WO2016153276A1 - 뉴로필린1 특이적 결합 펩타이드 및 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 및 이의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a peptide (TPP, tumor penetrating peptide) that specifically binds to Neuropilin-1 (NRP1, Neuropilin 1).
  • TPP tumor penetrating peptide
  • NRP1 Neuropilin-1
  • the peptide of the present invention is a peptide that selectively binds only to NRP1 with high affinity, which is constructed by screening and mutating a library of peptides that simultaneously bind to Neuropilin 1 (NRP1) and Neuropilin 2 (NRP2). It is about.
  • the present invention also relates to a fusion protein, a small molecule drug, a nanoparticle or a liposome to which a peptide specifically binding to NRP1 is fused.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a peptide that specifically binds to the NRP1.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer or neovascular diseases, including peptides that specifically bind to the NRP1, or fusion proteins, small molecule drugs, peptides, nanoparticles or liposomes to which the peptides are fused. It is about.
  • the present invention relates to a peptide for binding specifically to the NRP1 or a composition for the diagnosis of cancer or neovascular disease, including a fusion protein, small molecule drug, peptide, nanoparticles or liposomes fused to the peptide.
  • the present invention relates to a method for selecting a peptide that specifically binds to NRP1 by constructing a peptide library on the surface of the yeast cell at the C-terminus of the constant region of the antibody heavy chain.
  • Antibodies are proteins that act to neutralize antigens by binding to high specificity and high affinity for antigens. In addition, it has antibody-dependent cellular cytotoxicity and complement-dependent cellular cytotoxicity, which are functions of the heavy chain constant region of the antibody, and binds to blood through binding with neonatal Fc receptor (FcRn).
  • FcRn neonatal Fc receptor
  • FcRn neonatal Fc receptor
  • the combination of high specificity and high affinity to antigens can reduce unwanted side effects and can lead to disease with antibody-dependent cellular cytotoxicity and complement-dependent cellular cytotoxicity. It can induce the death of induced cells, and long half-life in the blood can be expected to effect long-lasting antibodies. Because of the nature of these antibodies, studies are actively underway to develop them as therapeutic proteins.
  • Cancer antibodies developed to date are classified into two categories: antibodies for treating solid tumors and antibodies for treating leukemia / lymphoma.
  • the response rates of treatment with each class of antibody alone differ between the two antibodies.
  • the treatment response rate of the anticancer antibody alone was 30-51%, whereas the treatment response rate of the solid cancer antibody alone was 8-15%, which is relatively low. .
  • the amount of antibody that accumulates in tumor tissues in humans is due to the various obstacles that are present in solid cancer treatment antibody accumulation and penetration into cancer tissues to reach cancer cells within tissues. Very low 0.01 to 0.0001% dose / g injected tissue per gram tumor tissue, resulting in low therapeutic response rates (Thurber et al. 2008). Therefore, it is very important to develop an antibody technology in which antibodies are selectively accumulated in tumor tissues and have high permeability into tumor tissues, thereby increasing the therapeutic effect of antibodies for treating solid cancers.
  • the reasons why the antibody does not penetrate the tissue well include: 1) the essential characteristics of the antibody (size ( ⁇ 150 kDa), antigen-binding barrier, etc. (Thurber and Dane Wittrup, 2012), and 2) normal Two different histological and physiological characteristics of tumor tissues (e.g., incomplete and abnormal blood vessel formation, very low lymph node formation, high cell density, high extracellular matrix density, etc.) can be attributed to both tissues (Jain and Stylianopoulos, 2010). Therefore, various methods such as the use of antibody engineering techniques that control the size and antigen-binding specificity of antibodies or co-administration with molecules (so-called promoter agents) that enhance the infiltration of tumor tissues of antibodies are used. Effort has been raced.
  • Fab antigen binding fragments
  • scFv single chain variable fragments
  • VH heavy chain variable domain
  • the fragment of the antibody has no Fc portion and is small in size, the half-life of the antibody is shortened due to the large kidney when it is administered in vivo, and the efficacy of the antibody is not significantly improved (Behr et al. 1998).
  • Antibodies for treating solid cancers have a high affinity for tumor-associated antigens, or targets that are overexpressed in tumors and important for tumor growth. Even when the antibody reaches a tissue with a specific antigen, in the tumor tissue composed of cells with high antigen expression, the antibody stays on the surface of the tumor tissue with the antibody bound to the antigen expressed on the cells on the surface of the tumor tissue due to the high affinity of the antibody. (Lee and Tannock, 2010). In addition, after binding, the cells enter the cell (Endocytosis) together with the antigen and are destroyed within the cell.
  • the antibody may be located on the surface of the tumor tissue, but it binds to and destroys the overexpressed tumor antigen, so that efficient penetration into the tumor tissue does not occur.
  • antibodies cannot reach tumor cell antigens within tissues far from tumor blood vessels, thereby reducing tumor growth inhibitory activity and inducing antibody resistance and tumor recurrence.
  • studies are being conducted to control affinity or increase half-life (Dennis et al. 2007).
  • the physiological properties of tumor tissues that interfere with the penetration and distribution of antibodies into tumor tissues can be classified into four categories: endothelial barrier, high interstitial fluid pressure, and matrix barrier. (Stromal impediment), Epithelial Barrier.
  • High interstitial fluid pressure results from a situation where the pressure differential for the drug to convex from the blood vessels to the tissue is small or even the tissue hydraulic pressure is higher than the blood pressure. Unlike normal tissues, this is mainly caused by the absence of lymphatic vessels in the tumor tissue and accumulation of fluid in the tissue, and also contributes to abnormal angiogenesis.
  • a method of promoting vascular endothelial cell growth particularly vascular endothelial growth factor-A (VEGF165A)
  • VEGF165A vascular endothelial growth factor-A
  • a method of increasing the oil pressure of blood vessels has been performed in combination with the antibody albumin, a plasma protein, to increase the osmotic pressure of blood vessels, thereby improving the tumor tissue delivery effect of the antibody (Hofmann et al. 2009).
  • Stromal impediment is an extracellular matrix barrier that is encountered when an antibody exits microvessels and convections into tissue. It is composed mainly of collagen and hyaluronan. Depending on the extracellular matrix, the shape of the tumor is greatly affected. This results in a non-uniform distribution of drugs because there is a difference between where the drug is well distributed and where it is not. In addition, when the expression level of the extracellular matrix increases, the tumor tissue hydraulic pressure is increased due to the high cell density due to the solid cancer compression. An approach to overcome this is to induce the death of tumor tissue cells to reduce the cell density in the tumor tissue. In addition, the treatment of collagen in tumor tissues (Collagenase) to reduce the compression of solid cancer has been about 2 times the drug delivery effect compared to the control group (Eikenes et al. 2004).
  • Epithelial Barrier densely fills the cell gap between cell-cell adhesion factors of tumor tissue epithelial cells, preventing the therapeutic agent from spreading or convection between cells.
  • E-cadherin is known to be a major factor in this cell-cell adhesion.
  • a substance that reduces E-cadherin is found in the virus (Adenovirus-3), and only the part (JO-1) having the activity of reducing the cell's E-cadherin among the proteins constituting the virus is administered in combination with the antibody.
  • JO-1 the part having the activity of reducing the cell's E-cadherin among the proteins constituting the virus
  • peptides that bind to neuropilin NBP, Neuropilin
  • One method using peptides that bind neurophylline is co-administration of iRGD peptides with antibodies (Sugahara et al. 2010).
  • iRGD peptides with antibodies
  • pharmacokinetics due to the size of the small molecule of the peptide is very short half-life, so the amount and frequency of administration to the actual patient should be very large.
  • the inevitable process of co-administration requires the production of a therapeutic agent and a tumor-permeating substance, respectively, and thus the industrial practicality is low.
  • a recent technique to overcome this is an example of fusion of an A22p peptide that binds neuropilin to the heavy chain C-terminus of a monoclonal antibody, utilizing the long half-life of the antibody as it is, and enhancing the tumor tissue penetration of the antibody (Shin et. al. 2014; Korean Patent Application 10-2014-0061751; PCT Patent Application PCT / KR2014 / 004571).
  • Neurophylline is a transmembrane glycoprotein, and there are two forms of neurophyllin 1 (NRP1) and neuropilin 2 (NRP2) (Kolodkin et al. 1997). Neuropilins 1 and 2 are composed of 923 and 931 amino acids, respectively, exhibit about 44% amino acid sequence homology, and share many structural and biological activities. Neuropilin 1/2 is commonly composed of extracellular a1, a2, b1, b2, MAM domains and intracellular PDZ binding domains (Appleton et al. 2007). Neurophylline is very poorly expressed in normal cells, while it is overexpressed in most tumor vascular endothelial cells, solid cancer cells and hematologic cells (Grandclement, C. and C.
  • Neurophylline acts as a coreceptor of VEGF receptors (VEGFRs) by binding VEGF family ligands.
  • VEGFRs VEGF receptors
  • NRP1 acts as a co-receptor of VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 and binds to various VEGF ligands, thereby contributing to angiogenesis, cell survival, migration & adhesion and invasion in tumor tissues.
  • NRP2 acts as a co-receptor for VEGFR2 and VEGFR3, contributing to lymphangiogenesis and cell adhesion.
  • Neurophilin 1/2 also binds to the secreted semaphorin 3 family ligands (class 3 semaphorins: Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F, and Sema3G) ligands, acting as co-receptors of Plexin family receptors.
  • Neurophylline is known to have no functional intracellular domain and thus is inactive even when ligands are bound, and signal is transmitted through the co-receptor of the VEGF receptor or flexin, which is a co-receptor.
  • Sema3 binds to neurophilin and flexin receptors 2: 2: 2.
  • neuropilrin proteins can provide independent signaling without interaction with the VEGF receptor or flexin co-receptors.
  • the exact molecular mechanism for this is still unclear.
  • anti-neuphylline1 antibodies bind only VEGA-A and neurophylline1, which are known to bind VEGFR2 and neurophylline1, to angiogenesis, cell survival, and migration of VEGFR2. It has been reported to have a function of inhibiting migration & adhesion and invasion (Pan Q et al. 2007).
  • anti-neuphylline 2 antibodies it binds competitively to VEGA-C and neurophylline 2, which are known to bind VEGFR3 and neurophylline 2 simultaneously, and inhibits lymphangiogenesis and cell adhesion, which are functions of VEGFR3.
  • the C-terminal region of the VEGF ligand family and Sema3 family of ligands that bind neuropilin 1 and 2 binds to the so-called Arginine-binding pocket in the b1 domain that is commonly present in neuropilin 1/2 ( MW Parker et al. 2012).
  • the cationic arginine (Arg) or lysine (Lys) at the C-terminal residue is very essential for the binding, and when substituted with other amino acid residues, the binding with neurophylline is lost and the biological activity is lost.
  • the necessity of the C-terminal region R / K-x-x-R / K motifs of these neurophylline ligands is called the C-end rule / CendR (Teesalu et al. 2009).
  • Proteins or peptides with C-terminal regulatory sequences can bind neuropilins with C-terminal arginine (Arg) or lysine (Lys) residues (Zanuy et al, 2013).
  • the C-terminal region of the VEGF ligand and the Sema3 family of ligands have a common R / KxxR / K motif, indicating that most ligands bind to both proteins rather than selectively to neuropilin 1 and 2 see.
  • peptides that bind neuropillin have been screened or designed, all of which have R / KxxR / K motifs, such that the peptides are arginine binding pockets of the b1 domain of neuropillin 1/2. It is believed to bind to an arginine-binding pocket.
  • the iRGD peptide (Sugahara et al. 2010), which binds to neuropillin 1/2 and increases the tumor tissue permeability of the coadministered drug, and the A22p peptide, which is fused to the heavy chain terminal of the antibody to increase the tumor tissue permeability of the fusion antibody ( Shin et al. 2014) have an amino acid sequence that follows the CendR rule.
  • neurophylline 1 is mainly overexpressed in neovascularization and plays an important role in neovascularization, and neurophylline 2 is expressed in lymphatic vessels and contributes to lymphatic vessel formation. Therefore, peptides that selectively bind neurophilin 1 or neurophylline 2 with high affinity may have properties that can specifically tune the biological activity of each neurophylline, but there is no previous report on this.
  • neurophylline 1 and 2 are activated in the form of a homodimer or a heterodimer, and in the case of existing peptides, a monomolecular form is developed so that the biologically active coordination effect is very weak. Peptide forms that bind in (homodimer) form to tune biological activity are preferred.
  • neurophylline 1 is overexpressed in endothelial cells and is stimulated by VEGF ligands to play an important role in neovascularization, resulting in high specificity / high affinity for neurophyllin 1 only.
  • peptides that bind competitively with VEGF ligands may have tumor tissue accumulation (homing & accumulation) function and inhibitory angiogenesis.
  • neurophylline 1 is overexpressed in tumor tissue vessels and tumor cells (epithelial cells), stimulated by VEGF ligands play an important role in tumor growth and neovascularization, specifically binding only to neurophilin 1, and VEGF ligand and Of competitively binding peptides may have activity that inhibits tumor growth.
  • VE-cadherin which is an endothelial barrier
  • E-cadherin which is an epithelial barrier
  • Tumor tissue extravasation of co-administrated proteins, antibodies, nanoparticles, and small molecule drugs may be increased, and tissue tissue penetration may be increased even within tumor tissues.
  • the present inventors have attempted to find a novel peptide that binds to neurophylline 1 selectively, with high affinity, without binding to neurophylline 2, in order to overcome the limitations of the peptides that bind to both conventional neurophylline 1 and 2.
  • bivalent binding to the b1 domain Arginine-binding pocket of neurophyllin1 induces signaling that activates neuropilin1 into cells, thereby fusion or co-administered protein.
  • tumor tissues such as antibodies, promote extravasation into tumor tissues, and discover novel peptides having tumor tissue permeability even inside tumor tissues. Therefore, it was intended to develop a novel peptide that is fused to the C-terminus of the antibody heavy chain constant region, which is always present as an homodimer.
  • a peptide library fused to the carboxy terminus (Carboxy-terminus) of the antibody heavy chain constant region (Fc) was designed, expressed on the surface of the yeast cell to construct an Fc-fusion peptide library, and then the b1 domain of neuropilin1.
  • Fc antibody heavy chain constant region
  • a clone was found that has tumor tissue infiltration ability and binds to the neuropilin1 b1 domain, and the peptide is fused to the heavy chain C-terminus of the antibody so that the antibody-peptide is fused in bivalent binding.
  • a fusion antibody was prepared in which the antibody retained its original function. This fusion antibody technology selectively accumulates in tumor tissues overexpressing neurophylline 1 and enhances its ability to penetrate into tumor tissues.
  • VEGF165A angiogenesis factor-A
  • One aspect of the invention is that, unlike existing ligands and peptides that bind to both neurophylline 1 (NRP1) and neurophylline 2 (NRP2), peptides, particularly tumors, that bind only to neurophylline 1 with high specificity / high affinity It is to provide a penetrating peptide (TPP, tumor penetrating peptide).
  • TPP tumor penetrating peptide
  • one aspect of the present invention is a peptide that binds only neurophilin 1 with high specificity / high affinity to the VEGF ligand that binds neuropilin 1 competitively, and inhibits angiogenesis and tumor invasive activity in tumors. It is to provide a peptide having at the same time.
  • one aspect of the present invention is to provide a fusion protein, small molecule drug, nanoparticles or liposomes fused to the peptide specifically binding to the NRP1.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding a peptide that specifically binds to the NRP1.
  • Another aspect of the present invention for the treatment or prevention of cancer or neovascular vessel-related disease including a peptide that specifically binds to the NRP1, or a fusion protein, small molecule drug, peptide, nanoparticles or liposomes fused to the NRP1 It is to provide a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer or neovascular disease, including a peptide specifically binding to NRP1 or a fusion protein, small molecule drug, peptide, nanoparticle or liposome to which the peptide is fused. It is.
  • another aspect of the present invention is to provide a method for screening a peptide specifically binding to the NRP1.
  • One aspect of the present invention provides a peptide that binds only neurophylline 1 with high specficity / high affinity, particularly a tumor penetrating peptide (TPP).
  • TPP tumor penetrating peptide
  • Such neuropilin1 specific peptides provide peptides having sequences different from ligands and peptides that bind to both existing neuropilin1 (NRP1) and neuropilin2 (NRP2).
  • the peptide according to the present invention consists of 5 to 50 amino acids;
  • the C terminus of the peptide is X 1 -X 2 -X 3 -X 4, wherein X 1 is an arginine, lysine, or any amino acid sequence, wherein X 2 and X 3 are each independently any amino acid sequence, and X 4 is With or with lysine.
  • peptide library fused to the C-terminus (Carboxy-terminus) of the antibody heavy chain constant region (Fc), and expressing it on the surface of the yeast cell to construct an Fc-fusion peptide library
  • neurophylline Clones that selectively bind to the b1 domain of 1 were selected and isolated peptides were isolated and identified.
  • a b1b2 domain protein of neurophylline 2 is selected at the same time as a competitor using a b1b2 domain protein of neurophylline 1 and a competitor. By using, the screening process was carried out.
  • Fc-fusion peptide fused to (Carboxy-terminus) with a linker consisting of 15 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) X3 amino acid sequences to inhibit tumor invasive activity and angiogenesis. Peptides were simultaneously isolated and identified.
  • tumor permeability refers to, for example, 1) specific recognition and accumulation of tumor specific vascular endothelial cells, tumor cells, or tissues, or 2) widening the cell gap of tumor vascular endothelial cells, resulting in extravasation ( Or 3) controlling one's tumor cell gap within the tumor to promote deepvasation into the tumor.
  • angiogenesis refers to, for example, VEGF ligand that binds to neuropillin 1 and competitively binds to neurophilin by inhibiting ligand activity by binding to neurophilin.
  • anti-angiogenesis in tumor tissues.
  • the peptide of the present invention may be composed of 5 to 50 amino acids, preferably 7 to 30 or less.
  • the peptide of the present invention may be any amino acid sequence of the amino acid sequence constituting X3 from the N-terminus, preferably serine, threonine, tyrosine, asparagine, glutamine, histitin, glycine, phenylalanine, leucine, May be isoleucine, valine, alanine, methionine, proline, lysine, asparagine acid, glutamic acid, or stopcodone, more preferably histidine, glycine, asparagine, serine, glutamine, phenylalanine, valine, leucine, threonine, ar And may be selected from the group consisting of proline, isoleucine, alanine and lysine.
  • the peptide of the present invention preferably N-terminal may be made of histidine-threonine-proline-glycine (H-T-P-G).
  • the peptide may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 3, specific sequence information of SEQ ID NO: 1 to 3 are as follows.
  • the most preferred example of the peptide according to the present invention is TPP11 of SEQ ID NO: 3.
  • the peptide specifically binding to NRP1 of the above aspect may further include a linker peptide.
  • the linker peptide may be composed of 1 to 50 amino acids, preferably 4 to 20, more preferably 4 to 15 amino acids.
  • the linker peptide may be composed of glycine (glycine) or serine (serine),
  • the sequence of the linker peptide is composed of the amino acid sequence of (GGGGS) n (wherein each n is independently An integer from 1 to 20), and more preferably (GGGGS) 3.
  • the peptide sequence of the linker peptide bound state may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 to 6.
  • Another aspect of the present invention provides a fusion protein, a small molecule drug, a peptide, a nanoparticle or a liposome to which a peptide (SEQ ID NOs. 1 to 6) that specifically binds to NRP1 is fused.
  • the protein may be an antibody, fragment of an antibody, immunoglobulin, peptide, peptide, enzyme, growth factor, cytokine, transcription factor, toxin, antigenic peptide, hormone, carrier protein, motor function protein, receptor , Signaling proteins, storage proteins, membrane proteins, transmembrane proteins, internal proteins, external proteins, secreted proteins, viral proteins, glycoproteins, truncated proteins, protein complexes, or chemical Modified proteins, and the like.
  • Small molecule drugs in the present invention are broadly used herein to refer to organic compounds, inorganic compounds or organometallic compounds having a molecular weight of less than about 1000 Daltons (Da) and having activity as therapeutic agents for diseases.
  • Small molecule drugs herein include oligopeptides and other biomolecules having a molecular weight of less than about 1000 Daltons.
  • the nanoparticle means a particle made of a material having a diameter of 1 to 1000 nm
  • the nanoparticle is composed of a metal nanoparticle, a metal nanoparticle core and a metal shell surrounding the core It may be a metal / nonmetal coreshell composed of a metal / metal coreshell composite, a metal nanoparticle core and a nonmetal shell surrounding the core, or a nonmetal / metal coreshell composite composed of a nonmetal nanoparticle core and a metal shell surrounding the core.
  • the metal may be selected from gold, silver, copper, aluminum, nickel, palladium, platinum, magnetic iron and oxides thereof, but is not limited thereto, and the nonmetal may be silica, polystyrene, latex, and acrylic. It may be selected from the rate-based material, but is not limited thereto.
  • liposomes are composed of one or more lipid bilayer membranes surrounding an aqueous internal compartment that can associate themselves.
  • Liposomes can be specified by membrane type and size.
  • Small unilamellar vesicles SUVs
  • Large uni-lamellar vesicles LUV
  • Oligolamella large vesicles and multilamellar large vesicles have multiple, generally concentric, membrane layers and may be 100 nm or more in diameter. Liposomes with multiple asymmetrical membranes, ie several small vesicles contained within larger vesicles, are called multivesicular vesicles.
  • the peptide may bind bivalent or more to neuropilin1.
  • fusion refers to the integration of two molecules having different or identical functions or structures, and fusion by any physical, chemical or biological method in which the peptide can bind to the protein, small molecule drug, nanoparticle or liposome. Can be.
  • the fusion may preferably be by a linker peptide, which may bind, for example, to the C-terminus of the antibody heavy chain constant region (Fc) fragment.
  • the fusion protein may be a complete form of the antibody bound to the peptide.
  • a complete antibody has a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, and each light chain has a heavy chain constant region and a light chain constant region of a disulfide bond (SS-bond) antibody.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1) and gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant regions of the light chains have kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • the “heavy chain” refers to the variable region domain heavy chain variable domain (VH) and three constant region domains CH1 (heavy chain constant region 1) comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen. Is interpreted to include both full-length heavy chains comprising CH2 and CH3 and fragments thereof.
  • the term “light chain” refers to the variable region domain light chain variable domain (VL) and constant region domain light chain constant region (CL) comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It is interpreted to include both the full-length light chain and fragments thereof.
  • a fragment of an antibody means each domain of the heavy or light chain of the antibody or a fragment thereof, for example, a heavy chain constant region fragment (CH1, CH2, or CH3), a heavy chain variable region fragment (VH) of the antibody. ), Light chain constant region fragments (CL), light chain variable region fragments (VL), antigen binding fragments (Fab), single chain variable fragments (scFv) or fragments thereof.
  • the fragment of the antibody may be a crystalizable fragment (Fc) fragment consisting of the hinge (CHge) -CH2-CH3 of the antibody.
  • the fragment of the antibody may be a monomer, a dimer or a multimer.
  • Such antibodies include monoclonal antibodies, nonspecific antibodies, non-human antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain Fvs (scFV), single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') fragments, disulfide-binding Fvs ( sdFV) and anti-idiotype (anti-Id) antibodies, and epitope-binding fragments of the antibodies.
  • the monoclonal antibody may be IgG, IgM, IgA, IgD or IgE, for example IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, or IgD type and may be IgG1 type.
  • the light chain constant region of the antibody may be of the ⁇ or ⁇ type.
  • the peptide may be bound to an antibody heavy chain constant region (Fc) fragment, preferably to the C-terminus of the Fc, and the binding may be by a linker peptide.
  • Fc antibody heavy chain constant region
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding the peptide described above.
  • polynucleotide is a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides present in single- or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom and includes analogs of natural polynucleotides unless specifically stated otherwise.
  • the polynucleotide includes not only the nucleotide sequence encoding the peptide described above, but also a sequence complementary to the sequence.
