CN111936521A - 通过内化到细胞胞浆中抑制细胞中活化的Ras的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

根据本发明的组合了修饰的可变重链区和可变轻链区的肿瘤特异性胞浆内化RAS抑制抗体由于高产率而有利于发展成治疗性药物，并且可以通过肿瘤特异性内化到胞浆中来有效抑制突变体Ras，并且因此可以作为单独药物或与现有药品进行平行治疗来期待有效的抗癌活性。

Description

通过内化到细胞胞浆中抑制细胞中活化的Ras的抗体及其 用途
技术领域
本公开文本涉及一种抗体，其以完整免疫球蛋白的形式结合在肿瘤组织中过表达的细胞的表面上的膜蛋白受体并且因此经历胞吞作用，然后由于内体逃逸能力而定位在细胞的细胞质中，并且特异性地结合细胞质中与GTP偶联的活化的Ras(Ras·GTP)以抑制肿瘤突变体Ras的活性；一种制备所述抗体的方法及所述抗体的用途。
具体地，本公开文本涉及一种对于Ras·GTP具有高亲和力的重链可变区(VH)，其通过修饰以完整免疫球蛋白的形式渗透到细胞的细胞质中以直接抑制细胞内Ras GTP的抗体的重链可变区(VH)来产生；一种包含所述重链可变区的抗体；一种产生所述抗体的方法及所述抗体的用途。
本公开文本的抗体包括一种为轻链可变区(VL)赋予肿瘤组织特异性细胞质渗透能力的改进技术。
本公开文本涉及一种完整免疫球蛋白型的抗体，其包含经修饰来为所述抗体赋予肿瘤组织特异性细胞质渗透能力的改进的轻链可变区(VL)与具有改善的亲和力的重链可变区(VH)的组合，并且因此渗透到细胞质中并直接抑制细胞内Ras GTP。
本公开文本包括一种针对重链的促进抗体的细胞内稳定性、体内持久性和肿瘤组织特异性的改进技术。
此外，本公开文本涉及一种使用所述抗体抑制癌症或肿瘤细胞的生长的方法以及一种使用所述抗体治疗癌症或肿瘤的方法。
此外，本公开文本涉及一种构建用于改善特异性结合Ras GTP的重链可变区的亲和力的文库的方法以及一种通过所述方法构建的文库。
此外，本公开文本涉及一种用于使用所述文库筛选特异性结合Ras GTP并对其具有改善的亲和力的重链可变区的方法。
背景技术
突变和异常过表达发生在酶或者转录或信号传导相关蛋白质中，所述酶或者蛋白质在包括癌症的各种疾病中的细胞内蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)中发挥重要作用。为了使小分子药物特异性地结合这些肿瘤和疾病相关蛋白，在蛋白质表面上需要疏水性口袋，但是全部细胞内疾病相关物质中仅约10％具有这种疏水性口袋。因此，小分子药物不能特异性地靶向大多数细胞内肿瘤和疾病相关蛋白。Ras是不具有疏水性口袋的肿瘤和疾病相关蛋白的一个代表性例子，其充当通过细胞表面上的细胞膜受体向细胞内信号传导系统递送细胞外信号的分子开关。Ras蛋白家族中的癌症相关蛋白是三种亚型蛋白，即KRas、NRas和HRas。KRas可以作为两种剪接变体，即KRas4A和KRas4B中的一种表达。Ras蛋白在细胞质中表达之后，它穿过内质网(ER)和高尔基体，并且然后由于C末端区的脂化反应而定位在细胞膜中，但是其具有GTP酶活性的部分朝向细胞质暴露。在没有外部刺激的情况下，Ras蛋白在细胞中作为通过GTP酶活化蛋白(GAP)结合GDP的失活Ras(Ras·GDP)存在。在存在外部刺激的情况下，Ras蛋白作为通过鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)结合GTP的活化Ras(Ras·GTP)存在。Ras·GTP通过与细胞质中的效应蛋白(诸如Raf、PI3K和RalGDS)的蛋白质-蛋白质相互作用活化信号，诸如较低的Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt，以便传递各种关于细胞生长、细胞凋亡抑制、迁移、分化等的信号。在正常细胞中，Ras·GTP由于通过GAP进行的磷酸解离在信号传导之后立即被转化为Ras·GDP，所以信号传导以仅暂时传递信号的方式被调节。然而，致癌突变体Ras蛋白不经历通过GAP进行的磷酸解离过程，而维持Ras·GTP的形式，并且因此继续与效应蛋白相互作用，因此继续导致下游信号传导和正常细胞的致癌。最常发生的Ras蛋白致癌突变包括第12个残基的突变(诸如G12D、G12V、G13D和G12C)、第13个残基的突变(诸如G13D)和第61个残基的突变(诸如Q61R和Q61H)。已经发现，取决于癌，这些癌症相关Ras突变在全部肿瘤的约30％中发生，其中肺癌(≈25％)、结直肠癌(≈30-40％)和胰腺癌(≈90％)。已知这些致癌Ras突变导致对常规抗癌治疗的强烈耐受性。
开发小分子药物的主要目的在于治疗致癌Ras突变体肿瘤，并且主要策略包括抑制与Ras的C末端脂化相关联的酶的活性从而防止Ras置于细胞内膜中，抑制Ras与效应蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用从而直接靶向Ras，等等。Ras的C末端脂化是将在细胞质中表达的Ras定位到细胞内膜中以进行活化的过程，并且其相关酶包括法尼基转移酶(FT酶)、Ras转化CAAX内肽酶1(RCE1)、异戊二烯基半胱氨酸羧甲基转移酶(ICMT)等。虽然已经开发了靶向以上所述的酶的小分子药物，但是它们具有在正常Ras野生型细胞系中细胞生长抑制和细胞凋亡的副作用以及所述药物在具有最高频率的Ras突变体的KRas突变体肿瘤中由于牻牛儿牻牛儿转移酶1(GGT酶1)的间接(旁路)途径而无效的限制。作为另一种策略，直接靶向Ras的小分子药物包括Kobe0065和Kobe2602，其具有结合活化的Ras以抑制与亚效应蛋白Raf的相互作用的机制，但是这些药物具有限制，因为所述药物的稳定性较低并且需要高剂量药物进行治疗。此外，已经开发了ARS853，其具有共价结合KRas G12C突变体以抑制与亚效应蛋白Raf的相互作用的机制，但是它具有限制，因为它是仅限于KRas G12C突变体的药物，所述突变体仅占KRas突变体的小部分。此外，已经开发了利戈舍替(rigosertib)，其具有结合作为亚效应蛋白的Raf、PI3K和RalGDS的Ras结合结构域(RBD)以抑制与Ras的结合的机制，但是它具有限制，因为需要高剂量的药物进行治疗。
除小分子药物之外，开发了作为α螺旋的结构类似物的钉合肽，由于通过将两个非相邻单元与烃链连接造成的改善的肽结构稳定性以及增强的代谢稳定性和细胞渗透性的优点，其作为靶向细胞内的蛋白质的治疗剂。钉合肽能够基于这些特性使用以肽模拟与Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子(RasGEF)的Ras结合的位点的策略进行细胞质渗透，所述Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子将失活的Ras转化为活化的Ras。然而，此类钉合肽具有限制，因为需要高剂量的肽来获得治疗作用，并且它们对于Ras野生型细胞系以及Ras突变体细胞系具有非特异性作用。
为了克服小分子药物和钉合肽的这些技术限制，进行各种研究来为高分子材料诸如抗体片段或重组蛋白赋予渗透到活细胞中并且有效抑制蛋白质-蛋白质相互作用的能力。具体地，已经发现具有碱性氨基酸序列、疏水性和两亲性的蛋白质转导结构域(PTD)具有渗透到活细胞中的能力，并且进行许多尝试来在基因上将蛋白质穿透结构域与各种类型的抗体片段(以使用其来识别细胞内的特定蛋白质)融合。然而，它们中的大部分不从动物细胞分泌，或者仅少量释放到上清液中，从而导致低产率和渗透到细胞中的较差效率的限制。为了克服这个表达问题，进行研究来通过化学共价键合或生物素-链霉亲和素介导的结合等来融合细胞穿透结构域，但是存在限制，因为对应蛋白质的结构被改变。
通常，由于其较大尺寸和亲水性，完整免疫球蛋白型抗体不能直接渗透到活细胞中。然而，作为具有细胞质渗透能力的完整免疫球蛋白型抗体，cytotransmab具有通过涉及以下的机制渗透到细胞质中的能力：结合细胞膜受体HSPG(硫酸乙酰肝素蛋白多糖)、通过网格蛋白介导的胞吞作用进入细胞并且然后从内体逃逸到细胞质中。作为cytotransmab受体，HSPG通常在大部分动物组织中表达，并且充当用于使各种受体与生长因子和细胞因子结合的辅助受体，发挥作用以形成组织、愈合伤口等，并且部分从细胞膜切除并且因此也充当血液中的效应蛋白。由于这些特征，具有结合HSPG的位点的肝细胞生长因子/离散因子在血液中具有低半衰期。在尝试克服这个问题时，已经报告了去除HSPG结合位点来增加在血液中的半衰期的研究。
治疗性免疫球蛋白抗体比小分子药物具有更长的开发时间段，并且为了向患者给予必须在高浓度下产生。为此，确定对能够使抗体具有稳定性和溶解性的治疗性药物的可开发性作为开发早期阶段的较大问题出现。Cytotransmab通过细胞外受体HSPG的HS链的负电荷与cytotransmab抗体的互补决定区(CDR)的带正电荷的氨基酸残基之间的静电吸引进行的结合而被引入到细胞中。已经报告了抗体的CDR中带正电荷的氨基酸残基不利地影响抗体稳定性，并且当这些带正电荷的氨基酸残基被疏水性或带负电荷的氨基酸替代时，其物理特性显著改善。
在免疫球蛋白抗体结合体内的若干病原体之后，它可以随病原体一起渗透到细胞中。免疫球蛋白抗体可以结合细胞质中的TRIM21蛋白，从而产生细胞内免疫系统。TRIM21是属于E3连接酶家族的细胞质蛋白，其结合免疫球蛋白的CH2-CH3区来与病原体和免疫球蛋白形成复合物，其中所述复合物通过泛素-蛋白酶体机制来分解。已经报告了当免疫球蛋白抗体与TRIM21之间的结合被抑制时，针对病原体的免疫系统失效，并且TRIM21在免疫球蛋白抗体的降解中发挥重要作用。此外，免疫球蛋白抗体具有通过结合血液中的免疫细胞的Fcγ受体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来诱导肿瘤死亡的免疫系统。免疫球蛋白的每个亚类别与Fcγ受体具有不同的结合亲和力，并且具体地，IgG2和IgG4抗体由于与Fcγ受体的非常低的亲和力而缺乏ADCC功能。在相同亚类别的免疫球蛋白中，由于与Fcγ受体的亲和力，IgG2和IgG4比IgG1具有更长的体内半衰期。
因此，诸位发明人基于通过细胞质渗透直接抑制细胞内Ras活性的常规抗Ras·GTP iMab抗体(RT11)建立了重链可变区(VH)文库，选择在细胞质中具有对于Ras·GTP的改善的亲和力的重链可变区(VH)，并且通过同时表达重链可变区(VH)和具有人源化轻链可变区(VL)的轻链来构建完整免疫球蛋白型抗体，所述抗体渗透到活细胞中，并且定位在细胞质中，从而产生具有改善的Ras突变体特异性细胞生长抑制作用的抗Ras GTP iMab抗体。
此外，为了发现具有肿瘤组织特异性细胞质渗透能力的完整免疫球蛋白型抗RasGTP iMab抗体，诸位发明人开发了轻链可变区(VL)的单结构域，其降低对于HSPG的非特异性结合能力并且具有改善的稳定性和生产力，甚至在融合为其赋予肿瘤组织特异性的肽之后也是如此；并且通过同时表达包含轻链可变区(VL)的轻链和包含具有以高特异性结合Ras·GTP的能力的重链可变区(VH)的单结构域的重链而开发了具有高生产力的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab抗体。
此外，诸位发明人通过修饰重链以改善具有肿瘤组织特异性细胞质渗透能力的完整免疫球蛋白型抗Ras·GTP iMab抗体的细胞内稳定性、体内持久性和组织特异性而产生了具有改善的Ras突变体特异性细胞生长抑制作用的抗Ras·GTP iMab抗体。
此外，诸位发明人发现，肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab抗体渗透到各种Ras突变体依赖性癌细胞系中，在细胞质中表现出Ras·GTP特异性结合能力，并且与常规抗Ras·GTP iMab抗体相比具有改善的细胞生长抑制作用。此外，诸位发明人发现，肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab抗体降低HSPG结合能力而赋予肿瘤组织特异性，并且表现出高水平的产率，甚至与在肿瘤组织中过表达的整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合时也是如此，并且在Ras突变体依赖性肿瘤中表现出特异性地抑制Ras·GTP的活性而没有对于细胞质渗透或Ras·GTP活性抑制的不利影响。基于此发现，完成了本公开文本。
现有文献
专利文献
韩国专利号10-1602870
韩国专利号10-1602876
发明内容
技术问题
本公开文本的一个目的是提供一种用于改善呈完整免疫球蛋白形式的抗体的功能的方法，所述抗体结合在肿瘤组织中过表达的细胞表面上的膜蛋白受体，经历胞吞作用，并且然后通过从内体逃逸而定位在细胞质中，并且通过结合细胞内Ras·GTP来直接抑制肿瘤突变体Ras活性；以及一种产生所述抗体的方法。
本公开文本的另一个目的是提供一种重链可变区的氨基酸序列，所述重链可变区特异性地结合通过与Ras结合的GTP活化的Ras。
本公开文本的另一个目的是提供一种完整免疫球蛋白抗体，其包含所述重链可变区。
所述抗体可以具有细胞质渗透能力，并且可以包含用于此目的的特定氨基酸序列。此外，所述抗体可以包含进行以下所需的特定氨基酸序列：将作为在癌细胞表面上表达的膜蛋白的靶向EpCAM(上皮细胞粘附分子)、整合素αvβ3或整合素αvβ5的肽与轻链可变区或重链可变区融合以便改善癌细胞靶向能力。
此外，所述抗体可以包含源自人免疫球蛋白的重链恒定区或轻链恒定区，所述人免疫球蛋白选自IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。
此外，为了改善癌细胞靶向能力，所述抗体的所述重链恒定区可以包含CH3区的N434D和CH2区的L234A、L235A或P329G中的至少一个突变(氨基酸位置根据EU编号确定)。
此外，所述抗体可以选自抗体的单链Fv(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFV)和表位结合片段。
此外，所述抗体可以是双特异性抗体(双特异性Ab)，并且可以与选自以下的任何一种或多种融合：蛋白质、肽、小分子药物、毒素、酶和核酸。
本公开文本的另一个目的是提供一种用于制备完整免疫球蛋白型抗体的方法，所述完整免疫球蛋白型抗体具有对于细胞内Ras·GTP的改善的亲和力和肿瘤组织特异性细胞质渗透能力。
本公开文本的另一个目的是提供一种包含所述抗体的用于预防或治疗癌症的组合物。所述癌症可以具有活化的细胞内Ras的突变。具体地，所述Ras的突变可以是在所述Ras的第12、13或61个氨基酸中的突变。
