WO2019107812A1 - 세포의 세포질에 침투하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

세포의 세포질에 침투하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is based on the finding that the present invention relates to a cytotoxic agent which binds to a membrane protein receptor overexpressed on tumor tissue in the form of a complete immunoglobulin and is located in the cytoplasm of the cell by endosomal escape ability after endocytosis,
  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to an activated Ras (Ras GTP) to inhibit the activity of a tumor-mutated Ras, a method for producing the antibody, and a use thereof.
  • the present invention relates to an immunoglobulin type immunoglobulin having a high affinity to Ras GTP by modifying the heavy chain variable region (VH) of an antibody that directly penetrates into the cytoplasm of a cell and directly inhibits intracellular Ras ⁇ GTP, (VH), antibodies comprising the same, and methods of making and use thereof.
  • VH heavy chain variable region
  • the antibody of the present invention includes an improved technique of a light chain variable region (VL) for imparting tumor tissue specific cytoplasmic penetrating ability.
  • VL light chain variable region
  • the present invention encompasses heavy chain modification techniques for enhancing intracellular stability, endurance and tumor tissue specificity of the antibody.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting the growth of cancer or tumor cells using the antibody, and a method for treating cancer or tumor.
  • the present invention also relates to a library construction method and a library thereof for improving the affinity of the heavy chain variable region specifically binding to Ras GTP.
  • the present invention also relates to a screening method of a heavy chain variable region which specifically binds to Ras GTP using the library and has improved affinity.
  • Cancer-related proteins in the Ras protein family are the three isoform proteins of KRas, NRas, and HRas, and KRas can be expressed as two splicing variants of KRas4A and KRas4B.
  • the Ras protein is expressed in the cytoplasm and is then located in the cell membrane by the endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi apparatus through the lipidation of the C-terminal region, but the site having the GTPase activity is exposed to the cytoplasm .
  • ER endoplasmic reticulum
  • Ras ⁇ GTP activates signals such as Raf-MEK-ERK and PI3K-Akt by protein-protein interaction with effector proteins such as Raf, PI3K and RalGDS in the cytoplasm to inhibit cell growth, death suppression, migration and differentiation Of various signals.
  • Ras ⁇ GTP is converted to Ras ⁇ GDP due to phosphoric acid dissociation process by GAP immediately after signal transduction, and signal transduction is regulated in such a manner that signal is temporarily transmitted only.
  • the Ras protein in which a carcinogenic mutation is generated does not dissociate with phosphoric acid by GAP but maintains Ras ⁇ GTP form and continuously interacts with the effector protein, thereby causing lower signal transduction, (carcinogenesis).
  • the most frequent Ras protein carcinogenesis mutations include the 12th residue mutation (G12D, G12V, G13D, G12C, etc.), the 13th residue mutation (G13D), and the 61st residue mutation (Q61R, Q61H, etc.). These carcinogenic Ras mutations have been shown to occur in ⁇ 30% of all tumors, lung cancer ( ⁇ 25%), colorectal cancer ( ⁇ 30-40%) and pancreatic cancer ( ⁇ 90%). These cancer-associated Ras mutations are known to impart strong resistance to conventional chemotherapy.
  • the development of small molecule drugs has been attempted mainly for the treatment of cancer-related Ras mutation tumors.
  • the main strategy is to inhibit the activity of enzymes involved in the C-terminal lipidation of Ras, , A method of directly targeting Ras by inhibiting protein-protein interaction between Ras and effect protein.
  • the C-terminal lipidation of Ras is a process for locating the intracellular membrane to activate Ras expressed in the cytoplasm.
  • the related enzymes include farnesyltransferase (FTase), Ras-converting CAAX endopeptidase 1, RCE1), and isoprenylcysteine carboxylmethyltransferase (ICMT).
  • small molecule drugs targeting the above enzymes have been developed, there are side effects of inhibiting cell growth and apoptosis in the normal cell line of Ras wild type, and in the KRAS mutant tumors with the most frequent Ras mutations, geranyl geranyltransferase 1 There is a limit to the effectiveness of the drug due to the bypass route by geranylgeranyltransferase 1, GGTase1).
  • Other small-molecule drugs directly targeting Ras include Kobe0065 and Kobe2602, which have a mechanism of binding to activated Ras and inhibiting the interaction with Raf, a sub-effect protein, but the stability of the drug is poor , There is a limitation in that a high dose of a drug is required for treatment.
  • ARS853 a mechanism of inhibiting the interaction of KRas G12C mutation with Raf, a covalent bond, has been developed through the covalent linkage.
  • KRas G12C mutation which has a low frequency of KRa mutations.
  • a rigosertib of a mechanism that binds to the Ras binding domain (RBD) of Raf, PI3K, and RalGDS, which inhibits binding to Ras has been developed, but has a limitation in that a high dose of drug is required for therapeutic use.
  • stapled peptides that have been developed as ⁇ -helical structural analogs increase the structural stability of peptides by linking two nonadjacent monomers to a hydrocarbon chain, And it is being developed as a therapeutic substance targeting protein within the cell.
  • Staple peptides capable of penetrating cytoplasm have been developed as a strategy of mimicking the peptide-binding site of the Ras guanine nucleotide exchange factor (RasGEF) that converts inactive Ras into activated Ras using these properties.
  • RasGEF Ras guanine nucleotide exchange factor
  • a large amount of peptide is required for its effect, and it has a limitation that it has a nonspecific effect on the Ras mutant cell line as well as the Ras wild type cell line.
  • cytotransmab an immunoglobulin-like antibody with cytoplasmic permeability, binds to the cell membrane receptor HSPGs (Heparan Sulfate ProteoGlycans) and enters the cell by clathrin-mediated endocytosis, And the ability to penetrate the cytoplasm through the mechanism.
  • HSPGs Heparan Sulfate ProteoGlycans
  • HSPG a receptor for cytotransmab
  • HSPG a receptor for cytotransmab
  • Therapeutic immunoglobulin antibodies have a longer development period than small molecule drugs and are required to be produced at a high concentration for administration to patients. Therefore, therapeutic drugs containing stability and solubility of antibodies at the initial stage of development The developability of the technology has been greatly increased.
  • Cytotransmab the negative charge of the HS chain of the extracellular receptor HSPG and the Complementarity Determining Regions (CDRs) of the cytotransmab antibody are introduced into the cell by binding to the electrostatic attraction between positively charged amino acid residues. It has been reported that the amino acid residues positively charged to the CDR of the antibody adversely affect antibody stability, and when the amino acid residues of such positively charged amino acids are replaced with hydrophobic residues or negatively charged amino acids, the physical properties thereof are remarkably improved.
  • the immunoglobulin antibody binds to various pathogens in the body and can penetrate into the cells together by pathogens. It can bind to the cytoplasmic TRIM21 protein and cause an intracellular immunocytochemical system.
  • TRIM21 is a cytoplasmic protein belonging to the E3 ligase family. It binds to the CH2-CH3 region of immunoglobulins and forms a complex with pathogens and immunoglobulins. This complex is degraded by the ubiquitin-proteasome mechanism.
  • the binding of the immunoglobulin antibody to TRIM21 is decreased, the immune system by the pathogen does not work and TRIM21 plays an important role in the degradation of the immunoglobulin antibody.
  • immunoglobulin antibodies have an immune system that induces tumor killing by causing ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) through binding of immune cells in the blood with Fc receptors.
  • Immunoglobulin subclasses have different binding affinities to Fc ⁇ receptors.
  • IgG2 and IgG4 antibodies have very low affinity for Fc ⁇ receptors and lack ADCC function. Due to the affinity with the Fc receptor, IgG2 and IgG4 antibodies tend to have higher half-life than IgG1 in the case of the same antibody.
  • the present inventors constructed a heavy chain variable region (VH) library based on an anti-Ras GTP iMab antibody (RT11) that directly inhibits intracellular Ras activity through existing cytoplasmic penetration, (VH) with improved immunogenicity, and simultaneously expressing it with a light chain having a humanized light chain variable region (VL) having a characteristic of penetrating into cytoplasm and cytoplasmic distribution to construct a complete immunoglobulin type antibody To produce anti-Ras GTP iMab antibodies with improved Ras mutation-specific cell growth inhibitory effect.
  • VH heavy chain variable region
  • the present inventors have found that, in order to discover a complete immunoglobulin type anti-Ras GTP iMab antibody having tumor cell-specific cytoplasmic permeability, it is possible to reduce the non-specific binding ability to HSPG and, even after the peptide for imparting tumor tissue specificity is fused
  • VL light chain variable region
  • VL heavy chain variable region
  • the present inventors have found that by modifying the heavy chain to improve the intracellular stability, the somatic persistence and the tissue specificity of the complete immunoglobulin type anti-Ras GTP iMab antibody having the tumor cell specific cytotoxic ability, the Ras mutation- Anti-Ras GTP iMab antibody with improved effect was prepared.
  • the present inventors have found that the tumor-specific anti-Ras GTP iMab antibody penetrates into various Ras mutation-dependent cancer cells and exhibits Ras ⁇ GTP-specific binding ability in the cytoplasm, and the existing anti-Ras GTP iMab antibody Cell growth inhibition effect was observed.
  • HSPG binding ability is reduced to impart tumor tissue specificity, and even in a form in which integrin or EpCAM target circular peptide overexpressed in tumor tissue is fused, high production yield is obtained, and there is no adverse effect on cytoplasmic penetration and inhibition of Ras GTP activity , Demonstrating the activity of specifically inhibiting Ras ⁇ GTP in Ras mutation-dependent tumors, and thus completed the present invention.
  • the present invention relates to a method for inhibiting Ras activity by binding to a membrane protein receptor that is overexpressed on tumor tissue in the form of a complete immunoglobulin and then internalizing the membrane protein receptor and then exiting from the endosome and locating in the cytoplasm, And to provide a method for improving and producing the function of an antibody that directly inhibits the antibody.
  • the present invention specifically provides an amino acid sequence of a heavy chain variable region that specifically binds to GAS-activated Ras.
  • immunoglobulin antibody comprising the heavy chain variable region.
  • the antibody may have cytoplasmic penetration ability and may contain amino acids of a specific sequence.
  • a peptide targeting epithelial cell adhesion molecule EpCAM
  • integrin alpha v beta 3 integrin alpha v beta 3
  • integrin alpha v beta 5 integrin alpha v beta 5
  • the antibody may be characterized in that it comprises a heavy chain constant region or a light chain constant region derived from human immunoglobulin selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 and IgM.
  • the heavy chain constant region of the antibody may comprise N434D in the CH3 region, L234A, L235A or P329G in the CH2 region for enhancing cancer cell targeting activity. (Provided that the amino acid position is in accordance with EU numbering).
  • the antibody may also be selected from the group consisting of short chain Fvs (scFV), single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') fragments, disulfide-linked Fvs (sdFV) and epitope-binding fragments of the antibodies.
  • scFV short chain Fvs
  • single chain antibodies Fab fragments
  • F (ab ') fragments F (ab ') fragments
  • sdFV disulfide-linked Fvs
  • the antibody may be a bispecific antibody and may be fused with any one or more selected from the group consisting of proteins, peptides, small molecule drugs, toxins, enzymes, and nucleic acids.
  • the present invention also provides a method for preparing a complete immunoglobulin antibody having improved affinity for intracellular Ras / GTP and having tumor cell-specific cytoplasmic penetration ability.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating cancer comprising the antibody.
  • the cancer may be characterized in that the cancer has a mutation in which intracellular Ras is activated.
  • the mutation of Ras may be characterized by a mutation in the 12th, 13th, or 61st amino acid of Ras.
  • the prevention or treatment of cancer described in the present invention is characterized in that the antibody of the present invention has a mechanism of inhibiting the binding of B-Raf, C-Raf or PI3K to activated Ras (Ras GTP) in the cytoplasm .
  • the present invention provides a composition for diagnosing tumors comprising the antibody.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding said antibody.
  • the present invention also provides a heavy chain variable region library specifically binding to Ras GTP and having improved affinity and a construction method thereof.
  • the present invention provides a screening method for a heavy chain variable region that specifically binds to Ras GTP and has improved affinity.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising CDR1 comprising the amino acid sequence of the following general formula 1, CDR2 comprising the amino acid sequence of the general formula 2, and CDR3 comprising the amino acid sequence of the general formula 3
  • GTP is coupled to provide a heavy chain variable region that specifically binds to activated Ras (Ras. GTP).
  • X 11 is F or Y
  • X 21 is T, I or L
  • X 22 is Y, C, S, L or A
  • X 31 is K, F, R or N
  • X 32 may be M or L
  • X 33 is D or N.
  • the method of the present invention is a method for improving the affinity for a light chain variable region (VL) imparting tumor tissue specific cytoplasmic infiltration ability and an affinity for intracellular Ras ⁇ GTP, and a complete immunoglobulin having a heavy chain variable region (VH) (Immunoglobulin) type antibody to increase the efficiency of Ras mutant tumor-specific tumor suppression.
  • VL light chain variable region
  • VH heavy chain variable region
  • the present invention is to develop a complete immunoglobulin type antibody capable of infiltrating a tumor-specific cytoplasm and inhibiting the activity of Ras by binding to intracellular Ras GTP with high affinity after cytoplasmic penetration.
  • the antibody may be a complete immunoglobulin type antibody and a fragment thereof.
  • the antibody may be a chimeric, human, or humanized antibody.
  • the heavy chain variable region of the antibody according to the present invention consists of CDR1 comprising the amino acid sequence of the following general formula 1, CDR2 comprising the amino acid sequence of the general formula 2 and CDR3 comprising the amino acid sequence of the general formula 3:
  • X 11 is F or Y
  • X 21 is T, I or L
  • X 22 is Y, C, S, L or A
  • X 31 is K, F, R or N
  • X 32 may be M or L
  • X 33 is D or N.
  • X 11 in the general formula 1 defining the CDRs contained in the heavy chain variable region is F or Y
  • X 21 -X 21 in the general formula 2 is TY, IY, TC, TS , IS, LC, LL or IA
  • X 31 -X 31 -X 31 in the general formula 3 are KMD, RMD, FMN, RLD or NLD.
  • the affinity enhancing heavy chain variable region for intracellular Ras GTP is a sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20 to 32.
  • VH heavy chain variable region
  • the CDR1 sequence is selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 2 to 4
  • the CDR2 sequence is selected from the group consisting of the amino acids of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NOS: 10 to 16
  • the CDR3 sequence is selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 6 to 9 and SEQ ID NOS: 17 to 18.
  • the sequence information of the CDR is as follows
  • one aspect of the present invention provides a light chain variable region that confers tumor cell-specific cytoplasmic permeability and inhibits binding ability to HSPG, which is selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 34 to 43, and SEQ ID NOS: 44 to 60 Amino acid sequence.
  • the heavy chain variable region improved for improving tumor tissue targeting ability is a sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 61 to 63.
  • VH heavy chain variable region
  • one aspect of the present invention is a heavy chain constant region for enhancing intracellular stability of the tumor-specific cytoplasmic penetration antibody and imparting a long half-life is a sequence consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 65 to 69.
  • Another aspect of the present invention provides a method for constructing a library for improving the affinity of a heavy chain variable region specifically binding to Ras GTP.
  • one aspect of the present invention provides a screening method for a heavy chain variable region that specifically binds to Ras GTP comprising the following steps and has improved affinity.
  • one aspect of the present invention provides a complete form of an immunoglobulin antibody fused to the antibody with any one or more selected from the group consisting of proteins, peptides, small molecule drugs, toxins, enzymes, nucleic acids or nanoparticles.
  • the protein may be an antibody, an antibody fragment, an immunoglobulin, a peptide, an enzyme, a growth factor, a cytokine, a transcription factor, a toxin, an antigenic peptide, a hormone, A signal protein, a storage protein, a membrane protein, a transmembrane protein, an internal protein, an external protein, a secretory protein, a viral protein, a glycoprotein, a cleaved protein, a protein complex, And the like.
  • the small molecule drug has a molecular weight of less than about 1000 daltons and is widely used herein to represent an organic compound, an inorganic compound or an organometallic compound having activity as a therapeutic agent for diseases.
  • Small molecule drugs herein include oligopeptides and other biomolecules having a molecular weight of less than about 1000 daltons.
  • a nanoparticle means a particle made of materials having a diameter of 1 to 1000 nm, and the nanoparticle is composed of metal nanoparticles, a metal nanoparticle core, and a metal shell surrounding the core
  • Metal / non-metallic core shell composed of a metal / metal core shell composite, a metal nanoparticle core and a non-metallic shell surrounding the core, or a non-metallic / metal core shell composite composed of a non-metallic nanoparticle core and a metal shell surrounding the core.
  • the metal may be selected from gold, silver, copper, aluminum, nickel, palladium, platinum, magnetic iron and oxides thereof, but the present invention is not limited thereto and the base metal may be silica, polystyrene, latex, But it is not limited thereto.
  • &quot refers to the integration of two molecules having different functions or structures, in which all of the physicochemical, physiological and chemical properties of the protein, small molecule drug, nucleic acid, or nanoparticle capable of binding to the tumor- Or fusion by biological methods.
  • the fusion may preferably be with a linker peptide, which can relay the fusion with the bioactive molecule at various positions of the antibody light chain variable region, antibody, or fragment thereof of the invention.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a bioactive molecule selected from the group consisting of the above antibody, peptide, protein, small molecule drug, nucleic acid and nanoparticle fused thereto.
  • VH human antibody heavy chain variable region
  • a method of inhibiting the growth of cancer or tumor cells using the antibody and a method of treating cancer or a tumor.
  • the cancer is selected from the group consisting of squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma of the lung, peritoneal cancer, skin cancer, skin or intraocular melanoma, rectal cancer, Pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, colon cancer, colon cancer, colon cancer, pancreatic cancer, pancreatic cancer, pancreatic cancer, adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, Endometrial or uterine cancer, salivary gland cancer, renal cancer, liver cancer, prostate cancer, mucin cancer, thyroid cancer, liver cancer, and head and neck cancer.
  • the composition may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the composition include those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, But are not limited to, crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration and intrathecal administration.
  • the protein or peptide is extinguished and the oral composition should be formulated to coat the active agent or protect it from degradation from above.
  • the composition may be administered by any device capable of transferring the active agent to the target cell.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition for prevention or treatment of cancer may be determined by factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, Can be prescribed in various ways.
  • the preferred dose of the composition is in the range of 0.001-100 mg / kg on an adult basis.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to prevent or treat cancer, or to prevent or treat a disease caused by angiogenesis.
  • the composition may be prepared in unit dose form by formulating it with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily practiced by those skilled in the art, or may be manufactured by inserting it into a multi-dose container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
  • the composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with another therapeutic agent, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent.
  • the composition since the composition includes an antibody or an antigen-binding fragment, it can be formulated as an immunoliposome.
  • Liposomes containing antibodies can be prepared according to methods well known in the art.
  • the immunoliposome is a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and polyethylene glycol-derivatized phosphatidylethanolamine and can be prepared by reverse phase evaporation.
  • a Fab 'fragment of an antibody can be conjugated to a liposome via a disulfide-replacement reaction.
  • a chemotherapeutic agent such as doxorubicin may be further included in the liposome.
  • the present invention also provides a diagnostic composition for cancer comprising a bioactive molecule selected from the group consisting of the above antibody, or peptide, protein, small molecule drug, nucleic acid and nanoparticle fused thereto.
  • diagnosis means identifying the presence or characteristic of pathophysiology.
  • the diagnosis in the present invention is to confirm the onset and progress of cancer.
  • the complete immunoglobulin type antibody and fragment thereof can be combined with a phosphor for molecular imaging to diagnose cancer through imaging.
  • the phosphor for molecular imaging refers to all materials that generate fluorescence and preferably emits red or near-infrared fluorescence, and more preferably a phosphor having a high quantum yield (Quantaum yield), but is not limited thereto .
  • the fluorescent material for molecular imaging is preferably a fluorescent substance, fluorescent protein or other image-forming substance capable of binding with the tumor-permeable peptide specifically binding to the antibody of the complete immunoglobulin form and the fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the fluorescent material is preferably Fluorescein, BODYPY, Trtramethylrhodamine, Alexa, Cyanine, Allopicocyanine or derivatives thereof, but not limited thereto Do not.
  • the fluorescent protein is preferably, but not limited to, a Dronpa protein, a fluorescent coloring gene (EGFP), a red fluorescent protein (DsRFP), a cyanine fluorescent material Cy5.5 or other fluorescent protein showing near infrared fluorescence.
  • EGFP fluorescent coloring gene
  • DsRFP red fluorescent protein
  • Cy5.5 cyanine fluorescent material Cy5.5 or other fluorescent protein showing near infrared fluorescence.
  • imaging materials are preferably iron oxide, radioactive isotope, etc., but are not limited thereto, and can be applied to image equipment such as MR and PET.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding an antibody comprising a heavy chain variable region (VH) having improved affinity for intracellular Ras ⁇ GTP and a light chain variable region (VL) imparting the tumor tissue specific cytoplasmic permeability .
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the " polynucleotide " is a polymer of a deoxyribonucleotide or a ribonucleotide present in single-stranded or double-stranded form.
  • the polynucleotide may be selected from the group consisting of a heavy chain variable region (VH) having improved affinity for intracellular Ras ⁇ GTP as described above, a light chain variable region (VL) imparting tumor cell specific cytotoxicity, (CH1-CH2-CH3), as well as a sequence complementary to the sequence of the heavy chain constant region (CH1-CH2-CH3).
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • CH1-CH2-CH3 imparting tumor cell specific cytotoxicity
  • CH1-CH2-CH3 a sequence complementary to the sequence of the heavy chain constant region
  • the complementary sequence includes not only perfectly complementary sequences but also substantially complementary sequences. This means a sequence that can hybridize under stringent conditions known in the art, for example, a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 20 to 69.
  • the polynucleotide may also be modified. Such modifications include addition, deletion or non-conservative substitution or conservative substitution of nucleotides.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence is also interpreted to include a nucleotide sequence that exhibits substantial identity to the nucleotide sequence. The above substantial identity is determined by aligning the nucleotide sequence with any other sequence as closely as possible, and analyzing the aligned sequence using algorithms commonly used in the art to obtain a sequence having at least 80% homology, At least 90% homology or at least 95% homology.
  • the affinity enhancement to intracellular Ras GTP is performed.
  • the antibody penetrates into the cell using the light chain variable region and the light chain variable region imparted with tumor tissue specific cytoplasmic infiltration ability to produce a completely immunoglobulin type antibody distributed in the cytoplasm
  • An example of the method is as follows.
  • the heavy chain variable region (VH) in the heavy chain comprising the human heavy chain variable region (VH) and the human heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3) is replaced with a humanized heavy chain having enhanced affinity for intracellular Ras GTP
  • VL humanized light chain variable region
  • VL a humanized light chain variable region that penetrates the light chain variable region (VL) into the cytoplasm in the light chain
  • CL human light chain constant region
  • This method can express an antibody capable of expressing a heavy chain-expressing vector and a light chain-expressing vector and infiltrating the cell tissue specifically into tumor tissue and distributing in the cytoplasm and capable of targeting intracellular Ras ⁇ GTP with high affinity .
  • the vector is either a vector system in which light and heavy chains are expressed simultaneously in one vector, or a system in which each is expressed in a separate vector. In the latter case, both vectors can be introduced into host cells via co-transfomation and targeted transformation.
  • the light chain variable region (VL) and the light chain constant region (CL), the heavy chain variable region (VH) and the heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3) provided in the present invention in the recombinant vector are operably linked to a promoter .
  • the term "operatively linked” refers to the functional linkage between a nucleotide expression control regulatory sequence (e.g., a promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • the regulatory sequence may thereby regulate transcription and / or translation of the other nucleotide sequence.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression.
  • the expression vector may be any conventional vector used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector may be constructed by a variety of methods known in the art.
  • the recombinant vector may be constructed with prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (for example, pL? Promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.) , A ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription / translation termination sequence.
  • the origin of replication that functions in the eukaryotic cells contained in the vector is f1 replication origin, SV40 replication origin, pMB1 replication origin, adeno replication origin, AAV replication origin, CMV replication origin, and BBV replication origin But is not limited thereto.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothionein promoter
  • mammalian viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus (CMV) promoter and the tk promoter of HSV
  • CMV cytomegalovirus
  • HSV tk promoter
  • Yet another aspect of the present invention is to provide a host cell transformed with said recombinant vector.
  • the host cell can be any host cell known in the art and includes, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus strain, and Enterobacteriaceae such as Salmonella typhimurium, Serratia marcesensus and various Pseudomonas spp.
  • Saccharomyce cerevisiae When transformed into a cell, Saccharomyce cerevisiae, insect cells, plant cells and animal cells such as SP2 / 0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138 , BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN and MDCK cell lines.
  • SP2 / 0 CHO (Chinese hamster ovary) K1
  • CHO DG44 CHO DG44
  • PER.C6, W138 BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN and MDCK cell lines.
  • Yet another aspect of the present invention is to provide a method for producing a complete immunoglobulin form capable of targeting the intracellular Ras ⁇ GTP to a high affinity by penetrating into the cell tissue specifically to the tumor tissue and comprising the step of culturing the host cell Can be provided.
  • the insertion of the recombinant vector into a host cell can be carried out by using an insertion method well known in the art.
  • the host cell is a prokaryotic cell
  • the CaCl 2 method or the electroporation method can be used.
  • the host cell is a eukaryotic cell
  • the microinjection method, the calcium phosphate precipitation method, the electroporation method, Liposome-mediated transfection methods, and gene bombardment but the present invention is not limited thereto.
  • E. coli and other microorganisms are used, the productivity is higher than that of animal cells, but it is not suitable for the production of intact Ig-type antibody due to glycosylation problem.
  • the antigen binding fragments such as Fab and Fv It can be used for production.
  • the method of selecting the transformed host cells can be easily carried out according to a method widely known in the art by using a phenotype expressed by a selection marker.
  • a selection mark is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a strategy for selecting and constructing a library constructed based on the heavy chain variable region of RT11 for improving the affinity of anti-Ras GTP iMab for Ras GTP.
  • FIG. 2A is a graph showing the results of the screening of the library-expressing yeast in each step to confirm the specific enrichment of Avi-KRas G12D and GppNHp through the selection process using MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) and FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) nM Avi-KRas G12D ⁇ GppNHp or 1000 nM Avi-KRas G12D ⁇ GDP and the binding ability were analyzed by flow cytometer (FACS).
  • MACS Magnetic Activated Cell Sorting
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • FIG. 2B shows the results of analysis of the binding ability of 5 nM Avi-KRas G12D GppNHp and yeast expressing 47 individual clones in each of the final selected libraries using a flow cytometer.
  • FIG. 3A is a schematic diagram illustrating the construction of an anti-Ras GTP iMab (RT22-i3) form of complete IgG with improved affinity for integrin target circular peptide fusion and RT11-based Ras GTP.
  • Figure 3b RT11-based affinity is improved wherein -Ras ⁇ to determine the specific binding with the Avi-KRas G12D GppNHp the combination of GTP iMab, each of 1, 10 and 100 nM of the Avi-KRas G12D ⁇ GppNHp 100 nM of Avi-KRas G12D ⁇ GDP and the binding ability were analyzed by ELISA.
  • FIG. 3c is a result of confirming whether the anti-Ras / GTP iMabs having improved affinity to the KRas mutant colorectal cancer cell line SW480 were treated with 1 ⁇ M concentration at 37 ° C. for 12 hours and then superimposed with intracellularly activated Ras by a confocal microscope.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a strategy for selecting and constructing a library constructed based on the heavy chain variable region of RT22 for improving the affinity of anti-Ras GTP iMab for Ras GTP.
  • FIG. 5A shows the results of the RT-based affinity-enhanced heavy chain variable regions (VH) after the anti-Ras GTP iMab purification combined with the light chain variable region (hT4-i33) in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability were inhibited, And 12% SDS-PAGE under reducing conditions.
  • FIG. 5b shows the results of immunohistochemical staining of anti-Ras (hT4-i33) in combination with the light chain variable region (RT31 VH, RT33 VH, RT34 VH) in which the RT22-based affinity was improved and the light chain variable region (hT4-i33) in which the integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability were inhibited
  • RT31 VH, RT33 VH, RT34 VH the light chain variable region
  • hT4-i33 the light chain variable region in which the integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability were inhibited
  • each anti-Ras GTP iMab and 1, 10, 100 nM Avi-KRas G12D GppNHp or 100 nM Avi-KRas G12D and GDP were analyzed by ELISA.
  • FIG. 5c is a graph showing the results of immunohistochemistry showing the anti-Ras (anti-Ras) activity in combination with the light chain variable region (RT31 VH, RT36 VH, RT37 VH) with improved RT22-based affinity and the light chain variable region (hT4-i33) in which integrin target circular peptide fusion and HSPG-
  • RT31 VH, RT36 VH, RT37 VH the light chain variable region
  • hT4-i33 the light chain variable region in which integrin target circular peptide fusion and HSPG-
  • each anti-Ras GTP iMab and 1, 10, 100 nM Avi-KRas G12D GppNHp or 100 nM Avi-KRas G12D and GDP were analyzed by ELISA.
  • Figure 6 shows the affinity-modified anti-Ras GTP iMab (RT22-i33, RT22-ep33 (SEQ ID NO: 2)) in the form of complete IgG with improved affinity, including a light chain variable region (VL) in which binding ability to integrin or EpCAM target circular peptide fusion and HSPG was inhibited ) Construction.
  • VL light chain variable region
  • Fig. 7 shows the results of immunohistochemical staining for the anti-Ras GTP iMab (Fig. 7) of a complete IgG form with a light chain variable region (VL) in which the ability to bind integrin or EpCAM target circular peptide fusion and HSPG was inhibited to the KRas mutant colorectal cancer cell line SW480 (1 ⁇ M), CT-i33 MG (0.5 ⁇ M), CT-ep33 MG (1 ⁇ M), and the control cytotransmab )), And then examined for confluency with activated Ras in the cell by confocal microscopy.
  • VL light chain variable region
  • Figure 8a shows whether the anti-Ras GTP iMab and cytotransmab containing the light chain variable region introduced CDR1, CDR2 mutation for the improvement of production yield and inhibition of HSPG binding ability were reduced or eliminated in HSPG binding capacity and cytoplasmic permeability were measured with 1 [mu] M antibody And a bar graph plotting the results of confocal microscopy and Alexa488 (green fluorescence) fluorescence of HeLa cells treated at 37 ° C for 6 hours.
  • FIG. 8B is a graph showing the HSPG binding ability of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab including a light chain variable region in which CDR1 and CDR2 mutations were introduced for improving production yield and inhibiting HSPG binding ability.
  • CDR1 and CDR2 mutations were introduced for improving production yield and inhibiting HSPG binding ability.
  • Figure 8C shows that HSPG binding ability of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab containing light chain variable region introduced with CDR1, CDR2 mutation for production yield enhancement and inhibition of HSPG binding ability was examined by treating 500 nM of antibody with HeLa cell line And then analyzed by FACS.
  • FIG. 9A shows the results of immunohistochemical staining for anti-Ras GTP iMab containing 1, 10, 100 nM Avi-KRas G12D (hT4-i33 MG to hT4-i37 MG VL) containing light chain variable region ⁇
  • the binding ability of GppNHp or 100 nM to Avi-KRas G12D and GDP was analyzed by ELISA.
  • Fig. 9b shows the results of immunohistochemical staining for anti-Ras GTP iMab and cytotransmab of 1, 10, and 100 nM Avi-I, including the light chain variable region (hT4-i38 MG to hT4-i39 MG VL)
  • the binding ability of KRas G12D ⁇ GppNHp or 100 nM to Avi-KRas G12D ⁇ GDP was analyzed by ELISA.
  • Figure 9c shows anti-Ras GTP iMab and cytotransmabs containing the light chain variable region (VL) in which the integrin or EpCAM target circular peptide fusion and the binding ability to HSPG were inhibited in the KRas mutant colorectal cancer cell line SW480 at a concentration of 1 ⁇ M at 37 ° C Confirmation of overlapping with activated Ras after intracellular time treatment was confirmed by confocal microscopy.
  • VL light chain variable region
  • FIG. 10A shows the results of immunohistochemical staining for anti-Ras GTP iMab and cytotransmab including light chains (hT4-58, hT4-59) with improved antibody framework structure for EpCAM target circular peptide fusion and hT4-38 and hT4-39 based production yields. 10, and 100 nM Avi-KRas G12D GppNHp or 100 nM Avi-KRas G12D and GDP, respectively.
  • Figure 11a shows the effect of reducing or eliminating the HSPG binding capacity and cytoplasmic permeability of the anti-Ras GTP iMab and cytotransmab containing the light chain variable region introduced with the CDR1, CDR2 mutation for the improvement of production yield and inhibition of HSPG binding, (HeLa cells) for 6 hours and confirmed by confocal microscopy and Alexa488 (green fluorescence) fluorescence.
  • FIG. 11B shows the effect of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab on HSPG binding capacity including light chain variable region introduced with CDR1, CDR2 mutation for improvement of production yield and inhibition of HSPG binding ability.
  • Surface binding ELISA In order to confirm the HSPG binding ability of HSPG, Surface binding ELISA.
  • FIG. 11C shows that HSPG binding ability of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab containing light chain variable region introduced with CDR1, CDR2 mutation for production yield enhancement and inhibition of HSPG binding ability was examined by treating 500 nM of antibody with HeLa cell line And then analyzed by FACS.
  • FIG. 12A shows the results of FACS analysis of expression of integrin ⁇ 3 or integrin ⁇ 5 in the human colon cancer cell line SW480, LoVo, and human blood cancer cell line K562 and K562 integrin ⁇ 3 expressing cell lines.
  • Figure 12b shows the results of immunohistochemical staining for tumor-specific integrin-specific anti-Ras cell-penetrating antibodies (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG) with HSPG binding ability including the heavy chain (RT22)
  • RT22-i38 MG, RT22-i39 MG tumor-specific integrin-specific anti-Ras cell-penetrating antibodies
  • HSPG binding ability including the heavy chain
  • the binding activity of integrin ⁇ 3 or integrin ⁇ 5 on the cell surface of a specific anti-Ras cell-penetrating antibody (RT11-i) was confirmed by FACS.
  • FIG. 12C shows the results of experiments in which expression of EpCAM was confirmed by FACS in human colorectal cancer cell line SW480, LoVo and human cervical cancer cell line HeLa.
  • FIG. 12d shows the results of cell surface EpCAM of tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras cell penetration antibody (RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG) with HSPG binding ability removed including heavy chain (RT22) with improved affinity for Ras GTP The binding capacity was confirmed by FACS.
  • FIG. 13A shows the results of treatment of 0.5 ⁇ M of anti-Ras GTP iMab in combination with a light chain variable region in which HspG binding capacity was inhibited, and fusion of the integrin target circular peptide fusion and productivity in various Ras mutants and wild type cell lines at 37 ° C. for 48 hours, The inhibition was confirmed by the WST assay.