  • Such complementary sequences include sequences that are substantially complementary, as well as sequences that are substantially complementary. This refers to a sequence that can hybridize to nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and SEQ ID NOs: 4 to 6 under stringent conditions known in the art.
  • the polynucleotide may also be modified. Such modifications include addition, deletion or non-conservative substitutions or conservative substitutions of nucleotides.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence is to be interpreted to also include a nucleotide sequence showing substantial identity to the nucleotide sequence. The substantial identity is at least 80% homology when the nucleotide sequence is aligned with any other sequence as closely as possible and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art. A sequence exhibiting at least 90% homology or at least 95% homology.
  • Another aspect of the invention can provide a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • vector means a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors are included.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14).
  • phage e.g., ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1 and M13, etc.
  • viruses e.g., CMV, SV40, etc.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to 3 and SEQ ID NO: 4 to 6 in the recombinant vector may be operably linked to the promoter.
  • operatively linked means a functional bond between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • the regulatory sequence can thereby regulate transcription and / or translation of the other nucleotide sequence.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector may be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector may be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector may be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter for example, a pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • replication origins that operate in eukaryotic cells included in the vector include f1 origin, SV40 origin, pMB1 origin, adeno origin, AAV origin, CMV origin, and BBV origin.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallothionine promoters
  • promoters derived from mammalian viruses eg, adenovirus late promoters, vaccinia virus 7.5K promoters, SV40 promoters, Cytomegalovirus (CMV) promoter and tk promoter of HSV
  • CMV Cytomegalovirus
  • the vector can express not only the peptide specifically binding to the NRP1 of the present invention, but also fragments or antibodies of the antibody to which the peptide is fused.
  • the vector may be a vector system in which the peptide and the antibody or fragment thereof are simultaneously expressed in one vector, or a system in which each of them expresses in a separate vector. In the latter case, both vectors can be introduced into the host cell via co-transfomation and targeted transformation.
  • the recombinant vector of the present invention may have a cleavage map as described, for example, in FIG. 6 or 20.
  • Another aspect of the invention can provide a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the host cell may use any host cell known in the art, and prokaryotic cells include, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, Strains of the genus Bacillus, such as E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and enterococci and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marsons and various Pseudomonas species.
  • yeast Sacharomyce cerevisiae
  • insect cells for example, SP2 / 0, Chinese hamster ovary K1, CHO DG44, PER.C6, W138 , BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN and MDCK cell lines and the like can be used.
  • Another aspect of the present invention can provide a method for producing a peptide that specifically binds to NRP1, comprising culturing the host cell.
  • Insertion of the polynucleotide or a recombinant vector comprising the same into a host cell may use an insertion method well known in the art.
  • a CaCl 2 method or an electroporation method may be used.
  • a micro-injection method, calcium phosphate precipitation method, electroporation method, Liposome-mediated transfection and gene bombardment may be used, but is not limited thereto.
  • microorganisms such as E. coli
  • the productivity is higher than that of animal cells, but it is not suitable for the production of intact Ig-type antibodies due to glycosylation problems.
  • antigen-binding fragments such as Fab and Fv Can be used for production.
  • the method of selecting the transformed host cell can be easily carried out according to methods well known in the art using a phenotype expressed by a selection label.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • the above aspect is a concept including the preparation of NRP1 specific binding tumor-penetrating peptide (TPP) that specifically binds to NRP1, as well as an antibody or fragment thereof to which the peptide is fused.
  • TPP tumor-penetrating peptide
  • An example of a method for preparing an antibody heavy chain constant region (Fc) fragment in which a peptide specifically binding to NRP1, that is, a tumor penetrating peptide (TPP) is fused is as follows.
  • an example of a method for producing an antibody fused to the peptide of the present invention is as follows.
  • an aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising the peptide or a fusion protein, small molecule drug, peptide, nanoparticle or liposome to which the peptide is fused.
  • Peptides specifically binding to NRP1 according to the present invention specifically binds to NRP1, thereby exhibiting the effect of specific distribution in tumors and penetration into tumors.
  • the peptide that specifically binds to NRP1 specifically binds to neuropilin1, thereby competing for binding of VEGF165A to neuropilin1. Accordingly, by inhibiting the angiogenesis function that VEGF165A binds to neurophylline 1, it can be expected not only to treat cancer, but also to treat angiogenesis-related diseases.
  • the antibody fused to a peptide specifically binding to NRP1 according to the present invention shows a similar production yield as that of the wild-type antibody, and can simultaneously target the antigen to which the antibody binds and two antigens of neurophyllin 1 to which the peptide binds.
  • the cancer includes squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, peritoneal cancer, skin cancer, skin or intraocular melanoma, rectal cancer, anal muscle cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, Parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphocyte lymphoma, hepatocellular carcinoma, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, liver tumor, breast cancer, colon cancer, colon cancer, Endometrial or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulva cancer, thyroid cancer, liver cancer and head and neck cancer.
  • the angiogenesis-related diseases include diabetic retinopathy, macular degeneration, senile macular degeneration, prematurity retinopathy, corneal transplant rejection, neovascular glaucoma and posterior lens fibrosis, epidemic keratoconjunctivitis, vitamin A deficiency, contact lens over-wearing, atopic keratitis , Limbal keratitis keratitis, psoriatic psoriatic keratitis, Sjogren's syndrome, erythematous acne, pricken's keratoconjunctivitis, syphilis, mycobacterial infection, fatty degeneration, chemical burn, bacterial ulcer, fungal ulcer, herpes herpes infection, shingles infection, Protozoan infection, Kaposi's sarcoma, Muren's ulcer, Terrien's limbal keratopathy May be selected from the rejection group.
  • the composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the composition are conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, fine Crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration and rectal administration.
  • oral administration because proteins or peptides are digested, oral compositions should be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device in which the active substance may migrate to the target cell.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions for the prophylaxis or treatment of cancer are dependent on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. It can be prescribed in various ways. Preferred dosages of the compositions are in the range of 0.001-100 mg / kg on an adult basis.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to prevent or treat cancer or to prevent or treat a disease due to angiogenesis.
  • the composition may be prepared in unit dose form or formulated into a multi-dose container by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, according to methods readily available to those skilled in the art.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the composition since the composition comprises an antibody or antigen-binding fragment, it can be formulated as an immune liposome. Liposomes comprising the antibody can be prepared according to methods well known in the art.
  • the immune liposomes can be prepared by reverse phase evaporation as a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and polyethyleneglycol-derivatized phosphatidylethanolamine.
  • Fab 'fragments of antibodies can be conjugated to liposomes via disulfide-replacement reactions.
  • Chemotherapeutic agents such as doxorubicin may further be included in the liposomes.
  • composition may be administered as a separate therapeutic agent or in combination with therapies conventionally used to treat, prevent or treat cancer.
  • the composition may be administered in combination with a therapy, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapy.
  • compositions of the present invention may be used for the prevention or treatment of diseases or disorders other than cancer associated with or characterized by undesirable angiogenesis, which are therapeutically or in patients in need of such treatment or prevention.
  • the composition is administered in combination with other drugs (“secondary drugs”) or with methods of treating, treating or preventing cancer.
  • Secondary drugs do not limit the kind thereof, and may be proteins, antibodies, small molecule drugs, liposomes, nanoparticles, stem cells, and the like.
  • an aspect of the present invention provides a composition for diagnosing cancer comprising a peptide specifically binding to the NRP1 or a fusion protein, a small molecule drug, a nanoparticle or a liposome to which the peptide is fused.
  • diagnosis refers to identifying the presence or characteristic of pathophysiology. Diagnosis in the present invention is to determine the onset and progress of cancer.
  • the peptide that specifically binds to NRP1 may bind to a phosphor for molecular imaging to diagnose cancer through imaging.
  • the fluorescent material for molecular imaging refers to any material generating fluorescence, and preferably emits red or near-infrared fluorescence, and more preferably, a phosphor having a high quantum yield is more preferred, but is not limited thereto. .
  • the molecular imaging phosphor is preferably, but is not limited to, a phosphor, a fluorescent protein, or other imaging material capable of binding to a peptide specifically binding to the NRP1.
  • the phosphor is preferably fluorescein, BODYPY, tetramethylrhodamine, Alexa, cyanine, allopicocyanine or derivatives thereof, but is not limited thereto. Do not.
  • the fluorescent protein is preferably, but not limited to, Dronpa protein, fluorescent color gene (EGFP), red fluorescent protein (DsRFP), Cy5.5 or other fluorescent protein which is a near infrared fluorescence.
  • imaging materials are preferably iron oxide, radioisotopes, etc., but are not limited thereto, and may be applied to imaging equipment such as MR and PET.
  • the present invention also provides a method for screening such peptides.
  • the method comprises the steps of: (1) designing a library capable of interacting with an arginine-binding pocket of the NRP1-b1 domain;
  • a method for screening the peptides including the step of measuring the binding force between the library bound in step (3) and NRP1-b1b2.
  • the library preparation of step (1) is performed by PCR using primers based on existing antibody heavy chain constant region (Fc) fragments and semaphorin 3-derived sequences, and the amino acid does not exist in nature.
  • Fc antibody heavy chain constant region
  • Primer using the semaphorin 3 derived sequence as a template may be composed of the following sequence.
  • step (2) the library prepared in step (1) is fused to the antibody heavy chain constant region.
  • step (3) the library fused to the constant region of the heavy chain is expressed on the surface of the yeast cell, and then bound to the target molecule, NRP1-b1b2.
  • NRP1-b1b2 the target molecule
  • a peptide that does not bind to NRP2 but specifically binds to NRP1 provides an amino acid sequence capable of specifically binding to NRP1.
  • Peptides specifically binding to NRP1 and proteins fused with the peptides according to the present invention has a characteristic that specifically binds to NRP1, specifically accumulate in tumor tissue, and widen the cell gap of tumor vascular endothelial cells Invasion into tumor tissues is significantly increased by enhancing extravasation and controlling cell gaps within tumor tissues.
  • a fusion antibody in which a peptide that specifically binds to NRP1 is fused to an antibody or a fragment of the antibody, when compared with a control antibody to which the peptide is not fused, the fusion antibody specifically accumulates in tumor tissue and is injected into tumor tissue when administered at the same dose. Penetration increases, resulting in markedly increased tumor suppressor activity in vivo.
  • Antibodies or fragments thereof in which a peptide specifically binding to NRP1 according to the present invention is fused are characterized in that fusion antibodies are accumulated in tumor tissues with high efficiency and promote penetration into tumor tissues while maintaining the original antigen-specific antigen binding ability. By having a high effect can be expected in the treatment and diagnosis of the tumor.
  • the fragment of the antibody fused to the peptide specifically binding to NRP1 according to the present invention has the characteristics of inhibiting the neovascularization by VEGF165A by inhibiting the binding of VEGF165A to NRP1, tumor growth and metastasis, It can be used for the treatment and diagnosis of various diseases such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis and the like.
  • the antibody or fragment thereof in which the peptide is fused according to the present invention shows a similar production yield as the wild type antibody in which the peptide is not fused, and the fusion antibody or fragment thereof is a protein which is inherently a function of the antigen-binding ability and heavy chain constant region (Fc) of the wild type antibody.
  • the binding ability to A and protein G is preserved, so there is no additional cost in production compared to the existing antibody, and it has the characteristics of maintaining the anticancer activity of the antibody.
  • 1 is a schematic of the structure of neuropilin 1 and 2.
  • neurophilin is largely composed of five domains. From the N-terminus, the a1 and a2 domains are classified as CUB domains, and the Ig-like C2 type portion of semaphorin binds. That's the part. In particular, this site forms a complex with flexin and increases the binding force between semaphorin and flexin.
  • the b1 and b2 domains are classified as FV / VIII domains, to which the C-terminal sites of VEGF or semaphorin 3 family ligands bind. In particular, this part has a site to which heparin can bind, and the residue with a (+) sign facilitates the binding of many ligands.
  • MAM induces oligomerization
  • TM trans-membrane domain
  • PDZ Postsynaptic Density 95, Disk large, Zona occludens 1
  • NRP2 is a protein fused to NRP1 and an antibody heavy chain constant region and a peptide specifically binding to the selected NRP1, and a binding of the protein and neurophylline 1 fused to the antibody heavy chain constant region and a peptide specifically binding to the selected NRP1.
  • the complex is schematic. In the form of a dimer, a clone that does not bind to NRP2 but specifically binds to the arginine-binding pocket of the NRP1 b1 domain is attempted.
  • Figure 3 is based on the A22p peptide (N terminus-HTPGNSNKWKHLQENKKGRPR R -C terminus) that binds to NRP1 and NRP2 at the same time, 18-degree from the C-terminal (5-22) is a codon (degenerate codon)
  • NHB (ATGC / ACT / TCG).
  • Fc-fusion peptide peptide library is 15 (Gly-Gly) at the C-terminus (Carboxy-terminus) of the antibody heavy chain constant region (Fc)
  • a linker consisting of the -Gly-Gly-Ser) X3 amino acid sequence was constructed by fusion.
  • the constructed Fc-fusion peptide library is expressed by fusion to Aga1p-Aga2p on the surface of the yeast cell as shown in the diagram below, and the peptide library is present at the C-terminus of the antibody heavy chain constant region (Fc) fragment.
  • Figure 4 shows the results of MACS and FACS analysis of proteins used to select peptides that specifically bind to NRP1.
  • FIG. 4 (A) shows the structures of the biotinylated neuropilin1 b1b2 protein and the neuropilin2 b1b2 protein used to select peptides that specifically bind to NRP1. In addition, expression purification SDS-PAGE is shown.
  • FIG. 4 (B) shows that NRP1-b1b2 using biotinylated NRP1-b1b2 in the constructed library was used as binding antigen, and NRP2-b1b2, which was not biotinylated as a competitive antigen, was used at a 10-fold higher concentration, and MACS and FACS were performed to NRP1-b1b2. This is the result of FACS analysis of pool for each pooling process.
  • FIG. 5 (A) and FIG. 5 (B) show the results of identifying the binding of the selected monoclonal to biotinylated NRP1-b1b2 by FACS.
  • Figure 5 (B) shows the results of binding FACS analysis for 100 nM NRP1-b1b2 to Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 expressed on the surface of yeast cells.
  • FIG. 6 is a cleavage map of a vector for expressing Fc-fusion peptides Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 protein fused to antibody heavy chain constant regions and peptides specifically binding to selected NRP1 in animal cell HEK293 cells Is an example.
  • Figure 7 shows the schematic and expression purification SDS-PAGE of a protein fused to the antibody heavy chain constant region and the peptide specifically binding to the selected NRP1.
  • FIG. 7 (A) shows that the antibody heavy chain constant region is easily prepared to form a duplex by maintaining two disulfide bonds starting from a hinge at the N-terminus.
  • a peptide linker of 15 amino acids ((G4S) 3) at the CH3 terminus of the antibody heavy chain constant region, a peptide that specifically binds to NRP1 was fused.
  • Figure 7 (B) can be confirmed the purity of the duplex formation and purification of each clone on the SDS-PAGE.
  • the size difference can be confirmed by introducing a peptide that specifically binds to the linker and NRP1.
  • FIG. 8 shows the results of ELISA experiments in which the binding capacity of Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 to NRP1, which is a fused form of an antibody heavy chain constant region purified from animal cells and a peptide specifically binding to NRP1, is measured. .
  • FIG. 8 (A) shows that Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 have about 10 to 60 times improved affinity to the NRP1-b1b2 domain as compared to Fc-A22p. .
  • FIG. 8 (B) shows that Fc-TPP11 does not bind to NRP2-b1b2 protein but specifically binds to NRP1-b1b2 as compared with Fc-A22p. It does not bind to the control VEGFR2.
  • the synthetic peptide TPP11 which is not fused to Fc, exhibits at least 100-fold lower affinity for the NRP1-b1b2 protein compared to Fc-TPP11. This shows that Fc-TPP11 has a high affinity with an avidity effect.
  • FIG. 9 shows co-localization with NRP1 expressed on the surface of vascular endothelial cells (HUVEC) whether Fc-TPP1, Fc-TPP8, or Fc-TPP11 proteins are specifically bound to NRP1 expressed on the cell surface.
  • FIG. 10 shows that Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 proteins specifically bind to NRP1 expressed on the cell surface and activate NRP1 to analyze endocytosis by confocal microscopy.
  • the control group PBS buffer
  • Fc, Fc-A22p, Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 were treated with vascular endothelial cells (HUVEC) under the same conditions.
  • Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 was observed to be introduced into the cell while co-localization with NRP1. This means that Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 specifically bind to NRP1 to activate NRP1.
  • Figure 11 (A) is a Western blot results to confirm the biological mechanism of the Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 protein in HUVEC.
  • VEGF165A unlike Fc, shows a permeability enhancement effect in HUVEC, which can be confirmed by a decrease in VE-cadherin.
  • the control group VEGF165A reduced VE-cadherin, and Fc-TPP11 most effectively reduced VE-cadherin among NRP1-specifically selected monoclones.
  • Fc-TPP11 was found to reduce VE-cadherin more effectively at a concentration 10 times lower than Fc-A22p protein.
  • FIG. 11 shows that Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 protein is a blood vessel
  • Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 protein is a blood vessel
  • the result of the Transwell assay Transwell assay.
  • VEGF165A, Fc-TPP8 and Fc-TPP11 effectively increased permeability.
  • Fc-TPP1 without VE-cadherin reduction did not improve permeability. This result is closely related to the result of FIG.
  • FIG. 12 shows the results of Fc-TPP1, Fc-TPP8 and Fc-TPP11 proteins in immunohistochemistry.
  • Human epidermal cancer cell line A431 was transplanted into nude mice, grown, injected with Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 proteins into the tail vein, and the distribution of Fc fusion protein was then double-stained with blood vessels (CD31).
  • CD31 blood vessels
  • Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 proteins selectively reach the tumor tissue, and effectively penetrated into the tumor tissue.
  • Fc-TPP1, Fc-TPP11 effectively penetrated into the tumor tissue significantly improved compared to the Fc-A22p protein.
  • the bar graph on the right quantifies tumor tissue accumulation.
  • FIG. 13 shows the activity of Fc-TPP11 in epithelial cancer-derived tumor cells and tissues.
  • Figure 13 (A) is the result of Western blot changes in E-cadherin in the human head and neck cancer cell line FaDu of Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 protein.
  • Fc-TPP11 unlike Fc, among the single clones specifically selected for NRP1, Fc-TPP11 most effectively induced a decrease in E-cadherin and reduced E-cadherin at concentrations 10 times lower than Fc-A22p.
  • FIG. 13 (B) shows the results of Fc-TPP11 binding to NRP1 to control the cell gap of epithelial tissues to confirm tumor tissue invasiveness.
  • Fc-TPP11 did not penetrate into the tumor tissue, whereas Fc-TPP11 regulates cell clearance through the reduction of VE-cadherin and E-cadherin, which are cell adhesion factors by NRP1, without blood vessels.
  • FIG. 14 (B) shows a binding competition ELISA for the RPARPAR peptide (Teesalu et al. 2009), the VEGF165A ligand, and NRP1, wherein the synthesized TPP11 peptide binds to an arginine-binding pocket located at NRP1-b1.
  • the synthesized TPP11 peptide confirmed binding competition with the RPARPAR peptide and VEGF165A, which are known to bind to the NRP1-b1 arginine-binding pocket, which indicates that TPP11 binds to the NRP1 b1 arginine-binding pocket. Prove it.
  • FIG. 15 (A) shows the results of performing a tube formation assay to determine whether tube formation of vascular endothelial cells (HUVEC) by VEGF165A of Fc-TPP11 is inhibited.
  • Fc-TPP11 effectively inhibited the tube formation of VEGF165A induced endothelial cells.
  • Figure 15 is a result of performing a matrigel plug assay (in vivo matrigel plug assay) to determine whether Fc-TPP11 can inhibit the neovascularization induced by VEGF165A in vivo in mice (B).
  • Angiogenesis was measured by immunohistochemistry using an anti-CD31 antibody (C).
  • Fc-A22p and Fc-TPP11 inhibited the formation of blood vessels induced by VEGF165A in mice.
  • Fc-TPP11 more effectively inhibits blood vessel formation than Fc-A22p.
  • Figure 16 shows the results of measuring the migration and invasion inhibitory activity of vascular endothelial cells by VEGF165A of Fc-TPP11.
  • Figure 16 (A) is a wound healing assay results to determine whether Fc-TPP11 inhibits the migration of vascular endothelial cells by VEGF165A.
  • VEGF165A the vascular endothelial cell migration was increased.
  • Fc-TPP11 inhibited the vascular endothelial cell migration.
  • Figure 16 (B) is a result confirmed by the transwell (Transwell) assay that Fc-TPP11 inhibits the infiltration of HUVEC cells induced by VEGF165A. Unlike the control group VEGF165A, Fc-TPP11 inhibited the invasion of vascular endothelial cells.
  • 17 shows the results of measuring tumor growth inhibitory activity and tumor tissue neovascularization inhibitory activity of mouse Fc-TPP11 in vivo.
  • Figure 17 (A) is a result of cancer growth inhibition experiment in nude mouse model to confirm whether the neovascularization inhibitory ability of Fc-TPP11 actually affects the cancer cell growth inhibition in vivo. After transplanting FaDu cells into nude mice, Fc, Fc-TPP11 injection was confirmed that Fc-TPP11 inhibits the growth of cancer cells compared to PBS, Fc.
  • Figure 17 (B) is the result of measuring the weight of the mouse during the experiment. Compared with mice injected with PBS and Fc, there was no significant difference in the weight of mice injected with Fc-TPP11. This indirectly proved that Fc-TPP11 had no other toxicity in mice.
  • Figure 17 (C) is the result of performing the immunohistochemistry experiment (immunohistochemistry) by extracting the tumor of the experiment in order to confirm whether the tumor suppression ability of the experiment by the angiogenesis inhibitory ability.
  • the tumor tissues of mice injected with Fc-TPP11 decreased in vascular density and the co-localization of blood vessels and pericyte compared to the control groups PBS and Fc.
  • FIG. 18 (A) shows the results of immunohistochemistry experiments in order to confirm the infiltration capacity of doxorubicin in combination with Fc-TPP11.
  • Fc-TPP11 was administered in combination with doxorubicin in comparison with the control group Fc, the tumor tissue penetration ability of doxorubicin increased.
  • Figure 18 (B) is the result of quantitatively confirming the accumulation amount of doxorubicin in the tissue.
  • Fc-TPP11 does not bind to NRP2, but binds to an arginine-binding pocket located in the NRP1-b1 domain with high affinity and high specificity. Due to the above characteristics, Fc-TPP11 is able to reach tumor tissue selective upon in vivo injection of NRP1, increase extravasation of tumor tissue, and increase penetration into tumor tissue. In addition, competitive binding to NRP1 with angiogenic factor VEGF inhibits angiogenesis by VEGF.
  • 20 is an example of a cleavage map of a vector for expressing IgG heavy chain-TPP11.
  • 21 is an example of a cleavage map of a vector for expressing an IgG light chain.
  • 22A is a diagram illustrating an antibody constructed by introducing TPP11 into the heavy chain C-terminus of Cetuximab, an existing anti-EGFR antibody.
  • FIG. 22B is a result of temporarily expressing and purifying HEK293F cells through cotransformation, and analyzing the size and purity on SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions.
  • FIG. 23 shows the results of immunohistochemistry experiments for confirming the infiltration capacity of Cetuximab-TPP11 into tumor tissues.
  • Human epidermal cancer cell line A431 expressing EGFR was implanted into nude mice, followed by intravenous injection of Cetuximab, Cetuximab-A22p and Cetuximab-TPP11, and the tissue penetration was confirmed by double staining with blood vessels (CD31). .
  • CD31 blood vessels
  • Example 1 Peptide Library Design and construction of specifically binding to the binding site NRP1 arginine (Arginine -binding pocket) of -b1
  • neurophyllin is largely composed of five domains. From the N-terminus, a1 and a2 domains are classified as CUB domains, and Ig-like C2 of semaphorin. The type part joins. In particular, this site forms a complex with flexin and serves to increase the binding force with semaphorin-flexin.