本公开文本中提供的所述癌症的预防或治疗的特征在于，本公开文本中提供的抗体具有用于抑制细胞质中活化的Ras(Ras·GTP)与B-Raf、C-Raf或PI3K的结合的机制。
本公开文本的另一个目的是提供一种包含所述抗体的用于诊断肿瘤的组合物。
本公开文本的另一个目的是提供一种编码所述抗体的多核苷酸。
本公开文本的另一个目的是提供一种重链可变区文库，其特异性地结合Ras·GTP并且对其具有改善的亲和力；以及一种用于构建所述重链可变区文库的方法。
本公开文本的另一个目的是提供一种用于筛选特异性地结合Ras·GTP并且对其具有改善的亲和力的重链可变区的方法。
技术方案
根据本公开文本的一个方面，以上和其他目的可以通过提供特异性结合通过与Ras结合的GTP活化的Ras(Ras·GTP)的重链可变区来实现，所述重链可变区包含具有由以下式1表示的氨基酸序列的CDR1、具有由以下式2表示的氨基酸序列的CDR2和具有由以下式3表示的氨基酸序列的CDR3：
[式1]
D-X11-SMS
其中X11是F或Y，
[式2]
YISRTSHT-X21-X22-YADSVKG
其中X21是T、I或L，并且X22是Y、C、S、L或A，
[式3]
G-F-X31-X32-X33-Y
其中X31是K、F、R或N，X32是M或L，并且X33是D或N。
在另一方面，本公开文本提供了一种用于改善抗体的功能以通过以完整免疫球蛋白的形式通过肿瘤组织特异性细胞膜受体进行的胞吞作用和内体逃逸主动地渗透到活细胞中的细胞质中来抑制细胞内Ras·GTP的活性的方法；以及一种用于制备所述抗体的方法。
在下文中，将详细地描述本公开文本。
本公开文本的方法能够通过完整免疫球蛋白型抗体来增加对于Ras突变体肿瘤具有特异性的肿瘤抑制的效率，所述完整免疫球蛋白型抗体具有：重链可变区(VH)，所述重链可变区对于细胞内Ras·GTP表现出改善的亲和力并且因此对其表现出高结合能力；和轻链可变区(VL)，所述轻链可变区具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力。
也就是说，本公开文本的目的在于开发一种完整免疫球蛋白型抗体，其实现肿瘤特异性细胞质渗透并且在细胞质渗透之后以高亲和力结合细胞内Ras·GTP以抑制Ras活性。
所述抗体可以是完整免疫球蛋白型抗体或其片段。
所述抗体可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
根据本公开文本的抗体的重链可变区包含具有由以下式1表示的氨基酸序列的CDR1、具有由以下式2表示的氨基酸序列的CDR2和具有由以下式3表示的氨基酸序列的CDR3：
[式1]
D-X11-SMS
其中X11是F或Y，
[式2]
YISRTSHT-X21-X22-YADSVKG
其中X21是T、I或L，并且X22是Y、C、S、L或A，
[式3]
G-F-X31-X32-X33-Y
其中X31是K、F、R或N，X32是M或L，并且X33是D或N。
具体地，在本公开文本的实施方案中，在定义所述重链可变区中包含的CDR的式1中，X11是F或Y，在式2中，X21-X22是TY、IY、TC、TS、IS、LC、LL或IA，并且在式3中，X31-X32-X33是KMD、RMD、FMN、RLD或NLD。
具体地，在本公开文本的一个实施方案中，对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区是包括选自SEQ ID NO:20至32的氨基酸序列的序列。
所述重链可变区(VH)的序列信息如下。
Figure GDA0002713334410000101
关于对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区，所述CDR1序列选自由SEQ ID NO:2至4表示的氨基酸序列，并且所述CDR2序列选自由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10至16表示的氨基酸序列，并且所述CDR3序列选自由SEQ ID NO:6至9和SEQ ID NO:17至18表示的氨基酸序列。
所述CDR的序列信息如下：
Figure GDA0002713334410000111
然而，排除所述重链恒定区和定义本文提供的CDR的式1、2和3中包含的X11、X21-X22和X31-X32-X33，序列编号中指定的所有氨基酸编号是Kabat编号(Kabat EA等人,1991)。
此外，在另一方面，本公开文本提供了一种轻链可变区，其具有对于肿瘤细胞具有特异性的细胞质渗透能力并且抑制对HSPG的结合能力，其中所述轻链可变区可以包含选自SEQ ID NO:34至43和SEQ ID NO:44至60的氨基酸序列。
用于此目的的轻链可变区(VL)的序列信息如下。
Figure GDA0002713334410000131
Figure GDA0002713334410000141
Figure GDA0002713334410000151
此外，在本公开文本的一个实施方案中，经修饰(改善)以改善肿瘤组织靶向能力的重链可变区是包括选自SEQ ID NO:61至63的氨基酸序列的序列。
所述重链可变区(VH)的序列信息如下。
Figure GDA0002713334410000161
此外，在本公开文本的一个实施方案中，用以改善具有肿瘤组织特异性细胞质渗透能力的抗体的细胞内稳定性并向所述抗体赋予长半衰期的重链恒定区是包括选自SEQID NO:65至69的氨基酸序列的序列。
用于此目的的(CH1-CH2-CH3)的序列信息如下。
Figure GDA0002713334410000171
Figure GDA0002713334410000181
此外，在另一方面，本公开文本提供了一种用于构建特异性地结合Ras·GTP并且对其具有改善的亲和力的重链可变区文库的方法。
所述方法包括：
(1)确定参与作为文库模板的RT11重链可变区(VH)的抗原结合的三个互补决定区(CDR)中具有结合细胞内Ras·GTP的高潜力的氨基酸位点；
(2)设计能够编码需要在所确定的氨基酸位点处包含在文库中的氨基酸的简并密码子引物；以及
(3)使用酵母表面表达系统表达呈scFab或Fab形式的所设计的重链可变区文库。
此外，在另一方面，本公开文本提供了一种用于筛选特异性地结合Ras·GTP并且对其具有改善的亲和力的重链可变区的方法，
所述方法包括：
(1)使用酵母表面表达系统表达能够结合Ras·GTP的重链可变区文库；
(2)构建呈稳定形式而不在生物素化期间变形的结合作为GTP类似物的GppNHp的Avi-KRasG12D；
(3)使所述文库与所述GppNHp结合的Avi-KRasG12D结合；以及
(4)测量所述文库与所述GppNHp结合的Avi-KRasG12D之间的结合亲和力。
此外，在另一方面，本公开文本提供了一种完整免疫球蛋白抗体，其包括与选自以下的一种或多种融合的抗体：蛋白质、肽、小分子药物、毒素、酶、核酸和纳米颗粒。
所述蛋白质包括抗体、抗体片段、免疫球蛋白、肽、酶、生长因子、细胞因子、转录因子、毒素、抗原肽、激素、转运蛋白、运动功能蛋白、受体、信号传导蛋白、贮藏蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、内部蛋白、外部蛋白、分泌型蛋白、病毒蛋白、糖蛋白、截短型蛋白、蛋白质复合物、化学改性的蛋白等。
术语“小分子药物”是指有机化合物、无机化合物或有机金属化合物，其具有小于约1,000道尔顿的分子量并且具有作为在本文中广泛使用的针对疾病的治疗剂的活性。本文所用的小分子药物包括寡肽和具有小于约1,000道尔顿的分子量的其他生物分子。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指包括直径为1至1,000nm的材料的颗粒，并且所述纳米颗粒可以是金属/金属核-壳复合物，其包括金属纳米颗粒、金属纳米颗粒核和包含核的金属壳；金属/非金属核-壳复合物，其包括金属纳米颗粒核和包围核的非金属壳；或非金属/金属核-壳复合物，其包括非金属纳米颗粒核和包围核的金属壳。根据一个实施方案，所述金属可以选自金、银、铜、铝、镍、钯、铂、磁性铁及其氧化物，但不限于此，并且非金属可以选自二氧化硅、聚苯乙烯、乳胶和丙烯酸物质，但不限于此。
如本文所用，术语“融合”是指具有不同或相同功能或结构的两个分子的整合，并且包括通过能够将肿瘤特异性细胞质渗透抗体与蛋白质、小分子药物、核酸或纳米颗粒结合的任何物理、化学或生物方法进行的融合。融合可以优选地使用接头肽进行，并且所述接头肽可以介导根据本公开文本的抗体轻链可变区、抗体或其片段在不同位置处与生物活性分子的融合。
此外，本公开文本提供了一种含有生物活性分子的用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述生物活性分子选自抗体或与其融合的肽、蛋白质、小分子药物、核酸和纳米颗粒。
选自抗体或与其融合的肽、蛋白质、小分子药物、核酸和纳米颗粒的所述生物活性分子实现细胞间穿透并且保持在细胞质中而不影响人抗体重链可变区(VH)的抗体特异性和高亲和力，并且因此预期在肿瘤和疾病相关因子的治疗和诊断方面高度有效，所述肿瘤和疾病相关因子被归类为用于使用小分子药物治疗疾病的靶物质，并且存在于细胞质中并通过蛋白质与蛋白质之间宽且平坦的表面形成结构复杂的相互作用。
在另一方面，本公开文本提供了一种使用所述抗体抑制癌症或肿瘤细胞的生长的方法以及一种治疗癌症或肿瘤的方法。
所述癌症选自鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼黑色素瘤、直肠癌、肛门癌、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴瘤、肝癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和头颈癌。
当所述组合物被制备为用于预防或治疗癌症的药物组合物时，所述组合物可以包含药学上可接受的载体。包含在所述组合物中的所述药学上可接受的载体常规地用于药物制备，并且包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。除以上成分之外，所述药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、风味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
可以口服或肠胃外给予用于预防或治疗癌症的所述药物组合物。所述肠胃外给予可以是静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮给予、局部给予、鼻内给予、肺部给予或直肠给予。口服给予后，蛋白质或肽被消化，从而可以用活性药物包覆或配制口服组合物以保护所述蛋白质或肽在胃中不降解。此外，可以使用能够将活性物质递送至靶细胞的任何装置来给予组合物。
用于预防或治疗癌症的药物组合物的合适剂量可以根据诸如以下的因素变化：配制方法、给予方法以及患者年龄、体重、性别、生理状况、饮食、给予时间、给予途径、排泄率和反应性。例如，对于成年人，组合物的合适剂量可以在0.001至100mg/kg的范围内。术语“药学上有效量”可以意指足以预防或治疗癌症或者预防或治疗新生血管性疾病的量。
通过根据本公开文本所属领域技术人员可以易于实施的方法使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制，可以将所述组合物制备为单位剂型，或者可以并入多剂量容器中。在这种情况下，所述配制品可以呈在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液的形式，或者可以按提取物、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊的形式配制。所述组合物可以进一步包含分散剂或稳定剂。此外，可以将所述组合物单独给予或与其他治疗剂组合给予。在这种情况下，可以将本公开文本的组合物与常规治疗剂依次或同时给予。同时，因为所述组合物包含抗体或其抗原结合片段，所以它可以被配制为免疫脂质体。可以根据本领域熟知的方法制备包含抗体的脂质体。可以按包含磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的液体组合物形式通过反相蒸发制备免疫脂质体。例如，抗体的Fab’片段可以通过二硫化物互换反应与脂质体融合。脂质体中可以进一步包含化疗剂诸如多柔比星。
此外，在另一方面，本公开文本提供了一种含有生物活性分子的用于癌症诊断的组合物，所述生物活性分子选自抗体以及与其融合的肽、蛋白质、小分子药物、核酸或纳米颗粒。
如本文所用，术语“诊断”意指确定病理生理的存在或特征。在本公开文本中，诊断用于确定癌症的发作或进展。
所述完整免疫球蛋白抗体或其片段可以结合用于分子成像的磷光体以通过成像诊断癌症。
用于分子成像的磷光体是生成荧光的任何材料，并且优选地发射红色或近红外荧光，并且更优选是具有高量子产率的磷光体，但不限于此。
用于分子成像的磷光体优选是但不限于磷光体、荧光蛋白或能够特异性地结合完整免疫球蛋白抗体或其片段的其他成像材料。
所述磷光体优选是荧光素、BODYPY、四甲基罗丹明、Alexa、花青、别藻蓝素或其衍生物，但不限于此。
所述荧光蛋白优选是Dronpa蛋白、荧光色基因(EGFP)、红色荧光蛋白(DsRFP)、表现出近红外花青荧光的cy5.5磷光体或其他荧光蛋白，但不限于此。
其他成像材料优选是铁氧化物、放射性同位素等，但不限于此，并且可以应用于成像设备，诸如MR和PET。
此外，本公开文本提供了一种编码抗体的多核苷酸，所述抗体包含对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区(VH)和具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，涵盖RNA基因组序列以及DNA(gDNA和cDNA)和由其转录的RNA序列，并且包括天然来源的多核苷酸的类似物，除非另外提及。
多核苷酸不仅包含编码对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区(VH)、具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)和赋予细胞内稳定性和长半衰期的重链恒定区(CH1-CH2-CH3)的核苷酸序列，并且还包含与所述序列互补的序列。此类互补序列包括完全互补序列以及基本上互补的序列。这是指可以在本领域已知的严格条件下与编码SEQ ID NO:20至69的任一个氨基酸序列的核苷酸序列杂交的序列。
