엔도좀 탈출능이 향상된 CT01-ep41-R 은 기존의 CT-ep41-R 에 비하여 향상된 세포 성장 억제를 보임을 확인하였다. 기대와 다르게 억제제 회피 RNA 분해효소를 포함하는 CT-ep41-RIE 는 CT-ep41-R 과 거의 유사한 세포독성을 보였다. 반면, 비활성화 RNA 분해효소를 포함하는 CT-ep41-R*는 고농도 조건에서도 유의미한 세포 성장 억제를 보이지 않았음을 확인하였다.
본 연구진은 이 결과를 통해 높은 엔도좀 탈출능이 재조합 면역독소의 높은 치료효과에 주요한 요소임을 확인하였고, 이 후 개발할 재조합 면역독소에는 억제제 회피 RNA 분해효소 (서열번호 10)를 고정하여 사용하였다.
실시예 6. 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체 (Cytotransmab) 와 다양한 형태의 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 물성 평가.
치료제 특히 바이오의약품이 최종적으로 신약으로 개발되기 위해서는 약물 자체의 물성에 문제가 없어, 생체 내에서 응집 또는 분해되지 않고 질환조직까지 온전히 전달되는 것이 매우 중요하다. 이를 간접적으로 확인할 수 있는 요소를 단백질 약물의 소수성을 평가하는 것이다. 소수성이 높은 단백질은 단백질 분자간의 비특이적 상호작용에 의하여 응집될 가능성이 높다.
이에 본 연구진은 상기 실시예 4에서 앞으로 사용할 억제제 회피 RNA 분해효소가 융합된 CT-ep41-RIE 과 높은 세포독성을 보인 CT01-ep41-R 의 품질을 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liuid Chromatography)에서 단백질의 소수성을 평가할 수 있는 Zenix (Sepax technologies) 컬럼을 이용하여 확인하였다.
도 5는 재조합 면역독소를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 단백질의 소수성을 평가할 수 있는 Zenix 컬럼으로 분석하였을 때 280 nm에서의 mAU값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, CT-ep41-RIE, CT01-ep41-R 를 1 mg/ml 의 농도로 80 μl 준비한 후 인서트에 넣어 샘플을 준비하였다. 크기배재크로마토그래피 컬럼의 경우 150 mM sodium phosphate, 137 mM NaCl pH 7.0 버퍼를 1.0 ml/min의 유속으로 흘려 주어 압력과 280 nm에서의 mAU 값이 안정화 될 때까지 기다려 준비하였다. 이후 준비된 샘플을 동일 유속으로 20 μl 로딩하여 30분 동안의 280 nm 에서의 mAU 값을 측정하였다.
CT-ep41-RIE은 대조군은 단일클론항체인 Herceptin 과 유사한 시간에 피크가 관찰되었으나, CT01-ep41-R 은 대조군에 비하여 늦은 시간에 피크가 관찰되었고 피크의 넓이도 비정상적으로 넓게 관찰되었다. 이와 같은 결과는 CT01-ep41 의 중쇄가변영역과 경쇄가변영역에 포함된 엔도좀 탈출능 모티프인 WYW 에 의하여 높은 소수성에 의한 것으로 판단하였다.
실시예 7. 물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체와 억제제 회피 인간 유래 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 구축.
엔도좀 탈출능 모티프가 중쇄가변영역과 경쇄가변영역에 모두 부여된 CT01-ep41 의 높은 소수성을 보완하기 위하여 더 안정적인 중쇄가변역영 골격을 도입하여, 전체적인 항체의 안정성을 높여 수율을 개선하고 높아진 소수성을 견딜 수 있도록 항체를 개발하였으며, 이 때, 개발한 물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체인 Humira01-ep41 은 선행 특허에 기술되어 있다 (한국 특허출원공개 제2018-0129514호). 본 특허에서는 Hu01-ep41 로 기술하였다. 항체 Hu01-ep41에서 중쇄가변영역의 서열은 서열번호 3이고, 경쇄가변영역의 서열은 서열번호 6이다.
또한, RNA 분해효소가 세포질에서 자유롭게 위치하여 RNA 와의 상호작용이 용이할 수 있도록 항체와 RNA 분해효소를 연결하는 링커를 기존의 비절단성 링커인 AAASSGS 대신 엔도좀에 위치하는 카뎁신 B에 의하여 절단되는 절단성 링커인 GSGFLG 링커를 사용하여, 세포질 침투항체 중쇄 C-말단에 억제제 회피 RNA 분해효소를 융합하였다.