  • Fig. 13B shows that anti-Ras GTP iMab 1 [mu] M combined with the light chain variable region in which the EpCAM target circular peptide improved fusion yield and HSPG binding ability was inhibited in several Ras mutants and wild type cell lines was incubated at 37 [deg.] C for 48 hours, Growth inhibition was confirmed by WST assay.
  • Fig. 14A is a graph showing the effect of the anti-Ras cell penetration antibody (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG) and HSPG-binding ability of the integrin target circular peptide fusion and RTN-i39 MG in the xenograft transplantation of the human colorectal cancer KRas mutant cell line LoVo and SW480, (RT11-i) fused with a circular peptide at a concentration of 20 mg / kg, administered intravenously every other day for 9 times.
  • RT22-i38 MG anti-Ras cell penetration antibody
  • HSPG-binding ability of the integrin target circular peptide fusion and RTN-i39 MG in the xenograft transplantation of the human colorectal cancer KRas mutant cell line LoVo and SW480, (RT11-i) fused with a circular peptide at a concentration of 20 mg / kg, administered intravenously every other day for 9 times.
  • FIG. 14B is a graph showing the tumor weight after measurement of the tumor after treatment with the anti-Ras cell permeabilizing antibody in which the integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 14C is a graph showing the weight of a mouse to confirm nonspecific adverse effects of anti-Ras cell penetrating antibodies in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • 15A shows inhibition of tumor growth of anti-Ras cell penetration antibody (RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG) in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability were removed in xenografts of human colorectal cancer KRas mutant cell lines LoVo and SW480 The results were compared by intravenous injection of 20 mg / kg and 9 doses every 2 days.
  • FIG. 15B is a graph showing the tumor weight by measuring the tumor after the anti-Ras cell infiltrating antibody treatment in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 15C is a graph showing the weight of a rat to confirm non-specific adverse effects of anti-Ras cell penetrating antibodies in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 16A shows the effect of the integrin target circular peptide fusion and the anti-Ras cell penetrating antibody (RT22-i39 MG) with HSPG binding ability removed in the mouse transplanted with the human colorectal cancer KRas mutant cell line LoVo This is the result of comparing tumor growth inhibition effect.
  • FIG. 16B is a graph showing tumor weights obtained after tumor removal after anti-Ras cell penetrating antibody treatment in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 16C is a graph showing the weight of a rat to confirm nonspecific adverse effects of anti-Ras cell penetrating antibodies in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 17A shows the effect of the anti-Ras cell penetration antibody (RT22-ep59 MG) with the EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability removed in xenotransplanted human colorectal cancer KRas mutant cell line LoVo according to the dose, This is the result of comparing tumor growth inhibition effect.
  • FIG. 17B is a graph showing the tumor weight after measuring the tumor after treatment with the anti-Ras cell penetrating antibody in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 17C is a graph showing the weight of a rat to confirm non-specific adverse effects of anti-Ras cell penetrating antibodies in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 18A shows the results of confirming the reduction of intracellular degradation of tumor-associated EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab using an improved fractionated green fluorescent protein complement system.
  • FIG. 18B shows the result of confirming the ability of EpCAM specific anti-Ras GTP iMab to inhibit adherent cell growth in a human colon cancer cell line through a soft agar colony formation method.
  • 18c shows the result of confirming the inhibition of non-adherent cell growth in an human colon cancer cell line of the tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab with improved cytoplasmic stability through an anoikis method.
  • FIG. 18d shows the results of confirming the inhibition of non-adherent cell growth by anoikis method in a human lung cancer cell line of tumor-specific integrin-specific anti-Ras GTP iMab with improved cytoplasmic stability.
  • FIG. 19A shows the result of 12% SDS-PAGE analysis under reducing or nonreducing conditions after purification of tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras GTP, which improves persistence in the body.
  • FIG. 19B shows the pharmacokinetics of tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras GTP, which improves persistence in the body, in BALB / c nude mice.
  • 20A is an experimental result of FACS-binding ability of anti-Ras GTP iMab epRas23 MG, which is a fusion of EpCAM target peptide to the N-terminal region of the heavy chain variable region, to enhance the tumor tissue targeting ability to cell surface EpCAM.
  • FIG. 20b shows the results of immunoblot analysis of anti-Ras GTP iMab 25, 50, 100 nM Avi-KRas G12D GppNHp or 100 nM Avi-KRas G12D of EpCAM target peptide fused to the heavy chain variable region N terminus ⁇ The result of analyzing the binding ability with GDP by ELISA.
  • 20C shows the result of confirming the inhibition of non-adherent cell growth by anoikis method in human colon cancer cell line of anti-Ras GTP iMab epRas23 MG in which EpCAM target peptide is fused to the N-terminal region of the heavy chain variable region to improve the tumor tissue targeting ability .
  • 20D is a graph showing the biodistribution of anti-Ras GTP iMab epRas23 MG fused with EpCAM target peptide at the N-terminus of the heavy chain variable region to improve the tumor tissue targeting ability, and quantifying the fluorescence of tumor and whole body Respectively.
  • Figure 20E shows the biodistribution of anti-Ras GTP iMab epRas23 MG fused EpCAM target peptide to the heavy chain variable region N terminus in mice to improve the tumor tissue targeting ability, and organs were excised and fluorescence quantified Results.
  • FIG. 21A shows the results of size-exclusion chromatography of the multimers of LALA-PG variants that improved the persistence of the tumor-associated EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab in vivo.
  • Figure 21B shows the pharmacokinetics of LALA-PG mutants in BALB / c nude mice, which improved the persistence of tumor-associated EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab in vivo.
  • FIG. 22A shows the results of size-exclusion chromatography to determine the content of multimers of LALA-PG mutants which improved the persistence of tumor-integrin-specific anti-Ras GTP iMab in vivo.
  • FIG. 22B is a graph showing the results of experiments comparing the tumor growth inhibitory effects of LALA-PG mutants which improved the persistence of the tumor-specific integrin-specific anti-RAS cell penetrating antibodies in the mice transplanted with human colon cancer KRas mutant cell line LS1034.
  • FIG. 22C is an experimental result comparing the tumor growth inhibitory effect of the LALA-PG mutant which improves the persistence of the tumor-specific integrin-specific anti-RAS cell penetration antibody in the mouse xenografted with the human colorectal cancer KRas mutant cell line SW403.
  • the Avi-KRas G12D antigen was fused to the N-term using Avi tag (GLNDIFEAQKIEWHE) for library screening. This was designed to minimize the structural degradation that might be a problem in antigen biotinylation during library screening.
  • the catalytic G domain (residues 1 to 169) except for the C-terminal partial hypervariable region in the KRas G12D protein and the 8X his tag and the Avi-tag at the N-terminus were ligated using the GSG linker
  • the fused form of DNA was constructed by PCR and cloned into pET23 vector for expression of E. coli using restriction enzymes NcoI and HindIII.
  • the stock solution for the addition of 50 ⁇ M d-biotin is made by adding 12 mg d-biotin to 10 ml of 10 mM bicin, pH 8.3 buffer. After culturing the E. coli, Escherichia coli collected using a centrifugal separator was resuspended in 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 2 mM ⁇ -ME buffer, and the E. coli was pulverized by ultrasonication (SONICS). The supernatant was obtained by removing the E. coli pulverized product using a centrifugal separator and purified using a Ni-NTA resin that specifically purified the protein fused with the His tag.
  • SONICS ultrasonication
  • washing buffer (20 mM Tris, pH 7.4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 2 mM MgCl 2 and 2 mM ⁇ -ME) 7.4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, and eluted protein using 2 mM MgCl 2 and 2 mM ⁇ -ME).
  • the eluted protein was buffered with a buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM DTT, 2 mM MgCl 2 ) using a dialysis method.
  • the purified protein was quantified using absorbance and extinction coefficient at 280 nm wavelength. A purity of about 98% or more was confirmed by SDS-PAGE analysis.
  • Avi-KRas G12D protein binds Avi-tag and biotin in high yield through in vivo biotinylation reaction.
  • the Avi-KRas G12D protein was diluted with SDS-PAGE loading buffer (25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1% SDS, 10% Glycerol, 175 mM ⁇ -ME) and incubated for 10 min with 1 ⁇ g of streptavidin The proteins were separated by SDS-PAGE for 30 min at room temperature and transferred to PVDF membrane. The protein was confirmed by using anti-His antibody fused with HRP.
  • Avi-KRas G12D protein was analyzed by SDS-PAGE after reaction with GTP analog (GppNHp) or GDP.
  • GppNHp GTP analog
  • the purified Ras protein was incubated with a substrate exchange buffer (40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 ⁇ M ZnCl 2 , 5 mM DTT), and GppNHp having a molar number of 10 times or more as compared with Ras protein and alkaline phosphatase fused with 2 units of beads per mg of Ras protein were added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • a substrate exchange buffer 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 ⁇ M ZnCl 2 , 5 mM DTT
  • the reaction was carried out at 30 ° C for 30 minutes under the condition of 20 mM EDTA and GDP having a molar number of 20 times or more higher than that of Ras protein. Then, 60 mM MgCl 2 was added thereto, And stopped the reaction.
  • Ras protein bound with GppNHp or GDP was exchanged with a storage buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM DTT, 2 mM MgCl 2 ) using a PD10 sephadex G25 column, and analyzed by SDS-PAGE .
  • the Ras protein bound to the substrate is stored at -80 ° C.
  • ELISA was performed to analyze the RT11 binding ability between Avi-KRas G12D protein prepared by the above method and His-KRas G12D protein without Avi-tag. Specifically, RT11, which is an anti-Ras GTP iMab, was bound at a concentration of 5 ⁇ g / ml each of 96-well EIA / RIA plates (COSTAR Corning) for 1 hour at room temperature. Then, 0.1% TBST (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1% Tween 20, 5 mM MgCl 2 ) for 10 minutes.
  • TBST (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1% Tween 20, 5 mM MgCl 2
  • Binding was performed for 1 hour with 4% TBSB (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4% BSA, 10 mM MgCl 2 ) and then washed three times with 0.1% TBST for 10 minutes. Then, KRas protein coupled with GppNHp and GDP-bound KRas protein was diluted with 4% TBSB, bound at 100 nM for 1 hour at room temperature, and washed three times with 0.1% TBST for 10 minutes. (HRP-conjugated anti-his mAb) conjugated with HRP as a labeling antibody. TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • Example 2 Construction of a high diversity antibody library based on the anti-Ras ⁇ GTP iMab RT11 and selection of a heavy chain variable region (VH) having improved affinity specific to Ras ⁇ GTP
  • anti-Ras GTP iMab RT11 in the existing patent (registration number: 10-1602876), it binds specifically to Ras GTP and exhibits biological activity in various Ras mutant cell lines, but has a biological activity of about 12 nM Level affinity, which is low affinity when compared to the affinity of various antibodies of the IgG format.
  • anti - Ras GTP iMab RT11 which exhibits biological activity through inhibition of binding between Ras ⁇ GTP and effector molecule, can induce enhanced biological activity by improving affinity with Ras ⁇ GTP.
  • the present inventor intends to further increase the affinity of Ras GTP for the anti-Ras GTP iMab RT11 in addition to the light chain variable region modification for imparting tissue specificity .
  • the light chain variable region using the Ras ⁇ GTP-specific heavy chain variable region having improved affinity based on RT11 was an hT4-3 light chain variable region having improved endo-escape ability, which was used in the existing patent (Registration No. 10-1602876) (Trp-Tyr-Trp) at 92-94 residues of hT4 light chain variable region (VL), and the production yield of the hydrophobic residues increased with the introduction of WYW (Phe) in the light chain variable region framework (Framework) residue 87 corresponding to the interface between the light chain variable region (VL) and the heavy chain variable region (VH) -2016-0065365).
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a strategy for selecting and constructing a library constructed based on the heavy chain variable region of RT11 for improving the affinity of anti-Ras GTP iMab for Ras GTP.
  • residues of CDR1 (No. 31 to No. 33) and CDR2 (No. 52 to No. 56) were degenerated codons capable of containing amino acid sequences suitable for the predicted binding structure
  • ASC, MRA, ASC, ASC, CRC, and WMC were sequentially used in CDR2 .
  • an ARG dedifferentiation codon capable of coding Arg, Lys in the germline antibody sequence was used.
  • the residues of CDR3 were spiked oligomers capable of conserving the sequence of RT11 at a 50% probability. This is a technique that keeps the wild type amino acid at 50 percent in the PCR process by maintaining 79 percent of each of the three nucleotides encoding the amino acid for each residue and 79 percent of the remaining nucleotide and 7 percent of the remaining nucleotide.
  • the CDR3 (No. 100a) residue was an important residue for VH / VL binding and used a WTK degenerate codon that could include Phe, Ile, Leu in the germline antibody sequence, including the Met of the RT11 antibody.
  • the light chain variable region used in the affinity-improving library was hT4-3 VL having improved cytoplasmic permeability.
  • the designed library-coding DNA was amplified using the PCR technique and then concentrated using the ethanol precipitation method.
  • the yeast surface expression vector (C-aga2) in which the aga2 protein is expressed at the c-terminus for homologous recombination is purified by agarose gel extraction using NheI and MluI restriction enzymes and purified by ethanol precipitation And concentrated.
  • Each 12 ⁇ g of library-coding DNA was transformed with 5 ⁇ g of restriction enzyme-treated vector EBY100 by electrophoresis (Baek DS and Kim YS, 2014)
  • the RT11-3-based affinity improved library constructed in Example 2 was selected using Avi-KRas G12D conjugated with GppNHp as an antigen.
  • Avi-KRas G12D conjugated with 100 nM purified GppNHp was digested with SG-CAA (20 g / L Galactose, 6.7 g / L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g / L Na 2 HPO 4 , 8.6 g / L NaH 2 PO 4 , 5 g / L casamino acids) medium for 1 hour at room temperature with yeast inducing the expression of a single chain Fab (scFab) heavy chain variable region library on the cell surface.
  • SG-CAA 20 g / L Galactose, 6.7 g / L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g / L Na 2 HPO 4 , 8.6 g / L NaH 2 PO 4 , 5 g / L casamino acids
  • the yeast expressing the library bound with GppNHp -coupled Avi-KRas G12D was reacted with Streptavidin Microbead (Miltenyi Biotec) at 4 ° C for 20 minutes, and then GppNHp was reacted with MACS (magnetic activated cell sorting)
  • MACS magnetic activated cell sorting
  • the yeast expressing the heavy chain variable region with high affinity to the bound Avi-KRas G12D was floated.
  • the yeast expressing the selected library was cultured in selective medium.
  • SD-CAA (20 g / L Glucose, 6.7 g / L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g / L Na 2 HPO 4 , 8.6 g / L NaH 2 PO 4 , 5 g / L casamino acids) and SG-CAA medium, followed by Avi-KRas G12D conjugated with GppNHP for primary FACS screening and Avi-KRas G12D antigen conjugated with in vivio biotinylated GDP (Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate, SA-PE) (Invitrogen) was reacted with yeast expressing the library competitively at a ratio of 1: 10 at room temperature for 1 hour and then subjected to FACS cell sorting (FACS Caliber) (BD biosciences).
  • FACS Caliber FACS Caliber
  • FIG. 2A is a graph showing the results of the screening of the library-expressing yeast in each step to confirm the specific enrichment of Avi-KRas G12D and GppNHp through the selection process using MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) and FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) nM Avi-KRas G12D ⁇ GppNHp or 1000 nM Avi-KRas G12D ⁇ GDP and the binding ability were analyzed by flow cytometer (FACS). This confirms that clones with a high affinity for Avi-KRas G12D binding to GppNHp in a heavy chain variable region (VH) -like manner are selected by RT -sorting in comparison with RT11-3.
  • MACS Magnetic Activated Cell Sorting
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • FIG. 2B shows the results of analysis of the binding ability of 5 nM Avi-KRas G12D GppNHp and yeast expressing 47 individual clones in each of the final selected libraries using a flow cytometer.
  • RT21, RT22, RT23, RT24, RT25, and RT26 Six unique clones (RT21, RT22, RT23, RT24, RT25, and RT26) with high affinity and specificity were selected for Avi-KRas G12D to which GppNHp was conjugated.
  • Table 1 shows the heavy chain variable region sequences of six individual clones showing high binding affinity to the selected GppNHp -conjugated Avi-KRas G12D
  • Table 2 is the CDR sequences of the heavy chain variable regions of Table 1.
  • a heavy chain comprising a heavy chain variable region and an heavy chain variable region (CH1-CH2-CH3) having improved affinity for Ras ⁇ GTP based on RT11
  • An RGD10 circular peptide having specificity for integrins (Integrin? V? 3 and? V? 5) overexpressed in neovascular cells and various tumors was cloned into an animal expression vector and GGGGS 2 linkers were used at the N-terminus of humanized light chain hT4-3 light chain Were genetically engineered and fused to an animal expression vector.
  • the RGD10 circular peptide In the case of the RGD10 circular peptide, it has an affinity similar to that of the RGD4C circular peptide, but only one disulfide bond is formed by two cysteines, which is characterized by the possibility of genetic engineering fusion.
  • the heavy chain variable having an improved affinity based on RT11 fused with a DNA encoding a secretion signal peptide at the 5 ' Region mutations were introduced and the DNA encoding the heavy chain containing the heavy chain constant region (CH1-CH2-CH3) was cloned into the pcDNA3.4 vector, respectively, with NotI / HindIII). Proteins were expressed and purified using the transient transfection of the heavy chain expression vector and the light chain of the previous cytoplasmic penetration antibody (Application No. 10-2016-0065365), and the yields were compared.
  • HEK293F cells growing suspended in serum-free FreeStyle 293 expression medium were transfected with a mixture of plasmid and polyethylenimine (PEI).
  • PEI polyethylenimine
  • the protein was applied to Protein A Sepharose column and washed with PBS (pH 7.4).
  • the antibody was eluted at pH 3.0 with 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl buffer, and the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer.
  • the eluted antibody fractions were concentrated by dialysis against the buffer (pH 6.5).
  • the purified protein was quantified using absorbance and extinction coefficient at 280 nm wavelength.
  • FIG. 3A is a schematic diagram illustrating the construction of an anti-Ras GTP iMab (RT22-i3) form of complete IgG with improved affinity for integrin target circular peptide fusion and RT11-based Ras GTP.
  • Figure 3b RT11-based affinity is improved wherein -Ras ⁇ to determine the specific binding with the Avi-KRas G12D GppNHp the combination of GTP iMab, each of 1, 10 and 100 nM of the Avi-KRas G12D ⁇ GppNHp 100 nM of Avi-KRas G12D ⁇ GDP and the binding ability were analyzed by ELISA.
  • the cells are washed with 0.1% TBST for 10 minutes and then washed three times with 4% TBSB (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4% BSA and 10 mM MgCl 2 ) for 1 hour.
  • KRas protein bound with GppNHp and GDP-bound KRas protein was diluted with 4% TBSB and bound at various concentrations of 100 nM, 10 nM and 1 nM for 1 hour at room temperature, followed by washing with 0.1% TBST for 10 minutes for 3 times .
  • HRP as a labeling antibody.
  • TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • FIG. 3c is a result of confocal microscopy to confirm whether the anti-Ras / GTP iMabs having improved affinity were treated with KRAS mutant colorectal cancer cell line SW480 and whether they were superimposed on intracellularly activated Ras.
  • the SW480 cell line was diluted to 0.5 ml with 2x10 4 cells per well and cultured in a 24-well plate for 12 hours at 37 ° C in 5% CO 2. Then , TMab4-i and RT11-i and six affinity Treated with 1 ⁇ M anti-Ras GTP iMab at 37 ° C for 12 hours. Subsequently, the medium was removed, washed with PBS, and proteins attached to the cell surface were removed with a weakly acidic solution (200 mM glycine, 150 mM NaCl pH 2.5). After washing with PBS, cells were fixed for 10 minutes at 25 ° C after addition of 4% paraformaldehyde.
  • a weakly acidic solution 200 mM glycine, 150 mM NaCl pH 2.5
  • the cells were washed with PBS and incubated with PBS containing 0.1% saponin, 0.1% sodium azide, and 1% BSA at 25 ° C for 10 minutes to form holes in the cell membrane. After washing with PBS, the reaction was carried out at 25 ° C for 1 hour with a buffer solution containing 2% BSA in PBS to inhibit nonspecific binding.
  • Each antibody was stained with an antibody that specifically recognizes human Fc to which Alexa-488 (green fluorescence) is linked.
  • the nuclei were stained (blue fluorescence) using Hoechst 33342 and the KRas-labeled antibody was observed with a staining (red fluorescence) confocal microscope. All anti-Ras GTP iMabs except TMab4-i3 were found to overlap with intracellular Ras and fluorescence.
  • RT22-i3 was diluted to 20 ⁇ l / ml in 10 mM NaAc buffer (pH 4.0) and immobilized in a CM5 sensor chip (GE healthcare) with about 1800 response units (RU).
  • Tris buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.01% Tween 20) was analyzed at a flow rate of 30 ⁇ l / min and GppNHp was detected at 50 nM for the bound GST- 3.125 nM.
  • CM5 chip regeneration was performed by flowing buffer (20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0) at a flow rate of 30 ⁇ l / min for 1 minute. Each sensorgram obtained from 3 minutes of coupling and 3 minutes of dissociation was compared with a blank cell and normalized and subtracted to calculate affinity.
  • Table 3 shows the results of affinity analysis of anti-Ras GTP iMab RT11-i and RT22-i3 against GST-KRas G12D in the form of GTPNHp -bound GST-KRas G12D using SPR (BIACORE 2000).
  • An anti-Ras GTP iMab (RT22-i3) with a heavy chain variable region (RT22 VH) with enhanced binding to Ras GTP shows a high affinity of about 1.4 nM.
  • it was screened in combination with the light chain variable region (hT4-3 VL), which is bound to the cell membrane receptor HSPG. Since HSPG is expressed in most tissues, a light chain variable region was constructed by introducing a germline antibody sequence into CDR1 and CDR2 that reduces binding with HSPG to impart tissue specificity. Using this light chain variable region, In the established anti-Ras GTP iMab, a significant reduction in yield was observed when the RGD circular peptide fusion occurred. Thus, the CDR of the heavy chain variable region (VH) was modified by binding to a tissue-specific light chain variable region to overcome the problem of decreasing affinity and production yield.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a strategy for selecting and constructing a library constructed based on the heavy chain variable region of RT22 for improving the affinity of anti-Ras GTP iMab for Ras GTP.
  • the existing amino acid sequence was maintained at a probability of 16.67%, and a desizing codon (VRC) was used so that an amino acid having a hydrophilic property or a negative charge could be obtained.
  • the degeneration codon (MYT) was used to increase the affinity with the antigen, considering the size and orientation of the side chain while maintaining a 25% probability.
  • the deletion codon (VST) was used to preserve or enhance the binding ability with Ras ⁇ GTP considering the size and orientation of the side chain while keeping the existing amino acid sequence at a probability of 16.67%.
  • the desaturation codon (WTK) was used so that a hydrophobic amino acid could be obtained.
  • the spiked oligomers used in Example 2 were used for residues 56 and 58 of CDR2 and residues 97 of CDR3.
  • This is a mutation method in which all amino acids can be applied while preserving the existing wild-type RT22 VH sequence at a 50% probability.
  • PCR is carried out by maintaining 79% of wild-type nucleotides at each of the three nucleotides encoding amino acid and designing the primer at the remaining nucleotide ratio of 7% It is a technology that keeps 50% of the wild type amino acid in the process.
  • yeast expressing the initial RT22-based library on the surface and the yeast secreting the cytoplasmic infiltration light chain (hT4-33 VL), which eliminated the HSPG binding ability, were ligated to the yeast surface in the form of Fab in the form of Fab.
  • the light chain variable region yeast secretion vector pYDS-K has cytoplasmic permeability and reduced HSPG binding ability
  • the pYDS-K-hT4-33 VL cloned with hT4-33 VL-encoding DNA using restriction enzymes NheI and BsiWI was transformed into YVH10 strain, which is a yeast mating ⁇ type mating ⁇ type junction
  • yeast conjugation when the absorbance at 600 nm is 1, there is 1 ⁇ 10 7 yeast.
  • the yeast expressing the heavy chain variable region library based on RT22 and the yeast containing hT4-33 VL were each mixed with 1.5 ⁇ 10 7 YPD (20 g / L Dextrose, 20 g / L peptone, 10 After washing three times with g / L yeast extract, 14.7 g / L sodium citrate, and 4.29 g / L citric acid (pH 4.5) (SIGMA), resuspension with 100 ⁇ l of YPD and drop it on the YPD plate Dry it and incubate at 30 degrees for 6 hours. Then, the yeast smear site washed with YPD medium is washed three times and cultured in a selective medium SD-CAA medium at 30 ° C. for 24 hours so that the final yeast concentration is 1 ⁇ 10 6 or less.
  • the yeast expressing the selected library was cultured in selective medium (SD-CAA + URA, 20 g / L D-glucose, 6.7 g / L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g / L Na 2 HPO 4 , 8.6 g / 2 PO 4, 5 g / L casamino acids, 0.2 mg / L Uracil) culture and SG-CAA + URA (20 g / L Galactose, 6.7 g / L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g / L Na 2 HPO from 4 , 8.6 g / L NaH 2 PO 4 , 5 g / L casamino acids, 0.2 mg / L Uracil) and then subjected to FACS screening from the first to the third.
  • selective medium SD-CAA + URA, 20 g / L D-glucose, 6.7 g / L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g / L Na 2 HPO 4 ,
  • Table 4 shows the heavy chain variable region (VH) sequences of the individual clones having seven unique amino acid sequences selected from the affinity-improving library, which is RT22-based.
  • Table 5 below shows the sequences of CDRs 1, 2 and 3 of the selected heavy chain variable regions (VH).
  • Example 7 RT22-based affinity. Expression, purification and analysis of binding activity of KRAS G12D coupled with GppNHp expression of improved anti-Ras GTP iMabs
  • the heavy chain variable region selected from the RT22-based library was cloned into a heavy chain animal expression vector in the same manner as in Example 4, transiently transfected into a cytoplasmic permeable humanized light chain expression vector and HEK293F protein expressing vector, And purified in the same manner as in Example 4.
  • cysteine was included in the CDR2 sequence.
  • the above RT22-based affinity heavy chain variable region was combined with a light chain variable region (hT4-i33 VL: SEQ ID NO: 38) in which the HGG binding ability inhibition form in which the RGD circular peptide was fused and the endosomal elimination ability was introduced into CDR3 through WYW mutation introduction Lt; / RTI >
  • a description of the light chain variable region (hT4-i33 VL) with reduced binding to HSPG of SEQ ID NO: 38 and imparted tissue specificity is described in detail below.
  • anti-Ras GTP iMabs having the same affinity as RT22-i33 used as a template showed a low production yield of 1 mg per L as in Example 3.
  • FIG. 5A shows the results of the RT-based affinity-enhanced heavy chain variable regions (VH) after the anti-Ras GTP iMab purification combined with the light chain variable region (hT4-i33) in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability were inhibited, And 12% SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the molecular weight of about 150 kDa was confirmed under non-reducing conditions and the molecular weight of the heavy chain of 50 kDa and the light chain of 25 kDa were shown under reducing conditions. It was confirmed that the individual purified clones present as a single body in a solution state and did not form a dendritic or oligomer through an unnatural disulfide bond.
  • FIG. 5b shows the results of immunohistochemical staining of anti-Ras (hT4-i33) in combination with the light chain variable region (RT31 VH, RT33 VH, RT34 VH) in which the RT22-based affinity was improved and the light chain variable region (hT4-i33) in which the integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability were inhibited
  • RT31 VH, RT33 VH, RT34 VH the light chain variable region
  • hT4-i33 the light chain variable region in which the integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability were inhibited
  • each anti-Ras GTP iMab and 1, 10, 100 nM Avi-KRas G12D GppNHp or 100 nM Avi-KRas G12D and GDP were analyzed by ELISA.
  • RT11 as an anti-Ras GTP iMab and RT22-i33 as a library template were used as a control group.
  • Five affinity-enhanced iMabs fused with an RGD circular peptide were immobilized on 96-well EIA / RIA plates at a concentration of 5 ⁇ g / ml for 1 hour at room temperature and then incubated at room temperature for 10 hours with 0.1% TBST (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1% Tween 20, 5 mM MgCl 2 ) Wash three times for minutes.
  • the cells are washed with 0.1% TBST for 10 minutes and then washed three times with 4% TBSB (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4% BSA and 10 mM MgCl 2 ) for 1 hour.
  • KRAS protein bound to GppNHp was diluted with 4% TBSB at various concentrations of 100 nM, 10 nM, and 1 nM.
  • the KRAS protein bound to GDP was diluted to 100 nM with 1% TBSB and incubated at room temperature for 1 hour. And washed three times for minutes. (HRP-conjugated anti-his mAb) conjugated with HRP as a labeling antibody.
  • TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • FIG. 5c is a graph showing the results of immunohistochemistry showing the anti-Ras (anti-Ras) activity in combination with the light chain variable region (RT31 VH, RT36 VH, RT37 VH) with improved RT22-based affinity and the light chain variable region (hT4-i33) in which integrin target circular peptide fusion and HSPG-
  • RT31 VH, RT36 VH, RT37 VH the light chain variable region
  • hT4-i33 the light chain variable region in which integrin target circular peptide fusion and HSPG-
  • each anti-Ras GTP iMab and 1, 10, 100 nM Avi-KRas G12D GppNHp or 100 nM Avi-KRas G12D and GDP were analyzed by ELISA.
  • RT11 as an anti-Ras GTP iMab and RT22-i33 as a library template were used as a control group.
  • Five affinity-enhanced iMabs fused with an RGD circular peptide were immobilized on 96-well EIA / RIA plates at a concentration of 5 ⁇ g / ml for 1 hour at room temperature and then incubated at room temperature for 10 hours with 0.1% TBST (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1% Tween 20, 5 mM MgCl 2 ) Wash three times for minutes.
  • the cells are washed with 0.1% TBST for 10 minutes and then washed three times with 4% TBSB (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4% BSA and 10 mM MgCl 2 ) for 1 hour.
  • KRAS protein bound to GppNHp was diluted with 4% TBSB at various concentrations of 100 nM, 10 nM, and 1 nM.
  • the KRAS protein bound to GDP was diluted to 100 nM with 1% TBSB and incubated at room temperature for 1 hour. And washed three times for minutes. (HRP-conjugated anti-his mAb) conjugated with HRP as a labeling antibody.
  • TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • RT33-i33, RT34-i33 and RT36-i33 were diluted in 10 mM Na-acetate buffer (pH 4.0), and the CM5 sensor chip (GE healthcare) with approximately 1600 response units (RU).
  • Tris buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.01% Tween 20) was analyzed at a flow rate of 30 ⁇ l / min and KRp G12D bound with GppNHp was incubated at a concentration of 6.25 nM Respectively.
  • CM5 chip After the binding and dissociation analysis, regeneration of the CM5 chip was performed by flowing the buffer solution (20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0) at a flow rate of 30 ⁇ l / min for 1.5 minutes. Each sensorgram obtained from 3 minutes of coupling and 3 minutes of dissociation was compared with a blank cell and normalized and subtracted to calculate affinity.
  • Table 6 shows the affinity of the improved anti-Ras GTP iMab affinity to KRas G12D combined with GppNHp using a SPR (BIACORE 2000) instrument.
  • RT31-i33, RT34-i33 and RT36-i33 which are anti-Ras GTP iMabs with improved affinity based on RT22 VH, showed higher affinity than RT22-i33.
  • Example 8 Tumor tissue cell-specific cytoplasmic infiltration and endosomal elimination ability Improved light chain variable region (VL) development logic.
  • the cytoplasmic penetration anti-Ras GTP iMab has high specific binding ability to Ras ⁇ GTP in the heavy chain variable region of cytotransmab, (VH). ≪ / RTI >
  • the cytoplasmic penetration antibody (cytotransmab) is an antibody capable of penetrating the cytoplasm by the light chain variable region (VL), and cell infiltration is initiated through binding with HSPG (heparan sulfate proteoglycan) on the cell surface.
  • HSPG heparan sulfate proteoglycan
  • CDR1 and CDR2 which are expected to contribute to HSPG binding among the light chain variable region (VL) hT4 VL of the cytotransmembrane antibody (cytotransmab), are different from that of the cationic patch of CDR1 And replaced with a CDR sequence having an amino acid sequence not including the sequence. At this time, amino acids known to be important for the stability of existing light chain variable regions were conserved.
  • the light chain variable region developed with this logic is hT4-03 (Application No. 10-2016-0065365).
  • Table 7 shows the sequences and names of the tumor cell specific cytosolic infiltration and endosomal elimination enhancing light chain variable region (hT4-33 VL) constructed using the overlapping PCR technique.
  • Example 9 Selection of circular peptides for tumor tissue-specific cell surface protein targeting and cellular internalization.
  • RT11 which is an anti-Ras GTP iMab using hT4 VL, enters the cell and binds to intracellular Ras ⁇ GTP to inhibit tumor growth, but has the disadvantage that it has HSPG-binding ability and low tumor tissue specificity.
  • the light chain with reduced HSPG binding capacity was obtained through Example 8, and the RGD10 circular peptide for targeting the integrin receptor was labeled with iMab in which the light chain variable region fused to the N-terminus was introduced Respectively.
  • EpCAM epidermal cell adhesion molecule receptor
  • EHLHCLGSLCWP Ep133 circular peptide
  • Table 8 shows sequences and names of circular peptides for tumor tissue specific cell surface protein targets and intracellular cleavage.
  • Example 10 Construction and purification of an anti-Ras GTP iMab in which a target circular peptide-fused light chain variable region (VL) was introduced into tumor tissue-specific cytoplasmic infiltration.
  • VL light chain variable region
  • Figure 6 shows the affinity-modified anti-Ras GTP iMab (RT22-i33, RT22-ep33 (SEQ ID NO: 2)) in the form of complete IgG with improved affinity, including a light chain variable region (VL) in which binding ability to integrin or EpCAM target circular peptide fusion and HSPG was inhibited ) Construction.
  • VL light chain variable region
  • VL light chain variable region
  • CL light chain constant region
  • a heavy chain variable region (RT22 VH) exhibiting specific binding activity to GTP-bound Ras and a cytoplasmic permeable humanized light chain expression vector were transiently transfected into HEK293F protein expressing cells, And purified in the same manner as in Example 4.
  • Table 9 is a table showing the yield of production of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab in which the tumor tissue-specific circular peptide contains a genetically engineered light chain variable region (VL).
  • VL light chain variable region
  • the yield of integrin or EpCAM target circular peptide fusion anti-Ras GTP iMab was significantly lowered to 1 mg / L.