所述多核苷酸可以具有变异。这种变异包括核苷酸的添加、缺失、或者非保守性或保守性取代。编码所述氨基酸序列的多核苷酸被解释为包含与所述核苷酸序列具有基本同一性的核苷酸序列。表述“具有基本同一性的核苷酸序列”意指，在将本公开文本的核苷酸序列与任何其他序列比对以尽可能多地与其对应，并使用本领域中常用的算法分析经比对序列时，具有至少80％的同源性，更优选至少90％的同源性并且最优选至少95％的同源性的核苷酸序列。
在另一方面，本公开文本提供了一种用于制备完整免疫球蛋白型抗体的方法，所述完整免疫球蛋白型抗体使用对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区(VH)和具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)渗透到细胞中并置于细胞质中，所述方法包括：
(1)制备用核酸克隆的内体逃逸重链表达载体，所述核酸被由包含在含有人重链可变区(VH)和人重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的重链中的重链可变区(VH)人源化的对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区(VH)取代；
(2)制备用核酸克隆的细胞质渗透轻链表达载体，所述核酸被由包含在含有人轻链可变区(VL)和人轻链恒定区(CL)的轻链中的轻链可变区(VL)人源化的具有细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)和人源化的具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)取代；
(3)将所制备的重链表达载体和轻链表达载体共转化到用于蛋白质表达的动物细胞中，以表达完整免疫球蛋白型抗体，所述完整免疫球蛋白型抗体包含对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区(VH)和具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)；以及
(4)纯化并回收所表达的完整免疫球蛋白型抗体。
所述方法可以表达一种表达重链的载体和一种表达轻链的载体，从而特异性地表达特异性地针对肿瘤组织渗透到细胞中并且定位在细胞质中并能够以高亲和力靶向细胞内Ras/GTP的抗体。所述载体可以是在一个载体中同时表达轻链和重链的载体系统或者在分开的载体中独立地表达这些链的系统。在后一种情况下，可以将两个载体通过共转化和靶向转化引入到宿主细胞中。
所述重组载体中由本公开文本提供的轻链可变区(VL)、轻链恒定区(CL)、重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)操作性地连接到启动子。术语“操作性地连接”意指核苷酸表达控制序列(例如，启动子序列)与另一个核苷酸序列之间的功能连接，这样使得控制序列能够调节另一个核苷酸序列的转录和/或翻译。
所述重组载体通常可以被构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。所述用于表达的载体可以是本领域中用于在植物、动物或微生物中表达外来蛋白的常规载体。所述重组载体可以通过本领域中已知的任何各种方法来构建。
所述重组载体可以使用原核或真核细胞作为宿主来构建。例如，当所使用的载体是表达载体并且使用原核细胞作为宿主时，所述载体通常包含能够进行转录的强启动子(诸如pLλ启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子等)、启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。此外，例如，当使用真核细胞作为宿主时，载体中包含的在真核细胞中操作的复制起点包括但不限于f1复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺病毒复制起点、AAV复制起点、CMV复制起点、BBV复制起点等。另外，可以使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子或HSV tk启动子)，并且所述载体通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
在另一方面，本公开文本提供了用所述重组载体转化的宿主细胞。
所述宿主细胞可以是本领域熟知的任何宿主细胞，并且在转化原核细胞的情况下，包括例如大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776、大肠杆菌W3110；芽孢杆菌属的菌株，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；以及肠球菌属，和菌株，诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和各种假单胞菌属物种(Pseudomonas species)。在转化真核细胞的情况下，可以使用酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞诸如SP2/0、中国仓鼠卵巢K1、CHO DG44、PER.C6、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Huh7、3T3、RIN和MDCK细胞系等作为宿主细胞。
在另一方面，本公开文本提供了一种用于产生完整免疫球蛋白型抗体的方法，所述完整免疫球蛋白型抗体特异性地渗透到肿瘤组织细胞中并且定位在细胞质中，并且因此能够以高亲和力靶向细胞内Ras/GTP，所述方法包括培养宿主细胞。
将重组载体插入到宿主细胞中可以使用本领域熟知的插入方法来进行。所述递送方法可以是CaCl2方法或电穿孔方法，例如当宿主细胞是原核细胞时。当宿主细胞是真核细胞时，所述递送方法可以是显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染、基因轰击等，但不限于此。使用微生物(诸如大肠杆菌)实现比使用动物细胞时更高的生产力，但是由于糖基化的问题而不适于产生完整Ig型抗体，而适于产生抗原结合片段诸如Fab和Fv。
用于选择经转化的宿主细胞的方法可以易于使用通过选择标记物表达的表型根据本领域熟知的方法进行。例如，当所述选择标记物是特异性地针对抗生素耐药性的基因时，转化体可以易于通过在含有抗生素的培养基中培养转化体来选择。
附图说明
图1是示出了用于基于RT11的重链可变区选择和构建文库以便改善抗Ras·GTPiMab对Ras·GTP的亲和力的策略的示意图。
图2a示出了FACS分析的结果，以确定每个步骤中文库表达酵母与10nM Avi-KRasG12D·GppNHp或1000nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力，以便确认在Avi-KRasG12D·GppNHp中通过使用MACS(磁活化细胞分选)和FACS(荧光活化细胞分选)的选择过程进行的特异性富集。
图2b示出了流式细胞术的结果，以确定在最终选择的文库中表达47种单独克隆的酵母与5nM Avi-KRasG12D·GppNHp的结合能力。
图3a是展示了构建与整合素靶向原肽融合并且基于RT11对于Ras·GTP具有改善的亲和力的完全IgG型抗Ras·GTP iMab(RT22-i3)的示意图。
图3b示出了ELISA的结果，以分析基于RT11的亲和力改善的抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppNHp和100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力，以便确定抗Ras·GTP iMab与GppNHp结合的Avi-KRasG12D的特异性结合。
图3c示出了共聚焦显微术分析的结果，以确定在37℃下用1μM对活化的细胞内Ras具有改善的亲和力的抗Ras·GTP iMab处理KRas突变体结直肠癌细胞系SW480 12小时之后与活化的细胞内Ras的重叠。
图4是示出了用于基于RT22的重链可变区选择和构建文库以便改善抗Ras·GTPiMab对Ras·GTP的亲和力的策略的示意图。
图5a示出了在包含基于RT22的亲和力改善的重链可变区(VH)与融合了整合素靶向原肽并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(hT4-i33)的组合的抗RasGTP·iMab的纯化之后，在还原或非还原条件下12％SDS-PAGE分析的结果。
图5b示出了每种抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppN Hp或与100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力的ELISA分析的结果，以确定GppNHp结合的Avi-KRasG12D与包含基于RT22的亲和力改善的重链可变区(R T31 VH、RT33 VH、RT34 VH)和融合了整合素靶向原肽并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(hT4-i33)的组合的抗Ras·GTP iMab之间的特异性结合。
图5c示出了每种抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppN Hp或100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力的ELISA分析的结果，以确定Gp pNHp结合的Avi-KRasG12D与包含基于RT22的亲和力改善的重链可变区(RT31VH、RT36 VH、RT37 VH)和融合了整合素靶向原肽并具有受抑制的HS PG结合能力的轻链可变区(hT4-i33)的组合的抗Ras·GTP iMab之间的特异性结合。
图6是展示了构建具有改善的亲和力的包含与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(VL)的完全IgG型抗Ras·GTP iMab(RT22-i33、RT22-ep33)的示意图。
图7示出了共聚焦显微术分析的结果，以确定在用具有改善的亲和力的包含与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(VL)的完全IgG型抗Ras·GTP iMab(RT22-33(1μM)、RT22-i33 MG(0.5μM)、RT22-ep33 MG(1μM))以及用作为对照组的cytotransmab(CT-33(1μM)、CT-i33 MG(0.5μM)、CT-ep33 MG(1μM))处理KRas突变体结直肠细胞系SW480之后与活化的细胞内Ras的重叠。
图8a示出了在37℃下用1μM抗体处理HeLa细胞6小时之后进行的共聚焦显微术的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力和细胞质渗透的降低或去除，并且是示出了定量的Alexa488荧光(绿色荧光)的柱状图。
图8b示出了表达HSPG的HeLa细胞系中非特异性细胞表面结合ELISA的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力。
图8c示出了在用500nM抗体处理HeLa细胞系之后使用FACS进行的流式细胞术的结果，以确定包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力。
图9a示出了ELISA的结果，以分析包含与整合素靶向原肽融合并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(hT4-i33 MG～hT4-i37 MG VL)的抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppNHp或100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力。
图9b示出了ELISA的结果，以分析cytotransmab和包含与整合素靶向原肽融合并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(hT4-i38 MG至hT4-i39MG VL)的抗Ras·GTPiMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppNHp或100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力。
图9c示出了共聚焦显微术分析的结果，以确定在37℃下用1μM cytotransmab和包含与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(VL)的抗Ras·GTP iMab处理KRas突变体结直肠癌细胞系SW480 12小时之后与活化的细胞内Ras的重叠。
图10a示出了ELISA的结果，以分析包含与EpCAM靶向原肽和基于hT4-38和hT4-39的修饰的抗体框架(以提高产率)融合的轻链可变区(hT4-ep58 MG至hT4-ep59 MG VL)的抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppNHp或100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力。
图10b示出了共聚焦显微术分析的结果，以确定在37℃下用1μM包含与EpCAM靶向原肽融合并具有基于hT4-38和hT4-39的修饰的抗体骨架以提高产率的轻链(hT4-58、hT4-59)的抗Ras·GTP iMab(RT22-ep58，RT22-ep59)处理KRas突变体结直肠癌细胞系SW480 12小时之后与活化的细胞内Ras的重叠。
图11a示出了在37℃下用1μM抗体处理HeLa细胞6小时之后进行的共聚焦显微术的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力和细胞质渗透的降低或去除，并且是示出了定量的Alexa488荧光(绿色荧光)的柱状图。
图11b示出了表达HSPG的HeLa细胞系中非特异性细胞表面结合ELISA的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力。
图11c示出了在用500nM抗体处理HeLa细胞系之后使用FACS进行的流式细胞术的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力。