  • the b1 and b2 domains are classified as FV / VIII domains, to which the C-terminal sites of VEGF or semaphorin 3 family ligands bind. In particular, this part has a site to which heparin can bind, and the residue with a (+) sign facilitates the binding of many ligands.
  • TM trans-membrane domain
  • PDZ Postsynaptic Density 95, Disk large, Zona occludens 1
  • b1 domain has a pocket-shaped structure to which the C-end rule / CendR can bind, and in fact, the neurophilin b1 arginine binding site (Arginine-binding pocket) of FIG.
  • the corresponding C-terminal rules are -R / KXXR / K.
  • NRP1 Natural ligands that interact with neuropillin to enhance tumor tissue permeability are known to interact with NRP1 rather than NRP2 for both VEGF165A or Sema3A. Therefore, the inventors expected that NRP1 is more closely related to tumor tissue permeability than NRP2, and NRP1 was expected to be a more preferable target. Therefore, as shown in FIG. 2, a tumor tissue-penetrating peptide (TPP) that does not bind to NRP2 but specifically binds to the arginine-binding pocket of NRP1-b1 is an antibody heavy chain. Constant site (Fc) fused Fc-TPP was selected.
  • TPP tumor tissue-penetrating peptide
  • Fc constant site fused Fc-TPP was selected.
  • the existing A22p sequence (HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR) was used as a template, and (5-22) of the region corresponding to 18 residues from the C-terminus was serine, threonine, tyrosine, and asparagine.
  • Reverse initiation with NHB (ATGC / ACT / TCG)
  • a degenerate codon consisting of glutamine, histitin, phenylalanine, leucine, isoleucine, valine, alanine, methionine, proline, lysine, asparagine acid and glutamic acid
  • the ruler was synthesized.
  • a forward initiator was synthesized in the CH3 portion of the antibody heavy chain constant region (Fc) fragment.
  • This forward and reverse starter contains 50 base pairs identical to the sequence of the vector to allow homologous recombination in yeast cells.
  • the base sequence of the initiator used in constructing the peptide library fused to the antibody heavy chain constant region (FC) is shown in Table 1 below.
  • Library DNA was prepared by performing PCR. DNA was amplified using the forward and reverse initiators using the Fc-A22p yeast surface expression vector (pCTCON, Colby et al. 2004) as a template, and the amplified DNA (total 300 ⁇ g, 10 ⁇ g / 1 transformation).
  • the Fc yeast surface expression vector was constructed by repeating electroporation in yeast 30 times with a vector DNA (1 ⁇ g / 1 transformation) prepared by treating BsrGI and XhoI restriction enzymes to build a library. Subsequently, the library and the vector were combined in yeast cells through homologous recombination as shown in FIG. 3.
  • the size of the peptide library fused to the antibody heavy chain constant region (Fc) was determined stepwise dilution, and the number of colonies grown on the selection medium according to the selection factors present in the vector was determined to be 2 ⁇ 10 7 .
  • the target protein NRP1-b1b2 (273-586) protein and the competition protein NRP2-b1b2 (275-595) were prepared in the same manner as the conventional method with more than 90% purity (BA Appleton et al., 2007).
  • the target protein NRP1-b1b2 was biotinylated as shown in FIG. 4 (EZ-LINK TM Sulfo-NHS-LC-Biotinlation kit (Pierce Inc., USA)).
  • FIG. 4 (A) shows the structures of the biotinylated neuropilin1 b1b2 protein and the neuropilin2 b1b2 protein used to select peptides that specifically bind to NRP1. Also shown is the expression purification SDS-PAGE.
  • FIG. 4 (B) shows a FACS in which the pool is analyzed for each pooling process for the pool on which the MACS and FACS have been constructed. It can analyze the expression level of the heavy chain constant region (Fc) of the antibody and the binding ability of the biotinylated NRP1-b1b2, compared with cells expressing Fc-A22p on the surface of yeast cells, MACS and FACS as the It represents an increase in the number of clones that binds to biotinylated NRP1-b1b2 and does not affect the expression of the heavy chain constant region (Fc) of the antibody.
  • Fc heavy chain constant region
  • Biotinylated 1 ⁇ M of NRP1-b1b2 was conjugated to a peptide library fused to an antibody heavy chain constant region (Fc) expressed on the surface of yeast for 1 hour at 37 ° C.
  • Peptide libraries fused to antibody heavy chain constant regions (Fc) expressed on the surface of yeast cells bound to biotinylated NRP1-b1b2 were combined with Streptavidin-Microbead (Miltenyi Biotec Inc., Germany) for 10 minutes at 4 ° C, followed by MACS (magnetic Activated cell sorting) was used to select clones bound to biotinylated NRP1-b1b2.
  • the next step was to combine 1 ⁇ M of NRP1-b1b2 with a peptide library fused to an antibody heavy chain constant region (Fc) expressed on the surface of yeast for 1 hour at 37 ° C, followed by PE-conjugated streptavidin (Streptavidin-R-phycoerythrin). conjugate (SA-PE), Invitrogen) and FITC conjugated anti-Fc antibody (anti-Fc antibody FITC conjugated, goat, (SIGMA-ALDRICH co., USA)) for 20 minutes at 4 °C and then FACS (Fluorescence) By using activated cell sorting, clones with high Fc expression and high binding capacity to biotinylated NRP1-b1b2 were selected.
  • Fc antibody heavy chain constant region
  • the amount of biotinylated NRP1-b1b2 was used as 0.5 ⁇ M.
  • individual clones that bind to NRP1-b1b2 were selected by competitively binding non-biotinylated NRP2-b1b2 as a competitive protein of biotinylated NRP1-b1b2 in MACS and FACS.
  • Each individual clone was recovered from the yeast cells and confirmed the DNA sequence and amino acid sequence through sequencing.
  • Table 2 shows the sequences of peptides selected to bind specifically to NRP1 without binding to NRP2.
  • TPP NRP1 target peptide sequence N-terminal to C-terminal direction
  • SEQ ID NO: TPP1 HTPGNSNQFVLTSTRPPR SEQ ID NO: 1
  • TPP8 HTPGIATRTPR SEQ ID NO: 2
  • TPP11 HTPGNSKPTRTPRR SEQ ID NO: 3
  • Table 3 shows the sequence including the linker used when the selected peptide is fused to the antibody heavy chain constant region.
  • a transient transfection was performed using a HEK293-F system (Invitrogen) to encode a plasmid encoding a protein fused to each of the antibody heavy chain constants constructed above and a peptide specifically binding to the selected NRP1. Protein was expressed.
  • HEK293-F cells Invitrogen
  • serum-free FreeStyle 293 expression medium Invitrogen
  • PEI Polyethyleneamine
  • HEK293-F cells Upon 200 mL transfection into a shake flask, HEK293-F cells were seeded in 100 ml of medium at a density of 2.0 ⁇ 10 6 cells / ml and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 . Subsequently, the plasmid encoding the protein fused with the antibody heavy chain constant region and the peptide specifically binding to the selected NRP1 was diluted to 250 ⁇ g (2.5 ⁇ g / ml) in 10 ml FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen), and PEI 750 ⁇ g (7.5 ⁇ g / ml) was mixed with diluted 10 ml of medium and reacted at room temperature for 10 minutes.
  • FreeStyle 293 expression medium Invitrogen
  • the reacted mixed medium was added to the cells sown in 100 ml, and then cultured at 120 rpm and 8% CO 2 for 4 hours, and then the remaining 100 ml of FreeStyle 293 expression medium was added and cultured for 7 days. Supernatants were harvested after 7 days.
  • Proteins were purified from cell culture supernatants taken with reference to standard protocols. Antibody was applied to Protein A Sepharose column (GE healthcare) and washed with PBS (pH 7.4). The antibody was eluted at pH 3.0 with 0.1 M glycine buffer and then immediately neutralized with 1 M Tris buffer. The eluted antibody fraction was concentrated using a Pierce Dextran Desalting Column (5K MWCO) to PBS (pH7.4), then concentrated using a MILLIPORE Amicon Ultra (10 MWCO) centrifuge concentrator, and purified antibody heavy chain constant. Protein fused to the site and the peptide specifically binding to the selected NRP1 was quantified using the absorbance and the extinction coefficient at 280nm wavelength. Proteins fused with purified antibody heavy chain constant regions and peptides that specifically bind to selected NRP1 were analyzed on SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions.
  • FIG. 7 (A) shows the Fc-TPP protein fused to an antibody heavy chain constant region and a peptide that specifically binds to selected NRP1.
  • the antibody heavy chain constant region was prepared to easily form a dimer by maintaining two disulfide bonds starting from a hinge at the N-terminus. It is a fusion form of a peptide that specifically binds to NRP1 using a linker peptide of (GGGGS) X3 to the CH3 terminus of the heavy chain constant region of the antibody.
  • Figure 7 (B) is the result of SDS-PAGE analysis of the reduced and non-reducing conditions of the purified Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 fusion protein. In Figure 7 (B) can be confirmed the dimer formation and purity of each clone on the SDS-PAGE.
  • Table 4 shows the yield of protein produced per 1 L of culture of purified Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 fusion proteins. The results obtained three times were statistically processed, and ⁇ represents the standard deviation value. The yield of the obtained protein was not significantly different between the wild type Fc protein and the control Fc-A22p fusion protein.
  • Fc-TPP1, Fc-TPP8, which is a fusion form of the antibody heavy chain constant region of individual clones specific to NRP1 selected through the control group Fc-A22p and the library, and a peptide specifically binding to the selected NRP1, It is the result of ELISA experiment which measured the binding force of Fc-TPP11 to NRP1.
  • Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 fusion proteins selected from the library than Fc-A22p was confirmed to have an affinity of 10 to 60 times improved.
  • NHS-biotin kit (SIGMA-ALDRICH co., USA) was used as a control for VEGF165A, Fc, and A22p, and a protein fused to each antibody heavy chain constant region and a peptide specifically binding to selected NRP1. ) was biotinylated.
  • NRP1-b1b2 (273-586) protein and NRP2-b1b2 (275-595) protein and control group VEGFR2 (46-753) were added to 96 well EIA / RIA plate (COSTAR Corning In., USA) for 1 hr each. After binding at room temperature, the mixture was washed three times for 10 minutes with 0.1% PBST (0.1% Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA).
  • 0.1% PBST (0.1% Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA).
  • PBST 0.1% Tween20 after binding for 1 hour with 5% skim milk (5% Skim milk, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA) , pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA) and washed three times for 10 minutes.
  • 5% skim milk 5% Skim milk, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA
  • Fc-TPP11 binds to NRP1 with high affinity and high specificity to NRP1.
  • SPR surface plasmon resonance
  • NRP1 and NRP2 b1b2 proteins were each diluted in 10 mM Na-acetate buffer (pH 4.0) and immobilized about 1000 response units (RU) on a CM5 sensor chip (GE healthcare, USA).
  • HBS-EP buffer 10 mM Hepes, 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and 0.005% surfactant P20 (pH 7.4), GE Healthcare] was analyzed at 30 ⁇ l / min flow rate, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 fusion protein was analyzed at a concentration of 100 nM to 0.4 nM.
  • Fc-A22p was used as a control.
  • CM5 chip After binding and dissociation analysis, regeneration of CM5 chip was performed by flowing buffer (20 mM NaOH, 1M NaCl, pH10.0) at 30 ⁇ l / min for 1 minute. Each sensorgram obtained by 3 minutes of association and 3 minutes of dissociation was normalized and subtracted to compare a blank cell to calculate affinity.
  • Table 5 shows the results of affinity analysis of the Nc1-b1b2 and NRP2-b1b2 proteins of the Fc-TPP protein using SPR (Surface plasmon resonance, BIACORE 2000, GE healthcare, USA).
  • Example 5 Specific binding of Fc - TPP1 , Fc - TPP8 , Fc - TPP11 fusion proteins to NRP1 expressed on the cell surface and evaluation of cellular influx through NRP1
  • HUVEC human vascular endothelial cell line
  • EGM2 Endothelial growth medium, Promocell
  • EBM2 Endothelial basal medium, Promocell
  • Fc, Fc-A22p and Fc-TPP1 Fc-TPP8 and Fc-TPP11 were diluted to 1 ⁇ M and incubated at 4 ° C. for 30 minutes.
  • NRP1 was stained with a recognized antibody (Sigma), and NRP1 was stained with a secondary antibody (Sigma) having a primary antibody (abcam) that recognizes NRP1 and TRITC (red fluorescence). Nuclei were stained (blue fluorescence) using DAPI and analyzed by confocal microscopy.
  • the protein fused with the antibody heavy chain constant region and the peptide that specifically binds to the selected NRP1 also has a cell influx ability to confirm whether the NRP1 has intracellular influx.
  • co-localization with NRP1 was observed by confocal microscopy (confocal microscopy). After diluting Fc, Fc-A22p and Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 to 1 ⁇ M and incubating at 37 ° C., 5% CO 2 for 10 minutes, the Fc and antibody heavy chain constant regions were selected as above. NRP1 was stained with a protein fused to a peptide specifically binding to NRP1 and analyzed by confocal microscopy.
  • Figure 10 is specific for the antibody heavy chain constant region and selected NRP1 through confocal microscopy to confirm the specific influx of Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 fusion proteins into cells through NRP1 The result of observing the co-localization of the fusion protein and NRP1 binding peptide.
  • Fc the control group
  • Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 that specifically bind to NRP1 do not enter the cell, and are relatively non-Fc-A22p that bind to NRP1 and 2. More of this was introduced into the cell was confirmed that more co-localization with NRP1. This means that Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 have specific influx by NRP1.
  • Semaphorin 3A or VEGF165A is known to enhance vascular permeability by using NRP1 as a co-receptor.
  • NRP1 vascular endothelial
  • VE-cadherin or E (Epithelial) -cadherin is an adhesion factor that forms intercellular gaps between endothelial or epithelial cells, and the reduction of these molecules densifies cell-cell gaps and interferes with the movement of substances.
  • Figure 11 (A) is a Western blot results to determine the biological mechanism in the HUVEC of Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 fusion protein.
  • FIG. 11 (A) in the case of the controls VEGF165A and Fc-A22p, a decrease in VE-cadherin was observed differently from Fc, and Fc-TPP8 and Fc-TPP11 specific to NRP1 were also detected in VE-cadherin. A decrease was observed. On the other hand, in the case of Fc-TPP1, the decrease in VE-cadherin was weak. In the case of Fc-A22p, VE-cadherin was significantly reduced after 1 ⁇ M treatment.
  • Fc-TPP8 and Fc-TPP11 which have specific strong binding to NRP1, showed a significant decrease in VE-cadherin even at 0.1 ⁇ M, 10 times lower than Fc-A22p. Among them, Fc-TPP11 was observed to induce the most effective reduction of VE-cadherin.
  • a transwell assay was performed by treating Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 fusion proteins as an experiment to confirm whether the permeability of vascular endothelial cells was improved.
  • vascular endothelial cells were seeded in an upper chamber with 5 ⁇ 10 4 cells per well in a transwell plate (Corning) using EGM2 medium, followed by 37 ° C. for 3 days. Incubated at 5% CO 2 conditions. Then, after changing to EBM medium, VEGF165A was treated with about 1.3 nM, Fc-A22p and Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 was treated for 30 minutes as a control group.
  • Dextran-FITC (Sigma) was placed in the upper chamber, and when the permeability of vascular endothelial cells was improved, using the principle that the fluorescent substance was observed in the lower chamber for 30 minutes. Afterwards, the medium in the lower chamber was sampled to measure fluorescence.
  • Figure 11 (B) is a result of performing a transwell assay to confirm whether the peptide specifically binding to NRP1 improves the permeability of vascular endothelial cells (HUVEC). As shown in FIG. 11 (B), it was confirmed that VEGF165A and Fc-A22p improved vascular endothelial cell permeability, and in the case of Fc-TPP8 and Fc-TPP11 specific to NRP1, vascular endothelial cell permeation was different from Fc. It was confirmed that the performance was improved. On the other hand, Fc-TPP1 is very poor in improving the permeability of vascular endothelial cells. In summary, the results of FIGS.
  • Fc-TPP11 is the most effective NRP1. The effect was confirmed by tumor permeable peptide (TPP).
  • Example 6 (1) to (2) it was confirmed that the protein fused to the antibody heavy chain constant region and the peptide specifically binding to the selected NRP1 in vitro improves the permeability of vascular endothelial cells. Therefore, IHC (Immunohistochemistry) experiments were performed to confirm the enhanced permeability of Fc-TPP1, Fc-TPP8 and Fc-TPP11 fusion proteins in the mouse model.
  • IHC Immunohistochemistry
  • A431 cells expressing neurophylline 1 in Balb / c nude mice were treated with 5 ⁇ 10 6 cells per mouse. Injected subcutaneously and after 9 days, when the tumor volume reached about 300-400 mm 3 , 10 mg / kg of PBS, Fc, Fc-A22p, Fc-TPP1, Fc-TPP8 and Fc-TPP11, respectively Intravenously. After injection, tumors were extracted from mice 15 hours after each, and an immunohistochemistry experiment was performed.
  • the isolated tumor was cut into 20 ⁇ m thickness by frozen section method, and the blood vessels were stained with a CD31 antibody (BD Pharmingen), a primary antibody, and a secondary antibody combined with TRITC (red fluorescence).
  • a CD31 antibody BD Pharmingen
  • TRITC red fluorescence
  • an FITC green fluorescence bound antibody that recognizes Fc was used.
  • FIG. 12 is an immunohistochemistry result for confirming the penetration ability of the peptide specifically binding to NRP1 in the actual tumor tissue.
  • Fc-A22p reached tumor tissue selectively, and it was confirmed that Fc-TPP1 and Fc-TPP11 specific to NRP1 also penetrated into the tumor tissue.
  • Fc-TPP1 and Fc-TPP11 which have higher selectivity and binding capacity to NRP1 than Fc-A22p, penetrated into tissue more effectively.
  • Fc-TPP8 did not penetrate into tumor tissue.
  • Fc-TPP1 and Fc-TPP11 have a high affinity for NRP1, they selectively reach NRP1 expressing tumor tissues, and because Fc-TPP11 has an additional ability to penetrate tumor tissues than Fc-TPP1, it has a wider range of tumor tissues. It confirmed that it exists.
  • Figure 13 (A) is the result of Western blot changes in E-cadherin in FaDu, a human head and neck cancer cell line.
  • Fc-A22p a reduction of E-cadherin was induced.
  • a decrease in E-cadherin was observed in Fc-TPP1, Fc-TPP8, and Fc-TPP11 specific to NRP1.
  • Fc-TPP11 most effectively induced a reduction of E-cadherin.
  • ex vivo tumor penetration assays to determine the permeability of a tumor in a cancer cell (Ex vivo tumor penetration assay)
  • ex vivo tumor invasion assay was performed to determine whether Fc-TPP penetrated into the tumor tissue by mitigating the cell gap of epithelial tissue even without blood vessels.
  • 5 ⁇ 10 6 cells per mouse were injected subcutaneously with FaDu cells into a Balb / c nude mouse (Narabio, 4 weeks old, female). About 10 days later, the tumor volume was about 300-400 mm 3 .
  • the tumor tissue was removed. After extraction, tissues were washed in MEM medium to which 1% BSA (Welgene) was added, followed by PBS, Fc as a control, and Fc-TPP11 as a control group at 3 ⁇ M for 2 hours and 30 minutes at 37 ° C., 5% CO 2.
  • FIG. 13 (B) shows that Fc-TPP11 was able to penetrate NRP1 into tissues independently of convection caused by blood flow through mediated tumor tissue infiltration activity, and observed through ex vivo tumor penetration assay. to be.
  • the control group Fc did not penetrate into the tumor tissue
  • Fc-TPP11 was observed to penetrate into the tumor tissue even without blood vessels. This means that Fc-TPP11 has the ability to penetrate tumor tissue by relieving the cell gap of epithelial tissue through the reduction of E-cadherin by NRP1.
  • Example 7 Evaluation of TPP11 Peptides Competitively Binding to VEGF165A and NRP1-b1b2
  • a binding competition ELISA was performed to evaluate VEGF165A and RPARPAR peptide competition known to bind to the Arginine-binding pocket of the NRP1-b1 domain, but not to NRP2 and specifically to NRP1. It was.
  • NRP1-b1b2 (273-586) protein was bound to 96-well EIA / RIA plate or 96-well EIA / RIA Black plate (COSTAR Corning In., USA) for 1 hour at room temperature, and then 0.1% PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA) and washed three times for 10 minutes.
  • PBST 0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA
  • FIG. 14 (A) shows the results of confirming that VEGF165A and NRP1 bind to Fc-A22p, Fc-TPP1, and Fc-TPP11. It was confirmed that the sites where Fc-TPP1, Fc-TPP11, and Fc-A22p bind to VEGF165A and NRP1 overlap, and that Fc-TPP1 and Fc-TPP11 have high affinity. This suggests that the position where Fc-TPP1 and Fc-TPP11 bind to NRP1-b1b2 is an arginine-binding pocket such as VEGF165A.
  • Figure 14 (B) confirms the competition binding to NRP1 RPARPAR and VEGF165A and TPP11 peptide known to bind to the NRP1-b1 Arginine-binding pocket.
  • the small peptide form of TPP11 peptide was found to inhibit the RPARPAR peptide and VEGF165's binding to NRP1. This demonstrates that TPP11 binds to the NRP1 b1 Arginine-binding pocket.
  • VEGF165A is known to produce angiogenesis using NRP1 as a co-receptor. Based on this, a tube formation assay was performed as an experimental method to confirm neovascularization in vitro.
  • 50 ⁇ l of ECMatrix was injected into a 96 well plate and polymerized at 37 ° C. for 2 hours. After 2 hours, HUVEC cells were suspended using EBM2 medium, mixed with VEGF165A (20 ng / ml), Fc, Fc-TPP11 (1 ⁇ M), plated 1 ⁇ 10 4 per well on ECMatrix and incubated for 8 hours. The cultured cells were observed under a microscope to obtain an image.
  • Figure 15 (A) is the result of confirming the tube forming inhibition through the tube forming assay. As shown in FIG. 15 (A), tube formation was increased in VEGF165A-treated cells, and unlike Fc, Fc-TPP11 inhibited tube formation.
  • Fc - TPP11 Neovascularization Matrigel plug assays is to determine the inhibitory ability (in vivo matrigel plug assay)
  • Matrigel plug assay was performed. Experimental methods were performed in 6-8 week-old balb / c nude mice subcutaneously with 7.5x10 6 cells of A431 cells per mouse, 200 ⁇ g of Fc, Fc-A22p or Fc-TPP11, and 0.4 ml of Matrigel (BD Biosciences). 8 days after the injection, the Matrigel plug was extracted and the next image was taken (FIG. 15 (B)), and then cut into a thickness of 20 ⁇ m by the freezing section method, and an immunohistochemistry experiment was performed.
  • the density of blood vessels was measured by staining blood vessels with a CD31 antibody, a primary antibody, and a secondary antibody combined with TRITC (red fluorescence).
  • 15 (C) shows that Fc-TPP11 can inhibit the formation of blood vessels induced by VEGF165A in mouse in vivo.
  • wound healing assays were performed to confirm the inhibitory ability of Fc-TPP11 to the migration action of vascular endothelial cells by VEGF165A.
  • the test method was inoculated with 5 ⁇ 10 5 HUVEC cells in 6 well plates and incubated for 1 hour in 0.5% serum EBM2 medium containing 1 ⁇ g / ml mitomycin c. Was made. Using a yellow tip, the bottom of the dish was straightened to create an injury line with a uniform width.
  • VEGF165A with Fc, Fc-TPP11 [1 ⁇ M] in HUVEC cells treated with 0, 20 ng / ml. Incubated at 5% CO 2 . Photographs were taken at 0 and 18 hours under a microscope and the distance between the two ends measured by a computer program (AxioVision LE, Carl Zeiss co., Germany) built in a microscope (Primo vert, Carl Zeiss co., Germany) was statistically compared. Treated.
  • Figure 16 (A) is a result confirmed by the wound healing assay that Fc-TPP11 inhibited the migration of vascular endothelial cells by VEGF165A.