도 6a 는 물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 또는 경쇄 C-말단에 서로 다른 2개의 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
구체적으로는, 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 엔도좀 탈출능이 부여된 임상승인항체 중쇄가변영역 (Hu01 VH) 을 포함하는 중쇄 C-말단에 비절단성 링커와 절단성 링커를 이용하여 억제제 회피 RNA 분해효소가 융합되도록 동물발현 벡터에 클로닝하고, EpCAM 표적 원형펩타이드가 융합된 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터 또는 경쇄 C-말단에 억제제 회피 RNA 분해효소가 융합되도록 동물발현 벡터에 클로닝하여 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 개별클론을 발현하였고, 상기 실시예 1와 동일하게 정제하였다.
하기 표 7은 다양한 형태의 세포질 침투 항체 및 재조합 면역독소의 생산 수율을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2018016844-appb-T000007
Hu01-ep41-RIE 의 생산 수율이 1 L 당 4 mg 수준으로 매우 낮은 값을 나타내는 결과를 확인하였다.
실시예 8. 물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체와 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 세포 성장 억제 평가
도 6b 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 SW480 에 물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 또는 경쇄 C-말단에 서로 다른 2개의 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소를 농도별로 37 도에서 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 당 3×103 개의 HCT116을 각각 10 % FBS가 포함된 배지 0.2 ml에 희석하여 24 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후 10 nM, 100 nM, 1 μM의 CT-ep41, CT-ep41-R, Hu01-ep41-RIE, Hu01-ep41-RIE (LC), Hu01-ep41-RIE (GSGFLG) 를 72시간 처리한 후, WST solution (Dojindo) 10 μl 넣고 450 nm 흡광도를 측정하였다.
물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 Hu01-ep41-RIE 은 기존의 CT-ep41-R 에 비하여 향상된 세포 성장 억제를 보임을 확인하였다. 경쇄 C-말단에 RNA 분해효소를 융합한 Hu01-ep41-RIE (LC) 은 중쇄 C-말단에 융합한 Hu01-ep41-RIE 과 유사한 세포 성장 억제를 보였으며, 절단성 링커를 포함하는 Hu01-ep41-RIE (GSGFLG) 는 소폭 상승된 세포 성장 억제를 보임을 확인하였다.
본 연구진은 이 결과를 통해 이후 개발할 재조합 면역독소에는 중쇄가변영역에 절단성 링커인 GSGFLG 를 고정하여 사용하였다.
실시예 9. 물성 및 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체 (Cytotransmab) 와 다양한 형태의 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 물성 평가.
도 6c 는 세포질 침투항체와 재조합 면역독소를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 단백질의 소수성을 평가할 수 있는 Zenix 컬럼으로 분석하였을 때 280 nm에서의 mAU값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, Hu01-ep41, Hu01-ep41-RIE 를 1 mg/ml 의 농도로 80 μl 준비한 후 인서트에 넣어 샘플을 준비하였다. 크기배재크로마토그래피 컬럼의 경우 150 mM sodium phosphate, 137 mM NaCl pH 7.0 버퍼를 1.0 ml/min의 유속으로 흘려 주어 압력과 280 nm에서의 mAU 값이 안정화 될 때까지 기다려 준비하였다. 이후 준비된 샘플을 동일 유속으로 20 μl 로딩하여 30분 동안의 280 nm 에서의 mAU 값을 측정하였다.
Hu01-ep41 은 대조군인 Herceptin 보다 늦은 시간에 피크가 관찰되지만 이전 CT01-ep41 보다 샤프한 형태를 띠고 있으며, Hu01-ep41-RIE 역시 샤프한 형태의 피크가 관찰되었다. RNA 분해효소가 융합됨에 따라 분자량이 커져 단일클론항체보다 빠른 시간에 피크가 관찰되었다.
실시예 10. 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 항체와 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 구축
Hu01-ep41-RIE 는 물성에 문제가 없었으나, 발현 수율이 매우 낮아 이 후 실험을 진행하기에 부적합하였다. 이에 본 연구진은 물성을 유지하며 발현 수율을 높이는 전략으로 세포질 침투 항체를 개발하였다 (한국 특허출원공개 제2018-0129514호).