图12a示出了使用FACS进行的测试的结果，以鉴定整合素ανβ3或整合素ανβ5在人结直肠癌细胞系SW480和LoVo以及人血癌细胞系野生型K562和表达整合素ανβ3的K562中的表达。
图12b示出了使用FACS进行的测试的结果，以确定对肿瘤组织整合素具有特异性、不具有HSPG结合能力并且包含对于Ras·GTP具有改善的亲和力的重链(RT22)的抗Ras细胞渗透抗体(RT22-i38 MG和RT22-i39 MG)和对肿瘤组织整合素具有特异性的常规抗Ras细胞渗透抗体(RT11-i)与细胞表面整合素ανβ3或整合素ανβ5的结合能力。
图12c示出了使用FACS进行的测试的结果，以确定EpCAM在人结直肠癌细胞系SW480和LoVo以及人宫颈癌细胞系HeLa中的表达。
图12d示出了使用FACS进行的测试的结果，以确定不具有HSPG结合能力并包含对Ras·GTP具有改善的亲和力的重链(RT22)的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras细胞渗透抗体(RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG)与细胞表面EpCAM的结合能力。
图13a是示出了细胞生长抑制能力的图，所述细胞生长抑制能力在若干Ras突变体和野生型细胞系中在37℃下用与融合了整合素靶向原肽并具有提高的产率和受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区组合的0.5μM抗Ras·GTP iMab处理48小时之后通过WST测定确定。
图13b是示出了细胞生长抑制能力的图，所述细胞生长抑制能力在若干Ras突变体和野生型细胞系中在37℃下用与融合了EpCAM靶向原肽并具有提高的产率和受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区组合的1μM抗Ras·GTP iMab处理48小时之后通过WST测定确定。
图14a示出了测试的结果，以便在以2天间隔，总计9次将与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的20mg/kg抗Ras细胞渗透抗体(RT22-i38MG、RT22-i39 MG)和与整合素靶向原肽融合的常规抗Ras细胞渗透抗体(RT11-i)静脉内注射到人结直肠癌KRas突变体细胞系LoVo和SW480异种移植物小鼠中时比较肿瘤生长抑制作用。
图14b是示出了所提取的肿瘤的重量的图，以及示出了在用与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体处理之后的肿瘤的图像。
图14c是示出了进行测量以确定与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体的非特异性副作用的小鼠的重量的图。
图15a示出了测试的结果，以便在以2天间隔，总计9次将与EpCAM靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的20mg/kg抗Ras细胞渗透抗体(RT22-ep58 MG、RT22-ep59 MG)静脉内注射到人结直肠癌细胞系LoVo和SW480异种移植物小鼠中时比较肿瘤生长抑制作用。
图15b是示出了所提取的肿瘤的重量的图，以及示出了在用与EpCAM靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体处理之后的肿瘤的图像。
图15c是示出了进行测量以确定与EpCAM靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体的非特异性副作用的小鼠的重量的图。
图16a示出了测试的结果，以便在人结直肠癌KRas突变体细胞系LoVo异种移植物小鼠中根据与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体(RT22-i39 MG)的剂量、给予间隔和给予途径来比较肿瘤生长抑制能力。
图16b是示出了所提取的肿瘤的重量的图，以及示出了在用与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体处理之后的肿瘤的图像。
图16c是示出了进行测量以确定与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体的非特异性副作用的小鼠的重量的图。
图17a示出了测试的结果，以便在人结直肠癌KRas突变体细胞系LoVo异种移植物小鼠中根据与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体(RT22-ep59 MG)的剂量、给予间隔和给予途径来比较肿瘤生长抑制能力。
图17b是示出了所提取的肿瘤的重量的图，以及示出了在用与EpCAM靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体处理之后的肿瘤的图像。
图17c是示出了进行测量以确定与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体的非特异性副作用的小鼠的重量的图。
图18a示出了使用改进的分裂绿色荧光蛋白互补系统确定肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab的减少的细胞质内降解的结果。
图18b示出了为了确定人结直肠癌细胞系中具有改善的细胞质内稳定性的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras GTP iMab对非贴壁细胞生长的抑制活性而实施的软琼脂集落形成方法的结果。
图18c示出了为了确定人结直肠癌细胞系中具有改善的细胞质内稳定性的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab对非贴壁细胞生长的抑制活性而实施的失巢凋亡方法的结果。
图18d示出了为了确定人肺癌细胞系中具有改善的细胞质内稳定性的肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab对非贴壁细胞生长的抑制活性而实施的失巢凋亡方法的结果。
图19a示出了在纯化具有改善的体内持久性的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras GTP之后在还原或非还原条件下通过12％SDS-PAGE进行的分析的结果。
图19b示出了在BALB/c裸小鼠中具有改善的体内持久性的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras GTP的药代动力学评价的结果。
图20a示出了使用FACS进行的测试的结果，以确定与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的抗Ras·GTP iMab即epRas23 MG与细胞表面EpCAM的结合能力。
图20b示出了ELISA的结果，以分析包含与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的抗Ras·GTP iMab与25、50、100nM Avi-KRasG12D·GppNHp或100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力。
图20c示出了为了确定人肺癌细胞系中具有与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的抗Ras·GTP iMab即epRas23MG对非贴壁细胞生长的抑制活性而实施的失巢凋亡方法的结果。
图20d是示出了包含与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的抗Ras·GTP iMab即epRas23 MG在小鼠中的生物分布的图像，以及示出了肿瘤和整个身体的荧光的图。
图20e是示出了包含与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的抗Ras·GTP iMab即epRas23 MG在小鼠中的生物分布的图像，以及示出了使用所提取的器官定量的荧光的图。
图21a示出了尺寸排阻色谱的结果，以确定改善肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体是否是多聚体。
图21b示出了改善肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体在BALB/c裸小鼠中的药代动力学评价的结果。
图22a示出了尺寸排阻色谱的结果，以确定改善肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体中多聚体的存在。
图22b示出了测试的结果，以在人结直肠癌KRas突变体细胞系LS1034异种移植物小鼠中比较改善肿瘤组织整合素特异性抗Ras细胞渗透抗体的体内持久性的LALA-PG突变体的肿瘤生长抑制作用。
图22c示出了测试的结果，以在人结直肠癌KRas突变体细胞系SW403异种移植物小鼠中比较改善肿瘤组织整合素特异性抗Ras细胞渗透抗体的体内持久性的LALA-PG突变体的肿瘤生长抑制作用。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开文本。然而，对于本领域技术人员明显的是，提供这些实施例仅用于说明本公开文本，并且不应该被解释为限制本公开文本的范围。
实施例1.结合GppNHp的Avi-KRasG12D蛋白的制备
构建Avi-KRasG12D抗原，所述抗原包含与其N末端融合的Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)以用于文库选择。构建Avi-KRasG12D抗原以便最小化结构变性，其可能在文库选择期间导致抗原生物素化中的问题。
具体地，通过PCR构建其中不包含C末端高变区的KRasG12D蛋白的催化G结构域(残基1至169)在N末端使用GSG接头与8X his标签和Avi标签融合的DNA，并且使用在作为用于大肠杆菌表达的载体的pET23载体中使用限制性酶NcoI和HindIII克隆。然后，通过电穿孔将构建的pET23-8Xhis-Avi-KRasG12D(1-169)与编码作为用于体内生物素化的生物素连接酶的BirA的载体(pBirAcm)一起转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)plysE中，并且然后在含有100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml氯霉素的选择性培养基中进行选择。在37℃下在含有5mMMgCl2的选择性培养基(LBCA)中培养选择的大肠杆菌，直至600nm处的吸光度达到0.6之后，向其中添加用于蛋白质表达的0.5mM IPTG和用于体内生物素化的50μM d-生物素，接着在30℃下再培养4小时。通过将12mg d-生物素添加到10mL 10mM bicin缓冲液(pH 8.3)中来制备用于添加50μM d-生物素的储备溶液。在培养大肠杆菌之后，将使用离心机收集的大肠杆菌重悬浮在含有20mM Tris、500mM NaCl、5mM咪唑和2mMβ-ME的缓冲液中，并且用超声波将大肠杆菌(SONICS)粉碎。使用离心机仅收集去除了粉碎的大肠杆菌的上清液，并且然后使用Ni-NTA树脂纯化以用于特异性地纯化与His标签融合的蛋白质。将Ni-NTA树脂用50ml洗涤缓冲液(20mM Tris，pH 7.4，300mM NaCl，20mM咪唑，2mM MgCl2和2mMβ-ME)洗涤，并且将蛋白质用洗脱缓冲液(20mM Tris，pH 7.4，300mM NaCl，250mM咪唑，2mM MgCl2和2mMβ-ME)洗脱。将洗脱的蛋白质使用透析方法用储备缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM DTT，2mM MgCl2)缓冲。使用在280nm波长处测量的吸光度和吸收系数定量纯化的蛋白质。通过SDS-PAGE分析鉴定到约98％或更大的纯度。
使用凝胶移位鉴定纯化的Avi-KRasG12D蛋白与Avi标签和生物素通过体内生物素化进行的高产率融合。具体地，将Avi-KRasG12D蛋白在SDS-PAGE加载缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 6.8，1％SDS，10％甘油，175mMβ-ME)中洗脱，使其反应10分钟并且然后使其在室温下与1μg链霉亲和素反应30分钟，将通过SDS-PAGE分离的蛋白质转移到PVDF膜，并且使用与HRP融合的抗His抗体进行鉴定。
使Avi-KRasG12D蛋白与GTP类似物(GppNHp)或GDP反应，并且然后通过SDS-PAGE分析。具体地，为了形成GTP类似物(GppNHP)与Ras蛋白的复合物，将纯化的Ras蛋白在底物交换缓冲液(40mM Tris-HCl，pH 7.5，200mM(NH4)2SO4，10μM ZnCl2，5mM DTT)中稀释，并且向其中添加对于每mg Ras蛋白而言与2个单位的珠粒融合的碱性磷酸酶以及摩尔量为Ras蛋白的至少10倍的GppNHp，接着使反应在室温下进行1小时。为了形成GDP和Ras蛋白的复合物，添加摩尔量为Ras蛋白的至少20倍的GDP和20mM EDTA，并使其在30℃下反应30分钟，并且然后向其中添加60mM MgCl2，并且使所得物在4℃下静置30分钟以使反应停止。在使用PD10 Sephadex G25柱使缓冲液与储备缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM DTT，2mMMgCl2)交换之后通过SDS-PAGE分析通过所述方法获得的GppNHp或GDP结合的Ras蛋白。对于长期储存，将结合所述底物的Ras蛋白储存在-80℃下。