  • Fig. 7 shows the results of a complete IgG-type anti-Ras GTP iMab (Fig. 7) modified with an affinity modified to include integrin or EpCAM target circular peptide fused tumor cell-specific cytoplasmic light chain variable region (VL) to KRas mutant colorectal cancer cell line SW480 (1 ⁇ M), CT-i33 MG (0.5 ⁇ M), CT-ep33 MG (1 ⁇ M), and the control cytotransmab )), And then examined for confluency with activated Ras in the cell by confocal microscopy.
  • VL tumor cell-specific cytoplasmic light chain variable region
  • SW480 cells were prepared and incubated with 1 ⁇ M RT22-33, 0.5 ⁇ M RT22-i33 MG, 1 ⁇ M RT22-ep33 MG, 1 ⁇ M CT-33, 0.5 ⁇ M CT- ep33 MG 1 ⁇ M and cultured at 37 ° C for 12 hours. Then, the cells were stained under the same conditions as in Example 4 and observed with a confocal microscope.
  • CT-33, CT-i33 MG and CT-ep33 MG which do not target intracellular Ras it was confirmed that intracellular Ras and fluorescence do not overlap.
  • the production yield of the circular peptide fusion did not decrease in the light chain variable region (hT4-3 VL) exhibiting the HSPG binding ability but the light chain variable region (hT4-33 VL) (RGD10, Ep133) and the light chain variable region (VL), which greatly influences the HSPG binding ability, in order to improve the production yield when fused with the tumor tissue specific recognition circular peptide (RGD10, Ep133) Of CDR1 and CDR2 were improved.
  • a phenylalanine residue at number 27c which is thought to affect the loop structure of the light chain variable region CDR1 of hT4 VL, is conserved in a light chain variable region with reduced HSPG binding ability
  • Leucine mutations were common, and mutations were made in residues 27f to 30, which are located at the tip of the CDR1 loop structure due to canonical structure and are expected to be exposed to the side chain.
  • hT4 VL was used as a template to give point mutation at residue 27c which is thought to affect the loop structure of CDR1 among CDR1 and CDR2 in the light chain variable region.
  • hT4-35, hT4-36, and hT4-37 VL were mutated according to their respective strategies using hT4-33 VL as a template with greatly reduced HSPG binding capacity.
  • aspartate residues 27d and 27f of CDR1 were mutated to asparagine and arginine, which are conserved in hT4 VL, respectively.
  • arginine 27f and lysine 29, in which the yield was increased when the hT4 VL sequence was maintained and hT4- 33 VL sequence Glycine, and 31 asparagine was also designed to minimize HSPG binding ability by mutating threonine present in the hT4-33 VL sequence.
  • arginine 27f and lysine 30 are preserved while threonine 28 is used as aspartate, arginine 29 is used (Arginine) was constructed to reduce HSPG binding capacity as much as possible using the sequence conserved in hT4-33 VL as glycine.
  • VL light chain variable region
  • Example 13 Improvement of production yield and tumor tissue cell specific cytoplasmic penetration Identification of HSPG binding ability of tumor tissue-specific anti-Ras GTP iMab into which a mutant of light chain variable region (VL) CDR1, CDR2 was introduced
  • the HSPG binding ability of the anti-Ras GTP iMab in which the mutant of the light chain variable region (VL) CDR1 and CDR2 was introduced for the improvement of the production yield and inhibition of HSPG binding ability constructed in Example 12 was compared with that of the Cytotransmab (TMab4 ) Was observed using a confocal microscope and a cell-based ELISA.
  • FIG. 8A shows that the HSPG binding ability and cytoplasmic permeability of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab including the light chain variable region introduced with the CDR1 and CDR2 mutations for the improvement of production yield and HSPG binding ability were decreased or eliminated.
  • a HeLa cell line expressing HSPG was added to a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells per well in 0.5 ml of a medium containing 10% FBS and cultured for 12 hours at 5% CO 2 at 37 ° C.
  • PBS, TMab4, RT22-33, RT22-34, RT22-35, RT22-36, RT22-37, RT22-38, RT22-39, CT-33, CT- mu M was incubated at 37 DEG C for 6 hours. After washing with PBS and weakly acidic solution, cells were fixed, perforated, and blocked in the same manner as in Example 4.
  • Each antibody was stained with an antibody that specifically recognizes human Fc to which Alexa488 (green fluorescence) is linked. The nuclei were stained (blue fluorescence) using Hoechst 33342 and observed with a confocal microscope.
  • FIG. 8B is a graph showing the HSPG binding ability of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab including a light chain variable region in which CDR1 and CDR2 mutations were introduced for improving production yield and inhibiting HSPG binding ability.
  • CDR1 and CDR2 mutations were introduced for improving production yield and inhibiting HSPG binding ability.
  • the HeLa (HSPG +) cell line is cultured in a 96-well plate so that cells are filled in the entire well bottom, and then washed three times with a washing buffer (HBSS buffer, 50 mM HEPES). Then, TMab4, RT22-33, RT22-34, RT22-35, RT22-36, RT22-37, RT22-38, RT22-39, CT- 33, CT-38, and CT-39 were diluted to 100, 50, 25, 12.5, 6.25, and 3.125 ng / ml and cultured at 4 degrees for 2 hours. After washing three times with washing buffer, HRP-conjugated anti-human mAb is bound to the labeled antibody. TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • Figure 8C shows that HSPG binding ability of an anti-Ras GTP iMab containing a light chain variable region introduced with CDR1, CDR2 mutation for improvement of production yield and inhibition of HSPG binding ability was confirmed by treating 500 nM of antibody with HeLa cell line, And analyzed by FACS.
  • HeLa (HSPG +) cells are prepared for each sample. Cells were incubated at 4 ° C for 1 hour with 500 nM of TMab4, RT22-33, RT22-34, RT22-35, RT22-36, RT22-37, RT22-38 and RT22-39 in PBSF (PBS buffer, Lt; / RTI > Each antibody was then reacted with antibodies specific for human Fc to which Alexa488 (green fluorescence) was linked for 30 minutes at 4 ° C.
  • PBSF PBS buffer, Lt; / RTI &gt
  • TMab4 After washing with PBS and analyzed by flow cytometry, TMab4, RT22-34, RT22-38, RT22-36, RT22-39, RT22-37, RT22-35, RT22-33 The fluorescence intensity of binding to the cells was measured.
  • Example 14 Improvement of Production Yield and Tumor Tissue Cell-Specific Cytoplasmic Infiltration Expression and Purification of Tumor Tissue-Specific Anti-Ras GTP iMab into which a Mutant of Light Chain Variable Region (VL) CDR1, CDR2 was Introduced
  • VL Light Chain Variable Region
  • the RGD circular peptide or Ep133 circular peptide was genetically engineered using a MG linker to the mutant light chain variable region (VL) for enhancing the production yield upon tumor cell-specific cytoplasmic penetration and circular peptide fusion Lt; / RTI >
  • Table 11 is a sequence of enhancing production yield and tumor cell specific cytoplasmic penetration light chain variable region (VL) fused with integrin target circular peptides.
  • VL light chain variable region
  • Example 4 a light chain expression vector containing a light chain variable region including CDR1 and CDR2 mutations for enhancing fusion and production yield of integrin target circular peptide for imparting tumor tissue specificity to the RT22 heavy chain animal vector was transfected with HEK293F protein expressing cells (Transient transfection), and then the tablets were purified in the same manner as in Example 4.
  • RT22-i35 MG, RT22-i37 MG, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep37 MG and RT22-ep38 MG were added to 10 mM NaAc buffer (pH 4.0) / ml and immobilized about 1800 response units (RU) in a CM5 sensor chip (GE healthcare).
  • Tris buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.01% Tween 20) was analyzed at a flow rate of 30 ⁇ l / min and GppNHp was detected at 50 nM for the bound GST- 3.125 nM.
  • CM5 chip after binding and dissociation analysis was performed by flowing buffer (20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0) at a flow rate of 30 ⁇ l / min for 1 minute. Each sensorgram obtained from 3 minutes of coupling and 3 minutes of dissociation was compared with a blank cell and normalized and subtracted to calculate affinity.
  • Table 13 summarizes the light chain (hT4-i34 MG to hT4-i39 MG and hT4-ep34 MG to hT4-ep39, to which hT4-i33 and hT4-ep33 were introduced and mutants of CDR1 and CDR2 were introduced to improve production yield and inhibit HSPG binding ability )
  • hT4-i34 MG to hT4-i39 MG and hT4-ep34 MG to hT4-ep39 to which hT4-i33 and hT4-ep33 were introduced and mutants of CDR1 and CDR2 were introduced to improve production yield and inhibit HSPG binding ability
  • Example 15 Improvement of Production Yield and Tumor Tissue Cell-Specific Cytoplasmic Penetration Analysis of Binding Ability to KRas G12D Binding GTPNHp of Tumor Tissue Specific Anti-Ras GTP iMab Incorporated with Mutants of Light Chain Variable Region (VL) CDR1, CDR2 .
  • VL Light Chain Variable Region
  • FIG. 9A shows the results of immunohistochemical staining for anti-Ras GTP iMab containing 1, 10, 100 nM Avi-KRas G12D (hT4-i33 MG to hT4-i37 MG VL) containing integrin target circular peptide fusion and tumor cell specific cytotoxic light chain variable region ⁇
  • the binding ability of GppNHp or 100 nM to Avi-KRas G12D and GDP was analyzed by ELISA.
  • the heavy chain variable region binding to GppNHp was fixed at RT22 VH to RT11, RT22-i33 MG, RT22-i34 MG, RT22-i35 MG and RT22-i36 MG , And RT22-i37 MG.
  • ELISA was performed in the same manner as in Example 4.
  • Tumor tissue-specific anti-Ras GTP iMabs having light chains in which the CDR1 and CDR2 mutations were introduced were immobilized on 96-well EIA / RIA plates and then GppNHp bound KRAS protein was bound to HRP-conjugated anti-his mAb at various concentrations of 100 nM, 10 nM, and 1 nM, followed by conjugation of 100 nM of KRAS protein bound to GDP and HRP-conjugated anti- .
  • TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • Fig. 9b shows the results of immunohistochemical staining for anti-Ras GTP iMab and cytotransmab of 1, 10, and 100 nM Avi-I, including the light chain variable region (hT4-i38 MG to hT4-i39 MG VL)
  • the binding ability of KRas G12D ⁇ GppNHp or 100 nM to Avi-KRas G12D ⁇ GDP was analyzed by ELISA.
  • ELISA was performed in the same manner as in Example 4.
  • Tumor tissue specific anti-Ras GTP iMab and cytotransmabs each having a light chain in which the CDR1 and CDR2 mutations were introduced were immobilized on a 96-well EIA / RIA plate and GppNHp HRP-conjugated anti-His mAb (HRP-conjugated anti-His mAb) conjugated with various concentrations of 100 nM, 10 nM and 1 nM of bound KRas protein and 100 nM of KRAS protein bound to GDP ).
  • TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • FIG. 9c shows anti-Ras GTP iMab and cytotransmabs containing a light chain variable region (VL) in which the ability to bind integrin or EpCAM target circular peptide fusion and HSPG was inhibited to the KRas mutant colorectal cancer cell line SW480 was incubated at a concentration of 0.5 ⁇ M at 37 ° C Confirmation of overlapping with activated Ras after intracellular time treatment was confirmed by confocal microscopy.
  • VL light chain variable region
  • Example 16 Construction of a light chain variable region (VL) mutant with improved antibody backbone for improved production yield
  • the yield of the light chain variable region (VL) CDR1 mutants constructed in Example 12 was increased when a circular peptide for tumor tissue specificity was added compared to the existing hT4-33, the Ep133 circular peptide having the best yield (RT22-ep38 MG, RT22-ep39 MG) was twice as low as that of the RGD10 circular peptide-conjugated antibody (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG).
  • mutants of the additional light chain variable region (VL) antibody backbone were constructed to increase stability and achieve higher yields in the Ep133 circular peptide-conjugated antibody.
  • Table 14 below shows the light chain variable (VL) with improved antibody backbone to improve production yield by fusing the light chain variable region (VL) and the EpCAM target circular peptide to improve the production yield based on hT4-38 and hT4-39 Is the sequence information of the region (VL).
  • Example 17 Expression and purification of tumor-specific anti-Ras GTP iMab into which a light chain variable region (VL) mutant with an improved antibody backbone was introduced to improve production yield
  • Example 10 In the same manner as in Example 10, a light chain expression vector containing an RT22 heavy chain expression vector and a light chain variable region having an improved antibody skeleton for enhancing EpCAM target circular peptide fusion and production yield for tumor tissue specificity was transfected with HEK293F protein expression Cells were simultaneously transiently transfected. Thereafter, the tablets were purified in the same manner as in Example 4.
  • RT22-ep58 MG and RT22-ep59 MG were diluted to 20 ⁇ l / ml in 10 mM NaAc buffer (pH 4.0) and immobilized in a CM5 sensor chip (GE healthcare) with about 1800 response units (RU).
  • Tris buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.01% Tween 20) was analyzed at a flow rate of 30 ⁇ l / min and GppNHp was detected at 50 nM for the bound GST- 3.125 nM.
  • CM5 chip after binding and dissociation analysis was performed by flowing buffer (20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0) at a flow rate of 30 ⁇ l / min for 1 minute. Each sensorgram obtained from 3 minutes of coupling and 3 minutes of dissociation was compared with a blank cell and normalized and subtracted to calculate affinity.
  • Table 15 shows the expression of light chain (hT4-ep58 MG, hT4-ep59 MG) in which the mutation of the antibody backbone moiety was introduced to enhance the EpCAM target circular peptide fusion and production yield for tumor tissue specificity together with the RT22 heavy chain And the affinity of cytotransmab production yield and SPR (BIACORE2000) for tumor-specific anti-Ras GTP iMab when expressed together with anti-Ras GTP iMab and TMab4 heavy chain at the same time to be.
  • RT22-ep59 MG which is a tumor tissue-specific anti-Ras GTP iMab in which a mutant of light chain variable region (VL) CDR1 and CDR2 for improving production yield was introduced, GpnHp coupled KRas G12D was not changed.
  • VL light chain variable region
  • FIG. 10A shows the results of immunohistochemistry of anti-Ras GTP iMab containing light chain variable region (hT4-ep58 MG to hT4-ep59 MG VL) in which the antibody backbone portion was modified to improve the EpCAM target circular peptide fusion and production yield.
  • Avi-KRas G12D ⁇ shows the result of analyzing the binding between the Avi-KRas G12D ⁇ GDP by ELISA of GppNHp or 100 nM.
  • ELISA was performed in the same manner as in Example 4.
  • Tumor tissue-specific anti-Ras GTP iMabs having light chains in which the CDR1 and CDR2 mutations were introduced were immobilized on 96-well EIA / RIA plates and then GppNHp bound KRAS protein was bound to HRP-conjugated anti-his mAb at various concentrations of 100 nM, 10 nM, and 1 nM, followed by conjugation of 100 nM of KRAS protein bound to GDP and HRP-conjugated anti- .
  • TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • FIG. 10B shows the results of immunohistochemical staining for anti-Ras and anti-Ras antibodies including the light chain (hT4-58, hT4-59) in which the antibody skeletal part was modified to improve the production yield of EpCAM target circular peptide fusion and hT4-38 and hT4-39 based on the KRas mutant colorectal cancer cell line SW480 GTP iMab (RT22-ep58, RT22-ep59) was treated with 1 ⁇ M concentration at 37 ° C for 12 hours and then examined for confluency with activated Ras cells by confocal microscopy.
  • SW480 GTP iMab RT22-ep58, RT22-ep59
  • the SW480 cell line was diluted to 2 x 10 4 cells per well in a 24-well plate and diluted to 0.5 ml.
  • the cells were cultured for 12 hours at 37 ° C in 5% CO 2.
  • the medium was removed, washed with PBS, and proteins attached to the cell surface were removed with a weakly acidic solution (200 mM glycine, 150 mM NaCl pH 2.5).
  • the nuclei were stained (blue fluorescence) using Hoechst 33342 and the KRas-labeled antibody was observed with a staining (red fluorescence) confocal microscope. All anti-Ras GTP iMabs except CT-ep59 were found to overlap with intracellular Ras and glare.
  • the HSPG binding ability of the introduced anti-Ras GTP iMab and cytotransmab in which the light chain variable region (VL) mutant with the improved antibody backbone was introduced was higher than that of the Cytotransmab (TMab4) using a confocal microscope and a cell-based ELISA.
  • Figure 11a shows the effect of reducing or eliminating the HSPG binding capacity and cytoplasmic permeability of the anti-Ras GTP iMab and cytotransmab containing the light chain variable region introduced with the CDR1, CDR2 mutation for the improvement of production yield and inhibition of HSPG binding, (HeLa cells) for 6 hours and confirmed by confocal microscopy and Alexa488 (green fluorescence) fluorescence.
  • a HeLa cell line expressing HSPG was added to a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells per well in 0.5 ml of a medium containing 10% FBS and cultured for 12 hours at 5% CO 2 at 37 ° C.
  • 1 ⁇ M of PBS, TMab4, Avastin, RT22-58, RT22-59, CT-58, CT-59 was incubated at 37 degrees for 6 hours.
  • cells were fixed, perforated, and blocked in the same manner as in Example 4.
  • Each antibody was stained with an antibody that specifically recognizes human Fc to which Alexa488 (green fluorescence) is linked. The nuclei were stained (blue fluorescence) using Hoechst 33342 and observed with a confocal microscope.
  • FIG. 11B shows the effect of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab on HSPG binding capacity including light chain variable region introduced with CDR1, CDR2 mutation for improvement of production yield and inhibition of HSPG binding ability.
  • Surface binding ELISA In order to confirm the HSPG binding ability of HSPG, Surface binding ELISA.
  • the HeLa (HSPG +) cell line is cultured in a 96-well plate so that cells are filled in the entire well bottom, and then washed three times with a washing buffer (HBSS buffer, 50 mM HEPES). Then, PBS, TMab4, Avastin, RT22-58, RT22-59, CT-58, and CT-59 were added to the blocking buffer (HBSS buffer, 50 mM HEPES, 1% BSA) at 100, 50, 25, 12.5, 3.125 ng / ml, and cultured at 4 ° C for 2 hours. After washing three times with washing buffer, HRP-conjugated anti-human mAb is bound to the labeled antibody. TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • FIG. 11C shows that HSPG binding ability of anti-Ras GTP iMab and cytotransmab containing light chain variable region introduced with CDR1, CDR2 mutation for production yield enhancement and inhibition of HSPG binding ability was examined by treating 500 nM of antibody with HeLa cell line And then analyzed by FACS.
  • HeLa (HSPG +) cells are prepared for each sample.
  • Cells were incubated with TMAB4, Avastin, RT22-58, RT22-59, CT-58, and CT-59 500 nM in PBSF (PBS buffer, 2% BSA) for 1 hour at 4 ° C.
  • PBSF PBS buffer, 2% BSA
  • Alexa488 green fluorescence
  • the cells were analyzed by flow cytometry. Fluorescence intensities were measured in the order of TMab4, RT22-58, CT-58, CT-59 and RT22-59 with the same tendency as confocal microscopy results.
  • VL light chain variable region
  • Example 19 RT-based affinity-enhanced Ras GTP-specific heavy chain variable region (VH) and tumor tissue-specific cytoplasmic infiltration and production Tumor tissue-specific anti-Ras / Expression and purification of GTP iMab
  • a light chain expression vector containing an integrin or EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability inhibition and production yield improved light chain expression vector for imparting tumor tissue specificity to the RT31, RT36, and RT37 heavy chain expression vectors
  • Transient transfection was performed simultaneously with HEK293F protein expressing cells. Thereafter, the tablets were purified in the same manner as in Example 4.
  • tumor-specific anti-Ras GTP iMabs with a light chain variable region introduced with integrin or EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability inhibition and production yield improved for RT31, RT36, RT37 heavy chain expression vector and tumor tissue specificity The quantitative affinities of KRp G12D bound with GppNHp were analyzed using a BIACORE2000 instrument.
  • RT31-i37 MG, RT31-ep37 MG, RT36-i37 MG, RT36-i38 MG, RT36-i39 MG, RT36-ep37 MG, RT36- 4.0 with a concentration of 20 ⁇ l / ml and immobilized approximately 1800 response units (RU) in a CM5 sensor chip (GE healthcare).
  • Tris buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.01% Tween 20) was analyzed at a flow rate of 30 ⁇ l / min and GppNHp was detected at 50 nM for the bound GST- 3.125 nM.
  • CM5 chip after binding and dissociation analysis was performed by flowing buffer (20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0) at a flow rate of 30 ⁇ l / min for 1 minute. Each sensorgram obtained from 3 minutes of coupling and 3 minutes of dissociation was compared with a blank cell and normalized and subtracted to calculate affinity.
  • RT31-i37 MG, RT31-ep37 MG, and RT37-i37 MG with a light chain variable region (VL) mutant introduced for improved RT31 and RT37 heavy chains and improved production yield and inhibition of HSPG binding ability based on RT22 (RT36-i38 MG, RT36-i39 MG, RT36-ep58 MG, and RT36-ep58 MG) in which production yield was not improved and RT36 and production yield improvement and tumor tissue cell specific cytotoxic light chain variable region (VL) , RT36-ep59 MG) showed lower affinity for Ras and GTP when compared with RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep59 MG and RT22-ep59 MG. Therefore, the experiments were conducted using RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep58 MG and RT22-ep59 MG, which have good yields and high
  • Example 20 Confirmation of cell surface integrin or EpCAM binding ability of anti-Ras GTP iMab including integrin or EpCAM target circular peptide fusion and tumor tissue cell specific cytoplasmic penetration light chain variable region
  • FIG. 12A shows the results of FACS analysis of expression of integrin ⁇ 3 or integrin ⁇ 5 in the human colon cancer cell line SW480, LoVo, and human blood cancer cell line K562 and K562 integrin ⁇ 3 expressing cell lines.
  • SW480, LoVo, K562, and K562 ⁇ 3 cells are prepared for each sample.
  • PE-conjugated anti-integrin ⁇ 3 or PE-conjugated anti-integrin ⁇ 5 was diluted 1: 100 and cultured at 4 ° C for 1 hour. After washing with PBS and analyzed by flow cytometry, it was confirmed that ⁇ 3 antibody binds to K562 ⁇ 3 expressing cell line and ⁇ 5 antibody binds to SW480 and LoVo cells.
  • Figure 12b shows the results of the RT-immunohistochemical staining for anti-HSPG-specific tumor-specific integrin-specific anti-Ras cell penetrating antibodies (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG) (RT11-i) on the cell surface of Integrin ⁇ 3 or Integrin ⁇ 5 by FACS.
  • 1 ⁇ 10 5 SW480, LoVo, K562, and K562 ⁇ 3 cells are prepared for each sample.
  • Cells were incubated with RT11-i, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG and CT-i39 MG 500 nM in PBSF (PBS buffer, 2% BSA) for 1 hour at 4 ° C.
  • PBSF PBS buffer, 2% BSA
  • Each antibody was then reacted with antibodies specific for human Fc to which Alexa488 (green fluorescence) was linked for 30 minutes at 4 ° C.
  • the fluorescence intensity of RT11-i, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG and CT-i39 MG antibodies were bound to SW480, LoVo and K562 ⁇ 3 cells expressing ⁇ 3 or ⁇ 5 Respectively.
  • FIG. 12C shows the results of experiments in which expression of EpCAM was confirmed by FACS in human colorectal cancer cell line SW480, LoVo and human cervical cancer cell line HeLa.
  • FIG. 12d shows the results of cell surface EpCAM of tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras cell penetration antibody (RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG) with HSPG binding ability removed including heavy chain (RT22) with improved affinity for Ras GTP The binding capacity was confirmed by FACS.
  • SW480, LoVo, and HeLa cells are prepared for each sample.
  • Cells were incubated with RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG and CT-ep59 MG 500 nM in PBSF (PBS buffer, 2% BSA) for 1 hour at 4 ° C.
  • PBSF PBS buffer, 2% BSA
  • Alexa488 green fluorescence
  • fluorescence intensity of RT22-ep59 MG, RT22-ep59 MG and CT-ep59 MG antibody was measured in SW480, LoVo cells expressing EpCAM.
  • Example 21 Enhancement of Production Yield and Tumor Tissue Cell Specific Cell Cytoplasm Attachment of tumor tissue specific anti-Ras GTP iMab combined with heavy chain variable region with improved affinity for light chain variable region (VL) and Ras GTP Assessment of sexual cell growth inhibition
  • Figure 13a shows the results of treatment of 0.5 ⁇ M of anti-Ras GTP iMab in combination with an enhancement of integrin target circular peptide fusion and production yields and tumor cell specific cytotoxic light chain variable regions in various Ras mutants and wild type cell lines at 37 ° C for 48 hours It is a graph that confirms cell growth inhibition through WST assay.
  • 1x10 4 cell lines per well were diluted in 0.2 ml of medium containing 10% FBS, and cultured in a 96-well plate for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 . Then, 0.5 ⁇ M of TMab4-i, RT11-i, RT22-i38 MG and RT22-i39 MG were treated for 48 hours and then 10 ⁇ l of WST solution (Dojindo) was added and the absorbance at 450 nm was quantified.
  • WST solution Dojindo
  • RT22-i38 MG and RT22-i39 MG showed significant inhibitory effect on cell growth than the anti-Ras GTP iMab RT11-i, which was used as a control.
  • anti-Ras GTP iMabs compared to the cytotransmab (TMab4-i), which had no Ras inhibitory effect, used as a control in the wild type cell line Colo320DM.
  • Fig. 13B shows that anti-Ras GTP iMab 1 [mu] M combined with the light chain variable region in which the EpCAM target circular peptide improved fusion yield and HSPG binding ability was inhibited in several Ras mutants and wild type cell lines was incubated at 37 [deg.] C for 48 hours, Growth inhibition was confirmed by WST assay.
  • RT22-ep58 MG and RT22-ep59 MG in the Ras mutant cell line expressing various EpCAMs showed significant inhibitory effect on the cell growth inhibition as compared with the control anti-Ras GTP iMab RT11 used as the control group.
  • the control anti-Ras GTP iMab RT11 used as the control group.
  • RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep58 MG and RT22-ep59 MG were all specific for Ras mutant cell line in vitro compared with the existing anti-Ras GTP (RT11, RT11- Cell growth inhibitory effect was improved. Then, in order to confirm whether or not the in vivo animal model has the effect of suppressing the tumor growth of gastric antibodies, the experiment is carried out.
  • Example 22 Confirmation of enhanced tumor growth inhibition of tumor tissue integrin-specific anti-Ras GTP iMab
  • Fig. 14A is a graph showing the effect of the anti-Ras cell penetration antibody (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG) and HSPG-binding ability of the integrin target circular peptide fusion and RTN-i39 MG in the xenograft transplantation of the human colorectal cancer KRas mutant cell line LoVo and SW480, (RT11-i) fused with a circular peptide at a concentration of 20 mg / kg, administered intravenously every other day for 9 times.
  • RT22-i38 MG anti-Ras cell penetration antibody
  • HSPG-binding ability of the integrin target circular peptide fusion and RTN-i39 MG in the xenograft transplantation of the human colorectal cancer KRas mutant cell line LoVo and SW480, (RT11-i) fused with a circular peptide at a concentration of 20 mg / kg, administered intravenously every other day for 9 times.
  • FIG. 14B is a graph showing the tumor weight and a tumor photograph taken after tumor treatment with anti-Ras cell penetration antibody treatment in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 14C is a graph showing the weight of a mouse to confirm nonspecific adverse effects of anti-Ras cell penetrating antibodies in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • the tumor tissue integrin-specific anti-Ras GTP iMab which has improved affinity and eliminates HSPG binding ability, is compared with conventional tumor-specific integrin-specific anti-Ras GTP iMab RT11-i.
  • KR4 G12V mutant human colorectal cancer cell line SW480 in BALB / c nude mice was treated with 5 ⁇ 10 6 cells per mouse in KRAS G13D mutant human colorectal cancer cell line LoVo was injected subcutaneously with 2 x 10 6 cells per mouse.
  • RT11-i, RT22-i38 MG and RT22-i39 MG inhibited the growth of cancer cells compared with CT-i39 MG as the control group and RT22-i38 MG and RT22-i39 MG inhibited tumor growth more effectively.
  • Tumor growth inhibition was quantified by CT-i39 (0%), RT11-i (46%), RT22-i38 (59.7%) and RT22-i39 (69.8%).
  • CT-i39 (0%), RT11-i (38.1%), RT22-i38 (47.1%) and RT22-i39 (68.2%) were found as tumor growth inhibition rates by the weight of the tumor removed .
  • 15A shows the tumor growth inhibitory effect of anti-Ras cell penetrating antibody (RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG) in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability were removed in xenografts of human colon cancer cell lines LoVo and SW480 20 mg / kg, intravenously, and every other day for 9 times.
  • anti-Ras cell penetrating antibody RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG
  • FIG. 15B is a graph showing the tumor weight and a tumor photograph taken after the treatment of anti-Ras cell penetrating antibody treated with EpCAM target circular peptide fusion and HSPG-binding ability removed.
  • FIG. 15C is a graph showing the weight of a rat to confirm non-specific adverse effects of anti-Ras cell penetrating antibodies in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • mice were treated with KRAS G12V mutant human colon cancer cell line SW480 was injected at 5 ⁇ 10 6 cells per mouse, and KRV G13D mutant human colorectal cancer cell line LoVo was injected at 2 ⁇ 10 6 cells per mouse by subcutaneous injection.
  • the tumor volume was about 50-80 mm 3
  • the same volume of PBS vehicle control and control CT-ep59 MG, RT22-ep59 MG and RT22-ep59 MG were intravenously injected at 20 mg / kg. Intravenous injections were performed at intervals of 2 days, and the tumor volume was measured using a caliper for 18 days.
  • RT22-ep58 MG and RT22-ep59 MG inhibited cancer cell growth compared with CT-ep59 MG as the control group. Quantitative inhibition of tumor growth was confirmed by CT-ep59 (16.2%), RT22-ep58 (49.2%) and RT22-ep59 (75.4%) compared to the vehicle.
  • CT-ep59 (8.1%), RT22-ep58 (47.3%) and RT22-ep59 (70.2%) were found as tumor growth inhibition rates based on the weight of the tumor removed.
  • Example 24 Confirmation of tumor growth inhibition according to dose, administration interval and route of administration of tumor-specific integrin-specific anti-Ras GTP iMab
  • FIG. 16A shows the effect of the integrin target circular peptide fusion and the anti-Ras cell penetrating antibody (RT22-i39 MG) with HSPG binding ability removed in the mouse transplanted with the human colorectal cancer KRas mutant cell line LoVo This is the result of comparing tumor growth inhibition effect.
  • FIG. 16B is a graph showing the tumor weight and a tumor photograph taken after tumor treatment with anti-Ras cell penetrating antibody treatment in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • FIG. 16C is a graph showing the weight of a rat to confirm nonspecific adverse effects of anti-Ras cell penetrating antibodies in which integrin target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • RT22-i39 MG which is a tumor-specific integrin-specific anti-Ras GTP iMab, which has improved affinity in vivo and HSPG binding ability
  • mice were injected with 2 ⁇ 10 6 LoVo cells, a KRas G13D mutant human colorectal cancer cell line, into each mouse by subcutaneous injection.
  • the experimental group RT22-i39 MG was 5, 10, 20 mg / kg injected intravenously or intraperitoneally, when mm is the third degree.
  • Six injections were performed at intervals of 2 days, 9 times or twice a week, and the tumor volume was measured using a caliper for 18 days.
  • RT22-i39 MG showed inhibition of cancer cell growth compared with CT-i39 MG as the control group.
  • Tumor growth inhibition was found to be 20 mg / kg iv biweekly (-2.8%) compared to vehicle, RT22-i39 20 mg / kg biweekly (-2.8%) compared to the vehicle, kg iv iv biweekly (65.3%), CT-i39 20 mg / kg ip (-5.8%), RT22-i39 20 mg / kg ip 70.4%, RT22-i39 10 mg / kg ip 72.4% kg iv (66.9%), and RT22-i39 5 mg / kg iv (64.3%).
  • tumor growth inhibition rate was calculated by the weight of the extracted tumor.
  • CT-i39 20 mg / kg iv biweekly (4.5%), RT22-i39 20 mg / kg iv biweekly (65.7% (70.6%), RT22-i39 10 mg / kg iv (72.5%), RT22-i39 5 mg / kg iv (70.6%), RT22- ).
  • Example 25 Tumor Tissue EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab assay for tumor growth inhibition according to dose, administration interval, and route of administration
  • FIG. 17A shows the effect of the anti-Ras cell penetration antibody (RT22-ep59 MG) with the EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability removed in xenotransplanted human colorectal cancer KRas mutant cell line LoVo according to the dose, This is the result of comparing tumor growth inhibition effect.
  • FIG. 17B is a graph showing the tumor weight and the obtained tumor photograph after the tumor was removed after the anti-Ras cell penetrating antibody treatment in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability were removed.
  • FIG. 17C is a graph showing the weight of a rat to confirm non-specific adverse effects of anti-Ras cell penetrating antibodies in which EpCAM target circular peptide fusion and HSPG binding ability are removed.
  • RT22-ep59 MG was found to inhibit cancer cell growth compared with the control group CT-ep59 MG.
  • Tumor growth inhibition rate was 20 mg / kg iv biweekly (3.7%), RT22-ep59 20 mg / kg, CT-ep59 compared to vehicle, and the tumor growth inhibition rate RT 22-ep59 10 mg / kg ip (78.8%), RT22-ep59 10 mg / kg ip (76%), RT22-ep59 10 mg / kg iv (75%) and RT22-ep59 5 mg / kg iv (77.8%).
  • the tumor growth inhibition rate was calculated by the weight of the extracted tumor.
  • Example 26 Design and expression of heavy chain modified mutants to improve intracellular stability, persistence in body and tumor tissue targeting ability of anti-Ras GTP iMab ⁇ Purification
  • Proteins in the cytoplasm are generally degraded by the ubiquitin-proteasome mechanism.
  • antibodies in the cytoplasm of a complete immunoglobulin-type antibody bind to the TRIM21 E3 ligase and are degraded by the ubiquitin-proteasome mechanism, and when the mutation is introduced into the CH3 region N434 amino acid of the antibody binding to TRIM21, do. Therefore, in order to improve the intracellular stability of the anti-Ras GTP iMab, a complete immunoglobulin type antibody, a variant in which the N434D mutation was introduced in the CH3 region was constructed.
  • the heavy chain expression vector (RT22 IgG1 N434D) and the cytoplasmic penetration humanized light chain expression vector (hT4-ep59 MG LC) of the anti-Ras GTP iMab with improved stability in the cytoplasm were introduced into HEK293F protein expressing cells At the same time, transient transfection was performed to express an anti-Ras GTP iMab mutation with improved cytoplasmic stability.