도 7a 는 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체 2종의 중쇄 C-말단에 절단성 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다. 항체 epCT65에서 중쇄가변영역의 서열은 서열번호 4이고, 경쇄가변영역은 서열번호 7이다. 항체 epCT74에서 중쇄가변영역의 서열은 서열번호 5이고, 경쇄가변영역의 서열은 서열번호 8이다.
구체적으로는, 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 엔도좀 탈출능이 부여된 중쇄가변영역 (CT10, CT12 VH) 을 포함하는 중쇄 C-말단에 절단성 링커를 이용하여 억제제 회피 RNA 분해효소가 융합되도록 동물발현 벡터에 클로닝하고, EpCAM 표적 원형펩타이드가 융합된 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터를 클로닝하여 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 개별클론을 발현하였고, 상기 실시예 1와 동일하게 정제하였다.
하기 표 8은 다양한 형태의 세포질 침투 항체 및 재조합 면역독소의 생산 수율을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2018016844-appb-T000008
epCT65-RIE, epCT74-RIE 의 생산 수율이 Hu01-ep41-RIE 과 비교하여 크게 향상된 결과를 확인하였다.
도 7b 는 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체 2종과 이의 중쇄 C-말단에 절단성 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
구체적으로는, 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체는 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 보여주었다. RNA 분해효소가 융합된 재조합 면역독소는 70 kDa의 중쇄, 25 kDa 의 경쇄에서 밴드가 관찰되었다. 이는 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체 2종과 이의 중쇄 C-말단에 절단성 링커를 이용하여 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소들이 용액 상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
실시예 11. 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능이 향상된 세포질 침투 항체와 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 물성 평가.
도 7c 는 발현 수율을 향상시킨 세포질 침투항체 및 재조합 면역독소를 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 단백질의 소수성을 평가할 수 있는 Zenix 컬럼으로 분석하였을 때 280 nm에서의 mAU값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, epCT65, epCT65-RIE, epCT74, epCT74-RIE 를 1 mg/ml 의 농도로 80 μl 준비한 후 인서트에 넣어 샘플을 준비하였다. 크기배재크로마토그래피 컬럼의 경우 150 mM sodium phosphate, 137 mM NaCl pH 7.0 버퍼를 1.0 ml/min의 유속으로 흘려 주어 압력과 280 nm에서의 mAU 값이 안정화 될 때까지 기다려 준비하였다. 이후 준비된 샘플을 동일 유속으로 20 μl 로딩하여 30분 동안의 280 nm 에서의 mAU 값을 측정하였다.
epCT65, epCT74 는 대조군인 Herceptin 보다 늦은 시간에 피크가 관찰되지만 샤프한 형태를 띠고 있으며, epCT65 -RIE, epCT74 -RIE 역시 샤프한 형태의 피크가 관찰되었다. RNA 분해효소가 융합됨에 따라 분자량이 커져 단일클론항체보다 빠른 시간에 피크가 관찰되었다. 따라서, 발현 수율을 증가시켰을 때에도 물성 측면에서의 문제점이 확인되지 않음을 확인하였다.
실시예 12. 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 항체와 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 세포 성장 억제 평가.
도 8은 EpCAM 과발현 대장암 세포주 HCT116, DLD-1, SW480 및 EpCAM 미발현 세포주 HeLa 에 발현 수율 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체 2종의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소를 농도별로 37 ℃에서 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 CTG 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 당 3×103 개의 HCT116, DLD-1, SW480 및 2×103 개의 HeLa을 각각 10 % FBS가 포함된 배지 0.2 ml에 희석하여 24 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후 10 nM, 100 nM, 1 μM의 epCT65, epCT74, epCT65 -RIE, epCT74 -RIE 를 72시간 처리한 후, CellTiter Glo solution (Promega) 100 μl 넣고 반응시킨 후 발광을 측정하였다.
epCT65 -RIE, epCT74 -RIE 모두 농도 의존적인 세포 성장 억제를 보이나, 두 재조합 면역독소 간의 유의미한 효능 차이를 보이지 않음을 확인하였다. 따라서, 본 연구진은 이 결과를 통해 RNA 분해효소 융합시 발현 수율에 차이가 거의 없는 epCT65 -RIE 을 선정하여, 이 후 실험을 진행하였다.