  • VEGF165A the vascular endothelial cell migration was increased.
  • Fc-TPP11 inhibited the vascular endothelial cell migration.
  • Fc-TPP11 specifically binds to neuropilin1, thereby inhibiting binding to VEGF165A and NRP1 b1 arginine-binding pockets, thereby inhibiting the migration of VEGF165A's vascular endothelial cells.
  • transwell assay was performed to investigate the inhibitory ability of Fc-TPP11 to vaGF endothelial invasion by VEGF165A.
  • a transwell transwell, Corning costar, USA
  • Matrigel matrigel, Corning costar, USA
  • HUVEC cells HUVEC cells and Fc, Fc in the upper well. Inoculate 5 ⁇ 10 4 of -TPP11 [1 ⁇ M] into EBM2 medium.
  • the lower well was injected with EBM2 medium containing VEGF165A (20 ng / ml). After 12 hours of incubation at 37 ° C., 5% CO 2 conditions, unmigrated cells in the upper wells are removed with cotton and 4% formaldehyde cells fixed. And the cells were stained with Crystal violet. The moved cells were observed under a microscope and the number of moved cells was measured.
  • Figure 16 (B) is a result confirmed by the transwell assay that Fc-TPP11 inhibits the infiltration of HUVEC cells induced by VEGF165A.
  • VEGF165A vascular endothelial invasion was increased.
  • Fc-TPP11 inhibited vascular endothelial invasion. This means that Fc-TPP11 specifically binds to the NRP1 b1 Arginine-binding pocket, thereby inhibiting the binding of VEGF165A and NRP1 to inhibit the invasive action of VEGF165A vascular endothelial cells.
  • Example 9 Fc - tumors in vivo inhibitory ability of TPP11 growth and angiogenesis inhibitory ability evaluation
  • Fc-TPP11 inhibited the growth of cancer cells compared to the control groups PBS and Fc.
  • Figure 17 (B) compared with PBS, Fc Fc-TPP11 was confirmed that there is no significant change in body weight, it was determined that there is no toxicity.
  • FIG. 17 (C) shows that the tumor growth inhibition of Fc-TPP11 in FIG. 17 (A) is thought to be an effect of inhibiting angiogenesis, and thus the tumors of the experiment were extracted and an IHC experiment was performed.
  • Blood vessels representing neovascularization were stained with CD31 antibody, pericyte surrounding the vessels were stained with ⁇ -SMA and observed under confocal microscopy.
  • the tumor tissue of the mice injected with Fc-TPP11 decreased the blood vessel density compared to the control group PBS, Fc, thereby reducing the co-localization of blood vessels and pericyte. This means that Fc-TPP11 inhibits neovascularization by VEGF165A produced from tumors.
  • NRP1 specific Fc-TPP protein competes with VEGF165A and NRP1 for angiogenesis-inhibiting ability by VEGF165A, thereby having tumor growth inhibitory activity in vivo.
  • the tumor-penetrating ability of Fc-TPP11, the fused form of TPP11 was the most effective.
  • Example 10 Fc - TPP11 co-administration of small molecule drugs tumor tissue accumulation and transmission of the function Promotion evaluation
  • the isolated tumor was cut into 20 ⁇ m thickness by frozen section method, and the blood vessel was stained with a CD31 antibody (BD Pharmingen), a primary antibody, and a secondary antibody combined with FITC (green fluorescence). Doxorubicin distributed in the tissue itself was confirmed that the red fluorescence.
  • BD Pharmingen BD Pharmingen
  • FITC green fluorescence
  • Figure 18 (A) is an IHC result for confirming the infiltration capacity of doxorubicin administered in combination with Fc-TPP11 in the tumor tissue. While red fluorescence was rarely observed in doxorubicin in FaDu cancer cell tissues, it was confirmed that doxorubicin in combination with Fc-TPP11 penetrated into the tissue farther from the blood vessel compared with doxorubicin alone. When the combination of Fc and doxorubicin was administered as a control it was confirmed that there is no effect on the penetration ability.
  • FIG. 18 (B) shows fluorescence values of doxorubicin in tumor tissues by homogenization of extracted tumor tissues in order to quantitatively confirm accumulation of doxorubicin in tissues.
  • doxorubicin, PBS, Fc, and Fc-TPP11 were intravenously injected, perfused with PBS through the heart of mice, and tumor tissues were extracted.
  • the extracted tissue is placed in a dissolution buffer containing 1 ml of 1% SDS (Sodium dodecyl sulfate) and 1 mM sulfuric acid and crushed. Then, chloroform and isopropyl alcohol are mixed 1: 1 and mixed with the dissolved tissue 2: 1 and then frozen at -80 ° C.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the solution was dissolved at 37 ° C. to obtain a supernatant through centrifugation, and the fluorescence (Excitation 485 nm / emission 528 nm) was measured to quantify the amount of doxorubicin transmitted.
  • tumor-penetrating peptides that specifically bind NRP1 can be applied to a variety of small molecule drugs.
  • anti-EGFR antibody Cetuximab a solid cancer treatment antibody, was selected as a model antibody of a peptide specifically binding to mAb-NRP1 for verifying the effect of the peptide specifically binding to NRP1 in a mouse model.
  • the DNA of this fused portion was substituted with a vector encoding the wild type Cetuxmab heavy chain.
  • 20 is a schematic diagram of the constructed Cetuxmab heavy chain-TPP11
  • FIG. 21 is a vector encoding the light chain of wild type Cetuximab.
  • FIG. 22 (A) shows a schematic diagram of cetuximab-TPP11, a complete IgG monoclonal antibody fused with a TPP11 peptide. Expression and purification were carried out in HEK293F by the method described in Example 3, and confirmed the purity through SDS-PAGE Figure 22 (B) is temporarily expressed and purified through cotransformation into HEK293F cells, then reducing And analysis of size and purity on SDS-PAGE under non-reducing conditions.
  • Table 6 shows the yield of protein produced per liter of culture of purified TPP11 fused antibody. The results obtained three times were statistically processed, and ⁇ represents the standard deviation value. The yield of the obtained protein (Cetuximab-TPP11) was not significantly different compared to the yield of wild-type protein (Cetuximab).
  • FIG. 22 (C) compares Cetuximab-TPP11 and wild-type antibody (Cetuximab) in which TPP11 is fused through ELISA for binding ability to EGFR as in Example 4.
  • the fusion of the original TPP11 peptide did not affect the binding ability to EGFR, an antigen of Cetuximab.
  • mice were treated with FaDu 5 ⁇ 10 6 per mouse.
  • the cells of the dogs were injected subcutaneously, and after about 9 days, when the tumor volume reached about 300-400 mm 3 , PBS, Cetuximab, and Cetuximab-TPP11 were intravenously injected at 1.25 mg / kg, respectively.
  • tumors were removed from the mice and immunohistochemistry experiments were performed. The tissues were stained and observed in the same manner as in Example 6.
  • Figure 23 is an IHC result for confirming the penetrating ability of tumor cells of Cetuximab fused TPP11 peptide.
  • Green fluorescence was observed only around the vessels of Cetuximab in FaDu cancer cell tissues, whereas TPP11-fused Cetuximab-TPP11 was found to penetrate into the tissues farther from the vessels as compared to Cetuximab, which was quantified
  • the ImageJ program was used to do this.
  • Cetuximab-TPP11 fused with TPP11 which has a higher binding capacity to NRP1
  • the above results indicate that NRP1 specific binding tumor-penetrating peptides can be applied to various monoclonal antibodies that recognize various antigens.

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Abstract

본 발명은 뉴로필린2(Neuropilin 2, NRP2)에는 결합하지 않고, 뉴로필린1(Neuropilin 1, NRP1)에만 특이적으로 결합하는 펩타이드와, 상기 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀, 이를 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 진환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 및 진단용 조성물에 관한 것이다. 또한, 또한 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항체 중쇄불변부위는 NRP1과 특이적으로 결합하는 특성을 갖게 되어, 생체 내 투여시 종양조직에 선택적으로 축적되고, 종양혈관내피세포의 세포간격을 넓혀서 혈관 밖 유출이 증진되고, 종양조직 내부로의 침투가 증가한다. 또한 본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항체 중쇄불변부위는 혈관생성인자(VEGF)가 뉴로필린1에 결합하는 것을 막아서, 종양조직에서의 신생혈관 생성 억제능을 지닌다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드가 융합된 항체 중쇄불변부위는 생체 내 종양억제 활성을 보인다.

Description

뉴로필린1 특이적 결합 펩타이드 및 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 및 이의 용도
본 발명은 Neuropilin-1(NRP1, 뉴로필린1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드(TPP, tumor penetrating peptide)에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명의 펩타이드는 뉴로필린1(Neuropilin 1, NRP1)과 뉴로필린 2(Neuropilin 2, NRP2)에 동시에 결합하는 펩타이드의 돌연변이 라이브러리를 구축하여 스크리닝 한, NRP1에만 고친화도로 선택적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 펩타이드, 나노입자 또는 리포좀을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 펩타이드, 나노입자 또는 리포좀을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항체 중쇄의 불변부위 C-말단에 펩타이드 라이브러리를 효모세포 표면에 구축하여, NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하는 방법에 관한 것이다.
항체는 항원에 대한 고특이성, 고친화도로 결합하여 항원을 중화시키는 작용을 하는 단백질이다. 또한 항체의 중쇄불변부위의 기능인 항체-의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cellular cytotoxicity)을 지니고, FcRn(neonatal Fc receptor) 와의 결합을 통해 혈액 내 긴 반감기(long serum half-life)를 가진다. 항원에 대한 고특이성, 고친화도로 결합하는 특성으로 원하지 않는 부작용을 줄일 수 있고, 항체-의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cellular cytotoxicity)으로 질병 유발 세포의 사멸을 유도할 수 있으며, 혈액 내 긴 반감기는 장 시간 동안 지속되는 항체의 효과를 기대할 수 있다. 이러한 항체의 특성 때문에, 이를 치료용 단백질로서 개발하려는 연구가 활발하다.
현재까지 개발된 암 치료용 항체는 고형암(Solid tumor) 치료용, 및 혈액암(Leukemia/lymphoma) 치료용 항체, 두 가지 분류로 나뉜다. 여기서 각 분류의 항체를 단독투여시 치료 반응률(response rates)이 이 두 가지 항체에서 차이를 보인다. 현재 시판되는 여러 항체들의 통계로 혈액암 치료용 항체의 단독투여시 치료 반응률은 30~51%에 달하는 반면, 고형암 치료용 항체의 단독투여 시 치료 반응률은 8~15% 로 비교적 낮은 치료 반응률을 보인다. 이는 혈액암 치료용 항체의 경우 혈액에 있는 암세포를 타겟하는 것과 달리, 고형암 치료용 항체의 경우 치료 효과를 나타내기 위해서는 1)시스템적인 정맥주사 또는 피하주사 후, 혈관을 흘러 고형암 조직에 있는 종양혈관에 도달해야하고(tumor homing 단계), 2)종양혈관에서 암 조직쪽으로 빠져나와(Extravasation 단계), 3)암조직 내에서도 혈관이 없는 조직내부로의 침투(tumor tissue penetration 단계), 4)암세포에 발현된 항원에 결합하여 작용해야(targeted antigen binding & effector function 단계)하는 과정이 이뤄져야 하기 때문이다(Scott AM et al. 2012). 이러한 일련의 과정에서 고형암 치료용 항체가 암조직 축적 및 암조직내부로의 침투하여 조직내부의 암세포에 도달하는데에 존재하는 여러 방해 요소 때문에, 실제 인간의 생체 내에서 종양조직 내에 축적되는 항체의 양은 0.01~0.0001% 투여량/1 g 종양조직(injected dose per gram tumor tissue)으로 매우 낮아서, 낮은 치료 반응률을 보이게 된다(Thurber et al. 2008). 따라서 항체가 종양조직에 선택적으로 축적되고 종양조직 내부로의 고침투성을 갖도록 하는 항체 기술 개발은 고형암 치료용 항체의 치료 효과를 높일 수 있어 매우 중요하다.
항체가 조직으로 침투가 잘 되지 않는 원인으로는 크게 1) 항체의 본질적인 특성(크기(~150 kDa), 항원결합특성(antigen-binding barrier) 등(Thurber and Dane Wittrup, 2012), 및 2) 정상조직과는 다른 종양 조직의 미세조직학적/생리학적 특성(예, 불완전하고 비정상적인 혈관 생성, 매우 낮은 임파선 형성, 높은 세포 밀도, 높은 세포외 기질 밀도 등) 두 가지에 기인한다고 볼 수 있다(Jain and Stylianopoulos, 2010). 따라서 항체의 크기 및 항원결합특이성을 조절하는 항체공학기술을 이용하거나, 항체의 종양조직 침투를 증진시키는 분자(소위 promoter agents)와의 병용투여 방법 등 여러 방법을 이용하여 항체의 종양조직 침투성을 증진시키려는 노력이 경주되어 왔다.
항체는 12개의 도메인으로 이루어져있는 150 kDa의 큰 분자이기 때문에, 혈액에 있는 항체들이 확산 또는 대류를 통하여 종양 조직으로 전달되기 어렵다(Baker et al. 2008). 따라서, 이를 극복하기 위해 크기가 감소된 항체의 항원과 결합하는 항원결합절편(antigen binding fragment(Fab), 50 kDa), 단일사슬항체절편(single chain variable fragment(scFv), 30kDa), 중쇄가변부위 단일도메인(heavy chain variable domain (VH), 14kDa)와 같은 항체 절편만 투여하는 시도가 있었다. 다만, 항체의 절편은 Fc 부분이 없고, 크기가 작아서, 생체내 투여 시 다량 신장으로 빠져나가 반감기(Half-Life)가 짧아져서 항체의 효능이 크게 향상되지는 않았다(Behr et al. 1998).
항체가 조직 내에 많이 분포하지 못하는 또 하나의 원인은 항체의 항원결합능이다. 고형암 치료용 항체는 종양에 관련된 항원(Tumor-Associated antigen), 또는 종양에 과발현되며 종양의 생장에 중요한 타겟에 대하여 높은 친화도를 갖는다. 항체는 특정 항원이 있는 조직에 도달하여도, 항원 발현양이 많은 세포로 이루어진 종양조직에서는 항체의 높은 친화도 때문에 항체가 종양조직 표면의 세포에 발현된 항원에 결합된 채 종양조직 표면에 머무르게 된다(Lee and Tannock, 2010). 또한 결합 후 항원과 함께 세포 내 유입(Endocytosis)되어 세포 내에서 파괴된다. 결과적으로 항체가 종양조직 표면에는 위치할 수 있지만, 과발현되어 있는 종양항원에 결합하여 파괴되므로, 결국 종양조직 내부로의 효율적인 침투가 일어나지 않는다. 따라서 종양혈관에서 멀리 떨어진 조직내부의 종양세포항원에는 항체가 도달할 수가 없게 되어, 종양성장억제 활성이 감소하고, 항체 내성과 종양 재발을 유도할 수 있다. 이를 극복하기 위하여, 친화도를 조절하거나, 반감기를 늘리기 위한 연구가 진행되고 있다(Dennis et al. 2007).
항체의 종양조직 내부로의 침투 및 분포를 방해하는 종양조직의 생리학적 성질은 크게 4가지로 분류될 수 있으며, 이는 내피 장벽(Endothelial Barrier), 높은 종양 조직 내 유압(interstitial fluid pressure), 기질 장벽(Stromal impediment), 상피 장벽(Epithelial Barrier)이다.
내피 장벽(Endothelial Barrier)에 있어서, 종양은 급격하게 성장하는 속도에 따라 많은 양의 영양분을 공급받기 위해 혈관 주위에 위치한 혈관내피세포 생장을 촉진시키는 인자(Pro-angiogenic Factor)를 과발현 및 분비한다. 이에 따라 신생혈관이 불균일하게 다량 생성되어 전체적인 혈류의 속도가 감소하게 된다. 이를 극복하기 위해 일혈(Extravasation)을 증가시켜서 치료제가 혈관으로부터 빠져나와 조직으로 분포되게 하는 방법이 있다. 일혈과 관련된 염증반응 사이토카인인 TNF-α 와 IL-2, 일혈을 촉진하는 화학 물질(Promoter chemical drug)과 치료제를 병용투여(Co-administration)하여 종양 조직으로 약물전달을 증진시킨 사례가 있다(Marcucci et al. 2013). 하지만 이러한 시도들은 항체 및 일혈촉진제의 두 가지 물질을 생산하여야 한다는 점에서 실용화 및 임상실험에 어려움이 있다.
높은 종양 조직 내 유압(interstitial fluid pressure)은 약물이 혈관에서부터 조직으로 대류 되기 위한 압력 차가 작거나 심지어 조직의 유압이 혈액의 유압보다 높은 상황으로부터 야기된다. 이는 정상조직과는 달리, 종양조직에 림프관이 부재하여 조직내부 유체가 축적됨으로써 주로 발생하고, 비정상적인 혈관생성(abnormal angiogenesis)도 기여한다. 이를 극복하기 위해서 혈관내피세포 생장을 촉진시키는 인자, 특히 혈관내피세포 생장인자-A(VEGF165A)의 작용을 막아 신생혈관 생성을 억제하여 혈관을 정상화하는 방법 또는 혈관의 유압을 증가시키는 방법이 시도되었다. 혈관의 유압을 증가시키는 방법은 혈장 단백질인 알부민을 항체와 병용 투여하여 혈관의 삼투압을 증가시켜 항체의 종양조직 전달효과를 향상시킨 사례가 있다(Hofmann et al. 2009).
기질 장벽(Stromal impediment)은 항체가 미세혈관으로 빠져 나와 조직으로 대류될 때 만나는 세포 외 기질 장벽(Extracellular matrix barrier)으로써 주로 콜라겐(Collagen)과 히알루로난(Hyaluronan)으로 구성되어 있다. 세포 외 기질에 따라 종양의 모양은 크게 영향을 받는다. 그에 따라 약물이 잘 분포되는 곳과 그렇지 못한 곳의 차이가 나기 때문에 약물 분포가 불균일하게 된다. 또한 세포 외 기질의 발현 양이 많아지면 고형암 압박(Solid stress)으로 높은 세포 밀도로 인한 종양 조직 유압이 상승하게 된다. 이를 극복하기 위한 접근 방법은 종양 조직 세포의 사멸을 유도하여 종양 조직 내 세포밀도를 줄이는 방법이 있다. 또한 종양 조직의 콜라겐을 분해하는 효소(Collagenase)를 처리하여 고형암 압박을 줄여서 대조군과 비교하여 약물전달 효과를 약 2배 높인 사례가 있다(Eikenes et al. 2004).
상피 장벽(Epithelial Barrier)은 종양조직 상피세포들의 세포-세포간 접착 인자들이 빽빽하게 세포 간극을 채우고 있어 치료제가 세포 사이로 확산 또는 대류가 일어나지 못하게 된다. E-카데린(E-cadherin)은 이러한 세포-세포간 접착의 주요 인자로 알려져 있다. 이러한 E-카데린을 감소 시키는 물질이 바이러스(Adenovirus-3)에서 발견되어, 바이러스를 구성하는 단백질 중 세포의 E-카데린을 감소시키는 활성을 가진 부분(JO-1)만 항체와 병용 투여하여 항체의 항암효과를 증진시킨 사례가 있다(Beyer et al. 2011).
또한 항체의 종양조직 침투를 증진시키기 위하여 종양혈관세포 및 종양세포에 과발현되는 뉴로필린(NRP, Neuropilin)에 결합하는 펩타이드를 이용하는 방법이 있다. 뉴로필린에 결합하는 펩타이드를 이용한 방법 중의 하나는 iRGD 펩타이드를 항체와 함께 병용투여(Co-administration)하는 것이다(Sugahara et al. 2010). 하지만, 펩타이드 병용투여 방법의 경우, 펩타이드의 작은 분자의 크기에서 기인한 약물동태학적(pharmacokinetics)으로 매우 짧은 반감기(half-life)때문에 실제 환자에게 투여하는 양과 투여횟수가 매우 많아야 한다. 더욱이 병용투여의 불가피한 과정으로 치료제 및 종양투과작용 물질을 각각 생산해야 하는바, 산업적으로 실용 가능성이 낮다. 이를 극복하기 위한 최근의 기술은 단일클론항체의 중쇄 C-말단에 뉴로필린과 결합하는 A22p 펩타이드를 융합하여, 항체의 긴 반감기를 그대로 이용하고, 항체의 종양조직 침투를 증진시킨 예가 있다(Shin et al. 2014; 대한민국 특허출원10-2014-0061751; PCT 특허출원 PCT/KR2014/004571).
뉴로필린은 막투과성 당단백질(transmembrane glycoprotein)으로서, 뉴로필린1(NRP1) 및 뉴로필린2(NRP2)의 두 가지 형태가 있다(Kolodkin et al. 1997). 뉴로필린1과 2는 각각 923 과 931 아미노산으로 구성되어 있고, 약 44%의 아미노산 서열 유사성(sequence homology)을 보이며, 여러 구조적인 면과 및 생물학적 활성을 공유한다. 뉴로필린1/2는 공통적으로 세포밖 a1, a2, b1, b2, MAM 도메인과 세포 내 PDZ 결합 도메인으로 구성되어 있다(Appleton et al. 2007). 뉴로필린은 정상세포에 매우 미약하게 발현되는 반면, 대부분의 종양혈관 내피세포, 고형암 세포, 혈액종양 세포에 과발현되어 있다(Grandclement, C. and C. Borg 2011). 뉴로필린은 VEGF 패밀리 리간드 결합에 의해 VEGFRs(VEGF receptors)들의 공수용체(coreceptor)로 작용한다. 특히 NRP1은 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3의 공수용체로 작용하여 다양한 VEGF 리간드와 결합함으로써, 종양조직에서 신혈관생성(angiogenesis), 세포 생존, 이동/부착(migration & adhesion) 및 침윤(invasion) 등에 기여한다. 반면 NRP2는 VEGFR2, VEGFR3의 공수용체로 작용하여 림프관 형성(lymphangiogenesis) 및 세포부착(adhesion)에 기여한다. 또한 뉴로필린1/2는 Plexin family receptors의 공수용체로 작용하여 분비된 세마포린 3계열 리간드(class 3 semaphorins : Sema3A, Sema3B, Sema3C, Sema3D, Sema3E, Sema3F, Sema3G) 리간드와 결합한다. 뉴로필린은 기능성 세포 내 도메인이 없어 리간드가 결합하더라도 단독으로 활성이 없고, 공수용체인 VEGF 수용체 또는 플렉신의 공동수용체를 통해 신호가 전달된다고 알려져 있다. Sema3는 뉴로필린, 플렉신 수용체와 2:2:2로 결합하여 작용한다. 하지만, 많은 연구결과들이 뉴로필린 단백질이 VEGF 수용체 또는 플렉신의 공동수용체와의 상호작용 없이도 단독적인 신호전달을 할 수 있음을 보여주고 있다. 그렇지만, 이에 대한 정확한 분자기전은 아직 불명확하다.
뉴로필린과 공수용체의 작용이 뉴로필린만 타겟팅 하였을 때에도 억제되는 사례들이 보고 되어 있다. 예를 들어, 항-뉴로필린1 항체의 경우, VEGFR2와 뉴로필린1에 결합한다고 알려진 VEGA-A와 뉴로필린1에만 경쟁적으로 결합하며, VEGFR2의 작용인 신혈관생성(angiogenesis), 세포 생존, 이동/부착(migration & adhesion) 및 침윤(invasion)의 억제 기능을 가진다고 보고되어 있다(Pan Q et al. 2007). 항-뉴로필린2 항체의 경우, VEGFR3와 뉴로필린2에 동시에 결합한다고 알려진 VEGA-C와 뉴로필린2에 경쟁적으로 결합하며, VEGFR3의 작용인 림프관 형성(lymphangiogenesis) 및 세포부착(adhesion)의 억제 기능을 가진다고 보고되어 있다(Caunt M et al. 2008).