  • the immunoglobulin type antibody binds to the Fc receptor of the immune cells and can be removed through the ADCC mechanism.
  • IgG2 and IgG4 among the IgG subclasses are weakly bound to the Fc gamma receptor. Therefore, in order to improve the in vivo stability of the anti-Ras GTP iMab, which is a complete immunoglobulin type IgG1 antibody, a variant incorporating the heavy chain constant region (CH1-CH3) of IgG4 was constructed. At this time, the S228P mutation was introduced into the hinge region so as to prevent the Fab-arm exchange, which is a characteristic of IgG4 in the body.
  • the heavy chain expression vector (RT22 IgG4 S228P) and the cytoplasmic penetration humanized light chain expression vector (hT4-ep59 MG LC) of the anti-Ras GTP iMab with improved persistence in the body were simultaneously administered to HEK293F protein expressing cells Transient transfection was performed to express the anti-Ras GTP iMab mutation with improved persistence in the body.
  • Table 17 below is the sequence information of the heavy chain constant region (CH1-CH3) modified to improve the intracellular stability and the in vivo persistence of the anti-Ras GTP iMab.
  • a clone that binds ep 133 peptide having an EpCAM-targeting ability at the N-terminus of the anti-Ras GTP iMab heavy chain variable region was constructed and purified.
  • a heavy chain expression vector (epRT22GS, epRT22MG, epRT22 (G4S) 2) of an anti-Ras GTP iMab having improved tumor tissue targeting ability and a cytoplasmic penetration humanized light chain expression vector (hT4-ep59Mg LC) was simultaneously transiently transfected into HEK293F protein expressing cells to express an anti-Ras GTP iMab mutation with improved tumor tissue targeting ability.
  • Table 18 below shows the heavy chain variable region sequences of the anti-Ras GTP iMab with improved tumor tissue targeting ability.
  • Table 19 is a table showing the production yield of anti-Ras GTP iMab improved in cytoplasmic stability, in vivo persistence and tumor tissue targeting ability.
  • FIG. 18A shows the results of confirming the reduction of intracellular degradation of tumor-associated EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab using an improved fractionated green fluorescent protein complement system.
  • the SW480 cell line expressing 1x10 4 SA-GFP1-10 per well was diluted in 0.1 ml of a medium containing 10% FBS in a 96-well plate and incubated for 24 hours at 37 ° C in 5% CO 2 Lt; / RTI > Subsequently, 2 ⁇ M of epRas03 MG, epRas03-GFP11-SBP2 MG, and epRas13-GFP11-SBP2 MG were treated for 6 hours and then replaced with fresh medium. After incubation for 0, 2, 4, and 6 hours, green fluorescence at excitation 485 nm and emission 528 nm wavelength was quantified using a fluorescent plate reader.
  • epRas13-GFP11-SBP2 MG having reduced cytoplasmic degradation showed 60% of green fluorescence after 6 hours, whereas epRas03-GFP11-SBP2 MG as a control group showed 5% Respectively. Green fluorescence was hardly observed in control group epRas03 MG. This confirms that epRas13 MG improves cytoplasmic stability.
  • FIG. 18B shows the result of confirming the ability of EpCAM specific anti-Ras GTP iMab to inhibit adherent cell growth in a human colon cancer cell line through a soft agar colony formation method.
  • 0.2 ml of 1.2% agarose solution and 2X RPMI + 20% FBS medium are mixed at a ratio of 1: 1 in a 24 well plate.
  • Bottom agar is solidified and 0.2 ml of 0.7% agarose solution and 2 ⁇ RPMI + 20% FBS medium containing 1 ⁇ 10 3 cells + 1 ⁇ M or 4 ⁇ M antibody are mixed at 1: 1 ratio.
  • the medium is replaced with medium containing 0.5 ⁇ M or 2 ⁇ M of antibody every 3 days. After 2-3 weeks, the colonies are stained with BCIP / NBT solution and the number of colonies larger than 200 ⁇ m is measured.
  • epRas13 MG having cytosolic stability improved in the Ras mutant cell line SW480, LoVo had an enhanced cell growth inhibitory effect than epRas03 MG used as a control group.
  • the wild type cell line, Colo320DM showed no difference compared to the cytoplasmic penetration antibody (epCT03 MG), which had no Ras inhibitory effect as a control.
  • 18c shows the result of confirming the inhibition of non-adherent cell growth in an human colon cancer cell line of the tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab with improved cytoplasmic stability through an anoikis method.
  • the ultra-low attachment (low-attchatment) then diluted with 96 well of 1x10 3 of the cell per well to the plate to the medium 0.1 ml in 0% FBS, respectively, and 48 hours with the antibody of 0.5, 2 ⁇ M concentration, 37 °, And cultured at 5% CO 2 . Then, 0.5, 2 ⁇ M antibody was further treated and incubated for 48 hours. After a total of 96 hours of culture, 50 ⁇ l of CellTiterGlo (Promega) was added to quantitate the luminescence.
  • CellTiterGlo Promega
  • epRas13 MG having cytosolic stability improved in the Ras mutant cell line SW480, LoVo had an enhanced inhibitory effect on cell growth than epRas03 MG used as a control.
  • the wild type cell line, Colo320DM showed no difference compared to the cytoplasmic penetration antibody (epCT03 MG), which had no Ras inhibitory effect as a control.
  • FIG. 18d shows the results of confirming the inhibition of non-adherent cell growth by anoikis method in a human lung cancer cell line of tumor-specific integrin-specific anti-Ras GTP iMab with improved cytoplasmic stability.
  • inRas13 which has improved cytoplasmic stability in various Ras mutant cell lines, was found to be more potent in inhibiting cell growth than inRas03 used as a control.
  • inCT03 cytoplasmic penetration antibody
  • Example 28 Evaluation of pharmacokinetics of tumor tissue having improved in vivo persistence EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab
  • FIG. 19A shows the result of 12% SDS-PAGE analysis under reducing or nonreducing conditions after purification of tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras GTP, which improves persistence in the body.
  • both epRas03 MG and epRas03 MG IgG4 showed a molecular weight of about 150 kDa under non-reducing conditions and showed a molecular weight of the heavy chain of 50 kDa and a light chain of 25 kDa under reducing conditions. It was confirmed that the individual purified clones present as a single body in a solution state and did not form a dendritic or oligomer through an unnatural disulfide bond.
  • FIG. 19B shows the pharmacokinetics of tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras GTP, which improves persistence in the body, in BALB / c nude mice.
  • BALB / c nude mice were intravenously injected with 20 mg / kg of experimental group epRas03 MG IgG4 and control group epRas03 MG. Then, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24 hours; 2, 4, 7, 14, 21 and 28, respectively. The collected blood was centrifuged at 12,000 rpm, 10 minutes, and 4 degrees, and the supernatant plasma was stored at -80 ° C. ELISA was performed to analyze the concentrations of epRas03 MG IgG4 and epRas03 MG in plasma.
  • anti-human Fab antibody (Sigma) was bound to a 96-well half-area plate (Corning) at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml for 1 hour at room temperature, Tween 20). After binding for 1 hour with 1% PBSB (PBS, pH 7.4, 1% BSA), the collected blood and purified antibody (for reference curve) were diluted in 1% PBSB and bound for 2 hours. Wash thoroughly. Then, HRP-conjugated anti-human IgG, Fc antibody (Sigma) was bound to the labeled antibody for 1 hour and then washed three times with 0.1% PBST. After reacting with TMB ELISA solution, the reaction was stopped with sulfuric acid solution, and the absorbance at 450 nm was quantified.
  • PBSB PBS, pH 7.4, 1% BSA
  • 20A is an experimental result of FACS-binding ability of anti-Ras GTP iMab epRas23 MG, which is a fusion of EpCAM target peptide to the N-terminal region of the heavy chain variable region, to enhance the tumor tissue targeting ability to cell surface EpCAM.
  • LoVo cells 1 ⁇ 10 5 LoVo cells are prepared per each sample.
  • Cells were cultured in PBSF (PBS buffer, 2% BSA) with 100 nM Ras03, epRas03 MG, and epRas23 MG for 1 hour at 4 ° C.
  • PBSF PBS buffer, 2% BSA
  • Alexa488 green fluorescence
  • FIG. 20b shows the results of immunoblot analysis of anti-Ras GTP iMab 25, 50, 100 nM Avi-KRas G12D GppNHp or 100 nM Avi-KRas G12D of EpCAM target peptide fused to the heavy chain variable region N terminus ⁇ The result of analyzing the binding ability with GDP by ELISA.
  • ELSIA was performed in the same manner as in Example 4, and anti-Ras GTP iMab epRas03 MG, epRas23 MG in which an EpCAM target peptide was fused to a heavy chain variable region N terminus in order to improve the tumor tissue targeting ability, / RIA plate, the KRAS protein bound to GppNHp at various concentrations of 100 nM, 50 nM and 25 nM, and the KRAS protein bound to GDP at a concentration of 100 nM, followed by HRP-conjugated anti-His antibody (HRP-conjugated anti-his mAb). TMB ELISA solution to determine absorbance at 450 nm.
  • 20C shows the result of confirming the inhibition of non-adherent cell growth by anoikis method in human colon cancer cell line of anti-Ras GTP iMab epRas23 MG in which EpCAM target peptide is fused to the N-terminal region of the heavy chain variable region to improve the tumor tissue targeting ability .
  • 1x10 3 LoVo, DLD-1, and HCT116 cell lines per well were diluted in a low-attatch 96-well plate to 0.1 ml of a medium containing 0% FBS, and then incubated with 0.5, 2 ⁇ M antibody 48 hours, 37 degrees, 5% CO 2 . Then, 0.5, 2 ⁇ M antibody was further treated and incubated for 48 hours. After a total of 96 hours of culture, 50 ⁇ l of CellTiterGlo (Promega) was added to quantitate the luminescence.
  • CellTiterGlo Promega
  • epRas23 MG having improved cytostatic stability in the Ras mutant cell lines LoVo, DLD-1 and HCT116 was found to be more potent in inhibiting cell growth than epRas03 MG used as a control group.
  • 20D is a graph showing the biodistribution of anti-Ras GTP iMab epRas23 MG fused with EpCAM target peptide at the N-terminus of the heavy chain variable region to improve the tumor tissue targeting ability, and quantifying the fluorescence of tumor and whole body Respectively.
  • mice were injected with 20 ⁇ g of DyLight fluorescence-labeled anti-Ras GTP iMab Ras03, epRas03 MG, and epRas23 MG, and then injected into the mouse body at 0, 6, 12, 24, Fluorescence is observed with IVIS Lumina XRMS Series III (Perkin Elmer). At this time, mice are anesthetized using 1.5-2.5% isoflurane (Piramal Critical Care). Each image was quantified by using Living Image software (Perkin Elmer).
  • epRas03 MG and epRas23 MG were found to be more abundant in tumor tissues than Ras03 not fused with EpCAM target peptide.
  • epRas23 MG was found to be more abundant in tumor tissues over time after antibody injection than epRas03 MG.
  • Figure 20E shows the biodistribution of anti-Ras GTP iMab epRas23 MG fused EpCAM target peptide to the heavy chain variable region N terminus in mice to improve the tumor tissue targeting ability, and organs were excised and fluorescence quantified Results.
  • the mouse was euthanized 72 hours after the injection of the antibody, and the tumor and the heart, lung, liver, kidney, pancreas and spleen were excised and the fluorescence from the organ was measured by Living Image software (Perkin Elmer) .
  • epRas03 MG and epRas23 MG were found to have a larger amount of antibody present in the tumor tissues and a smaller amount of antibodies present in other organs than Ras03 not fused with the EpCAM target peptide.
  • the amounts of antibodies located in tumor tissues were abundant in the order of epRas23 MG, epRas03 MG, and Ras03.
  • Example 30 Design and expression of a heavy chain modified variant to improve the persistence of anti-Ras GTP iMab in the body ⁇ Purification
  • Immunoglobulin type antibodies can be eliminated by binding to Fc receptors of the immune cells in the body through the ADCC mechanism.
  • IgG1, L234A, L235A, and P239G mutations inhibit binding of Fc gamma receptors. Therefore, in order to improve the stability of the anti-Ras GTP iMab, which is a complete immunoglobulin IgG1 antibody, L234A, L235A, and P239G mutants (LALA-PG) were introduced into the heavy chain constant region (CH1 to CH3) The mutant (IgG1 LALA-PG) was constructed.
  • a heavy chain expression vector (RT22 IgG1 LALA-PG or RT22 IgG1 LALA-PG, N434D) of an anti-Ras GTP iMab with improved persistence in the body in the same manner as in Example 4 and a cytoplasmic penetration humanized light chain expression vector (hT4-ep59 GSSG LC) was simultaneously transiently transfected into HEK293F protein expressing cells (transient transfection) to express an anti-Ras GTP iMab mutation with improved persistence in the body.
  • Table 20 below shows the sequence information of the heavy chain constant region (CH1-CH3) into which the LALA-PG mutation was introduced to improve the persistence of the anti-Ras GTP iMab in vivo.
  • Example 31 Evaluation of pharmacokinetics of LALA-PG mutants that improved the persistence of tumor tissue EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab in vivo
  • FIG. 21A shows the results of size-exclusion chromatography of the multimers of LALA-PG variants that improved the persistence of the tumor-associated EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab in vivo.
  • Figure 21B shows the pharmacokinetics of LALA-PG mutants in BALB / c nude mice, which improved the persistence of tumor-associated EpCAM-specific anti-Ras GTP iMab in vivo.
  • BALB / c nude mice were intravenously injected with 20 mg / kg of epRas03, epRas13, epRas33, and epRas83. Then, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24 hours; 2, 4, 7, 14, 21 and 28, respectively. The collected blood was centrifuged at 12,000 rpm, 10 minutes, and 4 degrees, and the supernatant plasma was stored at -80 ° C. ELISA was performed to analyze the concentrations of epRas03, epRas13, epRas33, and epRas83 in plasma.
  • the anti-human Fab antibody (Sigma) was bound to a 96-well half-area plate (Corning) at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml for 1 hour at room temperature, pH 7.4, 0.1% Tween 20). After binding for 1 hour with 1% PBSB (PBS, pH 7.4, 1% BSA), the collected blood and purified antibody (for reference curve) were diluted in 1% PBSB and bound for 2 hours. Wash thoroughly. Then, HRP-conjugated anti-human IgG, Fc antibody (Sigma) was bound to the labeled antibody for 1 hour and then washed three times with 0.1% PBST. After reacting with TMB ELISA solution, the reaction was stopped with sulfuric acid solution, and the absorbance at 450 nm was quantified.
  • epRas33 and epRas83 which introduced LALA-PG mutation had higher half-life than epRas03, and epRas13 had a half-life which was slightly smaller than epRas03.
  • GppNHp is diluted with epRas03, epRas13, epRas83, inRas03 MG, inRas13 MG, inRas83 MG to 10 mM NaAc buffer, 20 ⁇ l / ml concentration (pH 4.0) to determine the binding ability with the combined KRas G12D CM5 sensor Approximately 1800 response units (RU) were immobilized on a chip (GE healthcare).
  • Tris buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.01% Tween 20) was analyzed at a flow rate of 30 ⁇ l / min and 100 ⁇ M of GppNHp was added to the bound GST- 6.25 nM.
  • CM5 chip regeneration was performed by flowing buffer (20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0) at a flow rate of 30 ⁇ l / min for 1 minute. Each sensorgram obtained from 3 minutes of coupling and 3 minutes of dissociation was compared with a blank cell and normalized and subtracted to calculate affinity.
  • FcRn was diluted to a concentration of 20 ⁇ l / ml in 10 mM NaAc buffer (pH 4.0) to fix the FcRn with about 650 response units (RU) in a CM5 sensor chip (GE healthcare).
  • phosphate buffer (12 mM phosphate, pH 6.0, 137 mM NaCl, 0.01% Tween 20) was analyzed at a flow rate of 30 ⁇ l / min and analyzed for epRas03 at a concentration of 6.25 nM at 200 nM.
  • epRas13 epRas83 nM at a concentration of 62.5 nM.
  • Regeneration of the CM5 chip was performed after 3 minutes of 30 ⁇ l / min flow rate of phosphate buffer (12 mM phosphate, pH 7.4, 137 mM NaCl, 0.01% Tween 20). Each sensorgram obtained from 3 minutes of coupling and 6 minutes of dissociation was compared with a blank cell and normalized and subtracted to calculate affinity.
  • Table 21 shows the results of affinity analysis of KRAS G12D and FcRn in the form of integrants bound with GppNHp using SPR (BIACORE 2000) and LALA-PG mutants that improved the persistence of anti-Ras GTP iMab against FcRn.
  • Example 33 Confirmation of inhibition of tumor growth of LALA-PG mutants that improved the persistence of tumor-specific integrin-specific anti-Ras GTP iMab in vivo
  • FIG. 22A shows the results of size-exclusion chromatography to determine the content of multimers of LALA-PG mutants which improved the persistence of tumor-integrin-specific anti-Ras GTP iMab in vivo.
  • FIG. 22B is a graph showing the results of experiments comparing the tumor growth inhibitory effects of LALA-PG mutants which improved the persistence of the tumor-specific integrin-specific anti-RAS cell penetrating antibodies in the mice transplanted with human colon cancer KRas mutant cell line LS1034.
  • mice were injected with 1 x 10 7 cells of KRAS A146T mutant human colorectal cancer cell line LS1034 by subcutaneous injection into each mouse, and after about 14 days, the volume of the tumor was about 120 mm 3 (InRT03 MG, inRas13 MG, inRas33 MG, inRas83 MG) were injected intravenously at a dose of 20 mg / kg in the same volume of PBS vehicle control and in control (inCT03 MG, inCT13 MG, inCT33 MG, inCT83 MG) Respectively. Twenty times a week, the mice were injected seven times at 3 and 4 days intervals, and the tumor volume was measured for 24 days using a caliper.
  • FIG. 22C is an experimental result comparing the tumor growth inhibitory effect of the LALA-PG mutant which improves the persistence of the tumor-specific integrin-specific anti-RAS cell penetration antibody in the mouse xenografted with the human colorectal cancer KRas mutant cell line SW403.
  • 1 ⁇ 10 7 cells of KR40 G12V mutant human colorectal cancer cell line SW403 were injected into BALB / c nude mice by subcutaneous injection in each mouse. After about 14 days, the tumor volume was about 120 mm 3 (InRT03 MG, inRas13 MG, inRas33 MG, inRas83 MG) were injected intravenously at a dose of 20 mg / kg in the same volume of PBS vehicle control and in control (inCT03 MG, inCT13 MG, inCT33 MG, inCT83 MG) Respectively. Twenty times a week, twice a week, every 3 or 4 days, and the tumor volume was measured using a caliper for a total of 17 days.
  • a method for enhancing the tumor suppression efficiency of an antibody that directly penetrates into a tumor tissue-specific cytoplasm in the form of a complete immunoglobulin provided by the present invention and directly inhibits intracellular Ras ⁇ GTP is a method in which a heavy chain having an improved affinity for Ras GTP Variable region screening, and tumor tissue specific Ras / GTP, which is located within a specific tumor cell and is always activated through mutation, is capable of effectively inhibiting the target and its activity have.
  • the light chain variable region or the antibody comprising the antibody of the present invention having enhanced cytotoxic ability to tumor tissue may have a decreased ability to bind to HSPG expressed in most normal cells
  • the heavy chain variable region (VH) which is capable of intracellular cleavage and endosomal cleavage through a tumor-specific receptor, enhances affinity for Ras and GTP, and has an enhanced Ras inhibitory effect when the antibody reaches the cytoplasm .
  • the antibody that directly inhibits intracellular Ras GTP penetrates into the tumor tissue-specific cytoplasm in the form of a complete immunoglobulin combined with the modified light chain variable region and the heavy chain variable region exhibits enhanced tumor growth inhibition.
  • the cytosolic infiltrating Ras inhibitory antibody in combination with the modified light chain variable region and the heavy chain variable region according to the present invention is easy to develop as a therapeutic drug through high production yield and effectively inhibits mutant Ras through cytosolic infiltration Effective anticancer activity can be expected through simultaneous treatment with a single drug or an existing therapeutic agent.

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Abstract

본 발명에 따른 개량된 중쇄가변영역과 경쇄가변영역이 조합된 종양조직 특이적 세포질 침투 Ras 억제항체는 높은 생산 수율을 통해 치료 약물로 개발이 용이하며, 종양특이적으로 세포질 침투를 통한 효과적으로 돌연변이Ras를 억제할 수 있어 단독 약물 또는 기존 체료제와의 병행치료를 통해 효과적인 항암 활성을 기대할 수 있다.

Description

세포의 세포질에 침투하여 세포내 활성화된 RAS를 억제하는 항체 및 이의 용도
본 발명은 완전한 이뮤노글로불린 형태로 종양 조직에 과발현되는 세포 표면의 막단백질 수용체에 결합하여 내재화(endocytosis)된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포의 세포질에 위치하고, 세포질 내의 GTP와 결합한 활성화된 Ras(Ras·GTP)에 특이적으로 결합하여 종양돌연변이 Ras의 활성을 억제하는 항체와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 완전한 이뮤노글로불린 형태로 세포의 세포질에 침투하여 세포내 Ras·GTP를 직접적으로 억제하는 항체의 중쇄가변영역 (VH)을 개량하여 Ras·GTP에 높은 친화도를 보이는 중쇄가변영역 (VH) 및 이를 포함하는 항체와 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 종양조직 특이적 세포질 침투능을 부여하기 위한 경쇄가변영역(VL)의 개량 기술을 포함한다.
본 발명은 상기 종양조직 특이적 세포질 침투능을 부여하기 위해 개량된 경쇄가변영역(VL)과 친화도가 개선된 중쇄가변영역(VH)들의 조합으로 이루어진 완전한 이뮤노글로불린 형태로 세포질에 침투하여 세포내 Ras·GTP를 직접적으로 억제하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 상기 항체의 세포내 안정성, 체내 지속성 및 종양 조직 특이성을 향상시키기 위한 중쇄 개량 기술을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 암 또는 종양 세포의 성장을 억제시키는 방법 및 암 또는 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 Ras·GTP에 특이적으로 결합하는 중쇄가변영역의 친화도 개량을 위한 라이브러리 구축 방법과 그 라이브러리에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 라이브러리를 이용하여 Ras·GTP에 특이적으로 결합하며, 친화도가 개량된 중쇄가변영역의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암을 포함한 여러 질환들에서 세포내 단백질-단백질 상호작용(Protein-Protein Interaction, PPI)에 중요한 역할을 하는 효소 또는 전사, 신호전달 관련 여러 단백질의 돌연변이 및 비정상적 과발현되는 현상이 발생한다. 이러한 종양 및 질환관련 단백질에 대해 소분자 약물이 특이적 결합을 하기 위해선 단백질 표면에 소수성 포켓(Hydrophobic pocket)이 필요하지만, 세포내부의 질환관련 물질 전체 중에서 약 10 % 내외만 소수성 포켓을 가지고 있기 때문에 소분자 약물은 대부분의 세포내부의 종양 및 질환관련 단백질을 특이적으로 표적하지 못한다. 소수성 포켓이 없는 종양 및 질환관련 단백질의 대표적인 예 중 하나인 Ras는 세포 표면의 세포막 수용체를 통해 세포 외부의 신호를 세포 내 신호전달 체계로 전달하는 분자적 스위치(Molecular switch)역할을 한다. Ras protein family 중 암과 관련있는 단백질은 KRas, NRas, HRas 세가지 isoform 단백질이며, KRas는 KRas4A 및 KRas4B 두가지 스플라이싱 변이체(Splicing variant)로 발현될 수 있다. 상기 Ras 단백질은 세포질에 발현된 후, 소포체(Endoplasmic Reticulum, ER)와 골지체(Golgi apparatus)에서 거쳐 C-말단부위의 지질화 반응에 의해 세포막에 위치하지만, GTPase활성이 있는 부위는 세포질 쪽으로 노출된다. 외부 자극이 없는 경우 세포내의 GTP 가수분해효소 활성화 단백질(GTPase Activating Protein, GAP)에 의해 GDP와 결합한 불활성화된 Ras(Ras·GDP)로 존재하고, 외부 자극이 있는 경우 세포내의 구아닌 뉴클레오타이드 교환인자(Guanine nucleotide Exchange Factor, GEF)에 의해 GTP와 결합한 활성화된 Ras (Ras·GTP)로 존재한다. Ras·GTP는 세포질 내에서 Raf, PI3K, RalGDS 등의 effector 단백질과 단백질-단백질 상호작용에 의해 하위 Raf-MEK-ERK, PI3K-Akt 와 같은 신호를 활성화 시켜 세포성장, 사멸 억제, 이동, 분화 등의 다양한 신호를 전달한다. 정상세포에서는 Ras·GTP가 신호전달 후, 바로 GAP에 의한 인산해리 과정으로 인해 Ras·GDP로 바뀌어, 일시적으로만 신호를 보내는 형식으로 신호전달이 조절된다. 하지만, 발암관련 돌연변이가 생긴 Ras 단백질은 GAP에 의한 인산해리 과정이 일어나지 않고, Ras·GTP 형태로 유지되어 effector 단백질과 지속적인 상호작용하게 되고, 그로 인해 하위 신호전달이 계속해서 일어나게 됨으로써 정상세포의 암화(carcinogenesis)를 유도한다. 가장 빈도수가 높은 Ras 단백질 발암돌연변이는 12번째 잔기 돌연변이 (G12D, G12V, G13D, G12C 등), 13번째 잔기 돌연변이 (G13D 등), 및 61번째 잔기 돌연변이 (Q61R, Q61H 등)가 있다. 이런 발암관련 Ras 돌연변이는 모든 종양의 ~ 30%에서, 암종 별로는 폐암 (~25%), 대장암 (~30-40%), 췌장암 (~90 %)의 비율로 생기는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발암관련 Ras 돌연변이는 기존의 항암치료에 대한 강한 내성을 부여한다고 알려져 있다.
발암관련 Ras 돌연변이 종양 치료를 위해 주로 소분자 약물 (Small molecule drug) 개발이 시도되어 왔으며, 주요 전략은 Ras의 C-말단 지질화에 관련된 효소의 활성을 저해함으로써 Ras를 세포내막으로 위치하는 것을 막는 전략, Ras와 효과단백질간의 단백질-단백질 상호작용을 저해하여 Ras를 직접적으로 표적하는 방법 등이 있다. Ras의 C-말단 지질화는 세포질에 발현된 Ras가 활성화되기 위해 세포내막으로 위치하기 위한 과정이며, 이에 관련된 효소로는 파네실 전이효소(farnesyltransferase, FTase), Ras 변환효소 1 (Ras-converting CAAX endopeptidase 1, RCE1), 이소프레닐시스테인 카복실메틸 전이효소(isoprenylcysteine carboxylmethyltransferase, ICMT) 등이 있다. 위의 효소들을 표적하는 소분자 약물들이 개발되어 왔으나, Ras 야생형의 정상세포주에도 세포성장억제 및 세포사멸을 시키는 부작용이 있으며, Ras 돌연변이중 가장 빈도수가 높은 KRas 돌연변이 종양에서는 제라닐제라닐 전이효소 1(geranylgeranyltransferase 1, GGTase1)에 의한 우회경로로 인해 약물의 효과가 없는 한계점이 있다. 다른 전략인 Ras를 직접적으로 표적하는 소분자 약물로는, 활성화된 Ras에 결합하여 하위 효과 단백질인 Raf와의 상호작용을 억제하는 기작을 가지고 있는 Kobe0065, Kobe2602가 있으나, 약물의 안정성(Stability)이 좋지 않으며, 치료용으로 고용량의 약물이 필요하다는 한계를 가지고 있다. 또한, KRas G12C 돌연변이에 공유결합을 통해 하위 효과 단백질인 Raf와의 상호작용을 억제하는 기작의 ARS853이 개발되었지만, KRas 돌연변이 중 발견되는 빈도수가 낮은 KRas G12C 돌연변이에만 한정된 약물이라는 한계를 가지고 있다. 그리고, 하위 효과 단백질인 Raf, PI3K, RalGDS의 Ras Binding Domain(RBD)에 결합하여 Ras와의 결합을 억제하는 기작의 rigosertib이 개발되었지만, 치료용으로 고용량의 약물이 필요하다는 한계를 가지고 있다.
소분자 약물 이외에 알파-나선(α-helix) 구조 유사체로서 개발되고 있는 스테이플드 펩타이드(stapled peptide)는 인접해 있지 않은 두 단위체를 탄화수소 사슬로 연결함으로써 펩타이드의 구조적 안정성을 높이며, 대사적 안정성, 그리고 세포 투과성을 높일 수 있다는 장점을 가지고 있어 세포내부 단백질 표적 치료물질로 개발중에 있다. 이러한 특성을 이용하여 비활성 상태인 Ras를 활성화된 Ras로 변환시켜주는 Ras 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(RasGEF)의 Ras와 결합하는 부위를 펩타이드로 모방하는 전략으로 세포질 침투가 가능한 스테이플 펩타이드가 개발되어 왔으나, 치료 효과를 보기 위해 고용량의 펩타이드가 필요하며, Ras 돌연변이 세포주 뿐만 아니라 Ras 야생형 세포주에도 비특이적으로 효과를 준다는 한계를 가지고 있다.
소분자약물과 스테이플 펩타이드의 기술적 한계를 극복하기 위해 단백질-단백질 상호작용을 효과적으로 저해할 수 있는 항체절편 또는 재조합단백질과 같은 고분자 물질에 살아있는 세포내부로 침투능을 부여하기 위한 다양한 연구가 이루어져왔다. 그 중에서도 염기성 아미노산 서열 및 소수성(Hydrophobic), 양친매성(Amphipathic)의 특성을 갖는 단백질 투과 도메인(Protein Transduction Domain, PTD)들이 살아있는 세포에 대해서 세포침투능을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이를 이용한 세포내부 특정 단백질을 인식하기 위해 단백질 투과 도메인을 유전공학적으로 다양한 형태의 항체절편과 융합하는 시도가 많이 진행되어왔다. 하지만 대부분 동물세포에서 분비가 되지 않거나 굉장히 소량만 상등액으로 유출되어 생산수율이 낮으며, 세포내부로 침투 효율이 좋지 못한 한계를 가지고 있다. 이러한 발현 문제를 극복하기 위해 세포 투과 도메인을 화학적 공유 결합 또는 바이오틴-스트렙타비딘(Biotin-Streptavidin) 등의 결합 등을 통해 융합하는 연구가 진행되고 있으나 해당 단백질의 구조에 변형을 초래하는 한계를 가지고 있다.
일반적으로 완전한 이뮤노글로불린(Immunoglobulin) 형태의 항체는 큰 사이즈와 친수성 특징으로 살아있는 세포내부로 직접 침투하지 못한다. 하지만, 완전한 이뮤노글로불린(Immunoglobulin) 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체인 cytotransmab은 세포막 수용체인 HSPGs (Heparan Sulfate ProteoGlycans)에 결합하여 clathrin-mediated endocytosis에 의해 세포 내부로 유입된 이후, 엔도좀에서 세포질로 탈출하는 기작을 통해 세포질로 침투할 수 있는 기능을 가지고 있다. Cytotransmab의 수용체인 HSPG의 경우 일반적으로 대부분의 동물조직에 모두 발현이 되어 있으며, 다양한 수용체와 성장인자 및 사이토카인 결합의 보조수용체로 역할을 함으로써, 조직형성, 상처치유 등의 기능을 하며, 일부는 세포막에서 잘려져 나와 혈액 내에서 효과단백질로 작용하기도 한다. 이러한 특성으로 인해 HSPG에 결합하는 부위를 지니고 있는 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor/scatter factor)의 경우 혈액 내 반감기가 낮다는 특징을 가지고 있으며, 이를 극복하기 위해 HSPG 결합 부위를 제거하여 혈액 내 반감기를 증가시킨 연구가 보고된 바 있다.
치료용 이뮤노글로블린 항체는 소분자 약물에 비해 개발기간이 길며, 환자에 투여하기위해 고농도로 생산되어야 하기 때문에, 개발 초기에 항체의 안정성(stability) 및 수용화(solubility)를 내포하는 치료용 약물로의 개발 가능성(developability)을 확인하는 것이 크게 대두되어 왔다. Cytotransmab의 경우, 세포외부 수용체인 HSPG의 HS chain의 음전하와 cytotransmab 항체의 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Regions, CDRs)의 양전하를 띠는 아미노산 잔기 간의 정전기적 인력에 결합에 의해 세포 내부로 유입된다. 이러한, 항체의 CDR에 양전하의 아미노산 잔기는 항체 안정성에 악영향을 끼치며, 이러한 양전하의 아미노산 잔기를 소수성 잔기 또는 음전하의 아미노산으로 치환한 경우, 그 물성이 현저하게 향상되는 것이 보고된 바 있다.
이뮤노글로불린 항체는 체내의 여러 병원균에 결합한 뒤, 병원균에 의해 함께 세포 내부로 침투할 수 있으며, 세포질내 TRIM21 단백질와 결합하여 세포 내부 면역체개 시스템을 일으킬 수 있다. TRIM21은 E3 ligase family에 속하는 세포질 단백질로 이뮤노글로불린의 CH2-CH3 영역에 결합하며, 병원균, 이뮤노글로불린와 함께 복합체를 형성, 이 복합체는 유비퀴틴-프로테아좀 기작을 통해 분해 된다. 이러한, 이뮤노글로불린 항체와 TRIM21의 결합이 감소된 경우 병원균에 의한 면역 시스템이 작동하지 않으며, 이뮤노글로불린 항체 분해에 TRIM21이 중요한 역할을 하고 있는것으로 보고된바 있다. 또한, 이뮤노글로불린 항체는 혈액내 면역세포의 Fcγ receptor와의 결합을 통해 ADCC(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)을 일으켜 종양 사멸을 유도하는 면역체개 시스템을 가지고 있다. 이뮤노글로불린의 subclass마다 Fcγ receptor에 결합 친화도가 다르며, 구체적으로 IgG2, IgG4 항체는 Fcγ receptor와의 친화도가 매우 낮아 ADCC 기능이 결핍되어 있다. Fcγ receptor와의 친화도의 영향으로 동일한 항체의 경우 IgG1 보다 IgG2, IgG4 항체가 체내 반감기가 높은 경향이 있다.
따라서 본 발명자는 기존의 세포질 침투를 통해 세포내 Ras 활성을 직접적으로 억제하는 항-Ras·GTP iMab 항체(RT11)를 기반으로 중쇄가변영역(VH) 라이브러리를 구축하여 세포질 내 Ras·GTP에 대해 친화도가 향상된 중쇄가변영역(VH)를 선별하였고, 이를 살아있는 세포내부로 침투 및 세포질에 분포하는 특징을 갖는 인간화 경쇄가변영역(VL)을 갖는 경쇄와 동시발현하여 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 구축함으로써, Ras 돌연변이 특이적 세포 성장 억제 효과가 향상된 항-Ras·GTP iMab 항체를 제작하였다.