실시예 13. 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 항체와 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 세포질 침투 확인.
개발한 재조합 면역독소가 세포질 침투 항체에 의해 실제 세포질에 위치하여 세포독성을 나타내는지 확인하였다.
도 9 은 EpCAM 과발현 대장암 세포주 SW480 에 발현 수율 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 세포질 침투능을 공초점 현미경 (confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 커버슬립을 넣고 각 웰 당 3 ×104개의 SW480 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 0.5 ml로 넣어 12시간 동안 5 % CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 그 후 각 웰에 새로운 배지 0.5 ml에 epCT65, epCT65-RIE 1 μM을 37℃에서 6 시간 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 약산성용액(200mM glycine, 150mM NaCl pH 2.5)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거하였다. PBS 세척 후, 4% 파라포름알데히드 첨가 후 25℃ 조건으로 10분간 세포를 고정하였다. 이후 PBS로 세척하고, PBS에 0.1% 사포닌, 0.1% 아지드화 나트륨, 1% BSA가 첨가되어있는 완충액으로 25℃, 10분간 배양하여 세포막에 구멍을 형성하는 과정을 거쳤다. 다시 PBS로 세척 후, 비특이적 결합을 억제하기 위해 PBS에 2% BSA가 첨가된 완충액으로 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, epCT65, epCT65-RIE 는 Alexa488 (녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색 (청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
epCT65, epCT65-RIE 를 처리한 세포 내부에서의 형광이 관찰되었다. 따라서, 재조합 면역독소가 세포질 침투 항체와 함께 세포질 내부로 전달되었다는 것을 확인하였다.
실시예 14. 발현 수율을 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 항체와 억제제 회피 인간 RNA 분해효소를 융합한 재조합 면역독소의 RNA 분해효소 활성 평가.
재조합 면역독소에 융합된 RNA 분해효소가 세포질 침투 항체에 융합되었을 때에도 RNA 분해 활성을 나타내는지 확인하였다. 또한, 억제제를 회피할 수 있는 인간 RNA 분해효소 돌연변이체를 사용하였기에, 억제제 처리시, 효소의 활성이 유지되는지 확인하였다.
도 10a 는 야생형 인간 RNA 분해효소와 발현 수율 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 융합된 억제제 회피 인간 RNA 분해효소의 RNA 분해효소 억제제 유무에 따른 RNA 분해 활성을 측정한 결과이다.
구체적으로는, RNase Alert Lab Test Kit v2 (Ambion by life technologies™) 시약의 프로토콜에 따라, 야생형 인간 유래 RNA 분해효소(SinoBio) 14.1, 28.1, 56.3 pM, epCT65-RIE 113, 225, 450 pM 와 형광 표지된 RNA 기질을 25 ℃에서 반응시키고, 1시간 동안 5초간격으로 형광값을 측정하였다.
시간별로 형광값을 측정한 후, 효소의 활성을 나타내는 K cat/Km 값을 계산한 결과, 야생형 인간 유래 RNA 분해효소는 8.9 ×107 M-1s-1, epCT65-RIE 는 4.1 ×106 M-1s-1 이며, 항체 C-말단에 융합시, 20배 정도 낮은 RNA 분해 활성을 보임을 확인하였다. 야생형 인간 유래 RNA 분해효소 56.3 pM 과 epCT65-RIE 225 pM 이 유사한 정도의 RNA 분해 활성을 보여, 이 농도에서 억제제 유무에 따른 RNA 분해효소의 RNA 분해 활성을 확인하였다.
도 10b 는 야생형 인간 RNA 분해효소의 RNA 분해효소 억제제 유무에 따른 RNA 분해 활성을 측정한 결과이다.
도 10c 는 발현 수율 향상시킨 엔도좀 탈출능 향상 완전 IgG 형태의 종양 EpCAM 특이적 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 융합된 억제제 회피 인간 RNA 분해효소의 RNA 분해효소 억제제 유무에 따른 RNA 분해 활성을 측정한 결과이다.