뉴로필린1 및 2에 결합하는 VEGF 리간드 패밀리 및 Sema3 계열 리간드의 C-말단 부위는 뉴로필린1/2에 공통적으로 존재하는 b1 도메인에 있는 소위 아르지닌 결합포켓(Arginine-binding pocket)에 결합한다(MW Parker et al. 2012). 이 때, 아르지닌 결합포켓과의 결합은 뉴로필린 결합 리간드의 C-말단 부위에 공통적으로 R/K-x-x-R/K (R=Arginine, K=lysine, x=any amino acids) 모티프에 의해서 일어난다. 상기 모티프에서 벗어나는 아미노산 서열로 돌연변이를 유도하면 리간드들은 뉴로필린과의 결합이 감소하거나 결합을 못하여, 생물학적 활성이 없어진다. 특히 C-말단 잔기에 양이온성 아르지닌(Arg) 또는 라이신(Lys)은 결합에 매우 필수적이어서, 이를 다른 아미노산 잔기로 치환하면, 뉴로필린과의 결합이 상실되고, 생물학적 활성이 없어진다. 따라서, 이러한 뉴로필린 리간드들의 C-말단 부위 R/K-x-x-R/K 모티프의 필수성을 C-말단 규칙(C-end rule/CendR)이라 칭한다(Teesalu et al. 2009). C-말단 규칙 서열을 지닌 단백질 혹은 펩타이드는 C-말단의 아르지닌(Arg) 혹은 라이신(Lys) 잔기로 뉴로필린과 결합할 수 있다(Zanuy et al, 2013).
VEGF 리간드 및 Sema3 계열 리간드의 C-말단 부위는 R/K-x-x-R/K 모티프를 공통적으로 가지고 있어, 대부분의 리간드가 뉴로필린1 및 2에 선택적으로 하나에 결합하기 보다는, 두 단백질에 모두 결합하는 특성을 보인다.
뉴로필린에 결합하는 리간드들 외에도, 뉴로필린에 결합하는 많은 펩타이드들이 선별되거나 디자인되어 보고되었는데, 모두 R/K-x-x-R/K 모티프를 가져, 상기 펩타이드들이 뉴로필린1/2의 b1 도메인의 아르지닌 결합포켓(Arginine-binding pocket)에 결합하는 것으로 여겨진다. 또한 뉴로필린1/2에 결합하여 병용 투여한 약물의 종양조직 침투성을 증가시키는 iRGD 펩타이드(Sugahara et al. 2010)와 항체의 중쇄말단에 융합되어 융합항체의 종양조직 침투성을 증가시키는 A22p 펩타이드도(Shin et al. 2014) 상기 CendR 규칙을 따르는 아미노산 서열을 가진다.
또한, 상기 뉴로필린에 결합하는 펩타이드들은 모두 뉴로필린1 또는 2의 둘 중의 하나에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 보고된 바가 없으며, CendR 서열 모티프를 가지고 있어 뉴로필린1과 2의 아르지닌 결합포켓(Arginine-binding pocket)에 모두 결합한다.
상술한 바와 같이 뉴로필린1은 주로 신생혈관에 과발현되어 신생혈관 생성에 중요한 역할을 하고, 뉴로필린2는 림프관에 발현되어 림프관 생성에 기여한다. 따라서 뉴로필린1 또는 뉴로필린2에 선택적으로 고친화도로 결합하는 펩타이드는 각 뉴로필린의 생물학적 활성을 특이적으로 조율할 수 있는 특성을 가질 수 있으나, 이에 대한 선행보고는 없다. 또한 뉴로필린1과 2는 동종이배체(homodimer) 또는 이종이배체(heterodimer)형태로 활성화 되는데, 기존 펩타이드의 경우 단일분자(monomeric)형태로 개발되어 생물학적 활성 조율 효능이 매우 약해, 뉴로필린1을 동종이배체(homodimer) 형태로 결합하여 생물학적 활성을 조율하는 펩타이드 형태가 바람직하다. 또한 뉴로필린1의 경우는 혈관내피세포(endothelial cells)에 과발현되며, VEGF 리간드의 자극을 받아 신혈관생성에 중요한 역할을 해서, 뉴로필린1에만 고특이적/고친화도(high specificity/high affinity)로 결합하며, VEGF리간드와의 경쟁적인 결합을 하는 펩타이드는, 종양조직 축적(homing & accumulation) 기능 및 신혈관생성 저해능을 가질 수 있다. 또한 뉴로필린1은 종양조직 혈관 및 종양세포(epithelial cells)에 과발현되어, VEGF 리간드의 자극을 받아 종양 성장 및 신생혈관 생성에 중요한 역할을 해서, 뉴로필린1에만 특이적으로 결합하며, VEGF리간드와의 경쟁적으로 결합하는 펩타이드는, 종양성장을 저해하는 활성을 가질 수 있다. 또한 뉴로필린1이 활성화 되었을 때, 내피세포 장벽(Endothelial barrier)인 VE-카데린(VE-cadherin)의 감소, 상피세포 장벽(Epithelial barrier)인 E-카데린(E-cadherin)을 감소시키는 활성이 있어, 뉴로필린1에만 특이적으로 결합하여, 혈관내피세포의 VE-카데린과 종양세포의 E-카데린의 양을 감소시키는 활성을 갖는 펩타이드는, 이 펩타이드가 융합(fusion)되거나 동시투여(co-administration)된 단백질, 항체, 나노입자, 소분자 약물 등의 종양 조직 일혈(Extravasation)을 증가시키고, 종양조직 내에서도 조직 투과성(tumor tissue penetration)을 증가시킬 수 있다.
따라서 본 발명자는 기존의 뉴로필린1 및 2 모두에 결합하는 펩타이드의 한계를 극복하고자, 뉴로필린2에는 결합하지 않고, 뉴로필린1에만 선택적으로, 고친화도로 결합하는 신규한 펩타이드를 발굴하고자 하였다.　또한 뉴로필린1의 b1 도메인 아르지닌 결합포켓(Arginine-binding pocket)에 2가 결합(bivalent binding)을 하여, 뉴로필린1을 세포 내로 들어가게 하는 활성화시키는 신호전달을 유도하여, 융합되거나 동시 투여된 단백질, 항체 등의 종양조직 분포 및 축적을 증가시키고, 종양조직 내부로의 혈관밖 유출(Extravasation)을 촉진하고, 종양조직 내부에서도 종양조직 투과성을 갖는 신규한 펩타이드를 발굴하고자 하였다. 따라서, 항상 동일이배체(homodimer)로 존재하는 항체 중쇄불변부위의 C-말단에 융합되어 활성을 갖는 신규한 펩타이드를 개발하고자 하였다.
이를 위해, 항체 중쇄불변부위(Fc)의 카복시말단(Carboxy-terminus)에 융합된 펩타이드 라이브러리를 디자인하여, 이를 효모세포표면에 발현시켜 Fc-융합펩타이드 라이브러리를 구축한 후, 뉴로필린1의 b1 도메인에 결합하는 클론을 선별하고자 하였다. 뉴로필린1에만 결합하는 펩타이드를 선별하기 위해, 선별과정에서 뉴로필린2을 경쟁자로 사용하였다. 선별된 클론 중 종양조직 침투능이 있고, 뉴로필린1 b1 도메인에 결합하는 클론을 발굴하였으며, 이 펩타이드를 항체의 중쇄 C-말단에 융합시켜 2가 형태로(bivalent binding) 항체-펩타이드가 융합된 단일분자로 항체 고유 기능은 그대로 유지한 융합항체를 제작하였다. 이 융합항체 기술은 뉴로필린1을 과발현하는 종양조직에 선택적으로 축적되고 종양조직 내부로의 침투능이 증진시켰다. 또한, 혈관생장인자-A(VEGF165A)의 뉴로필린1에 대한 결합을 방해하여, 신생혈관형성을 억제시키는 융합항체 기술을 개발하기에 이르렀다.
본 발명의 일 양상은, 뉴로필린1(NRP1) 및 뉴로필린2(NRP2)에 모두 결합하는 기존의 리간드 및 펩타이드와는 달리, 뉴로필린1에만 고특이적/고친화도로 결합하는 펩타이드, 특히 종양 침투성 펩타이드(TPP, tumor penetrating peptide)를 제공하는 것이다. 구체적으로 본 발명의 일 양상은 뉴로필린1에만 고특이적/고친화도로 결합하는 펩타이드가 뉴로필린1과 결합하는 VEGF 리간드 등과 경쟁적으로 결합하여, 종양에서 신혈관생성을 저해하는 활성과 종양 침투성 활성을 동시에 지닌 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 일 양상은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 펩타이드, 나노입자 또는 리포좀을 포함하는 암 또는 신행혈관 관련 진환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양상은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 펩타이드, 나노입자 또는 리포좀을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 뉴로필린1에만 고특이적/고친화도(high specficity/high affinity)로 결합하는 펩타이드, 특히 종양 침투성 펩타이드(TPP, tumor penetrating peptide)를 제공한다. 이러한 뉴로필린1 특이적 펩타이드는, 기존의 뉴로필린1(NRP1) 및 뉴로필린2(NRP2)에 모두 결합하는 리간드 및 펩타이드와는 다른 서열을 가지는 펩타이드를 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 상기 펩타이드는 5개 내지 50개의 아미노산으로 이루어지며; 상기 펩타이드의 C 말단은 X1-X2-X3-X4이고, 여기서, 상기 X1은 아르지닌, 리신, 또는 임의의 아미노산 서열이며, 상기 X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 서열이고, 상기 X4는 아르지닌 또는 리신인 것이다.
본 발명의 구체예에서는 항체 중쇄불변부위(Fc)의 C-말단(Carboxy-terminus)에 융합된 펩타이드 라이브러리를 디자인하여, 이를 효모세포표면에 발현시켜 Fc-융합펩타이드 라이브러리를 구축한 후, 뉴로필린1의 b1 도메인에 선택적으로 결합하는 클론을 선별하여 도출된 펩타이드를 분리, 동정하였다.
상기 Fc-펩타이드 라이브러리에서 뉴로필린1에 특이적이며 고친화도로 결합하는 펩타이드를 분리하기 위해, 뉴로필린1의 b1b2 도메인 단백질을 이용하여 선별함과 동시에 뉴로필린2 의 b1b2 도메인 단백질을 경쟁자(competitor)로 이용하여, 선별과정을 진행하였다.
또한, 본 발명의 일 구체예에서는 뉴로필린1에만 고특이적/고친화도로 결합하는 펩타이드가 2가 형태로 뉴로필린1과 결합하여 생물학적 활성을 갖도록, 항체 중쇄불변부위(Fc)의 C-말단(Carboxy-terminus)에 15개의 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)X3 아미노산 서열로 이루어진 링커로 융합된 Fc-융합펩타이드를 구축하여, 종양 침투성 활성과 신혈관생성(angiogenesis)을 저해하는 활성을 동시에 지닌 것을 펩타이드를 분리, 동정하였다.
본 발명에서 사용하는 용어 “종양 침투성”이란 예를 들면 1) 종양 특이 혈관내피세포, 종양세포 또는 조직을 특이적으로 인식하여 축적하거나, 2) 종양혈관내피세포의 세포간극을 넓혀 혈관밖 유출(Extravasation)을 촉진시키거나, 3) 종양내부에서 종양세포간극을 조절하여 종양내부로 깊숙이 침투를 촉진하는 특성 중 하나 이상의 특성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “신혈관생성(angiogenesis) 저해”는 예를 들면 뉴로필린1에 결합하여 신혈관생성을 촉진하는 VEGF 리간드 등과 뉴로필린과의 결합을 경쟁적으로 결합하여 리간드의 활성을 저해하여, 궁극적으로 종양조직 내에서 신혈관생성 억제능(anti-angiogenesis)을 보이는 특성을 의미한다.
본 발명의 상기 펩타이드는 5개 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 7개 내지 30개 이하로 이루어질 수 있다.
본 발명의 상기 펩타이드는 N-말단으로부터 X3를 구성하는 아미노산 서열이 임의의 아미노산 서열일 수 있으나, 바람직하게는 세린, 쓰레오닌, 타이로신, 아스파라진, 글루타민, 히스티틴, 글라이신, 페닐알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 알라닌, 메티오닌, 프롤린, 라이신, 아스파라긴 산, 글루타민 산, 또는 정지코돈일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 히스티딘, 글라이신, 아스파라진, 세린, 글루타민, 페닐알라닌, 발린, 류신, 트레오닌, 아르지닌, 프롤린, 이소류신, 알라닌 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 펩타이드는 바람직하게는 N-말단이 히스티딘-트레오닌-프롤린-글리신(H-T-P-G)으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 1 내지 3의 구체적인 서열정보는 하기와 같다.
본 발명에 따른 상기 펩타이드의 가장 바람직한 예는 상기 서열번호 3의 TPP11이다.
상기 일 양상의 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 링커 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 1개 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 4개 내지 20개, 더욱 바람직하게는 4개 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 링커 펩타이드는 글라이신(glycine), 또는 세린(serine)으로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 상기 링커 펩타이드의 서열은 (GGGGS)n의 아미노산 서열로 이루어진 것(단, 상기 n은 각각 독립적으로 정수 1 내지 20 중 하나이다)일 수 있고, 더욱 바람직하게는(GGGGS)3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 링커 펩타이드가 결합한 상태의 펩타이드 서열은 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 이루진 것일 수 있다.
그 구체적인 서열정보는 하기와 같다.
Figure PCTKR2016002942-appb-I000002
본 발명의 다른 양상은 상기의 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드(서열번호 1 내지 6)가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 펩타이드, 나노입자 또는 리포좀을 제공한다.
상기 단백질은 항체, 항체의 절편, 면역 글로불린, 펩타이드, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인(cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등일 수 있다.
본 발명에 있어서 소분자 약물은 약 1000 달톤(Da) 미만의 분자량을 지니며 질병의 치료제로서 활성도를 지니는 유기 화합물, 무기 화합물 또는 유기금속 화합물을 나타내는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 본원에서 소분자 약물은 올리고펩티드 및 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니는 그 밖의 바이오분자(biomolecule)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 나노입자(nanoparticle)는 직경 1 내지 1000 nm 크기를 갖는 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노입자는 금속 나노입자, 금속 나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 금속/금속 코어쉘 복합체, 금속 나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 비금속 쉘로 구성되는 금속/비금속 코어쉘 또는 비금속 나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 비금속/금속 코어쉘 복합체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 백금, 자성철 및 그의 산화물로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 비금속은 실리카, 폴리스티렌, 라텍스 및 아크릴레이트 계열의 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명에 있어서, 리포좀은 자기 스스로 회합할 수 있는, 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특정 수 있다. 작은 유니라멜라 소포(SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포(LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에서 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포(multivesicular vesicle)라고 한다.
또한, 상기 펩타이드는 뉴로필린1에 2가 (bivalent) 또는 그 이상으로 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 상기 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 링커 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 링커 펩타이드는 예를 들면 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편의 C-말단에 결합할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 융합단백질은 상기 펩타이드가 결합한 완전한 형태의 항체 일 수 있다.
본 발명에서 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
"중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH(heavy chain variable domain) 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1(heavy chain constant region 1), CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL(light chain variable domain) 및 불변 영역 도메인 CL(light chain constant region)을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명에 있어서, 항체의 단편은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 각각의 도메인 또는 이의 단편을 의미하며, 예를 들면, 항체의 중쇄불변영역절편(CH1, CH2, 또는 CH3), 중쇄가변영역절편(VH), 경쇄불변영역절편(CL), 경쇄가변영역절편(VL), 항원결합절편(antigen binding fragment(Fab)), 단일사슬항체절편(single chain variable fragment(scFv)) 또는 이들의 단편일 수 있다. 바람직하게는 상기 항체의 단편은 항체의 경첩(hinge)-CH2-CH3로 이뤄진 중쇄불변영역 (crystalizable fragment (Fc)절편일 수 있다.
또한, 상기 항체의 단편은 단량체(monomer), 이량체(dimer) 또는 다량체일 수 있다.
상기 항체는 단일클론 항체, 비특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있으며, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있으며, IgG1 타입일 수 있다. 또한, 상기 항체의 경쇄 불변 영역은 λ 또는 κ 형일 수 있다.
상기 펩타이드는 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 Fc의 C-말단에 결합할 수 있으며, 상기 결합은 링커 펩타이드에 의한 것 일수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 기술한 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 및 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 서열번호 1 내지 3 및 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 상기 벡터는 본 발명의 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 뿐만 아니라 이 펩타이드가 융합된 항체의 단편 또는 항체를 발현할 수 있다. 펩타이드가 융합된 항체 또는 항체의 단편의 경우, 벡터는 펩타이드와 항체 또는 이의 단편이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 예를 들면, 도 6, 또는 도 20에 기재된 개열지도를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공할 수 있다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
상기 일 양상은 NRP1에 특이적으로 결합하는 종양 침투성 펩타이드(NRP1 specific binding tumor-penetrating peptide, TPP) 뿐만 아니라, 이 펩타이드가 융합된 항체 또는 이의 단편의 제조를 포함하는 개념이다.
NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 즉 종양 침투성 펩타이드(TPP)가 융합된 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편을 제조하는 방법에 대한 예는 아래와 같다.
1) 상기 제조된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 항체의 중쇄불변부위 경첩(hinge)-CH2-CH3-linker-TPP 의 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 재조합 TPP 융합 중쇄불변부위 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 제조된 발현벡터를 세포에 형질전환하여 재조합 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 발현하는 단계; 및
3) 상기 발현된 재조합 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된단백질을 정제, 회수하는 단계.
또한, 본 발명의 펩타이드가 융합된 항체의 제조방법에 대한 예는 아래와 같다.
1) 상기 제조된 항체 IgG-TPP을 VH-CH1-경첩(hinge)-CH2-CH3-linker-TPP 의 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 재조합 TPP융합 IgG의 중쇄 부위 및 VL-CL의 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 제조된 중쇄, 경쇄 발현벡터를 세포에 공동형질전환하여 재조합 IgG-TPP 단백질을 발현하는 단계; 및
3) 상기 발현된 재조합 IgG-TPP 단백질을 정제, 회수하는 단계.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 펩타이드 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 펩타이드, 나노입자 또는 리포좀을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 NRP1과 특이적으로 결합함으로써, 종양에 특이적으로 분포하고 종양 내부로 침투되는 효능을 나타낸다.
또한, 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 뉴로필린1과 특이적으로 결합함으로써, VEGF165A가 뉴로필린1에 결합하는 것과 경쟁한다. 이에 따라 VEGF165A가 뉴로필린1에 결합하여 지니는 신생혈관형성(angiogenesis) 기능을 억제함으로써, 암 치료뿐만 아니라, 혈관신생 관련 질병에 대한 치료효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항체는 야생형 항체와 유사한 생산 수율을 나타내며, 항체가 결합하는 항원 및 상기 펩타이드가 결합하는 뉴로필린1의 2종 항원을 동시에 표적할 수 있는 이중특이성 항체의 특성을 지니며 이에 따라 고효율로 항체를 종양 조직으로 도달할 수 있는 특성을 가짐으로써, 암 치료에 높은 효과를 기대할 수 있다.
상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 혈관신생 관련 질병으로는 당뇨병성 망막증, 황반변성, 노인성 황반변성, 미숙아 망막증, 각막이식 거부, 신생혈관성 녹내장 및 후수정체 섬유증식증, 유행성 각결막염, 비타민 A 결핍, 콘택트 렌즈 과도착용, 아토피성 각막염, 상각막윤부 각막염, 익상편 건선 각막염, 쇼그렌 증후군, 홍반성 여드름, 플릭텐성 각결막염, 매독, 마이코박테리아 감염, 지방 변성증, 화학적 화상, 세균성 궤양, 진균성 궤양, 허피스 단순포진 감염, 대상포진 감염, 원충 감염, 카포시 육종, 무렌 궤양, 테리엔 변연성 각막변성증주변성 각질용해증, 정신적 외상, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반, 다발성 동맥염, 베게너 유육종증, 공막염, 스티브 존슨병, 주변반흔성 방사상 각막절개술 및 각막 이식 거부 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 조성물이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 암을 치료, 예방 또는 처리하는데 통상적으로 사용되어온 치료법과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 조성물은 치료법과 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료법와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
통상적 치료법의 예는 외과수술, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법 및 면역요법을 포함하되 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 조성물은 바람직하지 않은 혈관신생과 관련되거나 이것에 의해 특징되는 암 이외의 질병이나 장애의 예방 또는 치료하기 위하여 이용될 수 있는데, 그러한 치료, 또는 예방이 필요한 환자에게 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양의 특정 약물 또는 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 수화물, 입체 이성질체, 포접물 또는 이들의 프로드럭을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서는 상기 조성물은 다른 약물(“2차 약물”) 또는 암을 치료, 처리 또는 예방하는 방법과 병용하여 투여된다. 2차 약물은 그 종류를 제한하지 않으며, 단백질, 항체, 소분자 약물, 리포좀, 나노입자, 줄기세포 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀을 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 암의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.
상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 영상을 통하여 암을 진단하기 위하여 분자 영상용 형광체와 결합할 수 있다.
상기 분자 영상용 형광체는 형광을 발생시키는 모든 물질을 말하며, 적색이나 근적외선(near-infrared)의 형광을 발광하는 것이 바람직하며, 양자 수득량(quantum yield)이 높은 형광체가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 분자 영상용 형광체는 상기 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 결합할 수 있는 형광체, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
형광체는 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODYPY), 테트라메틸로드아민(Tertramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 또는 이들의 유도체가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
형광 단백질은 Dronpa 단백질, 형광 발색 유전자(EGFP), 적색 형광 프로테인(red fluorescent protein, DsRFP), 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5 또는 기타 형광 단백질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
기타 영상용 물질은 산화철, 방사성 동위원소 등이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, MR, PET과 같은 영상 장비에 응용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 펩타이드를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 (1) NRP1-b1 도메인의 아르지닌 결합부위 (Arginine-binding pocket)와 상호 작용할 수 있는 라이브러리를 디자인하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 라이브러리를 항체 중쇄 불변부위에 융합시키는 단계;
(3) 상기 단계 (2)의 항체 중쇄 불변부위에 융합된 라이브러리를, NRP2-b1b2와 경쟁시키면서 NRP1-b1b2와 결합시키는 단계; 및
(4) 상기 단계 (3)에서 결합된 라이브러리와 NRP1-b1b2간의 결합력을 측정하는 단계를 포함하는, 상기의 펩타이드를 스크리닝 하는 방법이다.
본 발명의 구체예에서, (1) 단계의 라이브러리 제작은 기존의 항체 중쇄불변부위(Fc) 단편 및 세마포린3 유래 서열을 주형으로 한 프라이머를 사용하여 PCR를 수행하여, 자연계에 존재하지 않는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 라이브러리를 디자인 하는 것이다.
상기 세마포린3 유래 서열을 주형으로 한 프라이머는 하기와 같은 서열로 이루어진 것일 수 있다.
항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리 구축을 위한 올리고뉴클레오타이드 염기서열
Figure PCTKR2016002942-appb-I000003
또한 본 발명의 구체예에서, 상기 (2) 단계에서는 (1) 단계에서 제작한 라이브러리를 항체 중쇄 불변부위에 융합시킨다. 또한 상기 (3) 단계에서는 상기 중쇄 불변부위에 융합된 라이브러리를 효모 세포 표면에 발현시킨 후, 표적분자인 NRP1-b1b2와 결합시킨다. 이때, 동시에, NRP2-b1b2 단백질과 경쟁적으로 결합시켜서 NRP2에는 결합하지 않으며, NRP1에만 결합되는 펩타이드를 선별한다.
본 발명에 따른, NRP2에 결합하지 않고, NRP1에만 특이적으로 결합하는 펩타이드는 NRP1에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이 펩타이드가 융합된 단백질은 NRP1과 특이적으로 결합하는 특성을 갖게 되어, 종양조직에 특이적으로 축적되고, 종양혈관내피세포의 세포간격을 넓혀 혈관밖 유출을 증진시키고, 종양조직 내부에서도 세포간극을 조절하여 종양 조직 내부로의 침투가 현저히 증가한다. 또한 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 항체 또는 항체의 단편에 융합된 융합 항체는, 펩타이드가 융합되지 않은 대조군 항체에 비해, 같은 용량으로 투여됐을 때 종양조직에 특이적으로 축적되고 종양 조직 내부로의 침투가 증가하여, 생체내에서 현저히 증가된 종양억제 활성을 보인다.