또한, 본 발명자는 종양조직 특이적 세포질 침투능을 가진 완전한 이뮤노글로불린 형태 항-Ras·GTP iMab 항체를 발굴하기 위해 HSPG에 대한 비특이적 결합능을 감소시키며, 종양조직 특이성을 부여하기 위한 펩타이드가 융합된 후에도 안정성 및 생산성이 개선된 경쇄가변영역(VL)의 단일도메인을 개발하였으며, 이를 포함한 경쇄와 Ras·GTP에 고특이적 결합능을 가지는 중쇄가변영역(VH) 단일도메인을 포함한 중쇄를 동시발현하여 고생산성의 종양조직 특이적 항-Ras·GTP iMab 항체를 개발하였다.
또한, 본 발명자는 종양조직 특이적 세포질 침투능을 가진 완전한 이뮤노글로불린 형태 항-Ras·GTP iMab 항체의 세포내 안정성, 체내 지속성 및 조직 특이성 향상시키기 위해 중쇄를 개량함으로써, Ras 돌연변이 특이적 세포 성장 억제 효과가 향상된 항-Ras·GTP iMab 항체를 제작하였다.
또한, 본 발명자는 상기 종양조직 특이적 항-Ras·GTP iMab 항체가 다양한 Ras 돌연변이 의존적 암세포주의 내부로 침투하여, 세포질에 있는 Ras·GTP 특이적 결합능을 보이며, 기존의 항-Ras·GTP iMab 항체에 비해 향상된 세포생장 억제 효과를 확인하였다. 또한 종양조직 특이성을 부여하기 위해 HSPG 결합능을 감소 시키고, 종양 조직에 과발현되는 Integrin 또는 EpCAM 표적 원형 펩타이드를 융합한 형태에서도 높은 수준의 생산수율을 보이며, 세포질 침투 및 Ras·GTP 활성 억제에 대한 악영향 없이, Ras 돌연변이 의존적 종양에서 Ras·GTP를 특이적 억제시키는 활성을 발휘함을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
선행기술문헌
특허문헌
국내 등록특허 제10-1602870호
국내 등록특허 제10-1602876호
발명의 요약
본 발명은 완전한 이뮤노글로불린 형태로 종양 조직에 과발현되는 세포 표면의 막단백질 수용체에 결합하여 내재화된 후, 엔도좀에서 탈출하여 세포질에 위치한 뒤, 세포내 Ras·GTP에 결합하여 종양돌연변이 Ras 활성을 직접적으로 억제하는 항체의 기능을 개량하고 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 구체적으로 GTP가 결합되어 활성화된 Ras에 특이적으로 결합하는 중쇄가변영역의 아미노산 서열을 제시한다.
또한, 상기 중쇄가변영역을 포함하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체를 제시한다.
상기 항체는 세포질 침투능을 가질 수 있으며, 이를 위하여 특정한 서열의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한 암세포 표적능 향상을 위해 암세포 표면에서 발현하는 막단백질EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), 인테그린 αvβ3(Integrin αvβ3) 또는 인테그린 αvβ5 (Integrin αvβ5)을 표적하는 펩타이드가 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역에 융합되는데 필요한 특정한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgM 로 이루어지는 군에서 선택된 인간 면역글로불린에서 유래된 중쇄불변영역 또는 경쇄불변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 암세포 표적능 향상을 위해 상기 항체의 중쇄불변영역은 CH3 영역의 N434D, CH2 영역의 L234A, L235A 또는 P329G 중 어느 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. (단, 상기 아미노산 위치는 EU 번호(EU numbering)에 따름.)
또한, 상기 항체는 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 상기 항체들의 에피토프-결합 단편으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 항체는 이중특이항체(Bispecific Ab)일 수 있으며, 단백질, 펩타이드, 소분자 약물, 독소, 효소 또는 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상과 융합될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상되고, 종양조직 특이적 세포질 침투능을 가지는 완전한 형태의 이뮤노글로불린 항체의 제조방법을 제시한다.
또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제시한다. 상기 암은 암은 세포내 Ras가 활성화된 돌연변이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히 상기 Ras의 돌연변이는 Ras의 의 12번째, 13번째 또는 61번째 아미노산에 돌연변이가 발생한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 제시하는 상기 암의 예방 또는 치료는 본 발명에서 제시한 항체가 세포질 내에서 B-Raf, C-Raf 또는 PI3K와 활성화된 Ras(Ras·GTP)의 결합을 억제하는 기작을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 종양 진단용 조성물을 제시한다.
또한, 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다.
또한, 본 발명은 Ras·GTP에 특이적으로 결합하며, 친화도가 개량된 중쇄가변영역 라이브러리와 그 구축 방법을 제시한다.
또한, 본 발명은 Ras·GTP에 특이적으로 결합하며, 친화도가 개량된 중쇄가변영역의 스크리닝 방법을 제시한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이 포함된 것을 특징으로 하는 GTP가 결합되어 활성화된 Ras(Ras·GTP)에 특이적으로 결합하는 중쇄가변영역을 제공한다.
[일반식 1]
D-X11-SMS
상기 일반식 1에서, X11는 F 또는 Y이며,
[일반식 2]
YISRTSHT-X21-X22-YADSVKG
상기 일반식 2에서, X21는 T, I 또는 L이며, X22는 Y, C, S, L 또는 A이며,
[일반식 3]
G-F-X31-X32-X33-Y
상기 일반식 3에서, X31는 K, F, R 또는 N이고, X32는 M 또는 L일 수 있으며, X33은 D 또는 N이다.
또한, 살아있는 세포에 완전한 이뮤노글로불린(Immunoglobulin) 형태로 종양조직 특이적 세포막 수용체에 의한 세포내재화(Endocytosis) 및 엔도좀 탈출 (Endosomal escape)을 통해 능동적으로 세포질로 침투하여 세포내 Ras·GTP의 활성을 억제하는 항체의 기능을 개량하고 이를 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 상기 방법은, 종양조직 특이적 세포질 침투능을 부여한 경쇄가변영역(VL)과 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도를 개량하여 높은 결합능을 보이는 중쇄가변영역(VH)를 가지는 완전한 이뮤노글로불린(Immunoglobulin) 형태의 항체를 통하여, Ras 돌연변이 종양 특이적 종양억제 효율을 높일 수 있도록 한다.
즉, 본 발명은 종양 특이적 세포질 침투가 가능하며, 세포질 침투 후 높은 친화도로 세포내 Ras·GTP에 결합하여 Ras의 활성을 억제하는 완전한 이뮤노글로불린 (Immunoglobulin) 형태의 항체를 개발하는 것이다.
상기 항체는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체 및 이의 절편일 수 있다.
상기 항체는 키메릭, 인간, 또는 인간화된 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄 가변영역은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3로 구성된다.
[일반식 1]
D-X11-SMS
상기 일반식 1에서, X11는 F 또는 Y이며,
[일반식 2]
YISRTSHT-X21-X22-YADSVKG
상기 일반식 2에서, X21는 T, I 또는 L이며, X22는 Y, C, S, L 또는 A이며,
[일반식 3]
G-F-X31-X32-X33-Y
상기 일반식 3에서, X31는 K, F, R 또는 N이고, X32는 M 또는 L일 수 있으며, X33은 D 또는 N이다.
구체적으로, 본 발명의 일 양상에서, 상기 중쇄가변영역에 포함된 CDR을 규정하는 일반식 1의 X11은 F 또는 Y이며, 일반식 2의 X21-X21는 TY, IY, TC, TS, IS, LC, LL 또는 IA이며, 일반식 3의 X31-X31-X31는 KMD, RMD, FMN, RLD 또는 NLD이다.
구체적으로, 본 발명의 일 양상에서, 상기 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도 향상 중쇄 가변영역은 서열번호 20 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 서열이다.
상기 중쇄가변영역(VH)의 서열정보는 하기와 같다.
Figure PCTKR2018014110-appb-I000001
상기 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 중쇄가변영역은 CDR1서열은 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 CDR2 서열은 서열번호 5, 및 서열번호 10 내지 16의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 CDR3 서열은 서열번호 6 내지 9, 및 서열번호 17 내지 18의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 CDR의 서열정보는 하기와 같다
Figure PCTKR2018014110-appb-I000002
단, 본 명세서에서 제공하는 CDR을 규정하는 일반식 1,2 및 3에 포함된 X11, X21-X22, X31-X32-X33와 중쇄불변영역을 제외한 서열번호에 명시된 모든 아미노산 번호는 Kabat 번호를 사용하였다 (Kabat EA et al., 1991).
또한, 본 발명의 일 양상은 종양조직 특이적 세포질 침투능을 부여하고, HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역을 제시하며, 이는 서열번호 34 내지 43, 및 서열번호 44 내지 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 목적의 경쇄가변영역(VL)의 서열정보는 하기와 같다.
Figure PCTKR2018014110-appb-I000003
Figure PCTKR2018014110-appb-I000004
Figure PCTKR2018014110-appb-I000005
또한, 본 발명의 일 양상에서, 종양 조직 표적능 향상을 위해 개량된 중쇄 가변영역은 서열번호 61 내지 63로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 서열이다.
상기 중쇄가변영역(VH)의 서열정보는 하기와 같다.
Figure PCTKR2018014110-appb-I000006
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 종양조직 특이적 세포질 침투 항체의 세포 내 안정성을 향상시키고 긴 반감기를 부여하기 위한 중쇄불변영역은 서열번호 65 내지 69으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 서열이다.
상기 목적의 중쇄불변영역(CH1-CH2-CH3)의 서열정보는는 하기와 같다.
Figure PCTKR2018014110-appb-I000007
Figure PCTKR2018014110-appb-I000008
또한 본 발명의 일 양상은 Ras·GTP에 특이적으로 결합하는 중쇄가변영역의 친화도 개량을 위한 라이브러리 구축 방법을 제공한다.
상기 방법은
(1) 라이브러리 주형인 RT11 중쇄가변영역(VH)의 항원 결합에 관여하는 3 개의 상보성 결합 부위 (CDR) 중 세포내 Ras·GTP에 결합할 가능성이 높은 아미노산 자리를 선정하는 단계;
(2) 상기 선정한 아미노산 자리에, 라이브러리에 포함되길 원하는 아미노산을 코딩할 수 있는 디제너레이트 코돈(degenerated codon primer)를 디자인하는 단계; 및
(3) 상기 디자인한 중쇄가변영역 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 scFab 또는 Fab 형태로 발현하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 다음 단계를 포함하는 Ras·GTP에 특이적으로 결합하며, 친화도가 개량된 중쇄가변영역의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법은
(1) Ras·GTP에 결합할 수 있는 중쇄가변영역 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 발현하는 단계;
(2) Biotinylation 시 변형을 극복하고 안정한 형태로 GTP 유사체인 GppNHp와 결합된 형태의 Avi-KRasG12D 구축 및 발현 단계;
(3) GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D 와 상기 라이브러리를 결합시키는 단계; 및
(4) 상기 GppNHp 가 결합된 Ras 와 상기 라이브러리 결합의 친화도를 측정하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 항체에 단백질, 펩타이드, 소분자 약물, 독소, 효소, 핵산 또는 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상과 융합된 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체를 제공한다.
상기 단백질은 단백질은 항체, 항체의 단편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자(Growth factor), 사이토카인(Cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩타이드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(Signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(Transmembrane) 단백질, 내부(Internal) 단백질, 외부(External) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등일 수 있다.
본 발명에 있어서 소분자 약물은 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니며 질병의 치료제로서 활성도를 지니는 유기 화합물, 무기 화합물 또는 유기금속 화합물을 나타내는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 본원에서 소분자 약물은 올리고펩타이드 및 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니는 그 밖의 바이오분자(Biomolecule)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 나노입자(Nanoparticle)는 직경 1 내지 1000 nm 크기를 갖는 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노 입자는 금속 나노 입자, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 금속/금속 코어쉘 복합체, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 비금속 쉘로 구성되는 금속/비금속 코어쉘 또는 비금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 비금속/금속 코어쉘 복합체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 백금, 자성철 및 그의 산화물로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 비금속은 실리카, 폴리스티렌, 라텍스 및 아크릴레이트 계열의 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 핵산, 또는 나노입자에 상기 종양 특이적 세포질 침투 항체가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체, 또는 이에 융합된 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 생체활성분자를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항체, 또는 이에 융합된 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 생체활성분자를 이용하여 인간 항체 중쇄가변영역(VH)이 가지는 항원 고특이성 및 고친화도에 영향을 주지 않으면서 세포내부로 침투 및 세포질에 잔류하는 특성을 부여할 수 있으며, 이를 통해 현재 소분자 약물을 이용한 질병 치료에 표적물질로 분류되고 있는 세포질 내에 존재하면서 단백질과 단백질 사이에 넓고 평평한 표면을 통해 구조복합성 상호작용을 이루는 종양 및 질환 관련 인자에 대한 치료 및 진단에 높은 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 일 양상에서는 상기 항체를 이용하여 암 또는 종양 세포의 성장을 억제시키는 방법 및 암 또는 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 조성물이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체, 또는 이에 융합된 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 생체활성분자를 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 암의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.
상기 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체 및 이의 절편은 영상을 통하여 암을 진단하기 위하여 분자 영상용 형광체와 결합할 수 있다.
상기 분자 영상용 형광체는 형광을 발생시키는 모든 물질을 말하며, 적색이나 근적외선(Near-infrared)의 형광을 발광하는 것이 바람직하며, 양자 수득량(Quantaum yield)이 높은 형광체가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 분자 영상용 형광체는 상기 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체 및 이의 절편에 특이적으로 결합하는 종양 침투성 펩타이드와 결합할 수 있는 형광체, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
형광체는 플루오레신 (Fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로드아민 (Trtramethylrhodamine), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine), 알로피코시아닌 (Allopicocyanine) 또는 이들의 유도체가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
형광 단백질은 Dronpa 단백질, 형광 발색 유전자(EGFP), 적색 형광 프로테인(Red Fluorescent Protein, DsRFP), 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5 또는 기타 형광 단백질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
기타 영상용 물질은 산화철, 방사성 동위원소 등이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, MR, PET과 같은 영상 장비에 응용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 중쇄 가변영역 (VH) 및 상기 종양조직 특이적 세포질 침투능을 부여한 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 중쇄가변영역 (VH), 상기 종양조직 특이적 세포질 침투능을 부여한 경쇄가변영역(VL) 및 세포내 안정성 및 긴 반감기를 부여하기 위한 중쇄불변영역(CH1-CH2-CH3)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(Complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(Stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 20 내지 69 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도 향상 중쇄가변영역 및 종양조직 특이적 세포질 침투능 부여한 경쇄가변영역을 이용한 세포내부로 침투하여 세포질에 분포하는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체 제조방법의 예는 아래와 같다.
(1) 상기 인간 중쇄가변영역(VH) 및 인간 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄에서 중쇄가변영역(VH)을 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 인간화 중쇄가변영역(VH) 으로 치환된 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 엔도좀 탈출 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 인간 경쇄가변영역(VL) 및 인간 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 경쇄에서 경쇄가변영역(VL)을 세포질에 침투하는 인간화 경쇄가변영역(VL) 및 종양조직 특이적 세포질 침투능 부여한 인간화 경쇄가변영역(VL) 으로 치환된 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 세포질 침투 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 제조된 중쇄, 경쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환 하여 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 인간화 중쇄가변영역(VH) 및 종양조직 특이적 세포질 침투능을 부여한 인간화 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 발현하는 단계; 및
(4) 상기 발현된 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 정제 및 회수하는 단계.
상기 방법은 중쇄를 발현하는 벡터와 경쇄를 발현하는 벡터를 발현하여 종양조직 특이적으로 세포내부로 침투하고 세포질에 분포하여 세포내 Ras·GTP를 높은 친화도로 표적할 수 있는 항체를 발현할 수 있다. 벡터는 경쇄와 중쇄를 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 본 발명에서 제공하는 경쇄가변영역(VL), 및 경쇄불변영역(CL), 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)은 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공할 수 있다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 종양조직 특이적으로 세포내부로 침투하고 세포질에 분포하여 세포내 Ras·GTP를 높은 친화도로 표적할 수 있는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
도 1은 항-Ras·GTP iMab의 Ras·GTP에 대한 친화도 향상을 위해 RT11의 중쇄가변영역을 기반으로 구축된 라이브러리의 선별 및 구축전략을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)와 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)을 이용한 선별과정을 통해서 Avi-KRasG12D·GppNHp에 특이적 부유화 (Enrichment)를 확인하기 위해 각 단계별 라이브러리 발현 효모에 대해서 10 nM Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 1000 nM Avi-KRasG12D·GDP와 결합능을 유세포 분석기 (FACS) 를 통해 분석한 결과이다.
도 2b은 최종 선별된 라이브러리 중 각각 47개의 개별클론을 발현하는 효모에 대해서 5 nM Avi-KRasG12D·GppNHp와 결합능을 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 3a는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 RT11 기반 Ras·GTP에 대한 친화도가 개량된 완전한 IgG 형태의 항-Ras·GTP iMab (RT22-i3) 구축을 설명한 모식도이다.
도 3b는 RT11 기반 친화도가 개량된 항-Ras·GTP iMab들의 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D와의 특이적 결합을 확인하기 위해, 각각 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp와 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 3c는 KRas 돌연변이 대장암 세포주 SW480에 친화도가 개량된 항-Ras·GTP iMab들을 1 μM 농도로 37 도에서 12시간 처리후 세포내 활성화된 Ras와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 4은 항-Ras·GTP iMab의 Ras·GTP에 대한 친화도 향상을 위해 RT22의 중쇄가변영역을 기반으로 구축된 라이브러리의 선별 및 구축전략을 나타낸 모식도이다.
도 5a는 RT22 기반 친화도가 개량된 중쇄가변영역(VH)들을 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i33)과 조합된 항-Ras·GTP iMab 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 결과이다.
도 5b는 상기 RT22 기반 친화도가 개량된 중쇄가변영역(RT31 VH, RT33 VH, RT34 VH)와 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i33)과 조합된 항-Ras·GTP iMab들의 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D와의 특이적 결합을 확인하기 위해, 각각의 항-Ras·GTP iMab와 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 5c는 상기 RT22 기반 친화도가 개량된 중쇄가변영역(RT31 VH, RT36 VH, RT37 VH)와 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i33)과 조합된 항-Ras·GTP iMab들의 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D와의 특이적 결합을 확인하기 위해, 각각의 항-Ras·GTP iMab와 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 6은 integrin 또는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 친화도가 개량된 완전한 IgG 형태의 항-Ras·GTP iMab (RT22-i33, RT22-ep33) 구축을 설명한 모식도이다.
도 7은 KRas 돌연변이 대장암 세포주 SW480에 integrin 또는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 친화도가 개량된 완전한 IgG 형태의 항-Ras·GTP iMab (RT22-33 (1μM), RT22-i33 MG (0.5μM), RT22-ep33 MG (1μM)) 및 대조군 cytotransmab (CT-33 (1μM), CT-i33 MG (0.5μM), CT-ep33 MG (1μM))을 처리 후 세포내 활성화된 Ras와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 8a는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능 및 세포질 침투능이 감소 혹은 제거되었는지를 항체 1 μM 농도로 37 도에서 6 시간 동안 HeLa 세포에 처리하여 공초점 현미경으로 확인한 결과 및 Alexa488 (녹색형광) 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 8b는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능을 확인하기 위해, HSPG를 발현하는 HeLa 세포주에서 비특이적 세포 표면 결합 ELISA 를 수행한 결과이다.
도 8c는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능을 확인하기 위해, 항체 500 nM 을 HeLa 세포주에서 처리한 후 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
도 9a는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i33 MG~hT4-i37 MG VL)을 포함한 항 Ras·GTP iMab의 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 9b는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i38 MG~hT4-i39 MG VL)을 포함한 항 Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 9c는 KRas 돌연변이 대장암 세포주 SW480에 integrin 또는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역(VL)을 포함한 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab들을 1 μM 농도로 37 도에서 12시간 처리 후 세포내 활성화된 Ras와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 10a는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 hT4-38와 hT4-39 기반 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄(hT4-58, hT4-59)를 포함한 항 Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 10b는 KRas 돌연변이 대장암 세포주 SW480에 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 hT4-38와 hT4-39 기반 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄(hT4-58, hT4-59)를 포함한 항 Ras·GTP iMab 및 cytotransmab 를 1 μM 농도로 37 도에서 12시간 처리후 세포내 활성화된 Ras와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 11a는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능 및 세포질 침투능이 감소 혹은 제거되었는지 항체 1 μM을 37 도에서 6 시간 동안 HeLa 세포에 처리하고 공초점 현미경을 통하여 확인한 결과 및 Alexa488 (녹색형광) 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 11b는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능을 확인하기 위해, HSPG를 발현하는 HeLa 세포주에서 비특이적 세포 표면 결합 ELISA 를 수행한 결과이다.
도 11c는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능을 확인하기 위해, 항체 500 nM 을 HeLa 세포주에서 처리한 후 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
도 12a는 인간 대장암 세포주 SW480와 LoVo 그리고 인간 혈액암 세포주 K562와 K562 Integrin ανβ3 발현 세포주에서 Integrin ανβ3 또는 Integrin ανβ5의 발현을 FACS로 확인한 실험 결과이다.
도 12b는 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 중쇄(RT22)를 포함한 HSPG 결합능이 제거된 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG)와 기존 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras 세포 침투 항체(RT11-i)의 세포 표면 Integrin ανβ3 또는 Integrin ανβ5에 결합능을 FACS를 통해 확인한 실험 결과이다.
도 12c는 인간 대장암 세포주 SW480와 LoVo 그리고 인간 자궁경부암 세포주 HeLa에서 EpCAM의 발현을 FACS로 확인한 실험 결과이다.
도 12d는 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 중쇄(RT22)를 포함한 HSPG 결합능이 제거된 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG)의 세포 표면 EpCAM에 결합능을 FACS를 통해 확인한 실험 결과이다.
도 13a는 여러 Ras 돌연변이 및 야생형 세포주에서 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 생산수율 향상과 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역이 조합된 항-Ras·GTP iMab 0.5 μM 을 37 도에서 48시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
도 13b는 여러 Ras 돌연변이 및 야생형 세포주에서 EpCAM 표적 원형펩타이드가 융합 및 생산수율 향상과 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역이 조합된 항-Ras·GTP iMab 1 μM 을 37 도에서 48시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
도 14a는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LoVo 와 SW480를 이종이식한 쥐에서 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG)와 기존 integrin 표적 원형펩타이드가 융합된 항-Ras 세포 침투 항체(RT11-i)와의 종양 성장 억제 효과를 20 mg/kg의 농도로 정맥주사, 2일 간격으로 총 9회 투여하여 비교한 실험 결과이다.
도 14b는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 14c는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
도 15a는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LoVo 와 SW480를 이종이식한 쥐에서 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG) 의 종양 성장 억제 효과를 20 mg/kg의 농도로 정맥주사, 2일 간격으로 총 9회 투여하여 비교한 실험 결과이다.
도 15b는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 15c는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
도 16a는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LoVo 를 이종이식한 쥐에서 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-i39 MG)의 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
도 16b는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 16c는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
도 17a는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LoVo 를 이종이식한 쥐에서 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-ep59 MG) 의 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
도 17b는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 17c는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
도 18a는 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 세포질내 분해 감소를 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 시스템을 이용하여 확인한 결과이다.
도 18b는 세포질내 안정성이 향상된 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 인간 대장암 세포주에서 비부착 세포 성장 억제능을 soft agar colony formation방법을 통해 확인한 결과이다.
도 18c는 세포질내 안정성이 향상된 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 인간 대장암 세포주에서 비부착 세포 성장 억제능을 anoikis 방법을 통해 확인한 결과이다.
도 18d는 세포질내 안정성이 향상된 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab의 인간 폐암 세포주에서 비부착 세포 성장 억제능을 anoikis 방법을 통해 확인한 결과이다.
도 19a는 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 결과이다.
도 19b는 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP의 약동학을 BALB/c 누드 마우스에서 확인한 결과이다.
도 20a 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas23 MG 의 세포 표면 EpCAM에 결합능을 FACS를 통해 확인한 실험 결과이다.
도 20b 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항 Ras·GTP iMab 의 25, 50, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 20c 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas23 MG 의 인간 대장암 세포주에서 비부착 세포 성장 억제능을 anoikis 방법을 통해 확인한 결과이다.
도 20d 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas23 MG 의 생체분포를 마우스에서 확인하고 종양과 몸 전체의 형광을 정량하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 20e 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas23 MG 의 생체분포를 마우스에서 확인하고 장기를 적출하고 형광을 정량하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 21a는 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 다량체 여부를 크기-배제 크로마토그래피로 확인한 결과이다.
도 21b는 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 약동학을 BALB/c 누드 마우스에서 확인한 결과이다.
도 22a 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 다량체 함량 여부를 크기-배제 크로마토그래피로 확인한 결과이다.
도 22b는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LS1034를 이종이식한 쥐에서 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras 세포 침투 항체의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
도 22c는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 SW403을 이종이식한 쥐에서 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras 세포 침투 항체의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D 단백질 준비
라이브러리 선별에 사용하기 위해 Avi tag (GLNDIFEAQKIEWHE)이 N-term 에 융합된 Avi-KRasG12D 항원을 구축하였다. 이는 라이브러리선별 시 항원 biotinylation 과정에서 문제가 될 수 있는 구조적 변성을 최소화하기 위한 목적으로 구축되었다.
구체적으로는, KRasG12D 단백질에서 C-말단부분 고다양성 부위(hypervariable region)을 제외한 catalytic G 도메인(1번~169번 잔기)와 N-말단에 8X his tag 및 Avi-tag 을 GSG 링커를 이용하여 융합된 형태의 DNA를 PCR 기법으로 구축하여 E. coli 발현용 벡터인 pET23 벡터에 제한효소 NcoI과 HindIII를 사용하여 클로닝하였다. 이후 구축된 pET23-8Xhis-Avi-KRasG12D(1-169) 벡터를 in vivo biotinylation이 될 수 있도록 biotin ligase 인 BirA를 코딩하는 벡터(pBirAcm)과 동시에 E. coli 균주인 BL21(DE3)plysE에 전기천공법을 이용하여 형질전환하여 100 μg/ml Ampicillin과 10 μg/ml chloramphenicol이 포함된 선택배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 5 mM MgCl2가 포함된 상기 선택배지(LBCA) 상에서 37 도 조건으로 600 nm 에서의 흡광도 0.6까지 배양 후, 단백질 발현을 위해 0.5 mM IPTG와 in vivo biotinylation 을 위해 50 μM d-biotin 을 첨가한 후, 30 도에서 4 시간을 더 배양하였다. 50 μM d-biotin 첨가를 위한 stock solution은 10 mM bicin, pH 8.3 버퍼 10 ml에 12 mg d-biotin 첨가를 통해 만든다. 대장균 배양 이후 원심분리기를 이용하여 모은 대장균을 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 2 mM β-ME 버퍼로 재부유하여, 초음파를 이용해 (SONICS)대장균을 분쇄하였다. 원심분리기를 사용해 대장균 분쇄물을 제거한 상등액 만을 얻어 His tag이 융합된 단백질을 특이적으로 정제하는 Ni-NTA 수지를 사용하여 정제하였다. Ni-NTA 수지를 세척하기 위해 세척버퍼 (20 mM Tris, pH 7.4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 2 mM MgCl2 and 2 mM β-ME) 로 50 ml 세척 후 용출버퍼 (20 mM Tris, pH 7.4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, 2 mM MgCl2 and 2 mM β-ME)를 이용하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질은 투석방법을 이용하여 저장버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM DTT, 2 mM MgCl2)로 버퍼를 바꿔주었다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량했다. SDS-PAGE 분석을 통해 약 98%이상의 순도를 확인하였다.
Gel shift 분석법을 이용하여, 정제된 Avi-KRasG12D 단백질이 in vivo biotinylation 반응을 통해 높은 수율로 Avi-tag과 biotin이 결합한 것을 확인하였다. 구체적으로, Avi-KRasG12D 단백질을 SDS-PAGE loading buffer (25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1% SDS, 10% Glycerol, 175 mM β-ME)로 희석하여 10 분간 반응 및 1 μg 의 streptavidin 과 30 분간 상온에서 반응하여 SDS-PAGE를 통해 분리된 단백질을 PVDF membrane에 단백질을 transfer하여 HRP가 융합되어 있는 anti-His 항체를 사용하여 확인하였다.
Avi-KRasG12D 단백질을 GTP 유사체(GppNHp) 또는 GDP와 반응 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 구체적으로, GTP 유사체(GppNHP)와 Ras 단백질의 복합체를 형성하기 위해 정제된 Ras 단백질을 기질교환버퍼(40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM (NH4)2SO4, 10 μM ZnCl2, 5 mM DTT)에 희석하고, Ras단백질 대비 10 배 이상의 몰수를 갖는 GppNHp와 Ras 단백질 mg 당 2 unit의 bead와 융합된 alkaline phosphatase를 첨가하여 1시간동안 실온에서 반응시킨다. GDP와 Ras 단백질의 복합체를 형성하기 위해서는 Ras 단백질 대비 20 배 이상의 몰수를 갖는 GDP와 20 mM EDTA를 첨가한 조건에서 30 도에서 30분간 반응시키고, 이후 60 mM MgCl2 첨가하여 4 도에서 30분간 유지하여 반응을 멈추었다. 상기 방법을 통해 GppNHp 또는 GDP가 결합된 Ras 단백질을 PD10 sephadex G25 column을 이용하여 저장버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM DTT, 2 mM MgCl2)로 교환한 이후 SDS-PAGE 분석한다. 장시간 보관을 위해 기질과 결합된 Ras 단백질은 -80 도에서 보관한다.
상기 방법을 통해 준비된 Avi-KRasG12D 단백질과 Avi-tag이 없는 상태의 His-KRasG12D 단백질과의 RT11 결합능을 분석하기 위하여 ELISA 를 실시하였다. 구체적으로, 항-Ras·GTP iMab인 RT11을 96웰 EIA/RIA 플레이트(COSTAR Corning)의 각각 5 μg/ml의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % TBST (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1 % Tween20, 5 mM MgCl2) 로 10분간 3회 세척한다. 4% TBSB (12 mM Tris, pH7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4% BSA, 10 mM MgCl2)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% TBST로 10분간 3회 세척한다. 이후 GppNHp가 결합된 KRas 단백질과 GDP가 결합된 KRas 단백질을 4 % TBSB로 희석하여 100 nM의 농도로 상온에서 1시간동안 결합시킨 후 0.1 % TBST로 10분간 3회 세척했다. 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution 로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
상기 실험을 통해 Avi-tag이 융합된 KRasG12D 단백질이 RT11 친화도 개량 라이브러리 선별에 사용 가능함을 확인하였다.
실시예 2. 항 Ras·GTP iMab RT11 기반 고다양성 항체 라이브러리 구축 및 Ras·GTP에 특이적인 친화도가 향상된 중쇄가변영역(VH) 선별
기존 특허(등록번호: 10-1602876)에서 항-Ras·GTP iMab RT11의 경우, Ras·GTP에 고특이적으로 결합하며, 다양한 Ras 돌연변이 세포주에서 생물학적 활성을 나타내지만 Ras·GTP에 대해서 약 12 nM 수준의 친화도를 보이며, 이는 IgG 포맷의 다양한 항체들의 친화도와 비교하였을 때 낮은 친화도이다. 또한, Ras·GTP와 효과단백질(effector molecule) 간의 결합저해를 통해 생물학적 활성을 나타내는 항-Ras·GTP iMab RT11의 경우, Ras·GTP와의 친화도 향상을 통해 향상된 생물학적 활성을 유도할 수 있다. 이에 본 발명자는 항-Ras·GTP iMab의 치료효율을 높이기 위해 조직특이성을 부여하기 위한 경쇄가변영역 개량과는 별개로 추가적으로 항-Ras·GTP iMab RT11의 Ras·GTP에 대한 친화도를 높이고자 하였다.
RT11 기반의 친화도가 향상된 Ras·GTP 특이적 중쇄가변영역을 선별과정에서 사용한 경쇄가변영역은 엔도좀 탈출능이 향상된 hT4-3 경쇄가변영역으로, 이는 기존 특허 (등록번호: 10-1602876)에서 사용된 세포질 침투 hT4 경쇄가변영역(VL)의 92-94 번 잔기에 WYW (Trp-Tyr-Trp)이 위치하는 CDR3을 도입하며, WYW 도입으로 인해서 소수성 잔기들이 용매 노출정도가 높아짐에 따라 생산수율이 낮아지는 것을 극복하기 위해 경쇄가변영역(VL)과 중쇄가변영역(VH)의 인터페이스에 해당하는 경쇄가변영역 골격부위(Framework) 87번 잔기를 페닐알라닌(Phe)로 치환한 돌연변이이다(출원번호: 10-2016-0065365).
도 1은 항-Ras·GTP iMab의 Ras·GTP에 대한 친화도 향상을 위해 RT11의 중쇄가변영역을 기반으로 구축된 라이브러리의 선별 및 구축전략을 나타낸 모식도이다.
Homology modeling 및 docking 프로그램을 이용하여 Ras·GTP와 RT11 항체간의 결합구조를 예측하였으며, 이를 통해 항원 결합에 중요한 역할을 할 것이라 예측되는 CDR 및 주변 지역을 무작위적인 돌연변이를 도입하였다.
구체적으로, CDR1(31번~33번) 및 CDR2(52번~56번)의 잔기를 상기 예측된 결합구조에서 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있는 디제너레이트 코돈(degenerated codon)을 사용하였고, 각각 디제너레이트 코돈은 CDR1(31번~33번)에서 순차적으로 RNC, THC, KSG을 사용하였으며, CDR2(52번~56번)는 순차적으로 ASC, MRA, ASC, ASC, CRC, WMC를 사용하였다. CDR3 주변 뼈대(framework) 94번 잔기는 CDR 구조에 영향을 줄 수 있는 위치의 잔기이므로 생식선(germline)항체 서열에 있는 Arg, Lys를 코딩할 수 있는 ARG 디제너레이트 코돈을 사용하였다. CDR3(95번~97번)의 잔기는 RT11의 서열을 50% 확률로 보존할 수 있는 spiked 올리고머를 사용하였다. 이는 각각 잔기에 대한 아미노산을 코딩하는 3개 뉴클레오타이드에서 각각 야생형 뉴클레오타이드를 79 퍼센트 유지하고 나머지 뉴클레오타이드 비율을 7 퍼센트로 프라이머를 디자인하므로써 PCR 과정에서 야생형 아미노산이 50 퍼센트가 유지되도록 하는 기술이다. CDR3(100a번) 잔기는 VH/VL 결합에 중요한 잔기로, RT11 항체의 Met 을 포함하여 생식선(germline)항체 서열에 있는 Phe, Ile, Leu 를 포함할 수 있는 WTK 디제너레이트 코돈을 사용하였다.