进行ELISA来分析通过以上方法制备的Avi-KRasG12D蛋白和没有Avi标签的His-KRasG12D蛋白的RT11结合能力。具体地，使作为抗Ras·GTP iMab的RT11在室温下在96孔EIA/RIA板(COSTAR Corning)中以5μg/ml的浓度结合1小时，并且然后在室温下用0.1％TBST(12mM Tris，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％Tween20，5mM MgCl2)洗涤10分钟。在与4％TBSB(12mM Tris，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，4％BSA，10mM MgCl2)结合1小时之后，将所得物用0.1％TBST洗涤3次，持续10分钟。然后，将与GppNHp结合的KRas蛋白和与GDP结合的KRas蛋白在4％TBSB中稀释，并且然后在室温下以100nM的浓度结合1小时，接着用0.1％TBST洗涤三次，持续10分钟。将所得物与作为标记抗体的HRP缀合的抗his抗体(HRP缀合的抗his mAb)结合。使所得物与TMB ELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
以上实验显示，与Avi标签融合的KRasG12D蛋白可以用于选择RT11亲和力改善文库。
实施例2.基于RT11D的抗Ras·GTP iMab高多样性抗体文库的构建和具有增强的Ras·GTP特异性亲和力的重链可变区(VH)的选择
常规专利(韩国专利号10-1602876)中的抗Ras·GTP iMab RT11高度特异性地结合Ras·GTP并且在各种Ras突变体细胞系中表现出生物活性，但是对于Ras·GTP表现出约12nM的亲和力水平，这是比呈IgG形式的各种抗体的亲和力更低的亲和力。此外，通过抑制Ras·GTP与效应分子之间的结合而表现出生物活性的抗Ras·GTP iMab RT11可以通过改善与Ras·GTP的亲和力来增强生物活性。因此，除修饰(改善)轻链可变区来为其赋予组织特异性以便增加抗Ras·GTP iMab的治疗效率之外，诸位发明人尝试增加抗Ras·GTP iMabRT11对Ras·GTP的亲和力。
在选择基于RT11的具有改善的亲和力的Ras·GTP特异性重链可变区期间使用的轻链可变区是具有改善的内体逃逸能力的hT4-3轻链可变区，其通过以下获得：引入其中WYW(Trp-Tyr-Trp)定位在常规专利(韩国专利号10-1602876)中使用的用于细胞质渗透的hT4轻链可变区(VL)的残基92-94处的CDR3，并且用苯丙氨酸(Phe)取代对应于轻链可变区(VL)与重链可变区(VH)之间的界面的轻链可变区框架区的残基87，以便克服由于引入WYW而产生的疏水性残基向溶剂的暴露增加以及因此产率降低的问题(韩国专利申请号10-2016-0065365)。
图1是示出了用于基于RT11的重链可变区选择和构建文库以便改善抗Ras·GTPiMab对Ras·GTP的亲和力的策略的示意图。
使用同源模建和对接程序预测Ras·GTP与RT11抗体之间的结合结构，并且将随机突变引入到CDR和基于预测结果预测在抗原结合中发挥重要作用的周围区域中。
具体地，将可以在预测的结合结构中包含合适的氨基酸序列的简并密码子用于CDR1(第31至33位)和CDR2(第52至56位)的残基。将简并密码子RNC、THC和KSG顺序地用于CDR1(第31至33位)，并且将简并密码子ASC、MRA、ASC、ASC、CRC和WMC顺序地用于CDR2(第52至56位)。使用能够编码在种系抗体序列中存在的Arg和Lys的ARG简并密码子，因为CDR3周围框架的残基94是在可以影响CDR结构的位置处的残基。CDR3的残基(第95至97位)是能够以50％概率保留RT11的序列的加标寡聚物。这是可以通过设计一种引物，使得在每个残基的3个编码氨基酸的核苷酸中的每个中，可以将野生型核苷酸维持在79％，并且将剩余核苷酸的比率调整至7％，以便在PCR过程中将野生型氨基酸维持在50％的技术。CDR3(第100a位)残基是用于VH/VL结合的重要残基，并且对其使用WTK简并密码子，其可以包含在种系抗体序列中存在的Phe、Ile和Leu，包括RT11抗体的Met。
具体地，对亲和力改善文库中的轻链可变区使用具有改善的细胞质渗透能力的hT4-3 VL。
具体地，使用PCR技术扩增编码所设计的文库的DNA，并且然后使用乙醇沉淀方法使其浓缩。用NheI和MluI限制性酶处理在c末端表达aga2蛋白以用于同源重组的酵母表面表达载体(C-aga2)，并且然后使用琼脂糖凝胶提取进行纯化并使用乙醇沉淀进行浓缩。通过电穿孔将针对12μg每种文库编码DNA的用限制性酶处理的5μg载体转化到用于酵母表面表达(Baek D.S.和Kim Y.S.,2014)的酵母EBY100中，并且通过系列稀释测量在选择性培养基SD-CAA(20g/L葡萄糖，6.7g/L没有氨基酸的酵母氮基，5.4g/L Na 2HPO4，8.6g/LNaH2PO4，5g/L酪蛋白氨基酸)中生长的菌落的数量，以确定文库大小。
实施例3.对于GppNHp结合的KRasG12D具有改善的亲和力的重链可变区(VH)的选择
使用GppNHp结合的KRasG12D作为抗原选择实施例2中构建的基于RT11-3的亲和力改善文库。
具体地，使约100nM纯化的GppNHp结合的Avi-KRasG12D在室温下与酵母反应1小时，所述酵母使用SG-CAA培养基(20g/L半乳糖，6.7g/L没有氨基酸的酵母氮基，5.4g/LNa2HPO4，8.6g/L NaH2PO4，5g/L酪蛋白氨基酸)在细胞表面上诱导单链Fab(scFab)型重链可变区文库的表达。然后，使表达与GppNHp结合的Avi-KRasG12D连接的文库的酵母在4℃下与链霉亲和素MicrobeadTM(Miltenyi Biotec)反应20分钟，并且然后使用MACS(磁活化细胞分选)富集表达对于GppNHp结合的Avi-KRasG12D具有高亲和力的重链可变区的酵母。在选择性培养基SD-CAA(20g/L葡萄糖，6.7g/L没有氨基酸的酵母氮基，5.4g/L Na2HPO4，8.6g/LNaH2PO4，5g/L酪蛋白氨基酸)和SG-CAA中培养所选择的文库的酵母以诱导文库表达，使得用于初级FACS筛选的不经历体内生物素化的GppNHP结合的Avi-KRasG12D和与GDP结合的Avi-KRasG12D抗原在室温下以1:10的比率与表达文库的酵母竞争性地反应1小时，与PE缀合的链霉亲和素-R-藻红蛋白(SA-PE,Invitrogen)反应，并通过FACS(荧光活化细胞分选，FACSCaliber，BD biosciences)悬浮。然后，使用10nM不经历体内生物素化的GppNHp结合的Avi-KRasG12D和与GDP结合的Avi-KRasG12D抗原以1:100的比率以如上相同的方式进行二级FACS筛选，并且使用1nM不经历体内生物素化的GppNHp结合的Avi-KRasG12D抗原和GDP结合的Avi-KRasG12D抗原以1:100的比率以如上相同的方式进行三级FACS筛选。
图2a示出了FACS分析的结果，以确定每个步骤中文库表达酵母与10nM Avi-KRasG12D·GppNHp或1000nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力，以便确认在Avi-KRasG12D·GppNHp中通过使用MACS(磁活化细胞分选)和FACS(荧光活化细胞分选)的选择过程进行的特异性富集。这鉴定了，通过超快选择过程以重链可变区(VH)依赖性方式选择了与RT11-3相比对于GppNHp结合的Avi-KRasG12D具有高亲和力的克隆。
图2b示出了流式细胞术的结果，以确定在最终选择的文库中表达47种单独克隆的酵母与5nM Avi-KRasG12D·GppNHp的结合能力。
通过如上所述对单独克隆结合能力的分析来选择对GppNHp结合的Avi-KRasG12D具有高亲和力和特异性的六种独特克隆(RT21、RT22、RT23、RT24、RT25、RT26)。
以下表1示出了对所选择的GppNHp结合的Avi-KRasG12D具有高结合能力的六种单独克隆的重链可变区序列，并且表2示出了表1的重链可变区的CDR序列。
[表1]
Figure GDA0002713334410000371
[表2]
Figure GDA0002713334410000381
实施例4.具有改善的亲和力的抗Ras·GTP iMab抗原的抗原结合能力的分析
为了构建在重链可变区中引入突变的细胞质渗透抗体(cytotransmab)，将包含基于RT11对于Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区和重链恒定区(CH1-CH2-CH3)的重链克隆到动物表达载体中，并且使用基因工程技术使用两个GGGGS接头将在新生血管性细胞和各种肿瘤中过表达的对于整合素(整合素αvβ3和αvβ5)具有特异性的RGD10原肽与细胞质渗透人源化hT4-3轻链的N末端融合，并且克隆到动物表达载体中。RGD10原肽与RGD4C原肽具有相似的亲和力，但是在两个半胱氨酸之间仅具有一个二硫键，并且它可以使用基因工程技术融合。将对于Ras·GTP具有改善的亲和力的重链表达载体和融合了RGD10原肽的细胞质渗透人源化轻链表达载体(hT4-i3 LC)在HEK293F蛋白质表达细胞中同时经受瞬时转染以表达具有改善的亲和力的抗Ras·GTP iMab突变。
具体地，为了构建用于产生完整免疫球蛋白型细胞质渗透抗体的重链表达载体，将编码包含基于RT11的重链恒定区(CH1-CH2-CH3)并引入具有改善的亲和力的重链可变突变的重链的DNA(在其5’末端融合了编码分泌信号肽的DNA)用NotI/HindIII克隆到pcDNA3.4载体中。表达蛋白质，并且使用重链表达载体和先前细胞质渗透抗体的轻链(韩国专利申请号10-2016-0065365)通过瞬时转染进行纯化，并且比较产率。将在无血清的FreeStyle 293表达培养基中悬浮和生长的HEK293F细胞在摇瓶中用质粒和聚乙烯亚胺(PEI)的混合物转染。在摇瓶中200mL转染期间，将HEK293F细胞以2.0x 106个细胞/ml的密度接种于100ml培养基中，并在120rpm、8％CO2和37℃下进行培养。为了产生抗体，将合适的重链和轻链质粒在10ml FreeStyle 293表达培养基中稀释至总计250μg(2.5μg/ml)，包括125μg重链和125μg轻链，并且过滤，然后与其中稀释750μg(7.5μg/ml)PEI的10ml培养基混合，并且在室温下反应10分钟。然后，将100ml反应的混合培养基添加到先前接种的细胞中，并且然后将细胞在120rpm和8％CO2下培养4小时，并且向其中添加剩余100ml FreeStyle293表达培养基，接着培养6天。根据标准方案从收集的细胞培养上清液中纯化蛋白质。将抗体施加到蛋白质A Sepharose柱上并用PBS(pH 7.4)洗涤。使用0.1M甘氨酸和0.5M NaCl缓冲液在pH 3.0下洗脱抗体，并且然后立即将样品用1M Tris缓冲液中和。将洗脱的抗体级分在通过透析方法进行缓冲液交换的新鲜PBS(pH 6.5)中浓缩。使用在280nm波长处的吸光度和吸收系数定量纯化的蛋白质。
图3a是展示了构建与整合素靶向原肽融合并且基于RT11对于Ras·GTP具有改善的亲和力的完全IgG型抗Ras·GTP iMab(RT22-i3)的示意图。
图3b示出了ELISA的结果，以分析基于RT11的亲和力改善的抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppNHp和100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力，以便确定抗Ras·GTP iMab与GppNHp结合的Avi-KRasG12D的特异性结合。
具体地，将作为抗Ras·GTP iMab的RT11-i和六种与RGD原肽融合的亲和力增强的iMab在室温下以5μg/ml的浓度在96孔EIA/RIA板中结合1小时。然后，将所得物用0.1％TBST(12mM Tris，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％Tween20，5mM MgCl2)洗涤三次，持续10分钟。然后，将所得物与4％TBSB(12mM Tris，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，4％BSA，10mMMgCl2)结合1小时，并且然后用0.1％TBST洗涤3次，持续10分钟。将GppNHp结合的KRas蛋白和GDP结合的KRas蛋白在4％TBSB中稀释，在室温下以100nM、10nM和1nM的不同浓度结合1小时，并且用0.1％TBST洗涤3次，持续10分钟。将所得物与作为标记抗体的HRP缀合的抗his抗体(HRP缀合的抗his mAb)结合。使所得物与TMB ELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
ELISA分析显示，所选择的6种类型的抗Ras·GTP iMab表现出比常规RT11-i3更高的抗原结合能力。
图3c示出了共聚焦显微术分析的结果，以确定用具有改善的亲和力的抗Ras·GTPiMab处理KRas突变体结直肠癌细胞系SW480之后与活化的细胞内Ras的重叠。
具体地，将SW480细胞系以0.5ml的2x104个细胞/孔在24孔板中稀释，在37℃下在5％CO2下培养12小时，并且然后用TMab4-i、RT11-i以及6种类型的具有改善的亲和力的1μM抗Ras·GTP iMab处理，并且然后在37℃下培养12小时。然后，去除培养基，将残余物用PBS洗涤，并且将附着到细胞表面的蛋白质用弱酸溶液(200mM甘氨酸，150mM NaCl pH 2.5)去除。在用PBS洗涤之后，添加4％多聚甲醛，并且将细胞在25℃下固定10分钟。在用PBS洗涤之后，将细胞在25℃下在含有补充0.1％皂苷、0.1％叠氮化钠和1％BSA的PBS的缓冲液中培养10分钟，并且在细胞膜中形成孔。然后，将细胞再次用PBS洗涤，并且在25℃下与除PBS之外还含有2％BSA的缓冲液反应1小时以便抑制非特异性结合。将每种抗体用特异性地识别与Alexa-488(绿色荧光)连接的人Fc的抗体染色。使用Hoechst33342对核进行染色(蓝色荧光)，并且对KRas标记的抗体进行染色(红色荧光)，并且然后用共聚焦显微镜观察。发现除了TMab4-i3以外所有的抗Ras·GTP iMab均具有与细胞内Ras重叠的荧光。
在它们之中，将在ELISA实验期间表现出与活化的细胞内Ras结合的能力和与Avi-KRasG12D·GppNHp最高的结合能力的RT22-i3 iMab经受使用Biacore2000仪器进行的SPR(表面等离子体共振)，以更加定量地分析其与GppNHp结合的KRasG12D的结合能力。