본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항체 또는 그의 단편은 원래 항체고유의 항원결합능을 유지하면서, 고효율로 융합항체를 종양 조직에 축적되고 종양조직 내부로의 침투를 촉진시키는 특성을 가짐으로써, 종양 치료 및 진단에 높은 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항체의 단편은 VEGF165A의 NRP1과의 결합을 억제하여 VEGF165A에 의한 신생혈관형성을 억제하는 특성을 가짐으로써, 종양의 성장과 전이, 연령관련 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 류마티스성 관절염 등과 같은 질병 등의 다양한 질병의 치료 및 진단에도 활용을 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드가 융합된 항체 또는 그의 단편은 펩타이드가 융합되지 않은 야생형 항체와 유사한 생산 수율을 나타내며 융합 항체 또는 이의 단편은 원래 야생형 항체가 지니는 항원결합능, 중쇄불변부위(Fc)의 고유기능인 protein A 및 protein G에 대한 결합능이 보존되어 생산에 있어서 기존항체에 비해 추가되는 비용이 없고 항체의 항암 활성을 유지하는 특성을 지닌다.
도 1은 뉴로필린1 및 2의 구조를 도식화 한 것이다.
도 1의 (A), (B)는 뉴로필린이 크게 5가지 도메인으로 구성되어 있는데, N-말단에서부터, a1, a2 도메인은 CUB 도메인으로 분류되며, 세마포린의 Ig-like C2 type 부분이 결합하는 부분이다. 특히 이 부위는 플렉신과 복합체를 형성해 세마포린-플렉신과의 결합력을 증가시키는 역할을 한다. b1, b2 도메인은 FV/VIII 도메인으로 분류되며, VEGF나 세마포린 3 계열의 리간드들의 C-말단 부위가 결합한다. 특히 이 부분에는 헤파린이 결합할 수 있는 부위가 존재하며, (+)를 띄는 잔기가 많은 리간드의 결합을 용이하게 한다. 또한, MAM은 올리고머화(oligomerization)를 유도하며, TM(trans-membrane domain)은 뉴로필린이 세포 표면에 고정될 수 있게 하고, 세포 내 도메인(cytosolic domain)에는 PDZ(Postsynaptic density 95, Disk large, Zona occludens 1) 도메인과 결합할 수 있는 부위가 존재한다.
도 2는 NRP1과 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질 및 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질과 뉴로필린1의 결합 복합체를 도식화한 것이다. 이중체(dimer)의 형태로 NRP2에는 결합하지 않고, NRP1 b1 도메인의 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 특이적으로 결합하는 클론을 도출하려 한다.
도 3은 NRP1과 NRP2에 동시에 결합하는 A22p 펩타이드(N 말단- H T P G N S N K W K H L Q E N K K G R P R R -C 말단)을 기반으로, C-말단에서부터 18개 잔기가 해당되는 부분에(5-22) 동의코돈(degenerate codon)인 NHB((ATGC /ACT / TCG)를 넣어 라이브러리를 구축한 것의 모식도이다. Fc-융합펩타이드 펩타이드 라이브러리는 항체 중쇄불변부위(Fc)의 C-말단(Carboxy-terminus))에 15개의 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)X3 아미노산 서열로 이뤄진 링커를 융합하여 구축하였다. 구축된 Fc-융합펩타이드 라이브러리는 하단의 도식과 같이 효모세포표면에 Aga1p-Aga2p에 융합되어 발현되고, 펩타이드 라이브러리는 항체 중쇄불변부위(Fc) 절편의 C-말단부에 존재한다.
도 4는 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 골라내기 위해 사용된 단백질과 MACS 및 FACS 분석 결과이다.
도 4(A)는 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별내기 위해 사용된 바이오틴화 된 뉴로필린1 b1b2 단백질과 뉴로필린2 b1b2 단백질의 구조를 도식화한 것이다. 또한 발현 정제 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 4(B)는 구축된 라이브러리에서 바이오틴화된 NRP1-b1b2을 결합항원으로 사용하고, 경쟁항원으로 바이오틴화가 안된 NRP2-b1b2를 10배 농도 높게 사용하여, MACS 및 FACS를 수행하여 NRP1-b1b2에 결합한 pool에 대하여 선별 과정마다 pool을 분석한 FACS 분석결과이다. 이는 항체의 중쇄불변부위(Fc)의 발현정도와 바이오틴화된 NRP1-b1b2에대한 결합능을 분석할 수 있으며, 효모세포표면에 Fc-A22p가 발현된 세포들과 비교하였고, MACS 및 FACS를 거듭할수록 바이오틴화된 NRP1-b1b2에 결합하며, 항체의 중쇄불변부위(Fc)의 발현에 영향을 주지 않는 클론의 수의 비중이 증가하는 것을 나타낸다.
도 5(A), 도 5(B)는 선별된 단일 클론의 바이오틴화된 NRP1-b1b2 에 대한 결합을 FACS로 동정한 결과이다.
도 5(A)는 총 50개의 단일클론을 A22p와 비교 분석하였으며, 각 클론들의 100nM 바이오틴화된 NRP1-b1b2 결합력을 FACS에서 나타난 평균형광세기(Mean fluorescence intensity)로 동정하였으며, 그 중에서 상위 평균형광세기를 나타낸 TPP1, TPP8, TPP11 이라고 명명한 클론들로 서열이 수렴되었다.
도 5(B)는 효모세포표면에 발현된 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11에 100 nM NRP1-b1b2에 대한 결합 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 Fc-융합펩타이드 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질을 동물세포 HEK293세포에서 발현하기 위한 벡터의 개열지도의 예이다.
도 7은 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질의 도식과 발현 정제 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 7(A)는 항체 중쇄불변부위는 N-말단에 경첩(hinge)부터 시작하여 2개의 이황화 결합을 유지하게 하여 이중체를 형성하기 용이하게 제작하였다. 항체 중쇄불변부위의 CH3 말단에 15개의 아미노산((G4S)3)의 펩타이드 링커를 이용하여 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 융합하여 제작하였다.
도 7(B)는 SDS-PAGE상에서 각 클론들의 이중체 형성과 정제 시 순도를 확인할 수 있다. 또한 링커 및 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 도입한 만큼 크기의 차이를 확인할 수 있다.
도 8은 동물세포에서 발현 정제된 항체 중쇄불변부위와 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 형태인 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11의 NRP1에 대한 결합력을 측정한 ELISA 실험 결과이다.
도 8(A)는 농도의존적인 ELISA를 수행결과, Fc-A22p와 비교하여, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11는 NRP1-b1b2 도메인에 약 10배에서 60배 가량 향상된 친화도를 지닌다.
도 8(B)는 Fc-A22p와 비교하여, Fc-TPP11는 NRP2-b1b2 단백질에는 결합하지 않고, NRP1-b1b2에 특이적으로 결합한다. 대조군인 VEGFR2에는 결합하지 않는다. Fc에 융합되지 않은 합성 펩타이드 TPP11는 Fc-TPP11에 비해, NRP1-b1b2 단백질에 대해 100 배 이상 낮은 친화도를 보인다. 이는 Fc-TPP11이 어비더티(avidity)효과로 높은 친화도를 가짐을 보여준다.
도 9은 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질이 세포 표면에 발현된 NRP1에 특이적인 결합여부를, 혈관 내피세포(HUVEC) 표면에 발현된 NRP1과의 중첩(co-localization)을 공초점 현미경(confocal microscopy) 분석을 관찰한 결과이다. Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11을 대조군 (PBS 버퍼), Fc, Fc-A22p와 동일하게 처리하여, 세포 표면에 결합한 정도를 염색하여 관찰한 결과, Fc와는 달리, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11은 세포 표면의 NRP1과 중첩됨으로써, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질이 NRP1에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
도 10은 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질이 세포표면에 발현된 NRP1에 특이적으로 결합하여 NRP1을 활성화시켜 세포 내부 유입능(endocytosis)을 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 분석한 결과이다. 혈관 내피세포(HUVEC)에 대조군 (PBS 버퍼), Fc, Fc-A22p, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11을 동일한 조건으로 처리하여, 세포 내로 유입된 정도를 염색하여 관찰한 결과, Fc와는 달리, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11은 NRP1과 중첩(co-localization)되면서 세포 내로 유입이 된 것을 관찰 하였다. 이는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11가 NRP1과 특이적으로 결합하여 NRP1을 활성화 시킴을 의미한다.
도 11는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질이 HUVEC에서의 생물학적 기작을 확인한 결과이다.
도 11(A)는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질의 HUVEC에서의 생물학적 기작을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과이다. 대조군으로 VEGF165A의 경우, Fc와는 달리 HUVEC에서 투과능 향상 효과를 보이며, 이는 VE-카데린(cadherin)의 감소로 확인할 수 있다. 대조군인 VEGF165A가 VE-카데린을 감소시켰으며, NRP1 특이적으로 선별된 단일 클론 중 Fc-TPP11이 가장 효과적으로 VE-카데린을 감소시켰다. 또한, Fc-TPP11은 Fc-A22p 단백질에 비해 10배 낮은 농도에서 더 효과적으로 VE-카데린을 감소시킴을 확인하였다.도 11(B)는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질이 혈관 내피세포(HUVEC)의 투과능을 향상시키는지 확인하기 위하여, 트렌스웰 어세이(Transwell assay)를 수행한 결과이다. 그 결과, VEGF165A, Fc-TPP8, Fc-TPP11이 효과적으로 투과능을 증가 시켰다. 반면, VE-카데린 감소능이 없는 Fc-TPP1는 투과능을 향상 시키지 못했다. 이는 도 11(A)의 결과와 밀접한 연관성이 있는 결과이다.
도 12는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질이 종양조직으로의 축적 및 조직 침투성을 면역조직화학(Immunohistochemistry)로 동정한 결과이다. 인간 표피암 세포주인 A431를 누드마우스에 이식하여 키운 후, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질을 꼬리 정맥으로 주입한 후, Fc 융합단백질의 분포를 혈관(CD31)과의 이중염색을 통해 확인한 결과, 대조군인 Fc와는 달리 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질이 종양 조직에 선택적으로 도달하며, 종양 조직 내로 효과적으로 침투됨을 확인하였다. 특히 Fc-TPP1, Fc-TPP11는 Fc-A22p 단백질에 비해 현저히 향상된 종양 조직 내로 효과적으로 침투됨을 확인하였다. 오른쪽 바그래프는 종양조직 축적을 정량화한 것이다.
도 13는 Fc-TPP11의 상피암 유래 종양세포 및 조직에서의 활성을 측정한 것이다.
도 13(A)는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 단백질의 인간 두경부암 세포주인 FaDu에서 E-카데린의 변화를 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다. 그 결과, Fc와는 달리, NRP1에 특이적으로 선별된 단일 클론들 중에서 Fc-TPP11이 가장 효과적으로 E-카데린의 감소를 유도했고, Fc-A22p보다 10배 낮은 농도에서 E-카데린을 감소시켰다. 도 13(B)는 Fc-TPP11이 NRP1에 결합하여 상피조직의 세포간극을 조절하여 종양 조직 침투능을 가지는지 확인하기 위해, ex vivo 종양 침투 어세이를 통해 관찰한 결과이다. 대조군 Fc의 경우, 종양 조직 내로 침투 되지 않는 반면, Fc-TPP11은 혈관이 없이도 NRP1에 의한 세포 접착인자인, VE-카데린 및 E-카데린의 감소를 통해 세포간극을 조절하여 종양 조직 침투능을 가짐을 확인했다.
도 14는 TPP11 펩타이드가 VEGF165A와 NRP1-b1b2에 경쟁적으로 결합하는 지를 평가한 실험이다.
도 14(A)는 Fc-TPP1, Fc-TPP11이 Fc-A22p에 비해 매우 낮은 농도에서도, VEGF165A의 NRP1 결합을 경쟁적으로 결합하여 저해하는 결과이다. 이는 Fc-TPP1, Fc-TPP11이 NRP1-b1b2에 결합하는 위치가 VEGF165A와 같은 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)임을 시사한다.
도 14(B)는 합성한 TPP11 펩타이드가 NRP1-b1에 위치하는 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합하는 RPARPAR 펩타이드(Teesalu et al. 2009)와 VEGF165A 리간드과 NRP1에 대하여 결합 경쟁 ELISA를 수행한 결과이다. 합성된 TPP11 펩타이드가 NRP1-b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합한다고 알려진 RPARPAR 펩타이드 및 VEGF165A와의 결합 경쟁을 확인하였고, 이는 TPP11이 NRP1 b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합함을 증명한다.
도 15는 Fc-TPP11의 신생혈관생성 저해(anti-angiogenesis) 활성을 측정한 결과이다.
도 15(A)는 Fc-TPP11의 VEGF165A에 의한 혈관 내피세포(HUVEC)의 튜브 형성(tube formation)이 억제되는 지 확인하기 위하여, 튜브 형성 어세이(tube formation assay)를 수행한 결과이다. 그 결과, Fc-TPP11이 VEGF165A에 의해 유도된 내피세포의 튜브 형성을 효과적으로 억제 시켰다.
도 15(B, C)는 마우스의 생체내에서 VEGF165A에 의해 유도된 신생혈관형성을 Fc-TPP11이 억제할 수 있는지 알아보기 위하여, 마트리겔 플러그 어세이(in vivo matrigel plug assay)를 수행한 결과이다 (B). 혈관생성은 면역조직화학(Immunohistochemistry)을 통해 항 CD31 항체로 혈관의 밀도를 측정하였다 (C) 오른쪽 그림은 이미지를 정량한 결과이다. 그 결과, Fc-A22p와 Fc-TPP11가 마우스 생체 내에서 VEGF165A에 의해 유도되는 혈관의 형성을 억제하였다. 특히, Fc-A22p보다 Fc-TPP11이 더 효과적으로 혈관의 형성을 억제함을 확인하였다. 도 16는 Fc-TPP11의 VEGF165A에 의한 혈관 내피세포의 이주(migration) 및 침윤(invasion) 억제활성을 측정한 결과이다.
도 16(A)는 Fc-TPP11이 VEGF165A에 의한 혈관 내피세포의 이주 작용을 억제하는 지 확인하기 위한 상처치유(wound healing) 어세이 결과이다. 대조군 VEGF165A의 경우, 혈관 내피세포의 이주 작용을 증가시켰고, Fc와 다르게 Fc-TPP11은 혈관 내피세포의 이주 작용을 억제하였다.
도 16(B)는 VEGF165A에 의해 유도된 HUVEC 세포의 침윤을 Fc-TPP11가 억제함을 트랜스웰(Transwell) 어세이를 통해 확인한 결과이다. 대조군 VEGF165A와 다르게 Fc-TPP11은 혈관 내피세포의 침윤 작용을 억제하였다.
도 17는 Fc-TPP11의 마우스 생체내에서 종양성장 억제 활성과 종양조직 신생혈관생성 억제 능을 측정한 결과이다.
도 17(A)는 Fc-TPP11의 신생혈관생성 억제능이 실제로 생체 내에서 암세포 성장 억제에 영향을 미치는 지 확인하기 위한 누드 마우스 모델에서의 암 성장 저해 실험 결과이다. FaDu 세포를 누드 마우스에 이식한 후, Fc, Fc-TPP11을 주입한 결과 PBS, Fc에 비해 Fc-TPP11이 암세포의 성장을 저해함을 확인하였다.
도 17(B)는 상기 실험시 마우스의 무게를 측정한 결과이다. PBS, Fc를 주입한 마우스와 비교하였을 때, Fc-TPP11을 주입한 마우스 무게에는 큰 차이가 없었다. 이는 Fc-TPP11이 마우스에 다른 독성이 없음을 간접적으로 증명한 결과이다.
도 17(C)는 상기 실험의 종양 억제능이 신생혈관생성 억제능에 의한 효능인지 확인하기 위하여, 상기 실험의 종양을 적출하여 면역조직화학(Immunohistochemistry) 실험을 수행한 결과이다. 그 결과, 대조군인 PBS, Fc와 비교하여 Fc-TPP11을 주사한 마우스의 종양 조직은 혈관 밀도가 줄어들었고, 또한 혈관과 pericyte의 중첩(co-localization)이 감소하였다.
도 18(A)는 Fc-TPP11와 병용 투여한 독소루비신의 종양조직 내 침투능을 확인하기 위하여, 면역조직화학(Immunohistochemistry) 실험을 수행한 결과이다. 그 결과, 대조군인 Fc와 비교하여 Fc-TPP11을 독소루비신과 병용 투여한 경우, 독소루비신의 종양 조직 침투능이 증가하였다.
도 18(B)는 조직 내의 독소루비신의 축적량을 정량적으로 확인한 결과이다.
도 19은 Fc-TPP11의 효능을 종합적으로 나타낸 모식도이다. Fc-TPP11은, NRP2에는 결합하지 않고, NRP1-b1 도메인에 위치한 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 고친화도, 고특이성으로 결합한다. 상기 특성으로 Fc-TPP11은 NRP1에 대한 생체내에 주입 시, 종양조직 선택적 도달이 가능하며, 종양조직의 혈관 밖 유출을 증가시키고, 종양 조직내부에서의 침투가 증가된다. 또한, 혈관생성인자 VEGF와의 NRP1에 대한 경쟁적 결합으로, VEGF에 의한 신생혈관형성을 억제한다.
도 20는 IgG 중쇄-TPP11를 발현하기 위한 벡터의 개열지도의 예이다.
도 21는 IgG 경쇄를 발현하기 위한 벡터의 개열지도의 예이다.
도 22의 (A)는 기존의 항-EGFR 항체인 Cetuximab의 중쇄 C-말단에 TPP11을 도입하여 구축된 항체를 도식화한 그림이다.
도22의 (B)는 HEK293F세포에 공동형질 전환을 통해 일시적으로 발현 및 정제한 다음, 환원성 및 비환원성 조건의 SDS-PAGE 상에서 크기 및 순도를 분석한 결과이다.
도22의 (C)는 ELISA를 통하여 Cetuximab-TPP11이 Cetuximab의 본래 항원인 EGFR과의 결합능에 차이가 없음을 확인한 결과로, TPP11 융합이 기존의 항체의 항원결합력에 영향을 주지 않음을 보여준다.
도 23은 Cetuximab-TPP11의 종양조직 내 침투능을 확인하기 위한 면역조직화학(Immunohistochemistry) 실험 결과이다. EGFR이 발현되어 있는 인간 표피암 세포주인 A431를 누드마우스에 이식한 후, Cetuximab, Cetuximab-A22p와 Cetuximab-TPP11을 정맥주사한 후, 조직 내 침투능을 혈관(CD31)과의 이중염색을 통해 확인하였다. 그 결과, Cetuximab의 경우, 혈관 주변에만 침투되는 반면, Cetuximab-A22p와 Cetuximab-TPP11의 경우, 혈관으로부터 좀 더 멀리 조직 내부로 침투되었음을 확인하였다(좌측 패널). 특히, Cetuximab-TPP11이 Cetuximab-A22p보다 더 효과적으로 조직 내부로 침투되었다. 이를, Image J 프로그램을 이용하여 정량화 하였다(우측 패널). 이는 TPP11이 완전 IgG 항체의 종양조직 축적 및 침투성을 증가시키는 활성을 가졌음을 시사한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: NRP1 -b1의 아르지닌 결합부위( Arginine -binding pocket)에 특이적으로 결합하는 펩타이드 라이브러리 디자인 및 구축
도 1의(A) 및 (B)에서 나타난 바와 같이, 뉴로필린은 크게 5가지 도메인으로 구성되어 있는데, N-말단에서부터, a1, a2 도메인은 CUB 도메인으로 분류되며, 세마포린의 Ig-like C2 type 부분이 결합하는 부분이다. 특히 이 부위는 플렉신과 복합체를 형성하여 세마포린-플렉신과의 결합력을 증가시키는 역할을 한다. b1, b2 도메인은 FV/VIII 도메인으로 분류되며, VEGF나 세마포린 3 계열의 리간드들의 C-말단 부위가 결합한다. 특히 이 부분에는 헤파린이 결합할 수 있는 부위가 존재하며, (+)를 띄는 잔기가 많은 리간드의 결합을 용이하게 한다. 또한, MAM은 올리고머화(oligomerization)를 유도하며, TM(trans-membrane domain)은 뉴로필린이 세포 표면에 고정될 수 있게 하고, 세포 내 도메인(cytosolic domain)에는 PDZ(Postsynaptic density 95, Disk large, Zona occludens 1) 도메인과 결합할 수 있는 부위가 존재한다. 이 도메인들 중 특히 b1 도메인은 C-말단 규칙(C-end rule/CendR)가 결합할 수 있는 주머니 모양의 구조를 지니고 있고, 실제로 도 2의 뉴로필린 b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합하는 리간드인 Sema3s 및 VEGF 패밀리의 C-말단 서열을 분석하였을 때, 모두 C-말단 규칙인 -R/K-X-X-R/K 해당하는 서열이 있다.
뉴로필린과 상호작용하여 종양 조직 투과능을 증진시킨다는 자연의 리간드들은 VEGF165A 혹은 Sema3A 모두 NRP2보다는 NRP1에 선호되어 상호작용한다고 알려져 있다. 따라서 본 발명자는 NRP2보다는 NRP1이 종양 조직 투과능과 더 밀접한 관계가 있다고 예상하였고, NRP1이 더욱 바람직한 타켓으로 예상하였다. 따라서 도 2에 나타난 바와 같이, NRP2에는 결합하지 않고, NRP1-b1의 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 특이적으로 결합하는 종양조직 침투 펩타이드(TPP, tumor tissue-penetrating peptide)가 항체 중쇄불변부위(Fc) 융합된 Fc-TPP를 선별하고자 하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여 도 3에 나타낸 바와 같이 기존 A22p 서열을 (HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR) 주형으로 하여 C-말단에서부터 18개 잔기가 해당되는 부분의 (5-22)을 세린, 쓰레오닌, 타이로신, 아스파라진, 글루타민, 히스티틴, 페닐알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 알라닌, 메티오닌, 프롤린, 라이신, 아스파라긴 산, 글루타민 산으로 구성된 동의 코돈(degenerate codon)인 NHB(ATGC/ACT/TCG)가 포함된 역방향 시발자를 합성하였다. 또한 항체 중쇄불변부위(Fc) 절편의 CH3 부분에 정방향 시발자를 합성하였다. 이 정방향 시발자와 역방향 시발자에는 효모세포에서 상동성 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 50 염기쌍이 벡터의 서열과 동일한 부분을 포함한다. 항체 중쇄불변부위(FC)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리 구축에 사용한 시발자의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
Fc-융합펩타이드 라이브러리 구축에 사용된 올리고뉴클레오타이드 염기서열
시발자 명칭 올리고뉴클레오타이드 서열 서열번호
정방향 시발자 (forward primer) 5'- CAT CGA GAA AAC CAT CTC CAA AGC CA - 3' 서열번호 7
역방향 시발자 (reverse primer) 5'- A AAG TCG ATT TTG TTA CAT CTA CAC TGT TGT TAT CAG ATC TCG AGA AGC TTA TCA VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN VDN TCC AGG AGT ATG TGA TCC -3' 서열번호 8
라이브러리 DNA는 PCR을 수행하여 준비되었다. Fc-A22p 효모 표면 발현 벡터(pCTCON, Colby et al. 2004))를 주형으로 하여 상기 정방향 및 역방향 시발자를 이용하여 DNA를 증폭하였으며, 증폭된 DNA(총 300 ㎍, 10 ㎍/1회 형질전환)는 Fc 효모 표면 발현 벡터를 BsrGI과 XhoI 제한효소를 처리하여 준비한 벡터 DNA(1 ㎍/1회 형질전환)와 함께 효모에 전기천공법(electroporation)을 30번 반복해 라이브러리를 구축하였다. 뒤이어, 도 3와 같이 상동성 접합(Homologous recombination)을 통하여 효모세포 내에서 라이브러리와 벡터를 결합하였다. 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리의 크기는 계단식 희석 한 후, 벡터에 존재하는 선별인자에 따른 선택 배지에 자란 콜로니의 수를 측정해 2×107 임을 확인 하였다.