구체적으로는, RNase Alert Lab Test Kit v2 (Ambion by life technologies™) 시약의 프로토콜에 따라, 야생형 인간 유래 RNA 분해효소 56.25 pM, epCT65-RIE 225 pM 와 형광 표지된 RNA 기질을 25 ℃에서 반응시키고, 1시간 동안 5초간격으로 형광값을 측정하였다.
epCT65-RIE의 경우, 억제제 처리시, RNA 분해 활성이 감소하기는 하나, 10U 수준의 높은 농도의 저해제를 처리하였을 때에도 RNA 분해 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 그러나, 야생형 RNA 분해효소의 경우, 0.1U 수준의 낮은 농도로 저해제를 처리하였을 때에도 RNA 분해 활성이 대부분 사라지는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해, 재조합 면역독소가 세포독성을 나타내는 작용기전이 RNA 분해효소의 RNA 분해 활성에 의한 것임을 확인하였으며, 야생형 RNA 분해효소와 달리, 세포질에 RNA 분해효소 억제제가 존재하여도 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 15. 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소의 구축 및 약동학 (pharmacokinetics) 평가
재조합 면역독소가 체내에서 오래 머물수록 종양 조직에 도달하여 종양 세포의 사멸을 유도할 가능성은 높아진다. IgG 형태의 항체는 체내 면역세포의 Fc receptor와 결합하여 ADCC 기작을 통해 제거될수 있으며, 이 상호작용을 감소시키면 면역세포에 의해 제거되는 항체의 양을 감소시킬 수 있다. 다양한 Fc receptor 에 대한 친화도는 감소시키고, 반감기에 주요한 역할을 하는 FcRn 에 대한 친화도는 유지되는 LALA-PG 돌연변이가 보고되어 있다 (Tilman Schlothauer et al., (2016) Protein engineering, design and selection 29;457-466). 따라서, 본 연구진은 이 돌연변이를 도입하는 재조합 면역독소를 구축하였다.
도 11a 는 체내 지속성을 향상시키기 위해 LALA-PG 돌연변이를 도입한 종양 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
구체적으로는, 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 억제제 회피 RNA 분해효소가 융합된 중쇄의 중쇄불변영역에 LALA-PG 돌연변이를 도입하여 동물발현 벡터에 클로닝하고, EpCAM 표적 원형펩타이드가 융합된 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터를 클로닝하여 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 개별클론을 발현하였고, 상기 실시예 1와 동일하게 정제하였다.
하기 표 9는 다양한 형태의 세포질 침투 항체 및 재조합 면역독소의 생산 수율을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2018016844-appb-T000009
epCT65(LALA-PG)-RIE 의 생산 수율이 epCT65-RIE 과 비교하여 유의미하게 감소하지 않음을 확인하였다.
도 11b 는 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP의 약동학을 BALB/c 누드 마우스에서 확인한 결과이다.
구체적으로는, BALB/c 누드 마우스에 실험군 epCT65, epCT65-RIE, epCT65(LALA-PG), epCT65(LALA-PG)-RIE 를 10 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 이후, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24시간; 2, 4, 7, 14, 21, 28일에 각각 마우스 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 12000 rpm, 10 분, 4 도 조건으로 원심분리한뒤 상등액인 혈장만 -80 ℃에 보관하였다. 이후 혈장내의 epCT65, epCT65-RIE, epCT65(LALA-PG), epCT65(LALA-PG)-RIE 의 농도를 분석하기 위하여 ELISA 를 실시하였다. 구체적으로, 항-human Fab 항체 (Sigma)을 96웰 half-area 플레이트(Corning)에 각각 2.5 μg/ml의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (PBS, pH7.4, 0.1 % Tween20) 로 3회 세척한다. 1% PBSB (PBS, pH 7.4, 1% BSA)로 1 시간 동안 결합한 후, 채취한 혈액 및 정제한 항체(기준 곡선용)를 1% PBSB에 희석하여 2 시간 동안 결합시킨 후 0.1% PBST로 3회 세척한다. 이후 HRP가 접합된 항-human IgG, Fc 항체 (Sigma)을 표지항체로 1 시간 동안 결합시킨 후 0.1% PBST로 3회 세척한다. TMB ELISA solution으로 반응시키고, 황산용액으로 반응을 중단시킨 후, 450 nm 흡광도를 정량하였다.