具体地，将RT22-i3在10mM NaAc缓冲液(pH 4.0)中稀释至20μl/ml的浓度，并且以大约1800个响应单位(RU)固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。随后，以30μl/min的流速分析Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，137mM NaCl，5mM MgCl2，0.01％Tween 20)，并且以50nM至3.125nM的浓度分析GppNHp结合的GST-KRasG12D完全抗体。在结合和解离分析之后，通过使缓冲液(20mM NaOH，1M NaCl，pH 10.0)以30μl/min的流速流动1分钟来进行CM5芯片的再生成。将通过结合3分钟并解离3分钟获得的每个传感图参考空白单元进行归一化并减去空白单元，并且由此计算亲和力。
以下表3示出了使用SPR(BIACORE 2000)进行的抗Ras·GTP iMab RT11-i和RT22-i3对于完全形式的GppNHp结合的GST-KRasG12D的亲和力分析的结果。
[表3]
Figure GDA0002713334410000411
实施例5.基于RT22重链可变区(VH)的额外亲和力改善的文库构建和选择
包含对Ras·GTP具有改善的结合能力的重链可变区(RT22 VH)的抗Ras·GTPiMab(RT22-i3)具有约1.4nM的亲和力。然而，其通过与维持与细胞膜受体HSPG的结合的轻链可变区(hT4-3 VL)组合来选择。因为HSPG在大部分组织中表达，所以构建其中将种系抗体序列引入到CDR1和CDR2中的轻链可变区，并且发现使用轻链可变区构建的抗Ras·GTPiMab在RGD原肽的融合期间具有严重的产率降低。因此，对与具有组织特异性的轻链可变区组合的重链可变区(VH)的CDR进行修饰，以克服亲和力和产率降低的问题。
以下详细给出具有降低的HSPG结合且具有组织特异性的轻链可变区的描述。
图4是示出了用于基于RT22的重链可变区选择和构建文库以便改善抗Ras·GTPiMab对Ras·GTP的亲和力的策略的示意图。
为了改善亲和力，使用Galaxy建模分析3D结构模型，并且向CDR2(第55至58位)和CDR3(第95、97和100a位)赋予突变，基于分析结果，这些位置被认为对于抗原结合具有显著影响。
具体地，对于CDR2的残基55使用简并密码子(VRC)，使得残基氨基酸序列可以维持在16.67％的概率，并且亲水性或带负电荷的氨基酸可以位于此处，并且对于CDR3的残基57使用简并密码子(MYT)，使得鉴于侧链的大小和方向，可以增加与抗原的亲和力，同时将常规氨基酸序列维持在25％概率。对于CDR3的残基95使用简并密码子(VST)，使得鉴于侧链的大小和方向可以维持或改善与Ras·GTP的结合能力，同时将常规氨基酸序列维持在16.67％概率，并且对于残基100a使用简并密码子(WTK)，使得亲水性氨基酸可以位于此处。对于CDR2的残基56和58以及CDR3的残基97使用与实施例2中相同的加标寡聚物。这是可以应用所有的氨基酸，同时保留50％概率的常规野生型RT22 VH序列的突变方法，并且是可以通过设计一种引物，使得在编码氨基酸的3个核苷酸中的每个中，可以将野生型核苷酸维持在79％，并且将剩余核苷酸的比率调整至7％，以便在PCR过程中将野生型氨基酸维持在50％的技术。
具体地，将在其表面上表达初始基于RT22的文库的酵母与分泌去除了HSPG结合能力的细胞质渗透轻链(hT4-33 VL)的酵母杂交，并且所得的产物在酵母表面上以Fab的形式表达。
具体地，为了构建分泌待与重链可变区(VH)文库缀合的细胞质渗透轻链(hT4-33VL)的酵母，将通过使用限制性酶NheI和BsiWI将编码具有细胞质渗透能力和降低的HSPG结合能力的hT4-33 VL的DNA克隆到轻链可变区酵母分泌载体pYDS-K中来获得的pYDS-K-hT4-33 VL通过电穿孔转化到作为杂交α类型酵母杂交菌株的YVH10菌株中，并且与在选择性培养基SD-CAA+Trp(20g/L葡萄糖，6.7g/L没有氨基酸的酵母氮基，5.4g/L Na2HPO4，8.6g/LNaH 2PO4，5g/L酪蛋白氨基酸，0.4mg/L色氨酸)(SIGMA)中选择性地培养的酵母杂交。
具体地，在酵母杂交的情况下，在600nm处吸光度为1指示1X 107个酵母个体。在培养的酵母中，将表达基于RT22的重链可变区文库的酵母和含有hT4-33 VL的酵母以1.5X107个个体的量混合，并且用YPD(20g/L右旋糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，14.7g/L柠檬酸钠，4.29g/L柠檬酸，pH 4.5)(SIGMA)洗涤三次，并且然后用100μl YPD重悬浮并滴落，同时防止其在YPD板上扩散，干燥并在30℃下培养6小时。然后，将干燥的扩散的酵母位点用YPD培养基洗涤三次并在30℃下在选择性培养基SD-CAA中培养24小时至1×106或更小的最终酵母浓度，并且仅选择杂交的酵母。
实施例6.基于RT22的具有与GTP结合的KRas G12D的高特异性结合能力的重链可变区(VH)的选择
将作为GTP类似物的GppNHp以与实施例1中相同的方式与体内生物素化的Avi-KRasG12D蛋白结合，并且用于文库选择。对于初级MACS选择，使约100nM的抗原在室温下与在酵母表面上表达的Fab文库反应1小时。然后，使表达与抗原结合的Fab文库的酵母在4℃下与链霉亲和素MicrobeadTM反应20分钟，并且然后使用磁活化细胞分选(MACS)富集表达对于GppNHp结合的Avi-KRasG12D具有高亲和力的重链可变区的酵母。将所选择的表达文库的酵母在选择性培养基SD-CAA+URA(20g/L D-葡萄糖，6.7g/L没有氨基酸的酵母氮基，5.4g/LNa2HPO4，8.6g/L NaH2PO4，5g/L酪蛋白氨基酸，0.2mg/L尿嘧啶)和SG-CAA+URA(20g/L半乳糖，6.7g/L没有氨基酸的酵母氮基，5.4g/L Na2HPO4，8.6g/L NaH2PO4，5g/L酪蛋白氨基酸，0.2mg/L尿嘧啶)中培养以诱导文库表达，并且进行初级至三级FACS选择。
作为以与实施例3中相同的方式分析最终初级MACS和三级FACS选择文库的47种单独克隆的结果，选择七种具有独特的对于GppNHp结合的Avi-KRasG12D蛋白具有高亲和力的氨基酸序列的重链可变区。
以下表4示出了七种重链可变区(VH)序列，其具有从基于RT22作为模板的亲和力改善文库选择的单独克隆的独特氨基酸序列。
以下表5示出了所选择的重链可变区(VH)的CDR 1、2和3的序列。
[表4]
Figure GDA0002713334410000451
[表5]
Figure GDA0002713334410000461
实施例7.基于RT22的亲和力改善的抗Ras·GTP iMab的表达和纯化以及其与GppNHp结合的KRasG12D的结合能力的分析
以与实施例4中相同的方式将从基于RT22的文库选择的重链可变区克隆到重链动物表达载体中，瞬时共转染到细胞质渗透人源化轻链表达载体和HEK293F蛋白表达细胞中以表达单独的克隆，并且以与实施例4中相同的方式纯化。在七种具有改善的亲和力的重链可变区中，从表达纯化排除RT32和RT35克隆，因为它们在CDR2序列中包含半胱氨酸并且因此不能作为单体(单独地)存在，并且在用IgG纯化时可能通过非天然二硫键形成二体或寡聚物。
将基于RT22的亲和力增强的重链可变区与具有对HSPG结合能力的抑制活性和通过在CDR3中引入WYW突变而产生的内体逃逸能力的融合了RGD原肽的轻链可变区(hT4-i33VL：SEQ ID NO:38)组合表达。以下将详细地描述对于HSPG具有降低的结合亲和力且具有组织特异性的轻链可变区(hT4-i33 VL)SEQ ID NO:38的描述。
作为表达的结果，与用作模板的RT22-i33具有相似的改善的亲和力的抗Ras·GTPiMab也显示1mg/L的低产率，如在实施例3中。
图5a示出了在包含基于RT22的亲和力增强的重链可变区(VH)与融合了整合素靶向原肽并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(hT4-i33)的组合的抗Ras·GTP iMab的纯化之后在还原或非还原条件下12％SDS-PAGE分析的结果。
具体地，在非还原条件下检测到约150kDa的分子量，并且在还原条件下发现重链的分子量和轻链的分子量分别为50kDa和25kDa。这指示，表达并纯化的单独克隆在溶液中作为单体存在(单独地)，并且不通过非天然二硫键形成二体或寡聚物。
图5b示出了每种抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppN Hp或与100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力的ELISA分析的结果，以确定GppNHp结合的Avi-KRasG12D与包含基于RT22的亲和力增强的重链可变区(R T31 VH、RT33 VH、RT34 VH)和融合了整合素靶向原肽并具有降低的HS PG结合能力的轻链可变区(hT4-i33)的组合的抗Ras·GTP iMab之间的特异性结合。
具体地，以与实施例4中相同的方式，使用用作模板的抗Ras·GTP iMab，RT11和RT22-i33作为对照组，并且将与RGD原肽融合的五种亲和力增强的iMab在室温下以5μg/ml的浓度在96孔EIA/RIA板中结合，持续1小时，并且用0.1％TBST(12mM Tris，pH 7.4，137mMNaCl，2.7mM KCl，0.1％Tween20，5mM MgCl2)洗涤三次，持续10分钟。然后，将所得物在4％TBSB(12mM Tris，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，4％BSA，10mM MgCl2)中结合1小时，并且然后用0.1％TBST洗涤3次，持续10分钟。将GppNHp结合的KRas蛋白稀释至100nM、10nM和1nM的不同浓度，并且将GDP结合的KRas蛋白在4％TBSB中稀释至100nM的浓度，在室温下结合1小时，并且用0.1％TBST洗涤3次，持续10分钟。将所得物与作为标记抗体的HRP缀合的抗his抗体(HRP缀合的抗his mAb)结合。使所得物与TMB ELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
图5c示出了每种抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppN Hp或100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力的ELISA分析的结果，以确定Gp pNHp结合的Avi-KRasG12D与包含基于RT22的亲和力增强的重链可变区(RT31 VH、RT36 VH、RT37 VH)和融合了整合素靶向原肽并具有降低的HSP G结合能力的轻链可变区(hT4-i33)的组合的抗Ras·GTP iMab之间的特异性结合。
具体地，以与实施例4中相同的方式，使用用作模板的抗Ras·GTP iMab，RT11和RT22-i33作为对照组，并且将与RGD原肽融合的五种亲和力增强的iMab在室温下以5μg/ml的浓度在96孔EIA/RIA板中结合，持续1小时，并且用0.1％TBST(12mM Tris，pH 7.4，137mMNaCl，2.7mM KCl，0.1％Tween20，5mM MgCl2)洗涤三次，持续10分钟。然后，将所得物在4％TBSB(12mM Tris，pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，4％BSA，10mM MgCl2)中结合1小时，并且然后用0.1％TBST洗涤3次，持续10分钟。将GppNHp结合的KRas蛋白稀释至100nM、10nM和1nM的不同浓度，并且将GDP结合的KRas蛋白在4％TBSB中稀释至100nM的浓度，在室温下结合1小时，并且用0.1％TBST洗涤3次，持续10分钟。将所得物与作为标记抗体的HRP缀合的抗his抗体(HRP缀合的抗his mAb)结合。使所得物与TMB ELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
此外，使用BIACORE2000仪器进行ELISA分析，以确定具有比RT22-i33更高的抗原结合能力的亲和力改善的抗Ras·GTP iMab对GppNHp结合的KRasG12D的定量亲和力。
具体地，以与实施例4中相同的方式，使用RT22-i33作为对照组，并且将RT31-i33、RT34-i33和RT36-i33在10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)中稀释并且以大约1600个响应单位(RU)的量固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。随后，以30μl/min的流速分析Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl，5mM MgCl2，0.01％Tween 20)，并且以100nM至6.25nM的浓度分析GppNHp结合的KRasG12D。在结合和解离分析之后，通过使缓冲液(20mMNaOH，1M NaCl，pH 10.0)以30μl/min的流速流动1.5分钟来进行CM5芯片的再生成。将通过结合3分钟并解离3分钟获得的每个传感图参考空白单元进行归一化并减去空白单元，并且由此计算亲和力。
以下表6示出了使用SPR(BIACORE 2000)进行的对于GppNHp结合的KRasG12D具有改善的亲和力的抗Ras·GTP iMab的亲和力分析的结果。
[表6]
Figure GDA0002713334410000491
结果显示，作为基于RT22 VH的具有改善的亲和力的抗Ras·GTP iMab，RT31-i33、RT34-i33和RT36-i33全部比常规RT22-i33具有更高的亲和力。
实施例8.开发具有特异性地针对肿瘤组织细胞的改善的细胞质渗透能力和内体逃逸能力的轻链可变区(VL)的逻辑
结果显示，先前专利(韩国专利号10-1602870和10-1602876)的细胞质渗透抗RasGTP iMab通过以下来构建：用对于Ras·GTP具有高度特异性的结合能力的重链可变区(VH)取代具有细胞质渗透能力的常规细胞质渗透抗体(cytotransmab)的重链可变区。细胞质渗透抗体(cytotransmab)是基于轻链可变区(VL)的能够渗透到细胞质中的抗体，并且细胞渗透通过与细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)结合来开始。然而，HSPG是也在正常细胞中高度表达的细胞表面蛋白，并且因此其HSPG结合能力需要被抑制以便将所述蛋白质修饰为能够特异性地渗透到肿瘤组织细胞的细胞质中。