구체적으로, 친화도 개량 라이브러리에 사용한 경쇄가변영역은 세포질 침투능이 향상된 hT4-3 VL을 사용하였다.
구체적으로, 디자인된 라이브러리 코딩하는 DNA는 PCR 기법을 이용하여 증폭 후 에탄올 침전법을 사용하여 농축하였다. 상동성 접합(Homologous recombination)을 위한 c-말단에 aga2 단백질이 발현되는 효모표면발현 벡터(C-aga2)는 NheI과 MluI 제한효소를 처리하여 아가로스 젤 추출법을 이용하여 정제 및 에탄올 침전법을 이용하여 농축하였다. 각각 라이브러리 코딩 DNA 12 μg 에 대하여 제한효소 처리된 5 μg 벡터를 효모표면 발현용 효모 EBY100에 전기천공법으로 형질전환하였고 (Baek D.S and Kim Y.S, 2014), 계단식 희석(serial dilution)을 통해 선택배지 SD-CAA (20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids)에 자란 콜로니의 수를 측정하여 라이브러리 크기를 확인하였다.
실시예 3. GppNHp가 결합된 KRasG12D에 친화도가 개량된 중쇄가변영역(VH) 선별
GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D를 항원으로 이용하여 상기 실시예 2에서 구축된 RT11-3 기반 친화도 개량 라이브러리를 선별하였다.
구체적으로, 100 nM 수준의 정제된 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D를 SG-CAA (20 g/L Galactose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4,5 g/L casamino acids) 배지를 이용하여 세포 표면에 단일사슬 Fab (scFab) 형태의 중쇄가변영역 라이브러리 발현을 유도한 효모와 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 이후 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D와 결합된 라이브러리를 발현하는 효모를 스트렙타아비딘(Streptavidin) MicrobeadTM (Miltenyi Biotec)와 4 도에서 20분간 반응시킨 후 MACS (magnetic activated cell sorting)을 이용하여 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D에 고친화도를 가지는 중쇄가변영역을 발현하는 효모를 부유화하였다. 선별된 라이브러리를 발현하는 효모를 선택배지에서 배양 SD-CAA (20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids) 및 SG-CAA 배지에서 라이브러리 발현을 유도한 이후 1차 FACS 스크리닝을 위해 GppNHP가 결합된 Avi-KRasG12D와 in vivio biotinylation 되지 않은 GDP가 결합된 Avi-KRasG12D항원을 1:10 비율로 경쟁적으로 라이브러리가 발현된 효모와 1시간동안 상온에서 반응시킨 후 PE가 접합된 스트렙타비딘 (Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate, SA-PE) (Invitrogen)과 반응하여 FACS (Fluorescence activated cell sorting) (FACS Caliber) (BD biosciences)를 통해 부유화하였다. 이후 동일 방법으로 10 nM의 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D 항원과 in vivo biotinylation 되지 않은 GDP가 결합된 Avi-KRasG12D 항원의 비율을 1:100으로 2차 FACS 스크리닝을 하였으며, 이후 1 nM의 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D 항원과 in vivo biotinylation 되지 않은 GDP가 결합된 Avi-KRasG12D 항원의 비율 1:100 조건으로 3차 FACS 스크리닝을 진행하였다.
도 2a는 MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)와 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)을 이용한 선별과정을 통해서 Avi-KRasG12D·GppNHp에 특이적 부유화 (Enrichment)를 확인하기 위해 각 단계별 라이브러리 발현 효모에 대해서 10 nM Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 1000 nM Avi-KRasG12D·GDP와 결합능을 유세포 분석기 (FACS) 를 통해 분석한 결과이다. 이는 초고속 선별과정을 통해서 RT11-3과 비교하여 중쇄가변영역(VH) 의존적으로 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D에 대한 높은 친화도를 갖는 클론들이 선별되는 것을 확인하였다.
도 2b는 최종 선별된 라이브러리 중 각각 47개의 개별클론을 발현하는 효모에 대해서 5 nM Avi-KRasG12D·GppNHp와 결합능을 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
위와 같은 개별클론 결합능 분석을 통해 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D 에 고친화도 및 특이성을 갖는 6개의 유니크한 클론(RT21, RT22, RT23, RT24, RT25, RT26)을 선별하였다.
하기 표 1은 선별된 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D에 높은 결합능을 보이는 6개의 개별클론의 중쇄가변영역 서열이며, 표 2는 표 1의 중쇄가변영역들의 CDR 서열이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000001
Figure PCTKR2018014110-appb-T000002
실시예 4. 친화도가 개량된 항-Ras·GTP iMab 항원 결합능 분석
상기 중쇄가변영역 돌연변이가 도입된 세포질 침투 항체(cytotransmab)을 구축하기 위해 RT11기반으로 Ras·GTP에 대한 친화도가 개량된 중쇄가변영역과 중쇄불변영역(CH1-CH2-CH3)이 포함된 중쇄를 동물발현 벡터에 클로닝하고, 신생혈관세포 및 다양한 종양에서 과발현되는 인테그린(Integrin αvβ3 및 αvβ5)에 특이성을 갖는 RGD10 원형펩타이드를 세포질 침투 인간화 경쇄 hT4-3 경쇄의 N-말단에 GGGGS 2 개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하여 동물발현 벡터에 클로닝 하였다. RGD10 원형펩타이드의 경우, RGD4C 원형펩타이드와 유사한 친화도를 가지고 있지만 두 개의 시스테인에 의한 하나의 이황화결합만 존재하며, 유전공학적 융합이 가능하다는 특징이 있다. 위의 Ras·GTP에 대한 친화도가 개량된 중쇄 발현백터와 RGD10 원형펩타이드가 융합된 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터 (hT4-i3 LC)를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 친화도가 개량된 항-Ras·GTP iMab 돌연변이를 발현하였다.
구체적으로는, 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투 항체를 생산하기 위한 중쇄 발현벡터를 구축하기 위해 5’ 말단에 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 RT11을 기반으로 친화도가 개량된 상기 중쇄가변영역 돌연변이가 도입되며, 중쇄불변영역(CH1-CH2-CH3)을 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA 를 각각 pcDNA3.4 벡터에 NotI/HindIII)으로 클로닝하였다. 상기 중쇄 발현 벡터와 이전 세포질 침투 항체의 경쇄(출원번호: 10-2016-0065365)를 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하여 수율을 비교하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지에서 부유 성장하는 HEK293F 세포를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 2.0 × 106 세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37 도에서 배양하였다. 항체를 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10 ml FreeStyle 293 발현 배지에 중쇄 125 μg, 경쇄 125 μg 총 250 μg (2.5 μg/ml)으로 희석 및 필터하여, PEI 750 μg (7.5 μg/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10 분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100 ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 120 rpm, 8% CO2에서 배양 후, 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일동안 배양했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 6.5)로 완충액을 교환하며 농축을 진행했다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량했다.
도 3a는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 RT11 기반 Ras·GTP에 대한 친화도가 개량된 완전한 IgG 형태의 항-Ras·GTP iMab (RT22-i3) 구축을 설명한 모식도이다.
도 3b는 RT11 기반 친화도가 개량된 항-Ras·GTP iMab들의 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D와의 특이적 결합을 확인하기 위해, 각각 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp와 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
구체적으로, 항-Ras·GTP iMab인 RT11-i와 RGD 원형펩타이드가 융합된 6종의 친화도 향상 iMab을 96웰 EIA/RIA 플레이트의 각각 5 μg/ml의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % TBST (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1 % Tween20, 5 mM MgCl2) 로 10분간 3회 세척한다. 이후 4 % TBSB (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4% BSA, 10 mM MgCl2)로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % TBST로 10분간 3회 세척한다. GppNHp가 결합된 KRas 단백질과 GDP가 결합된 KRas 단백질을 4 % TBSB로 희석하여 100 nM, 10 nM, 1 nM 의 다양한 농도로 상온에서 1시간동안 결합시킨 후 0.1 % TBST로 10분간 3회 세척했다. 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution 로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
상기 ELISA 분석을 통해 기존 RT11-i3과 비교하여 선별된 6 종의 항-Ras·GTP iMab들이 보다 높은 항원 결합능을 보이는 것을 확인하였다.
도 3c는 KRas 돌연변이 대장암 세포주 SW480에 친화도가 개량된 항-Ras·GTP iMab들을 처리 후 세포내 활성화된 Ras와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에 SW480 세포주를 각각 웰 당 2x104 개를 0.5 ml에 희석하여 12 시간, 37 도, 5 % CO2 조건에서 배양한 후, TMab4-i, RT11-i와 6종의 친화도가 향상된 항-Ras·GTP iMab 1 μM을 처리하여 37 도, 12 시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 약산성용액(200 mM glycine, 150 mM NaCl pH 2.5)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거했다. PBS 세척 후, 4 % 파라포름알데히드 첨가 후 25 도 조건으로 10 분간 세포를 고정했다. 이후 PBS로 세척하고, PBS에 0.1 % 사포닌, 0.1 % 아지드화 나트륨, 1 % BSA가 첨가되어있는 완충액으로 25 도, 10 분간 배양하여 세포막에 구멍을 형성하는 과정을 거쳤다. 다시 PBS로 세척 후, 비특이적 결합을 억제하기 위해 PBS에 2% BSA가 첨가된 완충액으로 25 도에서 1 시간 동안 반응시켰다. 각 항체는 Alexa-488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하였으며, KRas 표지항체를 염색(적색형광) 공초점 현미경으로 관찰했다. TMab4-i3를 제외한 모든 항-Ras·GTP iMab은 세포내 Ras와 형광이 중첩되는 것을 확인하였다.
이중 세포내 활성화된 Ras와의 결합능을 보이며 ELISA 실험 진행시 Avi-KRasG12D·GppNHp와 가장 높은 결합능을 보이는 RT22-i3 iMab에 대해서 GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 Biacore2000 기기를 이용하여 수행하였다.
구체적으로는, RT22-i3를 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 20 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 1800 response units(RU)고정화하였다. 이후 Tris 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.01 % Tween 20)을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, GppNHp가 결합 GST-KRasG12D 완전체에 대해서 50 nM에서 3.125 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(20mM NaOH, 1M NaCl, pH10.0)을 30μl/min 유속으로 1분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
표 3은 SPR (BIACORE 2000)를 이용하여 GppNHp가 결합된 완전체 형태의 GST-KRasG12D에 대한 항-Ras·GTP iMab RT11-i와 RT22-i3의 친화도 분석 결과를 나타낸다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000003
실시예 5. RT22 중쇄가변영역(VH) 기반 추가 친화도 개량을 위한 라이브러리 구축 및 선별
Ras·GTP에 대한 결합능이 향상된 중쇄가변영역(RT22 VH)가 포함된 항-Ras·GTP iMab (RT22-i3)은 약 1.4 nM 수준의 높은 친화도를 보인다. 하지만 이는 세포막 수용체인 HSPG와 결합이 유지되고 있는 경쇄가변영역(hT4-3 VL)과 조합을 통해 선별되었다. HSPG는 대부분의 조직에 발현되어 있기 때문에, 조직 특이성을 부여하기 위해 HSPG와의 결합을 감소시키는 CDR1, CDR2에 생식선(germline) 항체 서열을 도입한 경쇄가변영역을 구축하였고, 이 경쇄가변영역을 이용하여 구축된 항-Ras·GTP iMab에서 RGD 원형펩타이드 융합시 심각한 생산 수율감소를 확인하였다. 이에 따라 조직특이성이 있는 경쇄가변영역과 결합된 형태로 중쇄가변영역(VH)의 CDR을 개량하여 친화도 및 생산수율 감소문제를 극복하고자 하였다.
HSPG와의 결합이 감소되고 조직특이성이 부여된 경쇄가변영역에 대한 설명은 하기에서 자세히 설명하였다.
도 4는 항-Ras·GTP iMab의 Ras·GTP에 대한 친화도 향상을 위해 RT22의 중쇄가변영역을 기반으로 구축된 라이브러리의 선별 및 구축전략을 나타낸 모식도이다.
친화도를 개량하기 위해 Galaxy 모델링을 이용하여 3차원 구조 모델을 분석하였고, 이를 토대로 항원 결합에 중요한 영향을 줄 것으로 생각되는 CDR2(55번~58번)와 CDR3(95번, 97번, 100a번)에 돌연변이를 부여하였다.
구체적으로 CDR2의 55번 잔기에는 기존 아미노산 서열이 16.67 % 확률로 유지되면서, 친수성을 가지거나, 음전하를 가지는 아미노산이 올 수 있도록 디제너레이션 코돈(VRC)을 사용하였으며, 57번 잔기에는 기존 아미노산 서열을 25 % 확률로 유지하면서 측쇄(side chain)의 크기와 방향을 고려했을 때, 항원과의 친화도를 높일 수 있도록 디제너레이션 코돈(MYT)을 사용하였다. CDR3의 95번 잔기의 경우 기존 아미노산 서열이 16.67 % 확률로 유지되면서 측쇄 크기, 방향을 고려하여 Ras·GTP와 결합능을 보존 또는 향상 시킬 수 있도록 디제너레이션 코돈(VST)을 사용하였으며, 100a 잔기의 경우 소수성의 아미노산이 올 수 있도록 디제너레이션 코돈(WTK)을 사용하였다. CDR2의 56번, 58번 잔기와 CDR3의 97번 잔기에 대해서는 상기 실시예 2에서 사용한 것과 같은 spiked 올리고머를 사용하였다. 이는 기존 야생형 RT22 VH 서열이 50 % 확률로 보존하면서 모든 아미노산이 적용될 수 있는 돌연변이 방법으로서 아미노산을 코딩하는 3개 뉴클레오타이드에서 각각 야생형 뉴클레오타이드를 79 퍼센트 유지하고 나머지 뉴클레오타이드 비율을 7 퍼센트로 프라이머를 디자인하므로써 PCR 과정에서 야생형 아미노산이 50 퍼센트가 유지되도록 하는 기술이다.
구체적으로는, 초기 RT22을 기반으로 한 라이브러리를 표면에 발현시키는 효모와 HSPG 결합능을 제거한 세포질 침투 경쇄(hT4-33 VL)를 분비하는 효모를 효모접합하여 Fab형태로 효모표면에 발현시켰다.
구체적으로 중쇄가변영역(VH) 라이브러리와 접합시킬 세포질 침투 경쇄가변영역(hT4-33 VL)을 분비하는 효모를 구축하기 위해 경쇄가변영역 효모 분비 백터인 pYDS-K에 세포질 침투능이 있고 HSPG 결합능이 줄어든 hT4-33 VL를 코딩하는 DNA를 제한효소 NheI과 BsiWI을 사용하여 클로닝한 pYDS-K-hT4-33 VL을 전기천공법으로 접합α타입(mating α type)의 효모접합 균주인 YVH10균주에 형질전환하여 선택배지 SD-CAA+Trp (20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids, 0.4 mg/L tryptophan) (SIGMA)에서 선별 배양한 효모와 효모접합하였다.
구체적으로 효모 접합의 경우, 600 nm에서 흡광도가 1일 때, 1 X 107의 효모가 있다. 배양된 효모 중 RT22를 기반으로 한 중쇄가변영역 라이브러리가 발현된 효모와 hT4-33 VL을 포함하고 있는 효모를 각각 1.5 X 107씩 섞고, YPD (20 g/L Dextrose, 20 g/L peptone, 10 g/L yeast extract, 14.7 g/L sodium citrate, 4.29 g/L citric acid, pH 4.5) (SIGMA)로 3회 세척 후, YPD 100 μl로 재부유(resuspension)하여 YPD 플레이트 위에 퍼지지 않도록 드랍한 이후 건조하여 6시간동안 30 도에서 배양한다. 이후 YPD 배지로 건조된 효모 도말 부위를 3번 세척 이 후 최종 효모농도 1 × 106이하가 되도록 선택배지 SD-CAA배지에서 30 도, 24 시간 배양하여 접합된 효모만 선별한다.
실시예 6. RT22를 기반으로 GTP가 결합된 KRasG12D에 고특이적 결합능을 보이는 중쇄가변영역(VH) 선별
상기 실시예 1과 같은 방법으로 in vivo biotinylation 시킨 Avi-KRasG12D 단백질에 GTP 유사체인 GppNHp를 결합시켜 라이브러리 선별에 사용하였다. 1차 MACS 선별을 위해 100 nM 농도의 상기 항원을 효모 표면에 발현된 Fab 라이브러리와 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 이후 항원과 결합된 Fab 라이브러리를 발현하는 효모를 스트렙타비딘(Streptavidin) MicrobeadTM와 4 도에서 20분간 반응시킨 후 MACS (magnetic activated cell sorting)을 이용하여 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D에 고친화도를 가지는 중쇄가변영역을 발현하는 효모를 부유화(enrichment)하였다. 선별된 라이브러리를 발현하는 효모를 선택배지(SD-CAA+URA, 20 g/L D-glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4,5 g/L casamino acids, 0.2 mg/L Uracil)에서 배양 및 SG-CAA+URA (20 g/L Galactose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids, 0.2 mg/L Uracil) 배지에서 라이브러리 발현을 유도한 이후 1차부터 3차까지 FACS 선별을 진행하였다.
최종 1차의 MACS와 3차 FACS 선별된 라이브러리를 상기 실시예 3과 같은 방법으로 각각 47개의 개별클론을 분석한 결과 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D 단백질에 고친화도를 갖는 7종의 고유의 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역을 선별하였다.
하기 표 4은 RT22를 주형으로 한 상기 친화도 개량 라이브러리로부터 선별된 7 종의 고유한 아미노산 서열을 갖는 개별클론들의 중쇄가변영역(VH) 서열이다.
하기 표 5는 상기 선별된 중쇄가변영역(VH)들의 CDR 1, 2 및 3의 서열이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000004
Figure PCTKR2018014110-appb-T000005
실시예 7. RT22 기반 친화도 개량된 항-Ras·GTP iMab들의 발현, 정제 및 GppNHp가 결합된 KRasG12D와의 결합능 분석
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 RT22 기반 라이브러리로부터 선별된 중쇄가변영역을 중쇄 동물발현 벡터에 클로닝하고, 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터와 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 개별클론을 발현하였고, 상기 실시예 4와 동일하게 정제하였다. 7 종의 친화도가 개량된 중쇄가변영역 중 RT32, RT35 클론의 경우 CDR2 서열에 시스테인(Cysteine)이 포함되어 있어, IgG로 정제 시 단일체로 존재하지 못하고 비자연적 이황화 결합을 통한 이중체 또는 올리고머를 형성할 가능성이 있어 발현 정제에서 제외하였다.
상기 RT22 기반 친화도가 향상된 중쇄가변영역을 RGD 원형펩타이드가 융합된 형태의 HSPG 결합능 저해 및 CDR3에 WYW 돌연변이 도입을 통한 엔도좀 탈출능이 향상된 경쇄가변영역(hT4-i33 VL: 서열번호 38)과 조합하여 발현하였다. 상기 서열번호 38인 HSPG와의 결합이 감소되고 조직특이성이 부여된 경쇄가변영역(hT4-i33 VL)에 대한 설명은 하기에서 자세히 설명하였다.
발현 결과, 주형으로 사용한 RT22-i33과 동일하게 친화도가 개량된 항-Ras·GTP iMab들 또한 상기 실시예3과 마찬가지로 L당 1 mg 수준의 낮은 생산 수율을 보였다.
도 5a는 RT22 기반 친화도가 개량된 중쇄가변영역(VH)들을 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i33)과 조합된 항-Ras·GTP iMab 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 결과이다.
구체적으로는, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 개별클론 들이 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 확인하였다.
도 5b는 상기 RT22 기반 친화도가 개량된 중쇄가변영역(RT31 VH, RT33 VH, RT34 VH)와 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i33)과 조합된 항-Ras·GTP iMab들의 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D와의 특이적 결합을 확인하기 위해, 각각의 항-Ras·GTP iMab와 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
구체적으로 실시예 4와 동일한 방법으로, 항-Ras·GTP iMab인 RT11와 라이브러리 주형으로 사용된 RT22-i33을 대조군으로 사용하였으며, RGD 원형펩타이드가 융합된 5종의 친화도 향상 iMab을 96웰 EIA/RIA 플레이트의 각각 5 μg/ml의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % TBST (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1 % Tween20, 5 mM MgCl2) 로 10분간 3회 세척한다. 이후 4% TBSB (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4% BSA, 10 mM MgCl2)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% TBST로 10분간 3회 세척한다. GppNHp가 결합된 KRas 단백질은 100 nM, 10 nM, 1 nM 의 다양한 농도로, GDP가 결합된 KRas 단백질은 100 nM 농도로 4 % TBSB로 희석하여 상온에서 1시간동안 결합시킨 후 0.1 % TBST로 10분간 3회 세척했다. 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution 로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
도 5c는 상기 RT22 기반 친화도가 개량된 중쇄가변영역(RT31 VH, RT36 VH, RT37 VH)와 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i33)과 조합된 항-Ras·GTP iMab들의 GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D와의 특이적 결합을 확인하기 위해, 각각의 항-Ras·GTP iMab와 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
구체적으로 실시예 4와 동일한 방법으로, 항-Ras·GTP iMab인 RT11와 라이브러리 주형으로 사용된 RT22-i33을 대조군으로 사용하였으며, RGD 원형펩타이드가 융합된 5종의 친화도 향상 iMab을 96웰 EIA/RIA 플레이트의 각각 5 μg/ml의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % TBST (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1 % Tween20, 5 mM MgCl2) 로 10분간 3회 세척한다. 이후 4% TBSB (12 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4 % BSA, 10 mM MgCl2)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% TBST로 10분간 3회 세척한다. GppNHp가 결합된 KRas 단백질은 100 nM, 10 nM, 1 nM 의 다양한 농도로, GDP가 결합된 KRas 단백질은 100 nM 농도로 4 % TBSB로 희석하여 상온에서 1시간동안 결합시킨 후 0.1 % TBST로 10분간 3회 세척했다. 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution 로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
또한, 상기 ELISA를 통해 RT22-i33보다 높은 항원 결합능을 보이는 친화도 개량 항-Ras·GTP iMab들에 대해서 GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 정량적 친화도를 분석하기 위해 BIACORE2000 기기를 이용하여 분석하였다.
구체적으로는, 실시예 4와 동일한 방법으로 대조군으로 RT22-i33을 사용하였으며, RT31-i33, RT34-i33, RT36-i33을 10 mM Na-아세테이트 완충액(pH 4.0)에 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 1600 response units(RU)고정화하였다. Tris 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.01 % Tween 20)을 30μl/min 유속으로 분석하였으며, GppNHp가 결합된 KRasG12D 를 100 nM에서 6.25 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0)을 30 μl/min 유속으로 1.5분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
하기 표 6은 SPR (BIACORE2000) 기기를 이용하여 GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 친화도 개량된 항-Ras·GTP iMab의 친화도를 분석한 결과이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000006
상기 결과를 통해 RT22 VH 기반 친화도가 향상된 항-Ras·GTP iMab인 RT31-i33, RT34-i33, RT36-i33 모두 기존 RT22-i33 보다 높은 친화도를 보이는 것을 확인하였다.
실시예 8. 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 및 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역(VL) 개발 논리.
기존 특허(등록번호: 10-1602870, 10-1602876)에서 세포질 침투 항-Ras·GTP iMab은 기존 세포질 침투능을 갖고 있는 세포질 침투 항체(cytotransmab)의 중쇄가변영역을 Ras·GTP에 고특이적 결합능을 갖는 중쇄가변영역(VH)로 치환하여 구축되었다. 세포질 침투 항체(cytotransmab)은 경쇄가변영역(VL)에 의한 세포질 침투가 가능한 항체로서, 세포 표면의 HSPG(Heparan sulfate proteoglycan)과의 결합을 통해서 세포 침투가 시작된다. 하지만 HSPG는 정상 세포에서도 많이 발현되어 있는 세포표면 단백질이므로, 종양조직 특이적으로 세포질 침투가 가능하게 개량하기 위해 HSPG 결합능을 억제할 필요가 있다.
따라서 본 연구진은 세포질 침투 항체(cytotransmab)의 경쇄가변영역(VL) hT4 VL 중 HSPG 결합에 기여할 것으로 예상하는 CDR1과 CDR2를 인간 유래 생식선 서열 중에서 아미노산 개수가 같고, 세포내재화를 담당하는 CDR1의 양이온 패치 서열이 포함되지 않은 아미노산 서열을 가지는 CDR 서열로 치환하였다. 이 때, 기존 경쇄가변영역 안정성에 중요하다고 알려진 아미노산은 보존하였다.
이러한 논리로 개발된 경쇄가변영역은 hT4-03 이다 (출원번호: 10-2016-0065365).
추가적으로 이 경쇄가변영역의 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위하여, 경쇄가변영역(VL) 92-94 번 잔기에 WYW (Trp-Tyr-Trp) 이 위치하는 CDR3를 도입하였으며 (출원번호: 10-2016-0065365), WYW 도입으로 인해서 소수성 잔기들이 용매 노출정도가 높아짐에 따라 생산수율이 낮아지는 것을 극복하기 위해 경쇄가변영역(VL)과 중쇄가변영역(VH)의 인터페이스에 해당하는 경쇄가변영역 골격부위(Framework) 87번 잔기를 페닐알라닌(Phe)로 치환하였다 (출원번호: 10-2016-0065365).
이를 hT4-33 경쇄가변영역(VL) 으로 명명하였다.
표 7은 overlapping PCR 기법을 사용하여 구축한 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 및 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역(hT4-33 VL)의 서열 및 명칭이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000007
실시예 9. 종양조직 특이적 세포 표면 단백질 표적 및 세포내재화를 위한 원형펩타이드 선정.
hT4 VL을 사용한 항-Ras·GTP iMab인 RT11은 세포 내부로 들어가 세포 내 Ras·GTP와 결합하여 종양 성장 억제능을 보이지만, HSPG 결합능을 가지고 있어 종양 조직 특이성이 낮다는 단점을 가지고 있다. 이를 극복하기 위하여 상기의 실시예 8을 통해 HSPG 결합능이 감소된 경쇄를 얻었고, 상기 실시예들과 같이 인테그린 수용체를 표적하기 위한 RGD10 원형펩타이드가 N-말단에 융합된 경쇄가변영역이 도입된 iMab 형태로 실험하였다.
추가적으로, integrin 표적 원형펩타이드 이외에 종양 조직 특이성을 부여하기 위한 다양한 원형펩타이드를 선정하였다.
EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule) 수용체는 주로 대장암 세포에 과발현 되는 수용체로서 항-Ras·GTP iMab의 종양 특이성을 부여시 적합한 세포막에 위치한 표적이다. 이에 EpCAM 수용체를 표적할 수 있는 Ep133 원형펩타이드 (EHLHCLGSLCWP) (출원번호: US 14/428,017)가 N-말단에 융합된 형태의 경쇄가변영역을 구축하였다.
표 8은 종양조직 특이적 세포 표면 단백질 표적 및 세포내제화를 위한 원형펩타이드들의 서열 및 명칭이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000008
실시예 10. 종양조직 특이적 세포질 침투 위한 표적 원형펩타이드가 융합된 경쇄가변영역(VL) 도입된 항-Ras·GTP iMab 구축 및 정제.
도 6은 integrin 또는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 친화도가 개량된 완전한 IgG 형태의 항-Ras·GTP iMab (RT22-i33, RT22-ep33) 구축을 설명한 모식도이다.
구체적으로는, 원형펩타이드가 융합된 iMab 의 동물세포 발현을 위해 경쇄가변영역 (VL) hT4-33의 N-말단에 G4S 링커 2개를 사용하여 유전공학적으로 융합하였다. 이 후 원형펩티이드 융합된 hT4-33 경쇄가변영역과 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA 를, 5’ 말단에 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된, pcDNA3.4 벡터에 NotI/BsiWI)으로 클로닝하였다.
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 GTP가 결합한 Ras와 특이적 결합능을 보이는 중쇄가변영역(RT22 VH)와 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 개별클론을 발현하였고, 상기 실시예 4와 동일하게 정제하였다.
표 9은 종양조직 특이적 원형펩타이드가 유전공학적으로 융합된 경쇄가변영역(VL)을 포함하고 있는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab 의 생산 수율을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000009
Integrin 또는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 항-Ras·GTP iMab의 생산 수율이 1 L당 1 mg 수준으로 현격히 낮은 결과를 확인하였다.
실시예 11. RT22-i33 MG, RT22-ep33 MG 의 세포내 Ras·GTP와 특이적 결합 확인
도 7은 KRas 돌연변이 대장암 세포주 SW480에 integrin 또는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합된 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 친화도가 개량된 완전한 IgG 형태의 항-Ras·GTP iMab (RT22-33 (1μM), RT22-i33 MG (0.5μM), RT22-ep33 MG (1μM)) 및 대조군 cytotransmab (CT-33 (1μM), CT-i33 MG (0.5μM), CT-ep33 MG (1μM))을 처리 후 세포내 활성화된 Ras와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
구체적으로, 실시예 4와 동일하게 SW480 세포를 준비하고, RT22-33 1 μM, RT22-i33 MG 0.5 μM, RT22-ep33 MG 1 μM, CT-33 1 μM, CT-i33 MG 0.5 μM, CT-ep33 MG 1 μM을 처리하여 37 도, 12 시간 배양하였다. 이후 상기 실시예 4와 동일한 조건으로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰했다. 세포내제화가 되지 않는 RT22-33를 제외한 RT22-i33 MG, RT22-ep33 MG 은 세포내 Ras와 형광이 중첩되는 것을 확인하였다. 또한, 세포내 Ras를 표적하지 않는 CT-33, CT-i33 MG, CT-ep33 MG 의 경우, 세포내 Ras 와 형광이 중첩되지 않음을 확인하였다.
실시예 12. 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 수율 향상을 위한 경쇄가변영역(VL) CDR1, CDR2의 돌연변이체 디자인
실시예 10에서 분석한 결과와 같이 기존 HSPG 결합능을 보이는 경쇄가변영역(hT4-3 VL)에 원형펩타이드 융합시 생산 수율이 감소하지 않았으나, HSPG 와의 결합능을 감소시킨 경쇄가변영역(hT4-33 VL)와 원형펩타이드 융합시 생산 수율이 감소하는 경향을 확인하였고, 이에 추가적으로 종양조직 특이인식 원형펩타이드(RGD10, Ep133)와 융합시 생산수율을 향상시키기 위해 HSPG 결합능에 큰 영향을 미치는 경쇄가변영역(VL)의 CDR1과 CDR2를 개량하였다.
구체적으로, HSPG에 대한 낮은 결합능을 유지하기 위해 hT4 VL의 경쇄가변영역 CDR1의 루프구조 형성에 영향을 줄 것으로 생각이 되는 27c번 페닐알라닌(Phenylalanine) 잔기를 HSPG 결합능이 감소한 경쇄가변영역에서 보존되어 있는 류신(Leucine)으로 돌연변이를 공통적으로 주었고, 공간적(canonical) 구조상 CDR1 루프구조의 첨단 부분에 위치하여 측쇄가 노출될 것으로 예상되는 27f번~30번 잔기에 각각 돌연변이를 주었다.
구체적으로, hT4-34 VL의 경우 hT4 VL을 주형으로하여 경쇄가변영역의 CDR1, CDR2 중 CDR1의 루프구조 형성에 영향을 줄 것으로 생각이 되는 27c번 잔기만 점돌연변이를 주었다.
구체적으로, hT4-35, hT4-36, hT4-37 VL은 HSPG 결합능이 크게 감소한 hT4-33 VL을 주형으로 각각의 전략에 따라 돌연변이를 도입하였다. hT4-35 VL의 경우 CDR1의 27d번, 27f번의 아스파테이트(Aspartate)잔기를 각각 hT4 VL에서 보존되어 있는 아스파라진(Asparagine)과 아르지닌(Arginine)으로 돌연변이를 주었다. hT4-36 VL의 경우 CDR1의 27d번 아스파테이트(Aspartate)와 29번 글라이신(Glycine)잔기를 각각 아스파라진(Asparagine)과 아르지닌(Arginine)으로 돌연변이를 주었고, hT4-37 VL은 CDR1의 27d번 아스파테이트(Aspartate)와 30번 아스파라진(Asparagine)을 각각 아스파라진(Asparagine)과 라이신(Lysine)으로 돌연변이를 주었다. 상기 잔기 번호는 Kabat 번호에 따른다.
구체적으로, hT4-38 VL의 경우, hT4 VL의 서열을 유지하였을 때 수율이 증가했던 27f번 아르지닌(Arginine)과, 30번 라이신(Lysine)을 보존하면서 29번 아르지닌(Arginine)을 hT4-33 VL 서열인 글라이신(Glycine)으로 돌연변이를 주었고, 31번 아스파라진(Asparagine) 역시 hT4-33 VL 서열에 존재하는 스레오닌(Threonine)으로 돌연변이를 주어 HSPG 결합능을 최대한 낮출 수 있도록 디자인 하였다. hT4-39 VL의 경우 상기 hT4-38 VL과 마찬가지로 27f번 아르지닌(Arginine)과, 30번 라이신(Lysine)을 보존하면서 28번 스레오닌(Threonine)을 아스파테이트(Aspartate)로, 29번 아르지닌(Arginine)을 글라이신(Glycine)으로 hT4-33 VL에 보존되어 있는 서열을 사용하여 최대한 HSPG 결합능을 낮출 수 있도록 구축하였다.
하기 표 10는 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 및 원형펩타이드 융합 시 생산수율 증가를 위한 돌연변이가 들어간 경쇄가변영역(VL)의 서열이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000010
실시예 13. 생산수율 향상 및 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역(VL) CDR1, CDR2의 돌연변이체가 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 HSPG 결합능 확인
상기 실시예 12에서 구축한 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 경쇄가변영역(VL) CDR1, CDR2의 돌연변이체가 도입된 항-Ras·GTP iMab의 HSPG 결합능이 기존 hT4 경쇄를 사용하고 있는 Cytotransmab(TMab4)와 비교하여 어느정도 감소하였는지 공초점 현미경과 세포기반 ELISA를 이용하여 관찰하였다.
도 8a는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능 및 세포질 침투능이 감소 혹은 제거되었는지 항체 1 μM을 37 도에서 6 시간 동안 HeLa 세포에 처리하고 공초점 현미경을 통하여 확인한 결과 및 Alexa488 (녹색형광) 형광을 정량한 막대그래프이다.