도 11b 에서 나타난 바와 같이, 체내 지속성이 향상된 epCT65(LALA-PG), epCT65(LALA-PG)-RIE 의 경우 대조군인 epCT65, epCT65-RIE 보다 높은 반감기를 가지고 있으며, RNA 분해효소의 융합이 반감기에 큰 영향을 주지 않음을 확인하였다.
실시예 16. 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소의 종양 성장 저해능 확인.
도 12a 는 EpCAM 과발현 대장암 세포주 HCT116과 EpCAM 미발현 대장암 세포주 Colo320DM 를 이종이식한 쥐에서 종양 조직 EpCAM 특이적 세포질 재조합 면역독소 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 의 종양 성장 억제 효과를 10 mg/kg의 농도로 정맥주사, 일주일에 2번, 총 6회 또는 5회 투여하여 확인한 실험 결과이다.
도 12b 는 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 12c 는 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
구체적으로는, in vivo 상에서 종양 조직 EpCAM 특이적 재조합 면역독소 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 의 종양 성장 저해를 확인 하기 위하여, BALB/c 누드 마우스에 EpCAM 과발현 인간 대장암 세포주인 HCT116, EpCAM 미발현 인간 대장암 세포주 Colo320DM 를 마우스 당 3×106 개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 12일 후 종양의 부피가 약 100~120 mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 대조군 epCT65, epCT65-R* (Inactive form), 실험군 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 를 10 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 일주일에 2번 간격으로 총 6 회 또는 5 회 정맥 주사 하였고, 캘리퍼 (Caliper)를 이용하여 21일 또는 17일간 종양 부피를 측정하였다.
도 12a에 나타난 바와 같이, 대조군인 epCT65, epCT65-R* 에 비해 CT- epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 는 암세포 성장이 억제 된 것을 확인하였다. 하지만, epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 간의 차이는 거의 없었다. 정량적인 종양 성장 억제율 (Tumor growth inhibition)은 epCT65 대비 51.1 % 로 확인 되었다.
도 12b에서는 적출된 종양의 무게로 종양 성장 억제율을 구한 결과, 58.2 % 로 확인 되였다.
또한, 도 12c에서 나타난 바와 같이, 재조합 면역독소 epCT65-RIE 와 epCT65 (LALA-PG)-RIE 실험군 마우스의 체중의 변화가 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 다른 독성은 없음을 확인 하였다.
실시예 17. EGF 를 경쇄가변영역 N-말단에 융합하여 종양 EGFR 특이적인 재조합 면역독소의 구축
본 연구진은 종양 조직 특이적 표적으로써, EpCAM 이외에 추가적인 수용체를 탐색하였고, 다양한 소분자 의약품 및 항체의 표적으로 연구되고 있는 EGFR 을 새로운 종양 조직 특이적 표적으로 선정하였다. EGFR 을 표적하기 위해, 체내에 존재하는 자연적 리간드인, EGF 을 경쇄가변영역 N-말단에 융합하였다. 이 때, 본 연구진이 사용한 EGF 는 EGFR 에 대한 친화도가 향상된 돌연변이 m28 을 이용하였다 (Jennifer L. Lahti et al., (2011) FEBS letter 585;1135-1139). EGF 야생형 또는 m28 돌연변이 모두 엔도좀의 산성조건인 pH 5-6 에서는 EGFR 에 대한 친화도가 크게 감소하는 특성을 가지고 있다. 따라서, 세포질 침투 항체가 EGF 돌연변이와 EGFR 결합에 의해 세포내제화 되고, 엔도좀에서 EGF 가 EGFR 로부터 떨어져, 자유롭게 위치하게 되고, 최종적으로 엔도좀을 탈출하여 세포질에 위치할 수 있다.
도 13a 는 EGF 를 경쇄가변영역 N-말단에 융합하여 종양 EGFR 특이적인 재조합 면역독소 구축 재조합 면역독소 구축을 설명한 모식도이다.
구체적으로는, 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 엔도좀 탈출능이 부여된 중쇄가변영역을 포함하는 중쇄 C-말단에 절단성 링커를 이용하여 억제제 회피 RNA 분해효소가 융합되도록 동물발현 벡터에 클로닝하고, EGF가 경쇄가변영역 N-말단에 융합된 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터를 클로닝하여 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 개별클론을 발현하였고, 상기 실시예 1와 동일하게 정제하였다.