因此，诸位发明人发现，预期有助于HSPG结合的在细胞质渗透抗体(cytotransmab)轻链可变区(VL)的hT4 VL中的CDR1和CDR2被具有与人种系序列的氨基酸序列相同并且不包含负责胞吞作用的CDR1的阳离子修补序列的氨基酸序列的CDR序列取代。此时，保留了已知对于常规轻链可变区的稳定性重要的氨基酸。
基于此逻辑开发的轻链可变区是hT4-03(韩国专利申请号10-2016-0065365)。
为了进一步改善此轻链可变区的内体逃逸能力，将WYW(Trp-Tyr-Trp)定位在其中的CDR3引入到轻链可变区(VL)的残基92-94中(韩国专利申请号10-2016-0065365)，并且用苯丙氨酸(Phe)取代对应于轻链可变区(VL)与重链可变区(VH)之间的界面的轻链可变区框架区的残基87，以便克服由于引入WYW而产生的疏水性残基向溶剂的暴露增加以及因此产率降低的问题(韩国专利申请号10-2016-0065365)。
这被命名为“hT4-33轻链可变区”(VL)。
以下表7示出了使用重叠PCR技术构建的具有特异性地针对肿瘤组织细胞的改善的细胞质渗透和内体逃逸能力的轻链可变区(hT4-33 VL)的序列和名称。
[表7]
Figure GDA0002713334410000501
实施例9.用于靶向肿瘤特异性细胞表面蛋白并诱导胞吞作用的原肽的选择。
使用hT4 VL的作为抗Ras·GTP iMab的RT11进入细胞，并结合细胞中的Ras·GTP以表现出肿瘤生长抑制活性，但是由于其HSPG结合能力而具有低肿瘤组织特异性的缺点。为了克服此缺点，通过以上实施例8获得具有降低的HSPG结合能力的轻链，并且使用引入了轻链可变区的iMab形式进行实验，所述轻链可变区在其N末端与如以上实施例中的用于靶向整合素受体的RGD10原肽融合。
另外，除靶向整合素的原肽之外，还选择赋予肿瘤组织特异性的各种原肽。
EpCAM(上皮细胞粘附分子)受体是主要在结直肠癌细胞中过表达的受体，并且是位于合适的细胞膜上用于为抗Ras·GTP iMab赋予肿瘤特异性的靶标。因此，构建包含能够靶向EpCAM受体(美国专利申请号14/428,017)的Ep133原肽(EHLHCLGSLCWP)的轻链可变区，所述Ep133原肽与轻链可变区的N末端融合。
以下表8示出了用于靶向肿瘤组织特异性细胞表面蛋白并诱导胞吞作用的原肽的序列和名称。
[表8]
肽名称 靶抗原 序列
RGD10 整合素αvβ3/αvβ5 DGARYCRGDCFDG
EP133 EpCAM EHLHCLGSLCWP
实施例10.引入与用于肿瘤组织特异性细胞质渗透的靶原肽融合的轻链可变区(VL)的抗Ras·GTP iMab的构建和纯化
图6是展示了构建具有改善的亲和力的包含与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(VL)的完全IgG型抗Ras·GTP iMab(RT22-i33、RT22-ep33)的示意图。
具体地，对于与原肽融合的iMab在动物细胞中的表达，使用两个G4S接头将原肽与作为轻链可变区(VL)的hT4-33的N末端进行基因融合。随后，用NotI/BsiWI将编码包含与原肽融合的hT4-33轻链可变区和轻链恒定区(CL)的轻链的DNA(在其5′端融合了编码分泌信号肽的DNA)克隆到pcDNA3.4载体中。
以与实施例4中相同的方式，将对GTP结合的Ras具有特异性结合能力的重链可变区(RT22VH)和细胞质渗透人源化轻链表达载体瞬时共转染到表达HEK293F蛋白的细胞中以表达单独克隆，并且以与实施例4中相同的方式进行纯化。
以下表9示出了cytotransmab和包含使用基因工程技术与肿瘤组织特异性原肽融合的轻链可变区(VL)的抗Ras·GTP iMab的产率。
[表9]
Figure GDA0002713334410000521
a将编码每种IgG抗体的HC和LC的2个质粒以等摩尔比共转染到在1L培养基中的HEK293F细胞中。在培养6天之后，使用蛋白质-A亲和柱从细胞培养上清液纯化抗体。
发现与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合的抗RasGTP iMab的产率显著较低，即1mg/1L。
实施例11.RT22-i33 MG、RT22-ep33 MG与细胞内Ras·GTP的特异性结合的确定
图7示出了共聚焦显微术分析的结果，以确定在用具有改善的亲和力的包含与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合并具有特异性地针对肿瘤组织细胞的细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)的完全IgG型抗Ras·GTP iMab(RT22-33(1μM)、RT22-i33 MG(0.5μM)、RT22-ep33 MG(1μM))以及用作为对照组的cytotransmab(CT-33(1μM)、CT-i33 MG(0.5μM)、CT-ep33MG(1μM))处理KRas突变体结直肠细胞系SW480之后与活化的细胞内Ras的重叠。
具体地，以与实施例4中相同的方式制备SW480细胞，用RT22-33 1μM、RT22-i33 MG0.5μM、RT22-ep33 MG 1μM、CT-33 1μM、CT-i33 MG 0.5μM和CT-ep33 MG 1μM进行处理，并且然后在37℃下培养12小时。然后，将细胞在与实施例4相同的条件下进行染色并且用共聚焦显微镜观察。发现除不经历胞吞作用的RT22-33之外，RT22-i33 MG和RT22-ep33 MG具有与细胞内Ras重叠的荧光。此外，发现不靶向细胞内Ras的CT-33、CT-i33 MG和CT-ep33MG不具有与细胞内Ras重叠的荧光。
实施例12.设计轻链可变区(VL)的CDR1和CDR2突变体以提高肿瘤组织特异性抗RasGTP iMab的产率
与实施例10的分析结果一样，发现将原肽与具有HSPG结合能力的常规轻链可变区(hT4-3 VL)融合时产率不降低，但是在与具有降低的HSPG结合能力的轻链可变区(hT4-33VL)融合时产率降低。此外，对极大地影响HSPG结合能力的轻链可变区(VL)的CDR1和CDR2进行修饰，以在与特异性地识别肿瘤组织的原肽(RGD10，Ep133)融合时提高产率。
具体地，为了维持与HSPG的低结合能力，通常通过用保留在具有降低的HSPG结合能力的轻链可变区中的亮氨酸取代被认为影响hT4 VL的轻链可变区的CDR1环结构形成的苯丙氨酸(残基27c)来形成突变，并且在被认为由于典型结构位于CDR1环结构的尖端处并且因此暴露于侧链的残基27f至30中形成突变。
具体地，在hT4-34 VL的情况下，使用hT4 VL作为模板，仅在被认为在轻链可变区的CDR1和CDR2中影响CDR1环结构形成的残基27c中形成突变。
具体地，使用作为模板的具有极大降低的HSPG结合能力的hT4-33 VL，根据每个策略对hT4-35 VL、hT4-36 VL和hT4-37 VL进行突变。通过相应地将在CDR1的残基27d和27f处的天冬氨酸突变为保留在hT4 VL中的天冬酰胺和精氨酸来设计hT4-35 VL。通过相应地将CDR1的残基27d和29处的天冬氨酸和甘氨酸突变为天冬酰胺和精氨酸来设计hT4-36 VL，并且通过相应地将CDR1的残基27d和30处的天冬氨酸和天冬酰胺突变为天冬酰胺和赖氨酸来设计hT4-37 VL。残基编号遵循Kabat编号。
具体地，通过以下来设计hT4-38 VL：将hT4-33 VL的序列中存在的残基29处的精氨酸突变为甘氨酸并且将hT4-33 VL的序列中存在的残基31处的天冬酰胺突变为苏氨酸，同时保留残基27f处的精氨酸和残基30处的赖氨酸，这样在维持hT4 VL的序列以便使HSPG结合能力最小化时增加产率。与hT4-38 VL一样，通过以下来设计hT4-39 VL：将残基28处的苏氨酸突变为天冬氨酸并且将残基29处的精氨酸突变为甘氨酸，同时保留残基27f处的精氨酸和残基30处的赖氨酸以便使用hT4-33 VL中保留的序列来使HSPG结合能力最小化。
以下表10示出了在肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透和原肽融合后具有用于增加产率的突变的轻链可变区(VL)的序列。
[表10]
Figure GDA0002713334410000541
实施例13.抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力的确定，所述抗Ras·GTP iMab引入了具有提高的产率和肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透的轻链可变区(VL)的CDR1和CDR2的突变体。
使用共聚焦显微镜和基于细胞的ELISA，观察与使用常规hT4轻链的cytotransmab(TMab4)相比抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力的降低程度，所述抗Ras·GTP iMab引入了在以上实施例12中构建的用于提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区(VL)的CDR1和CDR2的突变体。
图8a示出了在37℃下用1μM抗体处理HeLa细胞6小时之后测量的共聚焦显微术的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力和细胞质渗透的降低或去除，并且是示出了定量的Alexa488荧光(绿色荧光)的柱状图。
具体地，将表达HSPG的HeLa细胞系以5×104个细胞/孔接种在含有10％FBS的0.5ml培养基中的24孔板中，并且在5％CO2和37℃下培养12小时。在细胞稳定化后，将PBS、TMab4、RT22-33、RT22-34、RT22-35、RT22-36、RT22-37、RT22-38、RT22-39、CT-33、CT-38和CT-39在37℃下以1μM培养6小时。在以与实施例4中相同的方式用PBS和弱酸溶液洗涤之后，将细胞固定，穿孔并且然后封闭。将每种抗体用特异性地识别与Alexa488(绿色荧光)缀合的人Fc的抗体染色。然后，使用Hoechst33342对核进行染色(蓝色荧光)，并且在共聚焦显微镜下观察。
结果显示，通过HSPG定位在细胞质中的抗RasGTP iMab表现出按以下顺序的荧光强度降低：TMab4(100％)，RT22-34(40％)，RT22-36(25％)，RT22-38(26％)，RT22-39(19％)，RT22-37(15.5％)，RT22-35(12.4％)和RT22-33(6.8％)。
图8b示出了表达HSPG的HeLa细胞系中非特异性细胞表面结合ELISA的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力。
具体地，将HeLa(HSPG+)细胞系在96孔板中培养，使得细胞完全填充孔的底部，并且然后用洗涤缓冲液(HBSS缓冲液，50mM HEPES)洗涤三次。然后将TMab4、RT22-33、RT22-34、RT22-35、RT22-36、RT22-37、RT22-38、RT22-39、CT-33、CT-38和CT-39在封闭缓冲液(HBSS缓冲液，50mM HEPES，1％BSA)中稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.125ng/ml的浓度，并且在4℃下培养2小时。在用洗涤缓冲液洗涤三次之后，将细胞连接至作为标记抗体的HRP缀合的抗人mAb。使细胞与TMB ELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
如与图8a中相同的行为，按TMab4、RT22-34、RT22-38、RT22-36、RT22-39、RT22-37、RT22-35和RT22-33的顺序测量到细胞表面结合能力。
图8c示出了在用500nM抗体处理HeLa细胞系之后使用FACS进行的流式细胞术的结果，以确定包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力。
具体地，针对每个样品制备1x105个HeLa(HSPG+)细胞。将细胞在4℃下在补充500nMTMab4、RT22-33、RT22-34、RT22-35、RT22-36、RT22-37、RT22-38和RT22-39的PBSF(PBS缓冲液，2％BSA)中培养1小时。然后，使每种抗体在4℃下与特异性地识别与Alexa488(绿色荧光)缀合的人Fc的抗体反应30分钟。将所得产物用PBS洗涤并且使用流式细胞术分析。结果显示，以与共聚焦显微术结果中相同的行为，按TMab4、RT22-34、RT22-38、RT22-36、RT22-39、RT22-37、RT22-35和RT22-33的顺序测量到结合细胞的荧光强度。
具有剩余40％的HSPG结合能力(其基于结果发现)的使用hT4-34轻链的抗Ras·GTP iMab不用于随后的生物化学鉴定实验。
实施例14.肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab的表达和纯化，所述肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab引入了具有提高的产率和肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透的轻链可变区(VL)的CDR1和CDR2的突变体
将RGD或Ep133原肽与引入了用于提供肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透和提高产率的突变体的轻链可变区(VL)融合，以便在以与实施例10中相同的方式使用基因工程技术使用Mg接头与原肽融合后进行克隆。
以下表11示出了具有提高的产率和肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透能力并与整合素靶向原肽融合的轻链可变区(VL)的序列。
[表11]
Figure GDA0002713334410000571
以下表12示出了具有用于提高产率和抑制HSPG结合能力的突变并与EpCAM靶向原肽融合的轻链可变区(VL)的序列。
[表12]
Figure GDA0002713334410000581
以与实施例4中相同的方式，将RT22重链动物表达载体和包含具有CDR1和CDR2突变的与整合素靶向原肽融合以用于提供肿瘤组织特异性和提高产率的轻链可变区的轻链表达载体瞬时共转染到HEK293F蛋白表达细胞中，并且然后以与实施例4中相同的方式进行纯化抗体的过程。
此外，使用BIACORE2000仪器分析在轻链可变区(VL)中引入CDR1和CDR2突变以用于提高产率和抑制HSPG结合能力的抗Ras·GTP iMab对GppNHp结合的KRasG12D的定量亲和力。