실시예 2: 구축된 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 Fc - 펩타이드 라이브러리에서 NRP1에만 특이적으로 결합하는 단일 클론 선별
타겟 단백질인 NRP1-b1b2(273-586)단백질과 경쟁 단백질인 NRP2-b1b2(275-595)을 기존 방법과 동일하게 90 %이상의 순도로 준비하였다 (BA Appleton et al., 2007). 타겟 단백질인 NRP1-b1b2은 도 4와 같이 바이오틴화 시켰다(EZ-LINKTM Sulfo-NHS-LC-Biotinlation kit(Pierce Inc., USA)).
도 4(A)는 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별내기 위해 사용된 바이오틴화 된 뉴로필린1 b1b2 단백질과 뉴로필린2 b1b2 단백질의 구조를 도식화한 것이다. 또한 발현 정제 SDS-PAGE를 나타내었다.
도4(B)는 구축된 라이브러리를 MACS 및 FACS를 수행한 pool에 대하여 선별 과정마다 pool을 분석한 FACS 이다. 이는 항체의 중쇄불변부위(Fc)의 발현정도와 바이오틴화된 NRP1-b1b2에 대한 결합능을 분석할 수 있으며, 효모세포표면에 Fc-A22p가 발현된 세포들과 비교하였고, MACS 및 FACS를 거듭할수록 바이오틴화된 NRP1-b1b2에 결합하며, 항체의 중쇄불변부위(Fc)의 발현에 영향을 주지 않는 클론의 수의 비중이 증가하는 것을 나타낸다.
바이오틴화 된 1 μM의 NRP1-b1b2를 효모세포표면에 발현된 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리와 37 ℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 바이오틴화 된 NRP1-b1b2와 결합한 효모세포표면에 발현된 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리를 Streptavidin-Microbead(Miltenyi Biotec Inc., Germany)와 4 ℃에서 10분간 결합시킨 후 MACS(magnetic activated cell sorting)을 이용하여 바이오틴화 된 NRP1-b1b2에 결합한 클론들을 선별하였다. 다음과정은 1 μM의 NRP1-b1b2를 효모세포표면에 발현된 항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리와 37 ℃에서 1시간 동안 결합시킨 후, PE가 접합된 streptavidin(Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate(SA-PE), Invitrogen)과 FITC가 접합된 항-Fc 항체(anti-Fc antibody FITC conjugated, goat, (SIGMA-ALDRICH co., USA))를 4 ℃에서 20분간 결합시킨 후 FACS(Fluorescence activated cell sorting)을 이용하여 Fc 발현량이 많고, 바이오틴화 된 NRP1-b1b2에 결합력이 높은 클론을 선별하였다. 이후 2회 FACS 과정은 상기 과정과 동일하며, 바이오틴화 된 NRP1-b1b2의 양을 0.5 μM로 사용하였다. 그리고 MACS, FACS 전 과정에서 바이오틴화된 NRP1-b1b2의 경쟁 단백질로서 바이오틴화 되지 않은 NRP2-b1b2을 10배 높은 농도로 경쟁 결합시켜, NRP1-b1b2에 결합하는 개별 클론들을 선별하였다.
또한, 도 5(A), 도 5(B)와 같이 FACS 분석을 통하여 바이오틴화 된 100 nM의 NRP1-b1b2에 대한 결합력이 높은 개별 클론들을 PE 신호에 따라 분류하였으며, TPP1, TPP8, TPP11으로 명칭한 클론이 선별되었다.
선별된 각 개별 클론들은 효모세포로부터 DNA를 회수하여 서열분석을 통하여 DNA 서열 및 아미노산 서열을 확인하였다.
하기 표 2는 NRP2에는 결합하지 않고, NRP1에 특이적으로 결합하도록 선별된 펩타이드의 서열을 나타낸다.
항체 중쇄불변부위(Fc)에 융합시킨 펩타이드 라이브러리로부터 선별된 개별 클론의 아미노산 서열 및 pI
TPP의 명칭 NRP1 타겟 펩타이드 서열 (N-말단에서 C-말단 방향) 서열번호
TPP1 HTPGNSNQFVLTSTRPPR 서열번호 1
TPP8 HTPGIATRTPR 서열번호 2
TPP11 HTPGNSKPTRTPRR 서열번호 3
하기 표 3는 선별된 펩타이드를 항체 중쇄불변부위에 융합할 때 사용된 링커까지 포함된 서열을 나타낸다.
링커가 연결된 NRP1 타겟 펩타이드 서열
TPP의 명칭 링커가 연결된 NRP1 타겟 펩타이드 서열 (N-말단에서 C-말단 방향) 서열번호
링커서열 NRP1 타겟 펩타이드 서열
TPP1 GGGGSGGGGSGGGGS HTPGNSNQFVLTSTRPPR 서열번호 4
TPP8 GGGGSGGGGSGGGGS HTPGIATRTPR 서열번호 5
TPP11 GGGGSGGGGSGGGGS HTPGNSKPTRTPRR 서열번호 6
실시예 3: NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 항체 중쇄불변부위의 구축 및 발현 정제
상기 실시예 2에서 선별된 개별 클론들을 동물세포에서 발현하기 위하여 효모세포로부터 회수한 DNA에서 항체의 중쇄불변부위의 CH3와 NRP1과 특이적으로 결합하는 펩타이드 부분을 BsrGI과 HindII 제한효소를 처리하여 얻었고, 얻어진 DNA 절편을 pcDNA3.4 벡터에 도 6과 같이 클로닝하였다.
HEK293-F 시스템(Invitrogen)을 사용하여 상기 구축된 각각의 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현시켰다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌아민(Polyethylenimine, PEI)(Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크(Corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2.0×106 세포/ml의 밀도로 배지 100 ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2에서 배양하였다. 그 후, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 250 ㎍(2.5 ㎍/ml)로 희석하여, PEI 750 ㎍(7.5 ㎍/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 120 rpm, 8% CO2에서 배양 후, 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 7일동안 배양하였다. 상청액은 7일 후에 채취하였다.
표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상청액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼(Protein A Sepharose column)(GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0 에서 항체를 용리한 후 1 M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉각적으로 중화하였다. 용리한 항체 분획은 Pierce Dextran Desalting Column(5K MWCO)를 이용하여PBS(pH7.4) 로 완충액을 교환한 후, MILLIPORE Amicon Ultra(10 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고, 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다. 정제된 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질은 환원성 및 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다.
도 7(A)는 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 Fc-TPP 단백질을 도식화한다. 항체 중쇄불변부위는 N-말단에 경첩(hinge)부터 시작하여 2개의 이황화 결합을 유지하게 하여 이량체를 형성하기 용이하게 제작하였다. 항체의 중쇄불변부위 CH3 말단에(GGGGS)X3의 링커 펩타이드를 이용하여 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 융합한 형태이다.
도 7(B)는 정제된 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 환원성 및 비환원성 조건에서 SDS-PAGE 상을 분석한 결과이다. 도 7(B)에서는 SDS-PAGE상에서 각 클론들의 이량체 형성과 순도를 확인할 수 있다.
하기 표 4는 정제된 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 배양 1 L당 생산되는 단백질의 수율을 나타낸다. 3회 수행하여 얻는 결과를 통계처리 하였으며, ±는 표준편차 값을 나타낸다. 얻어진 단백질의 수율은 야생형 Fc 단백질과 대조군인 Fc-A22p 융합단백질과의 큰 차이가 없었다.
Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 HEK293세포에서의 생산수율
클론의 명칭 수율 (mg/L)
Fc 34.2±4.8
Fc-A22p 36.1±5.6
Fc-TPP1 34.2±3.6
Fc-TPP8 32.5±3.2
Fc-TPP11 37.6±2.2
실시예 4: Fc - TPP1 , Fc - TPP8 , Fc - TPP11 융합 단백질의 NRP1 및 2의 b1b2 도메인에 대한 결합능의 평가
정제된 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 NRP1 및 2의 b1b2 도메인에 대한 결합능을 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)에서 확인하였다.
도 8과 같이 대조군인 Fc-A22p 및 라이브러리를 통해 선별된 NRP1에 특이적인 개별 클론의 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 형태인 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11의 NRP1에 대한 결합력을 측정한 ELISA 실험 결과이다. Fc-A22p보다 라이브러리로부터 선별된 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질은 10배에서 60배가량 향상된 친화도를 가지는 것으로 확인했다.
NRP1에 대한 특이성을 확인하기 위하여 대조군으로 VEGF165A 및 Fc, A22p와 각각의 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 NHS-바이오틴 키트(SIGMA-ALDRICH co., USA)를 이용하여 바이오틴화(biotinylation)시켰다.
NRP1-b1b2(273-586)단백질 및 NRP2-b1b2(275-595)단백질과 대조군인 VEGFR2(46-753)을 96 well EIA/RIA 플레이트(COSTAR Corning In., USA)에 1 ㎍씩 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 10분 간 3회 씻어내었다. 5 % 스킴 밀크(skim milk)(5 % Skim milk, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co.,USA)로 10분간 3회 씻어내었다. 대조군으로 바이오틴화된 VEGF165A 및 Fc, A22p, 실험군으로 뉴로필린1에 특이적으로 선별된 TPP11 펩타이드와 Fc-TPP11를 [10 nM](혹은 펩타이드 [100 nM])의 농도로 결합시킨 후 0.1 % PBST로 10분 간 3회 씻어내었다. AP가 접합된 항 바이오틴 항체(alkaline phosphatase-conjugated anti-biotin mAb, Sigma, USA) 결합시킨 후 pNPP(pnitrophenyl palmitate, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 반응시켜 405 nm 흡광도를 정량하였다. AP-pNPP를 30분간 반응시켜 얻은 ELISA 결과를 통해 발현 정제한 Fc-TPP의 NRP1 및 2의 b1b2 단백질에 대한 결합능을 확인하였다.
도 8(B)과 같이 Fc-TPP11이 NRP1에 고친화도 고특이성으로 NRP1에 결합하는 것을 확인하였다.
또한, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 NRP1 및 NRP2 b1b2 단백질에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 Biacore2000 기기(GE healthcare)를 이용하여 SPR(Surface plasmon resonance)을 수행하였다.
구체적으로는, NRP1 및 NRP2 b1b2 단백질 각각을 10 mM Na-아세테이트 완충액(pH 4.0)에 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare, USA)에 약 1000 response units(RU) 고정화하였다. HBS-EP 완충액[10 mM Hepes, 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and 0.005% surfactant P20(pH 7.4), GE Healthcare]을 30㎕/min 유속으로 분석하였으며, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질을 100 nM에서 0.4 nM의 농도로 분석하였다. 대조군으로 Fc-A22p를 사용하였다. 결합, 해리 분석 후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(20mM NaOH, 1M NaCl, pH10.0)을 30 ㎕/min 유속으로 1분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
표 5는 SPR(Surface plasmon resonance, BIACORE 2000, GE healthcare, USA)를 이용하여 Fc-TPP 단백질의 NRP1-b1b2 및 NRP2-b1b2 단백질에 대한 친화도 분석 결과를 나타낸다.
항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질의 NRP1-b1b2 및 NRP2-b1b2에 대한 친화도 및 특이성 분석
NRP1-b1b2Binding　 Affinity(nM) NRP2-b1b2Binding Affinity(nM) Binding Affinity Ratio[(K D for NRP2)/K D for NRP1)]
Fc-A22p 63.0 ± 2.1 62.0 ± 1.4 0.98
Fc-TPP1 1.81± 0.19 1126 ± 51 624.8
Fc-TPP8 3.85± 0.52 253.5± 33 65.8
Fc-TPP11 1.65± 0.18 1555± 205 945.3
표 5에서 나타나 바와 같이 NRP1 및 NRP2 b1b2 단백질에 결합하는 Fc-A22p와 뉴로필린1에 특이적으로 결합하는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11을 비교하였을 때, NRP1에 대한 친화도가 약 60배 가량 친화도 차이가 나타났고, NRP1에 대한 특이성은 NRP2에 대한 친화도 값을 분석하였을 때, 약 60배에서 1000배정도 향상되었다. 분석 시 적어도 5개의 센서그램을 이용하여 분석하였으며, 3회 수행하여 얻은 결과를 통계처리 하였다. ±는 독립적은 실험의 결과의 표준편차 값을 나타내었다.
실시예 5: Fc - TPP1 , Fc - TPP8 , Fc - TPP11 융합 단백질의 세포 표면에 발현된 NRP1과의 특이적 결합 및 NRP1을 통한 세포 내 유입능 평가
NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 생물학적 동정을 위한 실험에서는 NRP1이 과발현된 HUVEC(인간 혈관내피 세포주)를 사용하였다.
도 9는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질이 세포 표면에 발현된 NRP1과도 결합하는지 확인하기 위해 세포표면의 NRP1과의 중첩(co-localization) 여부를 공초점 현미경(confocal microscopy) 으로 관찰하였다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 각 웰 당 5x104 개의 HUVEC 세포를 EGM2(Endothelial growth medium, Promocell) 배지 0.5 ml로 넣어 24시간 동안 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 되면, 각 웰을 PBS 0.5 ml를 이용하여 세척하였고, 그 후 EBM2(Endothelial basal medium, Promocell) 배지로 바꿔서 4시간 배양한 후, EBM2 배지 0.5 ml에 Fc, Fc-A22p 및 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11을 1 μM로 희석하여 30분 동안 4 ℃ 조건에서 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 차가운 PBS로 세척한 후, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질의 경우, FITC(녹색형광)가 결합되어있는 Fc를 특이적으로 인지하는 항체(Sigma)로 염색하였고, NRP1은 NRP1을 인지하는 1차 항체(abcam)와 TRITC(적색형광)가 결합되어 있는 2차 항체(Sigma)를 이용하여 염색하였다. DAPI를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 분석하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, Fc-A22p 및 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11의 경우, Fc와는 달리 HUVEC 세포 표면에 있는 NRP1과 결합하는 것을 확인하였다.
또한 다른 뉴로필린 리간드들의 세포 유입능과 같이, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질도 NRP1에 의해 세포 내 유입능을 가지고 있는지 확인하기 위하여, 세포 내 유입 여부 및 NRP1과의 중첩(co-localization) 여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였다. Fc, Fc-A22p 및 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11을 1 μM로 희석하여 10분 동안 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후, 위와 같이 Fc 및 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질과 NRP1을 염색하여 공초점 현미경으로 분석하였다.
도 10은 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 NRP1을 통한 세포 내로의 특이적인 유입능을 확인하기 위해, 공초점 현미경 분석을 통해 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질과 NRP1 과의 중첩(co-localization)을 관찰한 결과이다. 도 10에서 나타난 바와 같이, 대조군인 Fc의 경우, 세포 내 유입이 되지 않고, 비교적으로 NRP1 및 2에 결합하는 Fc-A22p보다 NRP1에 특이적으로 결합하는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11이 더 많이 세포 내로 유입되어 NRP1과 더 많이 중첩(co-localization)됨을 확인하였다. 이는, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11이 NRP1에 의한 특이적인 유입능을 가짐을 의미한다.
실시예 6: Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 세포투과능 향상 평가
(1) Fc - TPP1 , Fc - TPP8 , Fc - TPP11 융합 단백질의 HUVEC에서의 생물학적 기작을 알아보기 위한 웨스턴 블롯
세마포린 3A 또는 VEGF165A는 NRP1을 공-수용체(co-receptor)로 이용하여 혈관 투과능(vascular permeability)을 향상시킨다고 알려져 있다. 이러한 과정에서 내피세포의 VE(vascular endothelial)-카데린(cadherin)의 감소, 인산화 등의 변화가 일어나게 된다. 즉, VE-카데린 또는 E(Epithelial)-카데린은 내피세포간 혹은 상피세포간 세포간극을 이루는 접착인자이며, 이 분자들의 감소는 세포-세포 간극을 조밀하게 하여 물질의 이동을 방해한다.
이를 바탕으로 혈관 투과성의 증진을 간접적으로 확인할 수 있는 실험 방법으로, 웨스턴 블롯을 통한 VE-카데린의 변화를 확인하였다. 구체적으로는, 6 웰 플레이트에 HUVEC 세포를 웰 당 5x105 개의 세포를 시딩(seeding) 한 후, 24시간 배양한 후, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질을 0.1 μM로 10 분간 처리하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. SDS-PAGE를 수행한 겔을 PVDF 막(membrane)에 옮기고 각각 VE-카데린과 β-actin을 인지하는 1차 항체(SantaCruz)와 HRP가 결합된 2차 항체(SantaCruz)를 이용하여 검출하였으며, 분석은 ImageQuant LAS4000 mini(GE Healthcare)를 이용하였다.
도 11(A)는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 HUVEC에서의 생물학적 기작을 알아보기 위한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 11(A)에 나타난 바와 같이, 대조군인 VEGF165A와 Fc-A22p의 경우, Fc와 다르게 VE-카데린의 감소가 관찰되었고, NRP1에 특이적인 Fc-TPP8, Fc-TPP11 또한 VE-카데린의 감소가 관찰되었다. 반면, Fc-TPP1의 경우, VE-카데린을 감소가 미약했다. Fc-A22p의 경우, 1 μM 처리 시 VE-카데린이 현저히 감소하였다. NRP1에 특이적으로 강한 결합을 가지는 Fc-TPP8, Fc-TPP11은 Fc-A22p보다 10 배 낮은 0.1 μM에서도 현저한 VE-카데린 감소가 관찰되었다. 그 중에서도 Fc-TPP11의 경우 VE-카데린의 감소 정도가 가장 효과적으로 유도됨이 관찰되었다.
(2) Fc - TPP1 , Fc - TPP8 , Fc - TPP11 융합 단백질의 혈관 내피세포 투과능을 확인하기 위한 트렌스웰 어세이(Transwell assay)
상기 실험 결과를 토대로, 혈관 내피세포의 투과능의 향상 여부를 확인하기 위한 실험으로 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질을 처리하여 트렌스웰 어세이(Transwell assay)를 수행하였다.
구체적으로는, 혈관 내피세포(HUVEC)를 Transwell plate(Corning)에 웰 당 5x104 개의 세포를 EGM2 배지를 이용하여 상위 챔버(upper chamber)에 시딩(seeding) 해 준 후, 3일 동안 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그 후, EBM 배지로 바꿔 준 후, 대조군으로 VEGF165A는 약 1.3 nM로, Fc-A22p와 실험군 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11은 1 μM로 30 분 동안 처리하였다. 그 후, Dextran-FITC(Sigma) 50 ㎍을 상위 챔버(upper chamber)에 넣어, 혈관 내피세포의 투과성이 향상되었을 경우, 하위 챔버(lower chamber)에서 형광 물질이 관찰되는 원리를 이용하여, 30분 후, 하위 챔버의 배지를 샘플링 하여 형광을 측정하였다.
도 11(B)는 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 혈관 내피세포(HUVEC)의 투과능을 향상시키는지 확인하기 위하여, Transwell assay를 수행한 결과이다. 도 11(B)에 나타난 바와 같이, VEGF165A와 Fc-A22p의 경우 혈관 내피세포 투과능이 향상 된 것을 확인하였고, NRP1에 특이적인 Fc-TPP8, Fc-TPP11의 경우, Fc와 다르게 혈관 내피세포의 투과능이 향상되었음을 확인하였다. 반면, Fc-TPP1은 혈관 내피세포의 투과능을 향상이 매우 미약하였다. 결과를 종합하면, 도 11의 (A)와 (B)의 결과가 밀접한 연관성이 있고, 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질 중 Fc-TPP11이 가장 효과적인 NRP1 종양 침투성 펩타이드(TPP)로 효과를 확인하였다.
(3) 마우스 모델에서 Fc - TPP1 , Fc - TPP8 , Fc - TPP11 융합 단백질의 투과능 향상을 확인하기 위한 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC) 실험
상기 실시예 6의(1) 내지(2)에서는 in vitro 상에서 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질이 혈관 내피세포의 투과능을 향상시킴을 확인하였다. 따라서 마우스 모델에서 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 투과능 향상을 확인 하기 위해 IHC(Immunohistochemistry) 실험을 수행하였다.
종양 조직 내의 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 투과능 향상을 확인하기 위한 실험으로, Balb/c 누드 마우스에 뉴로필린1을 발현하고 있는 A431 cell을 마우스 당 5x106개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 9일 후 종양의 부피가 약 300-400 mm3 정도가 되었을 때, 각각 PBS, Fc, Fc-A22p, Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11을 10 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 주사 후, 각각 15시간 후 마우스로부터 종양을 적출하여, 면역조직화학(immunohistochemistry) 실험을 수행하였다. 적출한 종양은 동결절편(frozen section) 방법으로 20 μm의 두께로 잘라, 1차 항체인 CD31항체(BD Pharmingen)와 이를 인지하는 TRITC(적색형광)이 결합된 2차 항체로 혈관을 염색하였고, 조직 내에 분포되어 있는 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질을 관찰하기 위해, Fc를 인지하는 FITC(녹색형광)이 결합된 항체를 사용하였다.
도 12는 실제 종양 조직 내의 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 침투능을 확인하기 위한 면역조직화학 결과이다. 도 12에 나타난 바와 같이, 대조군인 PBS, Fc와 달리 Fc-A22p 의 경우, 종양 조직 선택적으로 도달하며, NRP1에 특이적인 Fc-TPP1, Fc-TPP11도 종양 조직 내로 침투 되었음을 확인하였다. 또한, Fc-A22p보다 NRP1 에 대한 선택성과 결합능이 높은 Fc-TPP1, Fc-TPP11이 더 효과적으로 조직 내로 침투됨을 확인하였다. 반면, Fc-TPP8은 종양 조직 내로 침투되지 않았다. Fc-TPP1 및 Fc-TPP11은 NRP1에 대한 고친화도를 지니고 있기 때문에, NRP1 발현 종양 조직에 선택적으로 도달하며, Fc-TPP1 보다는 Fc-TPP11이 추가적으로 종양조직 침투능이 있기 때문에 종양 조직에서 더 넓은 범위에 존재하는 것을 확인하였다.
(4) Fc - TPP1 , Fc - TPP8 , Fc - TPP11 융합 단백질의 암세포에서의 투과성 증진 효과 확인
Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11 융합 단백질의 투과성 증진 효과를 암세포에서도 확인하기 위하여, NRP1을 발현하고 있는 인간 두경부암 세포주인 FaDu에서 상기 실험과 같은 조건으로 E-카데린의 변화를 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다
도 13(A)는 인간 두경부암 세포주인 FaDu에서 E-카데린의 변화를 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다. 도 13(A)에서 나타난 바와 같이, Fc-A22p의 경우, E-카데린의 감소를 유도하였다. 또한, NRP1에 특이적인 Fc-TPP1, Fc-TPP8, Fc-TPP11에서도 E-카데린의 감소를 관찰하였다. 상기 실시예 6의(1) 내지 (2)에서의 in vitro 상의 결과와 마찬가지로, Fc-TPP11이 가장 효과적으로 E-카데린의 감소를 유도하였다.
(5) 암세포에서의 종양 침투성을 확인하기 위한 ex vivo 종양 침투 어세이(Ex vivo tumor penetration assay)
추가적으로, Fc-TPP가 혈관이 없이도, 상피조직의 세포간극을 완화시켜 종양 조직 내로 침투하는지 확인하기 위하여, ex vivo 종양 침투 어세이를 수행하였다. 실험방법으로는 Balb/c 누드 마우스(나라바이오, 4주령, female)에 FaDu cell을 마우스 당 5x106개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 10 여일 후 종양의 부피가 약 300-400 mm3 정도가 되었을 때, 종양 조직을 적출하였다. 적출 후, 1% BSA(Welgene)가 첨가된 MEM 배지에 조직을 세척한 후, 대조군으로 PBS, Fc, 실험군으로는 Fc-TPP11을 3 μM로 2시간 30분 동안 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양시켰다. 그리고 1% BSA가 첨가된 MEM 배지로 10분씩 2번 세척한 후, 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 면역조직화학(Immunohistochemistry) 실험을 수행하였다. 종양은 동결절편(frozen section) 방법으로 20 μm 의 두께로 잘라, Fc, Fc-TPP11을 관찰하기 위해 Fc를 인지하는 FITC(녹색형광)이 결합된 항체를 사용하여 염색하였다.