구체적으로는, HSPG를 발현하고 있는 HeLa 세포주를 24 웰 플레이트에 각 웰 당 5x104 개로 10 % FBS가 포함된 배지 0.5 ml로 넣어 12 시간 동안 5 % CO2, 37 도 조건에서 배양했다. 세포가 안정화되면, PBS, TMab4, RT22-33, RT22-34, RT22-35, RT22-36, RT22-37, RT22-38, RT22-39, CT-33, CT-38, CT-39을 1 μM을 37 도에서 6 시간 동안 배양했다. 상기 실시예 4와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다. 각 항체는 Alexa488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. 그리고 Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰했다.
상기 결과를 통해서 HSPG를 통해 세포질에 위치하는 항-Ras·GTP iMab은 TMab4 (100%), RT22-34 (40 %), RT22-36 (25 %), RT22-38 (26 %), RT22-39 (19 %), RT22-37 (15.5 %), RT22-35 (12.4 %), RT22-33 (6.8 %) 순으로 형광 세기가 관찰되었다.
도 8b는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능을 확인하기 위해, HSPG를 발현하는 HeLa 세포주에서 비특이적 세포 표면 결합 ELISA 를 수행한 결과이다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 바닥 전체에 세포가 꽉 채워지도록 HeLa (HSPG+) 세포주를 배양한 후, 세척 버퍼 (HBSS buffer, 50 mM HEPES)로 3회 세척한다. 그 후, 블로킹 버퍼 (HBSS buffer, 50 mM HEPES, 1 % BSA) 에 TMab4, RT22-33, RT22-34, RT22-35, RT22-36, RT22-37, RT22-38, RT22-39, CT-33, CT-38, CT-39을 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 ng/ml 농도로 희석하여 4 도에서 2시간 동안 배양했다. 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 표지항체로 HRP가 접합된 항-인간 항체 (HRP-conjugated anti-human mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution으로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
도 8a와 동일한 경향으로, TMab4, RT22-34, RT22-38, RT22-36, RT22-39, RT22-37, RT22-35, RT22-33 순으로 세포표면 결합능이 측정되었다.
도 8c는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab의 HSPG 결합능을 확인하기 위해, 항체 500 nM 을 HeLa 세포주에서 처리한 후 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1x105 개의 HeLa (HSPG+) 세포를 준비한다. 세포를 PBSF (PBS buffer, 2 % BSA) 에 TMab4, RT22-33, RT22-34, RT22-35, RT22-36, RT22-37, RT22-38, RT22-39 500 nM을 넣어 4 도에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 각 항체는 Alexa488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체와 4 도 조건에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, 공초점 현미경 결과와 동일한 경향으로, TMab4, RT22-34, RT22-38, RT22-36, RT22-39, RT22-37, RT22-35, RT22-33 순으로 세포에 결합하는 형광 세기가 측정되었다.
상기 결과를 통해 HSPG 결합능이 40 % 남아있는 hT4-34 경쇄를 이용한 항-Ras·GTP iMab은 이후 생화학적 동정 실험에서 사용하지 않았다.
실시예 14. 생산수율 향상 및 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역(VL) CDR1, CDR2의 돌연변이체가 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 발현 및 정제
상기 실시예 10과 동일하게 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 및 원형펩타이드 융합 시 생산수율 증가를 위한 돌연변이가 들어간 경쇄가변영역(VL)에 MG 링커를 이용하여 RGD 원형펩타이드 또는 Ep133 원형펩타이드를 유전공학적으로 결합하여 클로닝하였다.
하기 표 11는 integrin 표적 원형펩타이드가 융합된, 생산수율 향상 및 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역(VL)의 서열이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000011
하기 표 12은 EpCAM 표적 원형펩타이드가 융합된, 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 돌연변이가 들어간 경쇄가변영역(VL)의 서열이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000012
상기 실시예 4와 동일하게 RT22 중쇄 동물발현 벡터와 종양조직 특이성 부여를 위한 integrin 표적 원형 펩타이드 융합 및 생산수율 향상을 위한 CDR1, CDR2 돌연변이를 포함한 경쇄가변영역을 포함하는 경쇄 발현백터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하였고, 이후 항제 정제 과정은 상기 실시예 4와 동일하게 정제하였다.
또한 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 경쇄가변영역(VL) CDR1, CDR2의 돌연변이체가 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab들이 GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 정량적 친화도를 BIACORE2000 기기를 이용하여 분석하였다.
구체적으로는, RT22-i35 MG, RT22-i37 MG, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep37 MG, RT22-ep38 MG, RT22-ep39 MG를 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 20 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 1800 response units(RU) 고정화하였다. 이후 Tris 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.01 % Tween 20)을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, GppNHp가 결합 GST-KRasG12D 완전체에 대해서 50 nM에서 3.125 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석후 CM5 칩의 재생(regeneration)은 완충액(20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0)을 30 μl/min 유속으로 1분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
하기 표 13은 각 hT4-i33, hT4-ep33과 생산 수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2의 돌연변이가 도입된 경쇄(hT4-i34 MG ~ hT4-i39 MG 및 hT4-ep34 MG ~ hT4-ep39)를 RT22 중쇄와 조합하여 함께 발현했을 때의 항-Ras·GTP iMab 및 TMab4 중쇄와 조합하여 함께 발현했을 때의 cytotransmab 생산 수율 및 SPR을 (BIACORE2000) 기기를 이용하여 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 친화도를 분석한 결과이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000013
생산수율 향상을 위한 경쇄가변영역(VL) CDR1, CDR2의 돌연변이체가 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab 들의 GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 친화도가 달라지지 않았음을 확인하였다.
상기 결과를 통해 생산수율이 증가하지 않은 hT4-36 경쇄를 이용한 항-Ras·GTP iMab은 이후 생화학적 동정 실험에서 사용하지 않았다.
실시예 15. 생산수율 향상 및 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역(VL) CDR1, CDR2의 돌연변이체가 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 결합능 분석.
도 9a는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역(hT4-i33 MG~hT4-i37 MG VL)을 포함한 항 Ras·GTP iMab의 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
구체적으로, CDR1, CDR2 돌연변이 경쇄에 의한 항원 결합능을 비교하기 위해 GppNHp와 결합하는 중쇄가변영역은 RT22 VH로 고정하여 RT11, RT22-i33 MG, RT22-i34 MG, RT22-i35 MG, RT22-i36 MG, RT22-i37 MG로 수행하였다.
구체적으로, 실시예 4와 동일한 방법으로 ELSIA를 수행하였으며, 상기 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄를 갖는 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab들을 96웰 EIA/RIA 플레이트에 고정 후 GppNHp가 결합된 KRas 단백질은 100 nM, 10 nM, 1 nM 의 다양한 농도로, GDP가 결합된 KRas 단백질은 100 nM 농도 결합시킨 후 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution 로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
항원 결합능을 ELISA로 분석한 결과, CDR1의 양이온 패치를 그대로 유지하고 있는 hT4-i34 VL에서 기존 RT22-i33과 비교하였을 때 중쇄가 동일한 상태에서 경쇄에 의한 GppNHp가 결합된 KRasG12D 항원과의 결합능이 향상되는 것을 확인하였다.
도 9b는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역(hT4-i38 MG~hT4-i39 MG VL)을 포함한 항 Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
구체적으로, 실시예 4와 동일한 방법으로 ELSIA를 수행하였으며, 상기 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄를 갖는 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab들을 96웰 EIA/RIA 플레이트에 고정 후 GppNHp가 결합된 KRas 단백질은 100 nM, 10 nM, 1 nM 의 다양한 농도로, GDP가 결합된 KRas 단백질은 100 nM 농도 결합시킨 후 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution 로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
항원 결합능을 ELISA로 분석한 결과, hT4-38, hT4-39 경쇄가변영역을 사용하였을 때 기존 RT11-i와 비교하여 GppNHp가 결합된 KRasG12D 항원과의 결합능이 향상되는 것을 확인하였다.
도 9c는 KRas 돌연변이 대장암 세포주 SW480에 integrin 또는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG에 대한 결합능이 저해된 경쇄가변영역(VL)을 포함한 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab들을 0.5 μM 농도로 37 도에서 12시간 처리 후 세포내 활성화된 Ras와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
구체적으로, 실시예 4와 동일하게 SW480 세포를 준비하고 CT-i33 MG (=TMab4-i33 MG), CT-i38 MG, CT-i39 MG, RT22-i33 MG, RT22-i34 MG, RT22-i35 MG, RT22-i36 MG, RT22-i37 MG, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, CT-ep33 MG, CT-ep38 MG, CT-ep39 MG, RT22-ep38 MG, RT22-ep39 MG 1 μM을 처리하여 37 도, 12 시간 배양하였다. 이후 상기 실시예 4와 동일한 조건으로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰했다. CT-i33 MG, CT-i38 MG, CT-i39 MG, CT-ep33 MG, CT-ep38 MG, CT-ep39 MG을 제외한 RT22-i33 MG, RT22-i34 MG, RT22-i35 MG, RT22-i36 MG, RT22-i37 MG, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep38 MG, RT22-ep39 MG 은 세포내 Ras와 형광이 중첩되는 것을 확인하였다.
실시예 16. 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역(VL) 돌연변이체의 구축
상기 실시예 12에서 구축된 경쇄가변영역(VL) CDR1 돌연변이체들은 기존 hT4-33 비해 종양 조직 특이성 부여를 위한 원형펩타이드가 결합되었을 때 수율이 증가하였지만, 가장 좋은 생산 수율을 보이는 Ep133 원형 펩타이드가 결합된 항체(RT22-ep38 MG, RT22-ep39 MG)는 RGD10 원형 펩타이드가 결합된 항체(RT22-i38 MG, RT22-i39 MG)보다 2배가량 낮은 생산수율을 보였다. 따라서, Ep133 원형 펩타이드가 결합된 항체에서 보다 안정성을 높이고 더 높은 수율을 확보하기 위해서 추가적인 경쇄가변영역(VL) 항체골격 부분의 돌연변이체를 구축하였다.
구체적으로, 인간 완전 IgG 형태의 항체에서 사용되는 경쇄의 경우 항체골격 부분인 2번, 3번 서열이 인간 유래 생식선 서열에서 많이 존재하고 있는 아이소류신(Isoleucine)과 글루타민(Glutamine)이 대부분 존재하고 있지만, 항-Ras·GTP iMab에 사용되고 있는 경쇄에는 2번, 3번 서열이 류신(Leucine)과 발린(Valine)으로 보존되어 있다. 이 2번과 3번 서열을 인간 완전 IgG 형태의 항체에서 주로 존재하고 있는 아이소류신(Isoleucine)과 글루타민(Glutamine)으로 돌연변이를 주어 안정성과 수율을 높일 수 있도록 경쇄가변영역(VL) 항체골격 돌연변이체를 구축하였다.
하기 표 14은 hT4-38와 hT4-39 기반 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역(VL) 및 EpCAM 표적 원형펩타이드를 융합한 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역(VL)의 서열정보이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000014
실시예 17. 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역(VL) 돌연변이체가 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 발현 및 정제
상기 실시예 10와 동일한 방법으로 RT22 중쇄 동물발현 벡터와 종양조직 특이성 부여를 위한 EpCAM 표적 원형 펩타이드 융합 및 생산수율 향상을 위한 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역을 포함하는 경쇄 발현백터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하였다. 이후 항제 정제 과정은 상기 실시예 4와 동일하게 정제하였다.
이후 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역 (VL) 이 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab들이 GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 정량적 친화도를 BIACORE2000 기기를 이용하여 분석하였다.
구체적으로는, RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG를 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 20 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 1800 response units(RU)고정화하였다. 이후 Tris 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.01 % Tween 20)을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, GppNHp가 결합 GST-KRasG12D 완전체에 대해서 50 nM에서 3.125 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0)을 30 μl/min 유속으로 1분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
하기 표 15는 종양조직 특이성 부여를 위한 EpCAM 표적 원형 펩타이드 융합 및 생산수율 향상을 위한 항체골격 부분의 돌연변이가 도입된 경쇄(hT4-ep58 MG, hT4-ep59 MG)를 RT22 중쇄와 조합하여 함께 발현했을 때의 항-Ras·GTP iMab 및 TMab4 중쇄와 조합하여 함께 발현했을 때의 cytotransmab 의 생산 수율 및 SPR을 (BIACORE2000) 기기를 이용하여 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 친화도를 분석한 결과이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000015
생산수율 향상을 위한 경쇄가변영역(VL) CDR1, CDR2의 돌연변이체가 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab인 RT22-ep38 MG, RT22-ep59 MG와 비교하였을 때, GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 친화도가 달라지지 않았음을 확인하였다.
도 10a는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역 (hT4-ep58 MG~hT4-ep59 MG VL)을 포함한 항 Ras·GTP iMab의 1, 10, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
구체적으로, 실시예 4와 동일한 방법으로 ELSIA를 수행하였으며, 상기 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄를 갖는 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab들을 96웰 EIA/RIA 플레이트에 고정 후 GppNHp가 결합된 KRas 단백질은 100 nM, 10 nM, 1 nM 의 다양한 농도로, GDP가 결합된 KRas 단백질은 100 nM 농도 결합시킨 후 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution 로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
항원 결합능을 ELISA로 분석한 결과, hT4-58, hT4-59 경쇄가변영역을 사용하였을 때 기존 RT11-i와 비교하여 GppNHp가 결합된 KRasG12D 항원과의 결합능이 향상되는 것을 확인하였다.
도 10b는 KRas 돌연변이 대장암 세포주 SW480에 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 hT4-38와 hT4-39 기반 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄(hT4-58, hT4-59)을 포함한 항 Ras·GTP iMab (RT22-ep58, RT22-ep59)를 1 μM 농도로 37 도에서 12시간 처리후 세포내 활성화된 Ras와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에 SW480 세포주를 각각 웰 당 2×104 개를 0.5 ml에 희석하여 12 시간, 37 도, 5 % CO2 조건에서 배양한 후, CT-ep58 MG와 친화도가 향상된 항-Ras·GTP iMab RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG 1 μM을 처리하여 37 도, 12 시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 약산성용액(200 mM glycine, 150 mM NaCl pH 2.5)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거했다. PBS 세척 후, 4 % 파라포름알데히드 첨가 후 25 도 조건으로 10 분간 세포를 고정했다. 이후 PBS로 세척하고, PBS에 0.1 % 사포닌, 0.1 % 아지드화 나트륨, 1 % BSA가 첨가되어있는 완충액으로 25 도, 10 분간 배양하여 세포막에 구멍을 형성하는 과정을 거쳤다. 다시 PBS로 세척 후, 비특이적 결합을 억제하기 위해 PBS에 2 % BSA가 첨가된 완충액으로 25 도에서 1 시간 동안 반응시켰다. 각 항체는 Alexa-488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하였으며, KRas 표지항체를 염색(적색형광) 공초점 현미경으로 관찰했다. CT-ep59를 제외한 모든 항-Ras·GTP iMab은 세포내 Ras와 현광이 중첩되는 것을 확인하였다.
실시예 18. 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역(VL) 돌연변이체가 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 HSPG 결합능 확인
상기 실시예 17에서 구축한 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역(VL) 돌연변이체가 도입된 도입된 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능이 기존 hT4 경쇄를 사용하고 있는 Cytotransmab(TMab4)와 비교하여 어느정도 감소하였는지 공초점 현미경과 세포기반 ELISA를 이용하여 관찰하였다.
도 11a는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능 및 세포질 침투능이 감소 혹은 제거되었는지 항체 1 μM을 37 도에서 6 시간 동안 HeLa 세포에 처리하고 공초점 현미경을 통하여 확인한 결과 및 Alexa488 (녹색형광) 형광을 정량한 막대그래프이다.
구체적으로는, HSPG를 발현하고 있는 HeLa 세포주를 24 웰 플레이트에 각 웰 당 5x104 개로 10 % FBS가 포함된 배지 0.5 ml로 넣어 12 시간 동안 5 % CO2, 37 도 조건에서 배양했다. 세포가 안정화되면, PBS, TMab4, Avastin, RT22-58, RT22-59, CT-58, CT-59을 1 μM을 37 도에서 6 시간 동안 배양했다. 상기 실시예 4와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다. 각 항체는 Alexa488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. 그리고 Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰했다.
상기 결과를 통해서 HSPG를 통해 세포질에 위치하는 항-Ras·GTP iMab은 TMab4 (100%), RT22-58 (30 %), CT-58 (27 %), CT-59, RT22-59 (20 %) 순으로 형광 세기가 관찰되었다.
도 11b는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능을 확인하기 위해, HSPG를 발현하는 HeLa 세포주에서 비특이적 세포 표면 결합 ELISA 를 수행한 결과이다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 바닥 전체에 세포가 꽉 채워지도록 HeLa (HSPG+) 세포주를 배양한 후, 세척 버퍼 (HBSS buffer, 50 mM HEPES)로 3회 세척한다. 그 후, 블로킹 버퍼 (HBSS buffer, 50 mM HEPES, 1 % BSA) 에 PBS, TMab4, Avastin, RT22-58, RT22-59, CT-58, CT-59을 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 ng/ml 농도로 희석하여 4 도에서 2시간 동안 배양했다. 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 표지항체로 HRP가 접합된 항-인간 항체 (HRP-conjugated anti-human mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution으로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
도 11a와 동일한 경향으로, TMab4, RT22-58, CT-58, CT-59, RT22-59 순으로 세포표면 결합능이 측정되었다.
도 11c는 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 CDR1, CDR2 돌연변이가 도입된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP iMab 및 cytotransmab의 HSPG 결합능을 확인하기 위해, 항체 500 nM 을 HeLa 세포주에서 처리한 후 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1x105 개의 HeLa (HSPG+) 세포를 준비한다. 세포를 PBSF (PBS buffer, 2 % BSA) 에 TMab4, Avastin, RT22-58, RT22-59, CT-58, CT-59 500 nM을 넣어 4 도에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 각 항체는 Alexa488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체와 4 도 조건에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, 공초점 현미경 결과와 동일한 경향으로, TMab4, RT22-58, CT-58, CT-59, RT22-59 순으로 세포에 결합하는 형광 세기가 측정되었다.
상기 결과를 통해 생산수율 향상을 위해 항체골격 부분이 개량된 경쇄가변영역(VL) 돌연변이체 역시 HSPG 결합능이 제거되었음을 확인하였다.
실시예 19. RT22 기반 친화도 향상된 Ras·GTP 특이적 중쇄가변영역(VH)와 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 및 생산수율 향상시킨 경쇄가변영역(VL)이 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 발현 및 정제
상기 실시예 10와 동일한 방법으로 RT31, RT36, RT37 중쇄 동물발현 벡터와 종양조직 특이성 부여를 위한 integrin 또는 EpCAM 표적 원형 펩타이드 융합 및 HSPG 결합능 저해 및 생산수율 향상시킨 경쇄가변영역을 포함하는 경쇄 발현백터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하였다. 이후 항제 정제 과정은 상기 실시예 4와 동일하게 정제하였다.
또한 RT31, RT36, RT37 중쇄 동물발현 벡터와 종양조직 특이성 부여를 위한 integrin 또는 EpCAM 표적 원형 펩타이드 융합 및 HSPG 결합능 저해 및 생산수율 향상시킨 경쇄가변영역이 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab들이 GppNHp가 결합된 KRasG12D에 대한 정량적 친화도를 BIACORE2000 기기를 이용하여 분석하였다.
구체적으로는, RT31-i37 MG, RT31-ep37 MG, RT36-i37 MG, RT36-i38 MG, RT36-i39 MG, RT36-ep37 MG, RT36-ep38 MG, RT36-ep39 MG를 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 20 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 1800 response units(RU)고정화하였다. 이후 Tris 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.01 % Tween 20)을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, GppNHp가 결합 GST-KRasG12D 완전체에 대해서 50 nM에서 3.125 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(20 mM NaOH, 1 M NaCl, pH 10.0)을 30 μl/min 유속으로 1분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
하기 표 16는 RT31, RT36, RT37 중쇄 동물발현 벡터와 종양조직 특이성 부여를 위한 integrin 또는 EpCAM 표적 원형 펩타이드 융합 및 HSPG 결합능 저해 및 생산수율 향상시킨 경쇄가변영역이 도입된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab 생산 수율 및 SPR을 (BIACORE2000) 기기를 이용하여 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 친화도를 분석한 결과이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000016
RT22 기반으로 친화도 개량된 RT31, RT37 중쇄와 생산수율 향상 및 HSPG 결합능 저해를 위한 경쇄가변영역(VL) 돌연변이체가 도입된 항체(RT31-i37 MG, RT31-ep37 MG, RT37-i37 MG)의 경우 생산 수율이 향상되지 않은 문제점을 보였으며, RT36와 생산수율 향상 및 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역(VL) 돌연변이체가 도입된 항체(RT36-i38 MG, RT36-i39 MG, RT36-ep58 MG, RT36-ep59 MG)의 경우 RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG와 비교하였을때, Ras·GTP에 대한 친화도가 낮아지는 문제점이 발생하였다. 따라서, 이후 생산 수율이 좋으며, Ras·GTP에 대한 친화도가 높은 RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG을 이용하여 실험을 진행하였다.
실시예 20. integrin 또는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역을 포함한 항 Ras·GTP iMab 의 세포 표면 integrin 또는 EpCAM 결합능 확인
도 12a는 인간 대장암 세포주 SW480와 LoVo 그리고 인간 혈액암 세포주 K562와 K562 Integrin ανβ3 발현 세포주에서 Integrin ανβ3 또는 Integrin ανβ5의 발현을 FACS로 확인한 실험 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1×105 개의 SW480, LoVo, K562, K562 ανβ3 세포를 준비한다. PE 가 conjugation 된 anti-integrin ανβ3 또는 PE 가 conjugation 된 anti-integrin ανβ5 를 1:100으로 희석하여 넣고 4 도에서 1 시간 동안 배양했다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, K562 ανβ3 발현 세포주에 ανβ3 항체가 결합하고, SW480, LoVo 세포에 ανβ5 항체가 결합함을 확인하였다.
도 12b는 Ras·GTP에 대한 친화도 향상된 중쇄(RT22)를 포함한 HSPG 결합능이 제거된 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG)와 기존 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras 세포 침투 항체(RT11-i)의 세포 표면 Integrin ανβ3 또는 Integrin ανβ5에 결합능을 FACS를 통해 확인한 실험 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1×105 개의 SW480, LoVo, K562, K562 ανβ3 세포를 준비한다. 세포를 PBSF (PBS buffer, 2 % BSA) 에 RT11-i, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, CT-i39 MG 500 nM을 넣어 4 도에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 각 항체는 Alexa488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체와 4 도 조건에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, ανβ3 또는 ανβ5 를 발현하는 SW480, LoVo, K562 ανβ3 세포에 RT11-i, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, CT-i39 MG 항체가 결합하는 형광 세기가 측정되었다.
도 12c는 인간 대장암 세포주 SW480와 LoVo 그리고 인간 자궁경부암 세포주 HeLa에서 EpCAM의 발현을 FACS로 확인한 실험 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1×105 개의 SW480, LoVo, K562, K562 ανβ3 세포를 준비한다. Anti-EpCAM 항체를 1:200으로 희석하여 넣고 4 도에서 1 시간 동안 배양했다. 그 후, 1차 항체는 Alexa488(녹색형광)이 연결된 쥐 Fc를 특이적 인지하는 항체와 4 도 조건에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, K562 ανβ3 세포에 ανβ3 항체가 결합하고, SW480, LoVo 세포에 ανβ5 항체가 결합하는 형광 세기가 측정되었다.
도 12d는 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 중쇄(RT22)를 포함한 HSPG 결합능이 제거된 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG)의 세포 표면 EpCAM에 결합능을 FACS를 통해 확인한 실험 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1×105 개의 SW480, LoVo, HeLa세포를 준비한다. 세포를 PBSF (PBS buffer, 2% BSA) 에 RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG, CT-ep59 MG 500 nM을 넣어 4 도에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 각 항체는 Alexa488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체와 4 도 조건에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, EpCAM 을 발현하는 SW480, LoVo 세포에 RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG, CT-ep59 MG 항체가 결합하는 형광 세기가 측정되었다.
실시예 21. 생산수율 향상 및 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역(VL) 과 Ras·GTP에 대해서 친화도가 개량된 중쇄가변영역이 조합된 종양 조직 특이적 항-Ras·GTP iMab의 부착성 세포 성장 억제 평가
도 13a는 여러 Ras 돌연변이 및 야생형 세포주에서 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 생산수율 향상과 종양조직 세포 특이적 세포질 침투 경쇄가변영역이 조합된 항-Ras·GTP iMab 0.5 μM 을 37 도에서 48시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 당 1x104 개의 상기 세포주들을 각각 10 % FBS가 포함된 배지 0.2 ml에 희석하여 24 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후 0.5 μM의 TMab4-i, RT11-i, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG 를 48시간 처리한 후, WST solution (Dojindo) 10 μl 넣고 450 nm 흡광도를 정량하였다.
도 13a 에서 나타난 바와 같이, 다양한 Ras 돌연변이 세포주에서 RT22-i38 MG, RT22-i39 MG는 대조군으로 사용한 개량전 항-Ras·GTP iMab RT11-i보다 유의미한 세포 성장 억제능을 확인하였다. 또한 모든 항-Ras·GTP iMab에서 야생형 세포주 Colo320DM에서는 대조군으로 사용한 Ras 억제능이 없는 세포질 침투 항체(cytotransmab, TMab4-i)과 비교하여 차이를 보이지 않았다.
도 13b는 여러 Ras 돌연변이 및 야생형 세포주에서 EpCAM 표적 원형펩타이드가 융합 및 생산수율 향상과 HSPG 결합능이 저해된 경쇄가변영역이 조합된 항-Ras·GTP iMab 1 μM 을 37 도에서 48시간 처리한 후 세포 성장 억제능을 WST 어세이를 통해서 확인한 그래프이다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 당 5x103 개의 상기 세포주들을 각각 10 % FBS가 포함된 배지 0.2 ml에 희석하여 24 시간, 37 도, 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 이후 1 μM의 CT-ep59, RT11, RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG 를 36시간 처리한 후, WST solution (Dojindo) 10 μl 넣고 450 nm 흡광도를 정량하였다.
도 13b 에서 나타난 바와 같이, 다양한 EpCAM이 발현되는 Ras 돌연변이 세포주에서 RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG는 대조군으로 사용한 개량전 항-Ras·GTP iMab RT11보다 유의미한 세포 성장 억제능을 확인하였다. 또한 모든 항-Ras·GTP iMab에서 야생형 세포주 FaDu, HT-29에서는 대조군으로 사용한 Ras 억제능이 없는 세포질 침투 항체(cytotransmab, CT-ep59)과 비교하여 차이를 보이지 않았다.
위 결과로, in vitro에서 기존 항-Ras·GTP(RT11, RT11-i)와 비교하였을 때, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG, RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG 모두 Ras 돌연변이 세포주 특이적 세포 성장 억제 효과가 향상된 것을 확인하였으며, 이후 in vivo 동물모델에서도 위 항체들의 종양 성장을 억제하는 효과가 향상되었는지를 확인하기 위한 실험을 진행함.
실시예 22. 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab의 향상된 종양 성장 저해능 확인
도 14a는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LoVo 와 SW480를 이종이식한 쥐에서 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-i38 MG, RT22-i39 MG)와 기존 integrin 표적 원형펩타이드가 융합된 항-Ras 세포 침투 항체(RT11-i)와의 종양 성장 억제 효과를 20 mg/kg의 농도로 정맥주사, 2일 간격으로 총 9회 투여하여 비교한 실험 결과이다.
도 14b는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프와 적출한 종양사진이다.
도 14c는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
구체적으로는, In vivo 상에서 기존의 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab RT11-i와 비교하여, 친화도 향상 및 HSPG 결합능이 제거된 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab인 RT22-i38 MG와 RT22-i39 MG의 향상된 종양 성장 저해를 확인 하기 위하여, BALB/c 누드 마우스에 KRasG12V 돌연변이 인간 대장암 세포주인 SW480는 마우스 당 5×106개의 세포를, KRasG13D 돌연변이 인간 대장암 세포주인 LoVo는 마우스 당 2×106 개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 10일 후 종양의 부피가 약 50~80 mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 PBS 매체대조군 (vehicle control)와 대조군 CT-i39 MG(TMab4 VH), 실험군 RT11-i, RT22-i38 MG, RT22-i39 MG를 20 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 2일 간격으로 총 8 회 정맥 주사 하였고, 캘리퍼 (Caliper)를 이용하여 16일간 종양 부피를 측정하였다.
도 14a에 나타난 바와 같이, 대조군인 CT-i39 MG에 비해 RT11-i, RT22-i38 MG와 RT22-i39 MG는 암세포 성장이 억제 된 것을 확인하였고, RT11-i 보다 RT22-i38 MG와 RT22-i39 MG가 더 효과적으로 종양 성장을 억제함을 확인 하였다. 정량적인 종양 성장 억제율 (Tumor growth inhibition)은 vehicle 대비 CT-i39(0 %), RT11-i(46 %), RT22-i38 (59.7 %), RT22-i39 (69.8 %)로 확인 되였다.
도 14b에서는 적출된 종양의 무게로 종양 성장 억제율을 구한 결과, CT-i39(0 %), RT11-i(38.1 %), RT22-i38 (47.1 %), RT22-i39 (68.2 %)로 확인 되였다.
또한, 도 14d에서 나타난 바와 같이, RT22-i38 MG와 RT22-i39 MG 실험군 마우스의 체중의 변화가 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 다른 독성은 없음을 확인 하였다.
실시예 23. 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 종양 성장 저해능 확인
도 15a는 인간 대장암 세포주 LoVo 와 SW480를 이종이식한 쥐에서 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG) 의 종양 성장 억제 효과를 20 mg/kg의 농도로 정맥주사, 2일 간격으로 총 9회 투여하여 비교한 실험 결과이다.
도 15b는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프와 적출한 종양사진이다.
도 15c는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
구체적으로는, In vivo 상에서 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG와의 종양 성장 저해를 확인 하기 위하여, BALB/c 누드 마우스에 KRasG12V 돌연변이 인간 대장암 세포주인 SW480는 마우스 당 5×106개의 세포를, KRasG13D 돌연변이 인간 대장암 세포주인 LoVo는 마우스 당 2×106 개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 약 10일 후 종양의 부피가 약 50~80 mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 PBS 매체대조군 (vehicle control)와 대조군 CT-ep59 MG, 실험군 RT22-ep58 MG, RT22-ep59 MG를 20 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 2일 간격으로 총 9 회 정맥 주사 하였고, 캘리퍼 (Caliper)를 이용하여 18일간 종양 부피를 측정하였다.
도 15a 에 나타난 바와 같이, 대조군인 CT-ep59 MG에 비해 RT22-ep58 MG와 RT22-ep59 MG는 암세포 성장이 억제 된 것을 확인하였다. 정량적인 종양 성장 억제율은 vehicle 대비 CT-ep59(16.2 %), RT22-ep58(49.2 %), RT22-ep59 (75.4 %)로 확인 되었다.
도 15b에서는 적출된 종양의 무게로 종양 성장 억제율을 구한 결과, CT-ep59(8.1 %), RT22-ep58(47.3 %), RT22-ep59 (70.2 %)로 확인 되였다.
또한, 도 15c에서 나타난 바와 같이, RT22-ep58 MG와 RT22-ep59 MG실험군 마우스의 체중의 변화가 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 다른 독성은 없음을 확인 하였다.
실시예 24. 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab의 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 저해능 확인
도 16a는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LoVo 를 이종이식한 쥐에서 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-i39 MG)의 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
도 16b는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프와 적출한 종양사진이다.
도 16c는 integrin 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
구체적으로는, In vivo 상에서 친화도 향상 및 HSPG 결합능이 제거된 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab인 RT22-i39 MG의 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
종양 성장 저해를 확인 하기 위하여, BALB/c 누드 마우스에 KRasG13D 돌연변이 인간 대장암 세포주인 LoVo 2×106 개의 세포를 각 마우스에 피하주사로 주입시켰고, 약 10일 후 종양의 부피가 약 50~80 mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 PBS 매체대조군 (vehicle control)와 대조군 CT-i39 MG(TMab4 VH), 실험군 RT22-i39 MG를 5, 10, 20 mg/kg으로 정맥 또는 복강 주사하였다. 2일 간격으로 총 9회 또는 일주일에 2번 간격으로 총 6 회 주사 하였고, 캘리퍼 (Caliper)를 이용하여 18일간 종양 부피를 측정하였다.
도 16a에 나타난 바와 같이, 대조군인 CT-i39 MG에 비해 RT22-i39 MG는 암세포 성장이 억제 된 것을 확인하였다. 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 억제율은 크게 차이 없으며, 정량적인 종양 성장 억제율 (Tumor growth inhibition)은 vehicle 대비 CT-i39 20mg/kg i.v biweekly (-2.8 %), RT22-i39 20mg/kg i.v biweekly (65.3 %), CT-i39 20mg/kg i.p (-5.8 %), RT22-i39 20mg/kg i.p (70.4 %), RT22-i39 10mg/kg i.p (72.4 %), RT22-i39 10mg/kg i.v (66.9 %), RT22-i39 5mg/kg i.v (64.3 %)로 확인되었다.
도 16b에서는 적출된 종양의 무게로 종양 성장 억제율을 구한 결과, CT-i39 20mg/kg i.v biweekly (4.5 %), RT22-i39 20mg/kg i.v biweekly (65.7 %), CT-i39 20mg/kg i.p (1.2 %), RT22-i39 20mg/kg i.p (69.3 %), RT22-i39 10mg/kg i.p (70 %), RT22-i39 10mg/kg i.v (72.5 %), RT22-i39 5mg/kg i.v (70.6 %)로 확인 되였다.
또한, 도 16c에서 나타난 바와 같이 RT22-i39 MG 실험군 마우스의 체중의 변화가 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 다른 독성은 없음을 확인 하였다.
실시예 25. 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 저해능 확인
도 17a는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LoVo 를 이종이식한 쥐에서 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 (RT22-ep59 MG)의 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
도 17b는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프와 적출한 종양사진이다.
도 17c는 EpCAM 표적 원형펩타이드 융합 및 HSPG 결합능이 제거된 항-Ras 세포 침투 항체의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
구체적으로는, In vivo 상에서 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab RT22-ep59 MG의 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 저해를 확인 하기 위하여, BALB/c 누드 마우스에 KRasG13D 돌연변이 인간 대장암 세포주인 LoVo 2×106 개의 세포를 각 마우스 당 피하주사로 주입시켰고, 약 10일 후 종양의 부피가 약 50~80 mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 PBS 매체대조군 (vehicle control)와 대조군 CT-ep59 MG, 실험군 RT22-ep59 MG를 5, 10, 20 mg/kg으로 정맥 또는 복강 주사하였다. 2일 간격으로 총 9 회 또는 일주일에 2번 간격으로 총 6회 주사 하였고, 캘리퍼 (Caliper)를 이용하여 18일간 종양 부피를 측정하였다.