하기 표 10은 EGF 가 경쇄가변영역 N-말단에 융합된 세포질 침투 항체 및 재조합 면역독소의 생산 수율을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2018016844-appb-T000010
EGF mut CT65, EGF mut CT65-RIE 의 생산 수율이 EpCAM 표적 재조합 면역독소와 비교하여 유사한 정도임을 확인하였다.
실시예 18. EGF 를 경쇄가변영역 N-말단에 융합하여 종양 EGFR 특이적인 재조합 면역독소의 세포 성장 억제 평가.
도 13b 는 EGFR 과발현 폐암 세포주 A549 에 EGF 를 경쇄가변영역 N-말단에 융합하여 종양 EGFR 특이적인 재조합 면역독소를 농도별로 37 도에서 72시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 당 2×103 개의 A549을 각각 10 % FBS가 포함된 배지 0.2 ml에 희석하여 24 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후 10 nM, 100 nM, 1 μM의 EGF mut CT65, EGF mut CT65-RIE, epCT65(LALA-PG)-RIE 를 72시간 처리한 후, WST solution (Dojindo) 10 μl 넣고 450 nm 흡광도를 측정하였다.
EGFR 과발현 세포주인 A549 에서 EGF mut CT65- RIE 은 농도 의존적으로 유의미한 세포 성장 억제를 보임을 확인하였다. 이 결과를 통해 다양한 종양 조직 특이적 수용체를 표적하여 재조합 면역독소를 전달할 수 있음을 확인하였다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (18)

  1. 세포질 침투 항체에 융합된 RNA 분해효소를 포함하는 면역독소.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포질 침투 항체는 세포내로 내재화한 이후 엔도좀을 탈출하여 세포질 내에 위치할 수 있는 것임을 특징으로 하는 면역독소.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 분해효소는 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단 및/또는 경쇄 C-말단에 융합된 것을 특징으로 하는 면역독소.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 세포질 침투 항체와 RNA 분해효소는 비절단 링커, 또는 엔도좀 내에서 절단되는 특성을 가진 링커를 통해 융합된 것을 특징으로 하는 면역독소.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 링커는 엔도좀 내에서 절단되는 GFLG 서열을 포함하는 GSGFLG 링커 및 비절단 링커는 구조적 유연성을 가지는 비절단 서열인 AAASSG 링커로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역독소.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 분해효소는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 면역독소.
  7. 제1항에 있어서.
    상기 RNA 분해효소는 세포질내에서 RNA 분해효소 억제제를 회피하기 위한 돌연변이를 도입한 것을 특징으로 하는 면역독소.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포질 침투 항체는 종양세포에서 과발현된 EpCAM, EGFR, integrin αvβ3/αvβ5 중 선택된 어느 하나 이상을 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 면역독소.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
  12. 제11항에 따른 숙주세포를 배양하고, 생산된 면역독소를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 아래 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역독소의 제조방법:
    (1) 세포질 침투능을 가지는 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄와 상기 중쇄의 C- 말단에 인간 RNA 분해효소가 융합된 아미노산을 코딩하는 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 엔도좀 탈출 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 상기 세포질 침투능을 가지는 인간 항체의 경쇄가변영역(VL) 및 경쇄불변영역(CL)이 포함된 경쇄와 상기 경쇄 C- 말단에 인간 RNA 분해효소가 융합된 아미노산을 코딩하는 핵산을 클로닝한 세포질 침투 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (3) 상기 제조된 중쇄 및 경쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환 하여 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투 항체와 인간 RNA 분해효소가 융합된 면역독소를 발현하는 단계; 및
    (4) 상기 발현된 면역독소를 정제 및 회수하는 단계.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역독소를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암은 EpCAM, EGFR, integrin αvβ3/αvβ5 중 선택된 어느 하나 이상이 과발현된 암종인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  16. 세포질 침투 항제에 RNA 분해효소가 융합된 형태로 RNA 분해효소를 세포질 내부로 전달하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포질 침투 항체는 세포내로 내재화한 이후에 엔도좀을 탈출하여 세포질 내에 위치함으로써 상기 RNA 분해효소를 세포질 내부로 전달하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 RNA 분해 효소는 상기 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단 및/또는 경쇄 C-말단에 융합된 것을 특징으로 하는 방법.
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