도 13(B)는 Fc-TPP11이 NRP1을 매개 종양조직 침투활성으로 혈류로 인해 생기는 대류(Convection)와는 독립적으로 조직내로 침투할 수 있는지 확인하기 위해, ex vivo 종양 침투 어세이를 통해 관찰한 결과이다. 도 13(B)에서 나타난 바와 같이, 대조군 Fc의 경우, 종양 조직 내로 침투 되지 않는 반면, Fc-TPP11은 혈관이 없이도 종양 조직 내로 침투되는 것을 관찰하였다. 이는 Fc-TPP11이 NRP1에 의해 E-카데린의 감소를 통해 상피조직의 세포간극을 완화시켜 종양 조직 침투능을 가짐을 의미한다.
실시예 7: TPP11 펩타이드가 VEGF165A와 NRP1-b1b2에 경쟁적으로 결합 평가
NRP2에는 결합하지 않고, NRP1에만 특이적으로 결합하는 TPP11 펩타이드가 NRP1-b1 도메인의 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합한다고 알려진 VEGF165A 및 RPARPAR 펩타이드 경쟁결합을 평가하기 위하여 결합경쟁 ELISA를 수행하였다.
구체적으로는, NRP1-b1b2(273-586)단백질을 96 웰 EIA/RIA 플레이트 혹은 96 웰 EIA/RIA Black 플레이트(COSTAR Corning In., USA)에 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 10분 간 3회 씻어내었다. 5% Skim milk(5 % Skim milk, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co.,USA)로 10분간 3회 씻어내었다. Fc-A22p [50 nM] 및 Fc-TPP1, Fc-TPP11 [3 nM]와 VEGF165A(25nM 에서 0.02nM)를 농도별로 섞은 혼합물을 생성하여 NRP1-b1b2 단백질에 결합시켰다. AP가 접합된 항 인간 항체(alkaline phosphatase-conjugated anti-human mAb, Sigma, USA)로 결합시킨 후 pNPP(pnitrophenyl palmitate, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 반응시켜 405 nm 흡광도를 정량하였다. ELISA 결과를 통해 VEGF165A와 Fc-TPP1, Fc-TPP11이 NRP1-b1b2에 대한 결합을 경쟁하는 것으로 확인하였다.
도 14(A)는 Fc-A22p, Fc-TPP1, Fc-TPP11에 대하여, VEGF165A와 NRP1에 경쟁하여 결합하는지 확인한 결과이다. Fc-TPP1, Fc-TPP11, Fc-A22p가 VEGF165A와 NRP1에 결합하는 부위가 겹치는 것을 확인하였고, Fc-TPP1, Fc-TPP11이 높은 친화도를 지니는 것을 확인하였다. 이는 Fc-TPP1, Fc-TPP11이 NRP1-b1b2에 결합하는 위치가 VEGF165A와 같은 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)임을 시사한다.
도 14(B)는 NRP1-b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합한다고 알려진 RPARPAR 및 VEGF165A와 TPP11펩타이드를 NRP1에 대한 경쟁결합을 확인한 것이다. 작은 펩타이드 형태의 TPP11 펩타이드가 RPARPAR 펩타이드 및 VEGF165의 NRP1에 대한 결합을 저해하는 것을 확인하였다. 이는 TPP11이 NRP1 b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합함을 증명한다.
실시예 8: Fc-TPP11의 신생혈관형성 억제능 평가
(1) Fc - TPP11의 HUVEC에서의 튜브 형성 억제능 확인 위한 튜브 형성 어세이(tube formation assay)
VEGF165A는 NRP1을 공-수용체로 이용하여 신생혈관형성(angiogenesis) 시킨다고 알려져 있다. 이를 바탕으로 신생 혈관 형성을 in vitro에서 확인할 수 있는 실험 방법으로, 튜브 형성 어세이를 수행하였다. 실험 방법으로는 50 ㎕의 ECMatrix를 96 웰 플레이트에 주입하고 37 ℃에서 2시간 폴리머화하였다. 2시간 후에, HUVEC 세포를 EBM2 배지를 이용하여 현탁시키고 VEGF165A(20 ng/ml), Fc, Fc-TPP11(1 μM)와 섞어서 ECMatrix 상에 웰 당 1x104 개씩 플레이팅하고 8시간 배양하였다. 배양된 세포를 현미경으로 관찰하여 이미지를 얻었다.
도 15(A)는 튜브 형성 억제능을 튜브 형성 어세이를 통해 확인한 결과이다. 도 15(A)에 나타난 바와 같이 VEGF165A 처리한 세포에서는 튜브 형성이 증가되었고, Fc와는 달리 Fc-TPP11은 튜브 형성을 억제한 것을 확인하였다.
(2) Fc - TPP11의 신생혈광형성 억제능을 확인하기 위한 마트리겔 플러그 어세이(in vivo matrigel plug assay)
추가적으로, 신생혈관형성 억제능을 in vivo에서도 확인하기 위하여, 마트리겔 플러그 어세이를 수행하였다. 실험 방법은 6-8주령의 balb/c 누드 마우스의 피하에 마우스 당 A431 cell 7.5x106개의 세포와 200 ㎍의 Fc, Fc-A22p 또는 Fc-TPP11, 그리고 0.4 ml의 마트리겔(Matrigel, BD Biosciences)을 주입한 후 8일 후에 마트리겔 플러그를 적출하여 다음 이미지를 촬영한 후(도 15(B)), 동결절편 방법으로 20 ㎛의 두께로 잘라, 면역조직화학(Immunohistochemistry) 실험을 수행하였다. 1차 항체인 CD31 항체와 이를 인지하는 TRITC(적색형광)이 결합된 2차 항체로 혈관을 염색하여 혈관의 밀도를 측정하였다. 도 15(C)는 Fc-TPP11이 마우스 생체 내에서 VEGF165A에 의해 유도되는 혈관의 형성을 억제할 수 있음을 확인한 결과이다.
(3) Fc - TPP11의 Wound healing 어세이를 통한 혈관 내피세포의 이주(migration) 작용 억제능 확인
상기 실시예 8(1) 내지 (2)의 결과에 추가적으로, VEGF165A에 의한 혈관 내피세포의 이주(migration) 작용에 대한 Fc-TPP11의 억제능을 확인하기 위하여, wound healing 어세이를 수행하였다. 실험 방법은 HUVEC 세포를 6 well plate에 5×105 개씩 접종한 후 1 ㎍/ml mitomycin c가 첨가된 0.5% 혈청 EBM2 배지에서 1시간 동안 배양하여 세포가 plate에 포화된(95% 이상) 상태가 되도록 하였다. yellow tip을 이용하여 dish 바닥을 일자로 그어 균일한 너비로 injury line을 만들었다. 그리고 PBS로 세포가 바닥에서 떨어지지 않도록 하면서 세척한 뒤 PBS를 제거한 후에 배지를 천천히 넣고 VEGF165A를 0, 20 ng/ml로 처리한 HUVEC 세포에 Fc, Fc-TPP11 [1 μM]로 처리하여 동안 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양시켰다. 현미경으로 0, 18시간대에 사진을 찍어 비교하였고 현미경(Primo vert, Carl Zeiss co., Germany)내에 내장된 컴퓨터 프로그램 (AxioVision LE, Carl Zeiss co., Germany)으로 측정된 두 양단 간의 거리를 통계적으로 처리하였다.
도 16(A)는 Fc-TPP11이 VEGF165A에 의한 혈관 내피세포의 이주 작용을 억제한 것을 wound healing 어세이를 통해 확인한 결과이다. 대조군 VEGF165A의 경우, 혈관 내피세포의 이주 작용을 증가시켰고, Fc와 다르게 Fc-TPP11은 혈관 내피세포의 이주 작용을 억제하였다. 이는 Fc-TPP11이 뉴로필린1에 특이적으로 결합함으로써 VEGF165A와 NRP1 b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 결합을 억제하여 VEGF165A의 혈관 내피세포의 이주 작용을 억제함을 의미한다.
(4) Fc - TPP11의 트랜스웰 어세이를 통한 혈관 내피세포의 침윤(Invasion) 작용 억제능 확인
추가적으로, VEGF165A에 의한 혈관 내피세포의 침윤(Invasion)에 대한 Fc-TPP11의 저해 능을 알아보기 위해 트랜스웰 어세이를 수행하였다. 8-mm 의 pore 사이즈의 폴리카보네이트 멤브레인을 가진 트랜스웰(transwell, Corning costar, USA)을 이용하였다. 상기 필터의 하층 표면에 1:10 비율로 마트리젤(matrigel, Corning costar, USA)을 코팅하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 2시간동안 폴리머화 시킨 후, 상층 웰에 HUVEC 세포와 Fc, Fc-TPP11 [1 μM]을 EBM2 배지에 5x104개로 접종한다. 그리고 하층 웰에는 VEGF165A(20 ng/ml)이 포함된 EBM2 배지를 주입하였다. 37 ℃, 5% CO2 조건에서 12시간 배양한 후, 상층 웰의 이동하지 않은 세포는 면솜으로 제거하고 4% 포름알데히드로 세포를 고정한다. 그리고 Crystal violet으로 세포를 염색하였다. 이동한 세포는 현미경으로 관찰, 이동한 세포수를 측정하였다.
도 16(B)는 VEGF165A에 의해 유도된 HUVEC 세포의 침윤을 Fc-TPP11가 억제함을 트랜스웰 어세이를 통해 확인한 결과이다. 대조군 VEGF165A의 경우, 혈관 내피세포의 침윤 작용을 증가시켰고, Fc와 다르게 Fc-TPP11은 혈관 내피세포의 침윤 작용을 억제하였다. 이는 Fc-TPP11이 NRP1 b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)에 특이적으로 결합함으로써 VEGF165A와 NRP1의 결합을 억제하여 VEGF165A의 혈관 내피세포의 침윤 작용을 억제함을 의미한다.
실시예 9: Fc - TPP11의 생체 내에서 종양성장 억제능 및 신생혈관생성 억제능 평가
상기 실시예 8에서 Fc-TPP11의 신생혈관생성 억제능을 확인하였다. 따라서, 마우스 모델에서 Fc-TPP11의 신생혈관생성 억제능에 의한 종양성장 억제능을 확인하기 위하여, Balb/c 누드 마우스에 FaDu를 마우스 당 5x106개의 세포를 피하주사로 주입시킨 후 Fc-TPP11을 주사하였다. 구체적으로, 세포를 이식한지 약 5일 후, 종양의 부피가 약 60 mm3 정도가 되었을 때, Fc와 Fc-TPP11을 20 mg/kg으로 3일 간격, 6번 정맥주사를 하였다(N=6).
도 17(A)에서 나타난 바와 같이, 대조군인 PBS, Fc에 비해, Fc-TPP11은 암세포의 성장을 억제하였다. 또한, 도 17(B)에서 나타난 바와 같이, PBS, Fc와 비교하여 Fc-TPP11이 크게 체중의 변화가 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 독성은 없는 것으로 판단되었다.
도 17(C)는 상기 도 17(A)의 Fc-TPP11의 종양성장 억제가 신생혈관생성 억제능에 의한 효능이라 생각되어 상기 실험의 종양을 적출하여 IHC 실험을 수행한 결과이다. 신생혈관을 나타내는 혈관을 CD31 항체로 염색하고, 혈관을 감싸고 있는 pericyte를 α-SMA로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 대조군인 PBS, Fc와 비교하여 Fc-TPP11을 주사한 마우스의 종양 조직은 혈관 밀도가 줄어들었고, 그에 따라 혈관과 pericyte의 중첩(co-localization)이 감소하였다. 이는 Fc-TPP11이 종양으로부터 생성되는 VEGF165A에 의한 신생혈관 생성을 억제함을 의미한다.
상기 실험 결과를 종합해 봤을 때, 도 19에 도식된 바와 같이 NRP2에는 결합하지 않고, NRP1에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄불변부위와 융합된 펩타이드(Fc-TPP)를 선별하여, NRP1에만 특이적으로 결합하여도 VE-카데린이나 E-카데린의 감소 등의 신호 전달의 경향성을 확인하였다. 또한, NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 단일 형태로는 NRP1의 신호전달을 크게 유도하지 못했으나, 2가 결합 형태인 Fc-TPP 단백질로 처리하였을 때는 신호전달을 효과적으로 유도함을 확인하였으며, 이는 NRP1에 의한 신호전달은 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질의 융합 형태일 때, NRP1에 2가 결합(bivalent binding)하여 효과적인 생물학적 활성을 가짐을 의미한다. 또한 NRP1에 특이적인 Fc-TPP 단백질은 VEGF165A와 NRP1에 대해 결합 경쟁을 하여 VEGF165A에 의한 신생혈관억제능을 가지고, 이로 인해 생체 내에서 종양성장 억제활성을 가진다. 선별한 펩타이드 중에서도 TPP11이 융합된 형태인 Fc-TPP11의 종양 침투능이 가장 효과적이었다.
실시예 10: Fc - TPP11의 병용 투여된 소분자 약물의 종양조직 축적 및 투과능 증진 평가
상기 실험에서 구축된 Fc-TPP11를 소분자 약물과 병용 투여 하였을 때 종양 조직 내의 소분자 약물의 침투를 확인하기 위하여, 면역조직화학(Immunohistochemistry)실험을 수행하였다. Balb/c 누드 마우스에 FaDu을 마우스 당 5x106 개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 15일 후 종양의 부피가 약 300-400 mm3 정도가 되었을 때, 항암제인 독소루비신 (Doxorubicin) 10 mg/kg과 각각 PBS, Fc, Fc-TPP11를 2.5 mg/kg 으로 정맥 주사하였다. 주사 1 시간 후, 마우스의 심장을 통해 PBS로 관류 시키고, 4% 파라포름알데히드로 관류시켜 조직을 고정시켰다. 그 후, 종양 조직을 적출하여, 면역조직화학실험을 수행하였다. 적출한 종양은 동결절편(frozen section) 방법으로 20 μm의 두께로 잘라, 1차 항체인 CD31항체(BD Pharmingen)와 이를 인지하는 FITC(녹색형광)이 결합된 2차 항체로 혈관을 염색하였고, 조직 내에 분포되어 있는 독소루비신은 자체적으로 적색 형광을 띠는 것을 확인하였다.
도 18 (A)는 Fc-TPP11와 병용 투여한 독소루비신의 종양조직 내 침투능을 확인하기 위한 IHC 결과이다. FaDu 암세포 조직에서 독소루비신의 경우 적색 형광이 거의 관찰되지 않는 반면에, Fc-TPP11와 병용 투여한 독소루비신의 경우, 독소루비신 단독과 비교했을 때, 혈관으로부터 좀 더 멀리 조직 내부로 침투되었음이 확인되었다. 대조군으로 Fc와 독소루비신을 병용 투여했을 때는 침투 능에 영향이 없음을 확인하였다.
도 18 (B)는 조직 내의 독소루비신의 축적량을 정량적으로 확인하기 위하여, 적출한 종양 조직을 파쇄(homogenization)하여 종양 조직 내의 독소루비신의 형광 값을 측정 하였다. 도 18 (A)와 동일한 방법으로 독소루비신과 PBS, Fc, Fc-TPP11을 정맥 주사한 후, 마우스의 심장을 통해 PBS로 관류 시키고 종양 조직을 적출하였다. 적출한 조직을 1 ml 의 1% SDS(Sodium dodecyl sulfate)와 1 mM 황산이 들어간 용해 버퍼에 넣고 파쇄 시킨다. 그리고 chloroform와 isopropyl alcohol을 1:1로 섞어 용해된 조직과 2:1 로 섞어준 후, -80 ℃에서 얼린다. 그 후, 37 ℃에서 녹여 원심분리를 통해 상등액을 얻어 형광(Excitation 485 nm/emission 528nm)을 측정하여, 독소루비신이 투과된 양을 정량화하였다.
상기의 결과는 NRP1 특이적으로 결합하는 종양 침투성 펩타이드가 다양한 소분자 약물에 대하여 일반적인 적용이 가능함을 나타낸다.
실시예 11: TPP11이 융합된 완전 항체(mAb-TPP11)의 구축 및 생산
상기 실시예 7,8에서 in vitro 및 in vivo 상으로 항체 중쇄불변부위와 선별된 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 융합된 단백질이 혈관 내피세포의 투과능을 향상시킴을 확인하였다. 따라서, 마우스 모델에서 NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 효과를 검증하기 위한 mAb-NRP1에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 모델 항체로 고형암 치료용 항체인 항-EGFR 항체 Cetuximab으로 선정하였다. Cetuximab-TPP11을 구축하기 위해 상기 실시예 3의 TPP11펩타이드와 항체의 중쇄불변부위(Fc)가 융합된 단백질을 생산하기 위한 벡터에서 BsrGI과 HindII 제한효소를 처리하여 얻은 항체의 중쇄불변부위 CH3에서 TPP11이 융합된 부분의 DNA를 야생형 Cetuxmab 중쇄를 인코딩하는 벡터에 치환하였다. 도 20은 구축된 Cetuxmab 중쇄-TPP11의 모식도이고, 도 21은 야생형 Cetuximab의 경쇄를 인코딩하는 벡터이다.
도 22(A)는 TPP11 펩타이드가 융합된 완전 IgG 단일클론항체인 cetuximab-TPP11 모식도를 나타낸다. 발현 및 정제는 상기 실시예 3에서 수행한 방법으로 HEK293F에서 수행하였고, SDS-PAGE를 통해 순도를 확인하였다 도 22(B)는 HEK293F세포에 공동형질 전환을 통해 일시적으로 발현 및 정제한 다음, 환원성 및 비환원성 조건의 SDS-PAGE 상에서 크기 및 순도를 분석한 결과이다.
하기 표 6는 정제된 TPP11이 융합된 항체의 배양 1 L당 생산되는 단백질의 수율을 나타낸다. 3회 수행하여 얻는 결과를 통계처리 하였으며, ±는 표준편차 값을 나타낸다. 얻어진 단백질의 수율(Cetuximab-TPP11)은 야생형 단백질(Cetuximab)의 수율과 비교하여 큰 차이가 없었다.
TPP11 펩타이드가 융합된 항체와 야생형 항체의 발현 정제수율 비교
클론의 명칭 수율 (mg/L)
Cetuximab 39.9±6.2
Cetuximab-Q11 40.2±5.0
도 22(C)는 상기 실시예 4에서와 같이 EGFR에 대한 결합능을 ELISA를 통해 TPP11이 융합된 Cetuximab-TPP11과 야생형 항체(Cetuximab)를 비교한 것이다. 본래 TPP11 펩타이드가 융합되어도 Cetuximab의 항원인 EGFR에 대한 결합능에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
실시예 12: Cetuximab-TPP11 항체의 조직 침투능 향상 확인
상기 실험에서 구축된 TPP11 펩타이드가 융합된 항체의 종양 조직 내의 항체의 침투를 확인하기 위하여, Balb/c 누드 마우스에 FaDu을 마우스 당 5x106 개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 9일 후 종양의 부피가 약 300-400 mm3 정도가 되었을 때, 각각 PBS, Cetuximab, Cetuximab-TPP11를 1.25 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 주사 후, 3시간 후 마우스로부터 종양을 적출하여, 면역조직화학실험을 수행하였다. 실시예 6과 동일하게 조직을 염색하여 관찰하였다.
도 23는 TPP11 펩타이드가 융합된 Cetuximab의 종양조직 내 침투능을 확인하기 위한 IHC 결과이다. FaDu 암세포 조직에서 Cetuximab의 경우 혈관 주위에만 녹색 형광이 관찰되는 반면에, TPP11이 융합된 Cetuximab-TPP11의 경우, Cetuximab과 비교했을 때, 혈관으로부터 좀 더 멀리 조직 내부로 침투되었음이 확인되었고, 이를 정량화하기 위해 ImageJ 프로그램을 사용하였다. 특히, NRP1에 결합력이 더 높은 TPP11이 융합된 Cetuximab-TPP11의 경우, Cetuximab-A22p보다 더 효과적으로 조직 내부로 침투되었다. 상기의 결과는 NRP1 특이적으로 결합하는 종양 침투성 펩타이드가 다양한 항원을 인지하는 여러 단일클론항체에 대하여 일반적인 적용이 가능함을 나타낸다.

Claims (23)

  1. 뉴로필린 2(Neuropilin 2, NRP2)에 결합하지 않으며, 뉴로필린 1(neuropilin 1, NRP1)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서,
    상기 펩타이드는 5개 내지 50개의 아미노산으로 이루어지며;
    상기 펩타이드의 C 말단은 X1-X2-X3-X4이고,
    여기서, 상기 X1은 아르지닌, 리신, 또는 임의의 아미노산 서열이며,
    상기 X2 및 X3는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 서열이고,
    상기 X4는 아르지닌 또는 리신인 것인, 펩타이드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단으로부터 X3를 구성하는 아미노산 서열은 히스티딘, 글라이신, 아스파라진, 세린, 글루타민, 페닐알라닌, 발린, 류신, 트레오닌, 아르지닌, 프롤린, 이소류신, 알라닌 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 펩타이드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 종양 침투성 또는 신혈관생성(angiogenesis) 저해 활성을 나타내는 것인, 펩타이드.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 링커 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 펩타이드.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 1개 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 것인 펩타이드.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 (GGGGS)n의 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서 n 은 독립적으로 정수 1 내지 20 중 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 4 내지 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인 펩타이드.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 펩타이드가 융합된 융합 단백질.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 단백질은 항체, 항체의 단편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 및 화학적으로 개질된 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 융합 단백질.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 펩타이드는 뉴로필린 1에 2가(bivalent) 이상으로 결합하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 융합은 링커 펩타이드에 의한 것인, 융합 단백질.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 항체의 단편은 항체의 중쇄불변영역절편(Fc), 중쇄불변영역 도메인 (CH1, CH2, 또는 CH3)절편, 항원결합절편(antigen binding fragment(Fab)), 단일사슬항체절편(single chain variable fragment(scFv)), 중쇄가변영역절편(VH), 경쇄불변영역절편(CL) 또는 경쇄가변영역절편(VL)인 것인, 융합 단백질.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 단백질이 항체인 경우, 펩타이드는 항체의 중쇄불변부위(Fc)의 C-말단에 결합된 것인 융합 단백질.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 결합은 링커 펩타이드에 의한 것인 융합 단백질.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 융합 단백질.
  17. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 펩타이드가 융합된 나노입자.
  18. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 펩타이드가 융합된 리포좀.
  19. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 펩타이드가 융합된 소분자 약물.
  20. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  21. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 펩타이드, 상기 펩타이드가 융합된 융합단백질, 상기 펩타이드가 융합된 나노입자, 상기 펩타이드가 융합된 리포좀, 또는 상기 펩타이드가 융합된 소분자약물을 포함하는 암 또는 신생혈관 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  22. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 펩타이드, 상기 펩타이드가 융합된 융합단백질, 상기 펩타이드가 융합된 나노입자, 상기 펩타이드가 융합된 리포좀, 또는 상기 펩타이드가 융합된 소분자약물을 포함하는, 암 또는 신생혈관 관련 질환의 진단용 조성물.
  23. (1) NRP1-b1 아르지닌 결합부위(Arginine-binding pocket)와 상호 작용할 수 있는 라이브러리를 디자인하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)의 라이브러리를 항체 중쇄 불변부위에 융합시키는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)의 항체 중쇄 불변부위에 융합된 라이브러리를 NRP1-b1b2와 결합시키는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)에서 결합된 라이브러리와 NRP1-b1b2간의 결합력을 측정하는 단계를 포함하는, 청구항 1의 펩타이드를 스크리닝 하는 방법.
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