도 17a 에 나타난 바와 같이, 대조군인 CT-ep59 MG에 비해 RT22-ep59 MG는 암세포 성장이 억제 된 것을 확인하였다. 투여량, 투여 간격, 투여 경로에 따른 종양 성장 억제율은 크게 차이 없으며, 정량적인 종양 성장 억제율 (Tumor growth inhibition)은 vehicle 대비 CT-ep59 20mg/kg i.v biweekly (3.7 %), RT22-ep59 20mg/kg i.v biweekly (80.6 %), CT-ep59 20mg/kg i.p (2.3 %), RT22-ep59 20mg/kg i.p (78.8 %), RT22-ep59 10mg/kg i.p (76 %), RT22-ep59 10mg/kg i.v (75 %), RT22-ep59 5mg/kg i.v (77.8 %)로 확인되었다.
도 17b에서는 적출된 종양의 무게로 종양 성장 억제율을 구한 결과, vehicle 대비 CT-ep59 20mg/kg i.v biweekly (-3.6 %), RT22-ep59 20mg/kg i.v biweekly (67.3 %), CT-ep59 20mg/kg i.p (-1.6 %), RT22-ep59 20mg/kg i.p (71.1 %), RT22-ep59 10mg/kg i.p (64.7 %), RT22-ep59 10mg/kg i.v (70.1 %), RT22-ep59 5mg/kg i.v (61.3 %)로 확인되었다.
또한, 도 17c에서 나타난 바와 같이, RT22-ep59 MG실험군 마우스의 체중의 변화가 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 다른 독성은 없음을 확인 하였다.
실시예 26. 항-Ras·GTP iMab의 세포질내 안정성, 체내 지속성 및 종양조직 표적능을 향상시키기위한 중쇄 개량 변이체 디자인 및 발현·정제
세포질내 단백질은 일반적으로 유비퀴틴-프로테아좀 기작에 의해 분해된다. 마찬가지로, 세포질내 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체는 TRIM21 E3 ligase에 결합하여 유비퀴틴-프로테아좀 기작에 의해 분해되며, TRIM21와 결합하는 항체의 CH3 영역 N434 아미노산에 돌연변이가 도입된 경우 항체의 분해가 저해된다. 따라서, 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체인 항-Ras·GTP iMab의 세포질내 안정성을 향상시키기 위해, CH3 영역에 N434D 돌연변이가 도입된 변이체를 구축하였다. 구체적으로 상기 실시예 4와 같은 방식으로 세포질내 안정성이 향상된 항-Ras·GTP iMab의 중쇄 발현백터(RT22 IgG1 N434D)와 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터 (hT4-ep59 MG LC)를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 세포질내 안정성이 향상된 항-Ras·GTP iMab 돌연변이를 발현하였다.
또한, 이뮤노글로불린 형태의 항체는 체내 면역세포의 Fc receptor와 결합하여 ADCC 기작을 통해 제거될수 있으며, IgG subclass 중 IgG2, IgG4의 경우 Fc gamma receptor와의 결합이 약해 이 기능이 저해되어 있다. 따라서, 완전한 이뮤노글로불린 형태의 IgG1 항체인 항-Ras·GTP iMab의 체내 안정성을 향상시키기 위해, IgG4의 중쇄불변영역(CH1~CH3)을 도입한 변이체를 구축하였다. 이때, 체내에서 IgG4의 특성인 Fab-arm exchange가 일어나지 않도록 Hinge 부위에 S228P 돌연변이를 함께 도입하였다. 구체적으로 상기 실시예 4와 같은 방식으로 체내 지속성이 향상된 항-Ras·GTP iMab의 중쇄 발현백터(RT22 IgG4 S228P)와 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터 (hT4-ep59 MG LC)를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 체내 지속성이 향상된 항-Ras·GTP iMab 돌연변이를 발현하였다.
하기 표 17은 항-Ras·GTP iMab의 세포질내 안정성 및 체내 지속성을 향상시키기 위해 개량된 중쇄불변영역(CH1-CH3)의 서열 정보이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000017
또한 항-Ras·GTP iMab의 종양조직 표적능을 향상시키기 위하여 항-Ras·GTP iMab 중쇄가변영역의 N-말단에 EpCAM 표적능을 가지는 ep133 펩타이드를 결합하는 클론을 구축하여 발현 정제하였다. 구체적으로 상기 실시예 4와 같은 방식으로 종양조직 표적능이 향상된 항-Ras·GTP iMab의 중쇄 발현백터(epRT22 GS, epRT22 MG, epRT22 (G4S)2)와 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터 (hT4-ep59 MG LC)를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 종양조직 표적능이 향상된 항-Ras·GTP iMab 돌연변이를 발현하였다.
하기 표 18는 종양조직 표적능이 향상된 항-Ras·GTP iMab의 중쇄가변영역 서열들이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000018
하기 표 19는 세포질내 안정성, 체내 지속성 및 종양조직 표적능이 향상된 항-Ras·GTP iMab의 생산수율을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000019
위 표 19에서 기존 RT22-ep59 MG를 epRas03 MG, RT22-i39 MG를 inRas03으로 새롭게 명명하였으며, 이를 기준으로 중쇄불변영역 변이체들의 명명하였다.
실시예 27. 세포질내 안정성을 향상시킨 항-Ras·GTP iMab의 세포질내 분해 감소 및 비부착 세포 성장 억제 평가
실시예 25에서 구축한 세포질내 안정성을 향상시킨 항-Ras·GTP iMab의 세포질내 분해 감소를 확인하기 위해 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 시스템(출원번호: 10-2015-0143278)을 이용하였다. 이를 위해, epRas03 MG 및 epRas13 MG의 중쇄 C-말단에 GFP11-SBP2 peptide가 융합된 epRas03-GFP11-SBP2 MG 및 epRas13-GFP11-SBP2 MG를 구축하였다.
도 18a는 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 세포질내 분해 감소를 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 시스템을 이용하여 확인한 결과이다.
구체적으로는, 검정 96 웰 플레이트에 웰 당 1x104 개의 SA-GFP1-10을 발현하는 SW480 세포주를 각각 10 % FBS가 포함된 배지 0.1 ml에 희석하여 24 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후 2 μM의 epRas03 MG, epRas03-GFP11-SBP2 MG, epRas13-GFP11-SBP2 MG를 6시간 처리한 후, 새로운 배지로 교체하였다. 이후 0, 2, 4, 6 시간 배양한 뒤, 형광 플레이트 리더기를 이용하여, Excitation 485nm, emission 528nm 파장의 녹색 형광을 정량하였다.
도 18a 에서 나타난 바와 같이, 세포질 분해를 감소 시킨 epRas13-GFP11-SBP2 MG는 6 시간 후에 60%의 녹색 형광이 남아있었으나, 대조군인 epRas03-GFP11-SBP2 MG은 5%로 거의 모든 항체가 분해됨을 확인하였다. 대조군인 epRas03 MG은 녹색 형광이 거의 관찰되지 않았다. 이를 통해 epRas13 MG이 세포질내 안정성이 향상됨을 확인하였다.
도 18b는 세포질내 안정성이 향상된 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 인간 대장암 세포주에서 비부착 세포 성장 억제능을 soft agar colony formation방법을 통해 확인한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 1.2% 아가로스 용액과 2X RPMI + 20% FBS 배지를 1:1 비율로 혼합하여 0.2ml 도말해준다. Bottom agar가 굳은 뒤 그 위에, 0.7% 아가로스 용액과 1x103개의 세포 + 1 μM 또는 4 μM의 항체가 포함된 2X RPMI + 20% FBS 배지를 1:1 비율로 혼합하여 0.2ml 도말해준다. Top agar가 굳은 뒤, 0.2ml의 배지를 넣어준다. 이후 3일 간격으로 0.5 μM 또는 2 μM의 항체가 포함된 배지로 교체해 준다. 2~3주 후에 BCIP/NBT 용액을 이용해 콜로니를 염색해 준 뒤, 200 μm이상 크기의 콜로니 수를 측정한다.
도 18b 에서 나타난 바와 같이, Ras 돌연변이 세포주 SW480, LoVo에서 세포질 안정성이 향상된 epRas13 MG은 대조군으로 사용한 epRas03 MG보다 세포 성장 억제능이 향상되었음을 확인하였다. 또한 야생형 세포주 Colo320DM에서는 대조군으로 사용한 Ras 억제능이 없는 세포질 침투 항체(epCT03 MG)과 비교하여 차이를 보이지 않았다.
도 18c는 세포질내 안정성이 향상된 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 인간 대장암 세포주에서 비부착 세포 성장 억제능을 anoikis 방법을 통해 확인한 결과이다.
구체적으로는, 초저부착(low-attchatment) 96 웰 플레이트에 웰 당 1x103 개의 상기 세포주들을 각각 0% FBS의 배지 0.1 ml에 희석한 뒤, 0.5, 2μM 농도의 항체와 함께 48 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후, 0.5, 2μM 농도의 항체를 추가 처리하여 48 시간 배양하였다. 총 96 시간 배양후, CellTiterGlo (Promega) 50 μl 넣고 발광을 정량하였다.
도 18c 에서 나타난 바와 같이, Ras 돌연변이 세포주 SW480, LoVo에서 세포질 안정성이 향상된 epRas13 MG은 대조군으로 사용한 epRas03 MG보다 세포 성장 억제능이 향상되었음을 확인하였다. 또한 야생형 세포주 Colo320DM에서는 대조군으로 사용한 Ras 억제능이 없는 세포질 침투 항체(epCT03 MG)과 비교하여 차이를 보이지 않았다.
도 18d는 세포질내 안정성이 향상된 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab의 인간 폐암 세포주에서 비부착 세포 성장 억제능을 anoikis 방법을 통해 확인한 결과이다.
구체적으로는, 초저부착(low-attchatment) 96 웰 플레이트에 웰 당 1x103 개의 상기 세포주들을 각각 10% FBS가 포함된 배지 0.1 ml에 희석한 뒤, 2μM 농도의 항체와 함께 48 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후, 2μM 농도의 항체를 2회 추가 처리하여 48 시간 씩 배양하였다. 마지막으로 총 144 시간 배양후, CellTiterGlo (Promega) 50 μl 넣고 발광을 정량하였다.
도 18d 에서 나타난 바와 같이, 다양한 Ras 돌연변이 세포주들에서 세포질 안정성이 향상된 inRas13은 대조군으로 사용한 inRas03보다 세포 성장 억제능이 향상되었음을 확인하였다. 또한 야생형 세포주들에서는 대조군으로 사용한 Ras 억제능이 없는 세포질 침투 항체(inCT03)과 비교하여 차이를 보이지 않았다.
위 결과로, 기존 epRas03 MG, inRas03와 비교하였을 때, 세포질 안정성이 향상됨으로써 epRas13 MG, inRas13 모두 Ras 돌연변이 세포주 특이적 세포 성장 억제 효과가 향상된 것을 확인하였다.
실시예 28. 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 약동학 (pharmacokinetics) 평가
도 19a는 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 결과이다.
구체적으로는, epRas03 MG 및 epRas03 MG IgG4 모두 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 개별클론 들이 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 확인하였다.
도 19b는 체내 지속성을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP의 약동학을 BALB/c 누드 마우스에서 확인한 결과이다.
구체적으로는, BALB/c 누드 마우스에 실험군 epRas03 MG IgG4와 대조군 epRas03 MG를 20 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 이후, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24시간; 2, 4, 7, 14, 21, 28일에 각각 마우스 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 12000 rpm, 10 분, 4 도 조건으로 원심분리한뒤 상등액인 혈장만 -80 도에 보관하였다. 이후 혈장내의 epRas03 MG IgG4, epRas03 MG의 농도를 분석하기 위하여 ELISA 를 실시하였다. 구체적으로, 항-human Fab 항체 (Sigma)을 96웰 half-area 플레이트(Corning)에 각각 2.5 μg/ml의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (PBS, pH7.4, 0.1 % Tween20) 로 3회 세척한다. 1% PBSB (PBS, pH 7.4, 1% BSA)로 1 시간 동안 결합한 후, 채취한 혈액 및 정제한 항체(기준 곡선용)를 1% PBSB에 희석하여 2 시간 동안 결합시킨 후 0.1% PBST로 3회 세척한다. 이후 HRP가 접합된 항-human IgG, Fc 항체 (Sigma)을 표지항체로 1 시간 동안 결합시킨 후 0.1% PBST로 3회 세척한다. TMB ELISA solution으로 반응시키고, 황산용액으로 반응을 중단시킨 후, 450 nm 흡광도를 정량하였다.
도 19b 에서 나타난 바와 같이, 체내 지속성이 향상된 epRas03 MG IgG4의 경우 대조군인 epRas03 MG보다 2배 높은 반감기를 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 29. 종양 조직 표적능을 향상시킨 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 EpCAM 표적능 향상 확인
도 20a 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas23 MG 의 세포 표면 EpCAM에 결합능을 FACS를 통해 확인한 실험 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1×105 개의 LoVo 세포를 준비한다. 세포를 PBSF (PBS buffer, 2% BSA) 에 Ras03, epRas03 MG, epRas23 MG 100 nM을 넣어 4 도에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 각 항체는 Alexa488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체와 4 도 조건에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, EpCAM 을 발현하는 LoVo 세포에 epRas03 MG, epRas23 MG 항체가 결합하는 형광 세기가 측정되었고, EpCAM 표적 펩타이드가 더 많이 융합된 epRas23 MG 가 더 높은 형광 세기를 보였다..
도 20b 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항 Ras·GTP iMab 의 25, 50, 100 nM의 Avi-KRasG12D·GppNHp 또는 100 nM의 Avi-KRasG12D·GDP와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
구체적으로, 실시예 4와 동일한 방법으로 ELSIA를 수행하였으며, 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas03 MG, epRas23 MG을 96웰 EIA/RIA 플레이트에 고정 후 GppNHp가 결합된 KRas 단백질은 100 nM, 50 nM, 25 nM 의 다양한 농도로, GDP가 결합된 KRas 단백질은 100 nM 농도 결합시킨 후 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA solution 로 반응시켜 450 nm 흡광도를 정량하였다.
상기 결과를 통해 중쇄가변영역 N 말단에 EpCAM 펩타이드를 융합하여도 Ras 와의 친화도 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다.
도 20c 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas23 MG 의 인간 대장암 세포주에서 비부착 세포 성장 억제능을 anoikis 방법을 통해 확인한 결과이다.
구체적으로는, 초저부착(low-attchatment) 96 웰 플레이트에 웰 당 1x103 개의 LoVo, DLD-1, HCT116 세포주들을 각각 0% FBS의 배지 0.1 ml에 희석한 뒤, 0.5, 2μM 농도의 항체와 함께 48 시간, 37 도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이후, 0.5, 2μM 농도의 항체를 추가 처리하여 48 시간 배양하였다. 총 96 시간 배양후, CellTiterGlo (Promega) 50 μl 넣고 발광을 정량하였다.
도 20c 에서 나타난 바와 같이, Ras 돌연변이 세포주 LoVo, DLD-1, HCT116 에서 세포질 안정성이 향상된 epRas23 MG은 대조군으로 사용한 epRas03 MG보다 세포 성장 억제능이 향상되었음을 확인하였다.
도 20d 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas23 MG 의 생체분포를 마우스에서 확인하고 종양과 몸 전체의 형광을 정량하여 그래프로 나타낸 결과이다.
구체적으로는, BALB/c 누드 마우스에 DyLight 형광 표지한 항 Ras·GTP iMab Ras03, epRas03 MG, epRas23 MG 20 μg 주사한 후, 0, 6, 12, 24, 48, 72 시간 별로 마우스 바디 전체에서 나오는 형광을 IVIS Lumina XRMS Series III (Perkin Elmer) 로 관찰한다. 이 때, 마우스는 1.5-2.5 % isoflurane (Piramal Critical Care) 를 이용하여 마취시킨다. 각 이미지는 Living Image software (Perkin Elmer) 를 이용하여 바디 전체의 형광값을 정량하였다.
도 20d 에서 나타난 바와 같이, EpCAM 표적 펩타이드를 융합하지 않은 Ras03 보다, epRas03 MG, epRas23 MG 는 종양 조직에 존재하는 항체의 양이 많음을 확인하였다. 또한, epRas23 MG 는 epRas03 MG 보다 항체 주사 후 시간이 지남에 따른 종양 조직 내 항체의 양이 더 많음을 확인하였다.
도 20e 는 종양 조직 표적능을 향상시키기 위해 EpCAM 표적 펩타이드를 중쇄가변영역 N 말단에 융합시킨 항-Ras·GTP iMab epRas23 MG 의 생체분포를 마우스에서 확인하고 장기를 적출하고 형광을 정량하여 그래프로 나타낸 결과이다.
구체적으로는, 상기 실험에 이어, 항체 주사 후 72시간 경과한 마우스는 안락사시키고, 종양 및 심장, 폐, 간, 신장, 췌장, 비장을 적출하여 그 장기에서의 형광을 Living Image software (Perkin Elmer) 를 이용하여 정량하였다.
도 20e 에서 나타난 바와 같이, EpCAM 표적 펩타이드를 융합하지 않은 Ras03 보다, epRas03 MG, epRas23 MG 는 종양 조직에 존재하는 항체의 양이 많고, 기타 장기에 존재하는 항체의 양이 적음을 확인하였다. 종양 조직에 위치하는 항체의 양은 epRas23 MG, epRas03 MG, Ras03 순으로 많은 양이 존재하였다.
실시예 30. 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시키기 위한 중쇄 개량 변이체 디자인 및 발현·정제
이뮤노글로불린 형태의 항체는 체내 면역세포의 Fc receptor와 결합하여 ADCC 기작을 통해 제거될 수 있으며, IgG1의 경우 L234A, L235A, P239G 돌연변이 도입으로 Fc gamma receptor와의 결합이 약해 이 기능이 저해된다. 따라서, 완전한 이뮤노글로불린 형태의 IgG1 항체인 항-Ras·GTP iMab의 체내 안정성을 향상시키기 위해, IgG1의 중쇄불변영역(CH1~CH3)에 L234A, L235A, P239G 돌연변이(LALA-PG)를 도입한 변이체(IgG1 LALA-PG)를 구축하였다. 구체적으로 상기 실시예 4와 같은 방식으로 체내 지속성이 향상된 항-Ras·GTP iMab의 중쇄 발현백터(RT22 IgG1 LALA-PG 또는 RT22 IgG1 LALA-PG, N434D)와 세포질 침투 인간화 경쇄 발현백터 (hT4-ep59 GSSG LC)를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 체내 지속성이 향상된 항-Ras·GTP iMab 돌연변이를 발현하였다.
하기 표 20은 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시키기 위해 LALA-PG 돌연변이가 도입된 중쇄불변영역(CH1-CH3)의 서열 정보이다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000020
실시예 31. 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체 약동학 (pharmacokinetics) 평가
도 21a는 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 다량체 여부를 크기-배제 크로마토그래피로 확인한 결과이다.
구체적으로는, Agilent Technologies HPLC 1200 series 를 사용하여 수행하였다. 이 때 사용한 컬럼은 Zenix® SEC-300 column 을 이용하여 수행하였다. 1 ml/분의 유속으로 실험을 진행하였다. 이동상은 150 mM sodium phosphate pH 7.0을 포함하였다. 희석제는 이동상이었고, 280 nm의 UV로 분석을 수행하였다. 모든 iMab에서 다량체 없이 단량체로 항체가 정제되었음을 확인하였다.
도 21b는 종양 조직 EpCAM 특이적 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 약동학을 BALB/c 누드 마우스에서 확인한 결과이다.
구체적으로는, BALB/c 누드 마우스에 epRas03, epRas13, epRas33, epRas83 를 20 mg/kg으로 정맥 주사하였다. 이후, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24시간; 2, 4, 7, 14, 21, 28일에 각각 마우스 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 12000 rpm, 10 분, 4 도 조건으로 원심분리한뒤 상등액인 혈장만 -80 도에 보관하였다. 이후 혈장내의 epRas03, epRas13, epRas33, epRas83 의 농도를 분석하기 위하여 ELISA 를 실시하였다. 구체적으로, 실시예 28과 동일하게 항-human Fab 항체 (Sigma)을 96웰 half-area 플레이트(Corning)에 각각 2.5 μg/ml의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (PBS, pH7.4, 0.1 % Tween20) 로 3회 세척한다. 1% PBSB (PBS, pH 7.4, 1% BSA)로 1 시간 동안 결합한 후, 채취한 혈액 및 정제한 항체(기준 곡선용)를 1% PBSB에 희석하여 2 시간 동안 결합시킨 후 0.1% PBST로 3회 세척한다. 이후 HRP가 접합된 항-human IgG, Fc 항체 (Sigma)을 표지항체로 1 시간 동안 결합시킨 후 0.1% PBST로 3회 세척한다. TMB ELISA solution으로 반응시키고, 황산용액으로 반응을 중단시킨 후, 450 nm 흡광도를 정량하였다.
도 21 에서 나타난 바와 같이, LALA-PG 돌연변이를 도입한 epRas33, epRas83 의 경우 대조군인 epRas03 보다 높은 반감기를 가지고, epRas13 은 epRas03 보다 소량 감소한 반감기를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 32. 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체 GppNHp가 결합된 KRasG12D 및 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와의 결합능 평가
항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체가 GppNHp가 결합된 KRasG12D 와의 결합능이 유지되고, FcRn과의 결합능에 영향을 주지 않음을 확인하기 위해서 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 Biacore2000 기기를 이용하여 결합능 분석을 수행하였다.
구체적으로는, GppNHp가 결합된 KRasG12D 와의 결합능을 확인하기 위해서 epRas03, epRas13, epRas83, inRas03 MG, inRas13 MG, inRas83 MG를 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 20 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 1800 response units(RU) 고정화하였다. 이후 Tris 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.01 % Tween 20)을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, GppNHp가 결합 GST-KRasG12D 완전체에 대해서 100 nM에서 6.25 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(20mM NaOH, 1M NaCl, pH10.0)을 30μl/min 유속으로 1분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 3분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
구체적으로는, FcRn과의 결합능을 확인하기 위해서 FcRn을 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 20 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 650 response units(RU) 고정화하였다. 이후 phosphate 완충액 (12 mM phosphate, pH 6.0, 137 mM NaCl, 0.01 % Tween 20)을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, epRas03에 대해서 200 nM에서 6.25 nM의 농도로 분석하였고, epRas13, epRas83에 대해서 2000 nM에서 62.5 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석후 CM5칩의 재생(regeneration)은 phosphate 완충액(12 mM phosphate, pH 7.4, 137 mM NaCl, 0.01 % Tween 20)을 30μl/min 유속으로 3분간 흘려주어 시행되었다. 결합 3분, 해리 6분으로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
표 21은 SPR (BIACORE 2000)를 이용하여 GppNHp가 결합된 완전체 형태의 KRasG12D 및 FcRn에 대한 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체와의 친화도 분석 결과를 나타낸다.
Figure PCTKR2018014110-appb-T000021
실시예 33. 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 종양 성장 억제능 확인
도 22a 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras·GTP iMab의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 다량체 함량 여부를 크기-배제 크로마토그래피로 확인한 결과이다.
구체적으로는, Agilent Technologies HPLC 1200 series 를 사용하여 수행하였다. 이 때 사용한 컬럼은 Zenix® SEC-300 column을 이용하여 수행하였다. 1 ml/분의 유속으로 실험을 진행하였다. 이동상은 150 mM sodium phosphate pH 7.0을 포함하였다. 희석제는 이동상이었고, 280 nm의 UV로 분석을 수행하였다. 모든 iMab에서 95%이상이 단량체로 이루어진 항체가 정제되었음을 확인하였다.
도 22b는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 LS1034를 이종이식한 쥐에서 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras 세포 침투 항체의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
구체적으로는, BALB/c 누드 마우스에 KRasA146T 돌연변이 인간 대장암 세포주인 LS1034 1×107 개의 세포를 각 마우스에 피하주사로 주입시켰고, 약 14일 후 종양의 부피가 약 ~120 mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 PBS 매체대조군 (vehicle control)와 대조군 (inCT03 MG, inCT13 MG, inCT33 MG, inCT83 MG), 실험군 (inRas03 MG, inRas13 MG, inRas33 MG, inRas83 MG)를 20 mg/kg으로 정맥주사하였다. 일주일에 2회 3, 4일 간격으로 총 7회 주사 하였고, 캘리퍼 (Caliper)를 이용하여 총 24일 간 종양 부피를 측정하였다.
도 22b에 나타난 바와 같이, inRas03 MG (대조군: inCT03 MG)와 inRas13 MG (대조군: inCT13 MG), inRas33 MG (대조군: inCT33 MG)를 투여한 마우스에서 암세포 성장이 억제된 것을 확인하였다. 반면 inRas83 (대조군: inCT83 MG)를 투여한 마우스에서는 암세포 성장이 억제되지 않음을 확인하였다.
도 22c는 인간 대장암 KRas 돌연변이 세포주 SW403을 이종이식한 쥐에서 종양 조직 integrin 특이적 항-Ras 세포 침투 항체의 체내 지속성을 향상시킨 LALA-PG 변이체의 종양 성장 억제 효과를 비교한 실험 결과이다.
구체적으로는, BALB/c 누드 마우스에 KRasG12V 돌연변이 인간 대장암 세포주인 SW403 1×107 개의 세포를 각 마우스에 피하주사로 주입시켰고, 약 14일 후 종양의 부피가 약 ~120 mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 PBS 매체대조군 (vehicle control)와 대조군 (inCT03 MG, inCT13 MG, inCT33 MG, inCT83 MG), 실험군 (inRas03 MG, inRas13 MG, inRas33 MG, inRas83 MG)를 20 mg/kg으로 정맥주사하였다. 일주일에 2회 3, 4일 간격으로 총 5회 주사 하였고, 캘리퍼 (Caliper)를 이용하여 총 17일 간 종양 부피를 측정하였다.
도 22c에 나타난 바와 같이, inRas33 MG (대조군: inCT33 MG)를 투여한 마우스에서 암세포 성장이 억제된 것을 확인하였다. 반면 inRas03 MG (대조군: inCT03 MG)와 inRas13 MG (대조군: inCT13 MG), inRas83 (대조군: inCT83 MG)를 투여한 마우스에서는 암세포 성장이 억제되지 않음을 확인하였다.
도 22에서 나타난 바와 같이 inRas33 MG의 경우 종양 성장 억제능이 향상되었으며, inRas13 MG 및 inRas83 MG 경우에서는 종양 성장 억제능이 비슷하거나 저하됨을 확인하였다.
본 발명에서 제공하는 완전한 이뮤노글로불린 형태로 종양조직 특이적 세포질에 침투하여 세포내 Ras·GTP를 직접적으로 억제하는 항체의 종양억제 효율을 향상시키기 위한 방법은 Ras·GTP와의 친화도가 개량된 중쇄가변영역 선별 및 종양조직 특이적으로 향상된 세포질 침투능을 갖는 경쇄가변영역 개발을 통해 달성되며, 이로서 특정 종양세포 내에 위치하고 있으며, 돌연변이를 통해 항상 활성화되는 Ras·GTP를 표적 및 그 활성을 효과적으로 저해할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 상기 항체의 종양조직 특이적 세포질 침투능이 향상된 경쇄가변영역 또는 이를 포함하는 항체는 대부분의 정상세포에서 발현되어 있는 HSPG와의 결합능을 낮춰 종양조직 표적 목적으로 융합된 펩타이드에 의한 종양조직 특이적으로 발현되는 수용체를 통해 세포내제화 및 엔도좀 탈출을 가능하며, Ras·GTP에 친화도가 향상된 중쇄가변영역(VH)는 세포질 내로 상기 항체가 도달하였을 때 향상된 Ras 억제능을 가지게 한다. 이를 통해 상기 개량된 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역이 조합된 완전한 이뮤노글로불린 형태로 종양조직 특이적 세포질에 침투하여 세포내 Ras·GTP를 직접적으로 억제하는 항체는 향상된 종양생장 억제능을 보인다.
본 발명에 따른 개량된 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역이 조합된 세포질 침투 Ras 억제항체는 높은 생산 수율을 통해 치료 약물로 개발이 용이하며, 종양조직 특이적으로 세포질 침투를 통한 효과적으로 돌연변이 Ras를 억제할 수 있어 단독 약물 또는 기존 치료제와의 병행치료를 통해 효과적인 항암 활성을 기대할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (27)

  1. 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이 포함된 것을 특징으로 하는 GTP가 결합되어 활성화된 Ras(Ras·GTP)에 특이적으로 결합하는 중쇄가변영역:
    [일반식 1]
    D-X11-SMS
    상기 일반식 1에서, X11는 F 또는 Y이며,
    [일반식 2]
    YISRTSHT-X21-X22-YADSVKG
    상기 일반식 2에서, X21는 T, I 또는 L이며, X22는 Y, C, S, L 또는 A이며,
    [일반식 3]
    G-F-X31-X32-X33-Y
    상기 일반식 3에서, X31는 K, F, R 또는 N이고, X32는 M 또는 L일 수 있으며, X33은 D 또는 N이다.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 일반식 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3이 포함된 것을 특징으로 하는 GTP가 결합되어 활성화된 Ras(Ras·GTP)에 특이적으로 결합하는 중쇄가변영역:
    [일반식 1]
    D-X11-SMS
    상기 일반식 1에서, X11는 F 또는 Y이며,
    [일반식 2]
    YISRTSHT-X21-X22-YADSVKG
    상기 일반식 2에서, X21-X21는 TY, IY, TC, TS, IS, LC, LL 또는 IA이며,
    [일반식 3]
    G-F-X31-X32-X33-Y
    상기 일반식 3에서, X31-X31-X31는 KMD, RMD, FMN, RLD 또는 NLD이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중쇄가변영역은
    CDR1 서열은 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 CDR2 서열은 서열번호 5, 및 서열번호 10 내지 16의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 CDR3 서열은 서열번호 6 내지 9, 및 서열번호 17 내지 18의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 중쇄가변영역.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄가변영역은
    i) 서열번호 2의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    ii) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    iii) 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 8의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    iv) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 9의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    v) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 8의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    vi) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 10의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    vii) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 11의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    viii) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 12의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    ix) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 13의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    x) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 14의 CDR2 및 서열번호 17의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역;
    xi) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 18의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및
    xii) 서열번호 3의 CDR1, 서열번호 16의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 중쇄가변영역.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄가변영역은 서열번호 20 내지 32의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 것인 중쇄가변영역.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 중쇄가변영역을 포함하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항체는 세포질 침투능을 갖는 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 항체의 경쇄가변영역은 서열번호 34 내지 43의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 항체의 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역은 세포 막단백질 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), 인테그린 αvβ3(Integrin αvβ3) 또는 인테그린 αvβ5 (Integrin αvβ5)을 표적하는 펩타이드가 융합된 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역은 서열번호 44 내지 63의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgM 로 이루어지는 군에서 선택된 인간 면역글로불린에서 유래된 중쇄불변영역 또는 경쇄불변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 중쇄불변영역은 CH3 영역의 N434D, CH2 영역의 L234A, L235A 또는 P329G 중 어느 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
    (단, 상기 아미노산 위치는 EU 번호(EU numbering)에 따름.)
  13. 제12항에 있어서,
    상기 중쇄불변영역 변이체는 서열번호 65 내지 69의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 항체는 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 상기 항체들의 에피토프-결합 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  15. 제6항에 있어서,
    상기 항체는 이중특이항체(Bispecific Ab)인 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  16. 제6항에 있어서,
    상기 항체는 단백질, 펩타이드, 소분자 약물, 독소, 효소 또는 핵산 또는 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상과 융합된 것을 특징으로 하는 완전한 형태의 이뮤노글로뷸린 항체.
  17. 다음 단계를 포함하는 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상되고, 종양조직 특이적 세포질 침투능을 가지는 완전한 형태의 이뮤노글로불린 항체의 제조방법.
    (1) 인간 중쇄가변영역(VH) 및 인간 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄에서 중쇄가변영역(VH)을 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 인간화 중쇄가변영역(VH)으로 치환된 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 엔도좀 탈출 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 인간 경쇄가변영역(VL) 및 인간 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 경쇄에서 경쇄가변영역(VL)을 세포질에 침투하는 인간화 경쇄가변영역(VL) 및 종양조직 특이적 세포질 침투능 부여한 인간화 경쇄가변영역(VL) 으로 치환된 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 세포질 침투 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (3) 상기 제조된 중쇄, 경쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환하여 세포내 Ras·GTP에 대한 친화도가 향상된 인간화 중쇄가변영역(VH) 및 종양조직 특이적 세포질 침투능을 부여한 인간화 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 발현하는 단계; 및
    (4) 상기 발현된 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 정제 및 회수하는 단계.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 암은 세포내 Ras가 활성화된 돌연변이를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 Ras가 활성화된 돌연변이는 Ras의 12번째, 13번째 또는 61번째 아미노산에 돌연변이가 발생한 암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용조성물.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 암의 예방 또는 치료는 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체가 세포질 내에서 B-Raf, C-Raf 또는 PI3K와 활성화된 Ras(Ras·GTP)의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 종양 진단용 조성물.
  23. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  25. 다음 단계를 포함하는 Ras·GTP에 특이적으로 결합하며, 친화도가 개량된 중쇄가변영역 라이브러리 구축 방법.
    (1) 라이브러리 주형인 RT11 중쇄가변영역(VH)의 항원 결합에 관여하는 3 개의 상보성 결합 부위(CDR) 중 세포내 Ras·GTP에 결합할 가능성이 높은 아미노산 자리를 선정하는 단계;
    (2) 상기 선정한 아미노산 자리에, 라이브러리에 포함되길 원하는 아미노산을 코딩할 수 있는 디제너레이트 코돈(degenerated codon primer)를 디자인하는 단계; 및
    (3) 상기 디자인한 중쇄가변영역 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 scFab 또는 Fab 형태로 발현하는 단계.
  26. 제25항의 방법으로 구축된 Ras·GTP에 특이적으로 결합하며, 친화도가 개량된 중쇄가변영역 라이브러리.
  27. 다음 단계를 포함하는 Ras·GTP에 특이적으로 결합하며, 친화도가 개량된 중쇄가변영역의 스크리닝 방법.
    (1) 제25항 (3)에 따라 제조된 Ras·GTP에 결합할 수 있는 중쇄가변영역 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 발현하는 단계;
    (2) Biotinylation시 변형을 극복하고 안정한 형태로 GTP 유사체인 GppNHp와 결합된 형태의 Avi-KRasG12D 구축 및 발현 단계;
    (3) GppNHp가 결합된 Avi-KRasG12D 와 상기 중쇄가변영역 라이브러리를 결합시키는 단계; 및
    (4) 상기 GppNHp가 결합된 Ras와 상기 중쇄가변영역 라이브러리 결합의 친화도를 측정하는 단계.
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