具体地，将RT22-i35 MG、RT22-i37 MG、RT22-i38 MG、RT22-i39 MG、RT22-ep37MG、RT22-ep38 MG和RT22-ep39 MG在10mM NaAc缓冲液(pH4.0)中稀释至20μl/ml的浓度，并且以大约1800个响应单位(RU)固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。随后，以30μl/min的流速分析Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，137mM NaCl，5mM MgCl2，0.01％Tween20)，并且以50nM至3.125nM的浓度分析完全GppNHp结合的GST-KRasG12D。在结合和解离分析之后，通过使缓冲液(20mM NaOH，1M NaCl，pH 10.0)以30μl/min的流速流动1分钟来进行CM5芯片的再生成。将通过结合3分钟并解离3分钟获得的每个传感图参考空白单元进行归一化并减去空白单元，并且由此计算亲和力。
以下表13示出了通过表达与hT4-i33和hT4-ep33组合的RT22重链以及引入了CDR1和CDR2的突变以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链(hT4-i34MG至hT4-i39MG和hT4-ep34MG至hT4-ep39)获得的抗RasGTP iMab以及通过表达TMab4重链和所述轻链的组合获得的cytotransmab的产率，以及使用BIACORE2000仪器基于SPR进行的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab的亲和力分析的结果。
[表13]
Figure GDA0002713334410000591
a将编码每种IgG抗体的HC和LC的2个质粒以等摩尔比共转染到在1L培养基中的HEK293F细胞中。在培养6天之后，使用蛋白质-A亲和柱从细胞培养上清液纯化抗体。
bND.未确定
引入轻链可变区(VL)CDR1和CDR2的突变体以提高产率的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab对于GppNHp结合的KRasG12D的亲和力未改变。
通过以上结果发现未增加产率的使用hT4-36轻链的抗Ras·GTP iMab不用于随后的生物化学鉴定实验。
实施例15.肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab与GppNHp结合的KRasG12D的结合能力的分析，所述肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab引入了具有提高的产率和肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透的轻链可变区(VL)的CDR1和CDR2的突变体
图9a示出了ELISA的结果，以分析包含与整合素靶向原肽融合并具有肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透的轻链可变区(hT4-i33 MG～hT4-i37 MG VL)的抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppNHp或100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力。
具体地，为了比较CDR1和CDR2突变体轻链的抗原结合能力，将结合GppNHp的重链可变区固定在RT22 VH处，并且对于RT11、RT22-i33 MG、RT22-i34 MG、RT22-i35 MG、RT22-i36 MG和RT22-i37 MG进行分析。
具体地，以与实施例4中相同的方式进行ELISA，并且将引入CDR1和CDR2的突变体的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab固定在96孔EIA/RIA板上，之后使GppNHp结合的KRas蛋白以100nM、10nM和1nM的不同浓度结合，并且使GDP结合的KRas蛋白以100nM的浓度结合，并且然后结合作为标记抗体的HRP缀合的抗his抗体(HRP缀合的抗his mAb)。使所得物与TMBELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
通过ELISA进行的抗原结合能力的分析结果显示，与常规RT22-i33相比，由于轻链同时重链与常规情况下相同，维持CDR1的阳离子补丁的hT4-i34VL具有改善的与GppNHp结合的KRasG12D抗原的结合能力。
图9b示出了ELISA的结果，以分析cytotransmab和包含与整合素靶向原肽融合并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(hT4-i38 MG至hT4-i39MG VL)的抗Ras·GTPiMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppNHp或100nM Avi-KRasG12D·GDP的结合能力。
具体地，以与实施例4中相同的方式进行ELISA，并且将cytotransmab和引入CDR1和CDR2的突变体的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab固定在96孔EIA/RIA板上，之后使GppNHp结合的KRas蛋白以100nM、10nM和1nM的不同浓度结合，并且使GDP结合的KRas蛋白以100nM的浓度结合，并且然后结合作为标记抗体的HRP缀合的抗his抗体(HRP缀合的抗hismAb)。使所得物与TMB ELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
通过ELISA进行的抗原结合能力的分析结果显示，与常规RT11-i相比，hT4-38和hT4-39轻链可变区改善了与GppNHp结合的KRasG12D抗原的结合能力。
图9c示出了共聚焦显微术分析的结果，以确定在37℃下用0.5uM cytotransmab和包含与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合并具有受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区(VL)的抗Ras·GTP iMab处理KRas突变体结直肠癌细胞系SW480 12小时之后与活化的细胞内Ras的重叠。
具体地，以与实施例4中相同的方式制备SW480细胞，并且用1μM CT-i33MG(＝TMab4-i33 MG)、CT-i38 MG、CT-i39 MG、RT22-i33 MG、RT22-i34MG、RT22-i35 MG、RT22-i36MG、RT22-i37 MG、RT22-i38 MG、RT22-i39MG、CT-ep33 MG、CT-ep38 MG、CT-ep39 MG、RT22-ep38 MG和RT22-ep39MG处理，并且然后在37℃下在5％CO2下培养12小时。然后，将细胞在与实施例4相同的条件下进行染色并且用共聚焦显微镜观察。发现排除CT-i33MG、CT-i38 MG、CT-i39 MG、CT-ep33 MG、CT-ep38 MG和CT-ep39 MG，RT22-i33 MG、RT22-i34 MG、RT22-i35MG、RT22-i36 MG、RT22-i37 MG、RT22-i38 MG、RT22-i39 MG、RT22-ep38 MG和RT22-ep39 MG具有与细胞内Ras重叠的荧光。
实施例16.具有修饰的抗体框架以提高产率的轻链可变区(VL)突变体的构建
与常规hT4-33相比，当与用于提供肿瘤组织特异性的原肽融合时，在实施例12中构建的轻链可变区(VL)CDR1突变体增加产率，但是显示最佳产率的与Ep133原肽融合的抗体(RT22-ep38 MG，RT22-ep39 MG)表现出的产率比RGD10原肽融合的抗体(RT22-i38 MG，RT22-i39 MG)的产率低大约2倍。因此，为了进一步增加与Ep133原肽融合的抗体的稳定性和产率，构建轻链可变区(VL)抗体框架的额外突变体。
具体地，人完全IgG型抗体中使用的轻链中的抗体骨架的大部分序列2和3包括人种系序列中存在的异亮氨酸和谷氨酰胺，但是在抗Ras·GTP iMab中使用的轻链中保留序列2和3作为亮氨酸和缬氨酸。因此，通过将这些序列2和3突变为主要在人完全IgG型抗体中存在的异亮氨酸和谷氨酰胺以便增加稳定性和产率来构建轻链可变区(VL)抗体框架突变体。
以下表14示出了具有基于hT4-38和hT4-39的修饰的抗体骨架以提高产率的轻链可变区(VL)和与EpCAM靶向原肽融合并且具有修饰的抗体骨架以提高产率的轻链可变区(VL)的序列信息。
[表14]
Figure GDA0002713334410000631
实施例17.引入具有修饰的抗体框架以提高产率的轻链可变区(VL)突变体的组织细胞特异性抗Ras·GTP iMab的表达和纯化
以与实施例10中相同的方式，将RT22重链动物表达载体和包含与EpCAM靶向原肽融合以用于提供肿瘤组织特异性并且具有修饰的抗体框架以提高产率的轻链可变区的轻链表达载体瞬时共转染到HEK293F蛋白表达细胞中，并且然后以与实施例4中相同的方式进行纯化抗体的过程。
然后，使用BIACORE2000仪器分析引入具有修饰的抗体框架以提高产率的轻链可变区(VL)的组织细胞特异性抗Ras·GTP iMab对于GppNHp结合的KRasG12D的定量亲和力。
具体地，将RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG在10mM NaAc缓冲液(pH4.0)中稀释至20μl/ml的浓度，并且以大约1800个响应单位(RU)固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。随后，以30μl/min的流速分析Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，137mM NaCl，5mMMgCl2，0.01％Tween 20)，并且以50nM至3.125nM的浓度分析完全GppNHp结合的GST-KRasG12D。在结合和解离分析之后，通过使缓冲液(20mM NaOH，1M NaCl，pH 10.0)以30μl/min的流速流动1分钟来进行CM5芯片的再生成。将通过结合3分钟并解离3分钟获得的每个传感图参考空白单元进行归一化并减去空白单元，并且由此计算亲和力。
以下表15示出了通过表达RT22重链以及与EpCAM靶向原肽融合以用于提供肿瘤组织特异性并引入抗体框架突变以提高产率的轻链(hT4-ep58 MG和hT4-ep59 MG)的组合获得的抗RasGTP iMab以及通过表达TMab4重链和所述轻链的组合获得的cytotransmab的产率，以及使用BIACORE2000仪器基于SPR进行的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab的亲和力分析的结果。
[表15]
Figure GDA0002713334410000641
a将编码每种IgG抗体的HC和LC的2个质粒以等摩尔比共转染到在1L培养基中的HEK293F细胞中。在培养6天之后，使用蛋白质-A亲和柱从细胞培养上清液纯化抗体。
发现与作为引入轻链可变区(VL)CDR1和CDR2的突变体以提高产率的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab的RT22-ep38 MG和RT22-ep59 MG相比，抗Ras·GTP iMab对于GppNHp结合的KRasG12D的亲和力未改变。
图10a示出了ELISA的结果，以分析包含与EpCAM靶向原肽和修饰的抗体框架(以提高其产率)融合的轻链可变区(hT4-ep58 MG至hT4-ep59 MG VL)的抗Ras·GTP iMab与1、10或100nM Avi-KRasG12D·GppNHp或100nM Avi-KRasGl2D·GDP的结合能力。
具体地，以与实施例4中相同的方式进行ELISA，并且将具有引入CDR1和CDR2的突变体的轻链的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab固定在96孔EIA/RIA板上，之后使GppNHp结合的KRas蛋白以100nM、10nM和1nM的不同浓度结合，并且使GDP结合的KRas蛋白以100nM的浓度结合，并且然后结合作为标记抗体的HRP缀合的抗his抗体(HRP缀合的抗his mAb)。使所得物与TMB ELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
通过ELISA对抗原结合能力进行的分析的结果显示，与常规RT11-i相比，hT4-58和hT4-59轻链可变区改善了与GppNHp结合的KRasG12D抗原的结合能力。
图10b示出了共聚焦显微术分析的结果，以确定在37℃下用1μM包含与EpCAM靶向原肽融合并具有基于hT4-38和hT4-39的修饰的抗体骨架以提高产率的轻链(hT4-58、hT4-59)的抗Ras·GTP iMab(RT22-ep58，RT22-ep59)处理KRas突变体结直肠癌细胞系SW480 12小时之后与活化的细胞内Ras的重叠。
具体地，将SW480细胞系以0.5ml的2x104个细胞/孔在24孔板中稀释，在37℃下在5％CO2下培养12小时，并且然后用1μM CT-ep58 MG以及具有改善的亲和力的抗Ras·GTPiMab即RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG处理，并且然后在37℃下培养12小时。然后，去除培养基，将残余物用PBS洗涤，并且将附着到细胞表面的蛋白质用弱酸溶液(200mM甘氨酸，150mMNaCl pH 2.5)去除。在用PBS洗涤之后，添加4％多聚甲醛，并且将细胞在25℃下固定10分钟。在用PBS洗涤之后，将细胞在25℃下在含有补充0.1％皂苷、0.1％叠氮化钠和1％BSA的PBS的缓冲液中培养10分钟，并且在细胞膜中形成孔。然后，将细胞再次用PBS洗涤，并且在25℃下与除PBS之外还含有2％BSA的缓冲液反应1小时以便抑制非特异性结合。将每种抗体用特异性地识别与Alexa-488(绿色荧光)连接的人Fc的抗体染色。使用Hoechst33342对核进行染色(蓝色荧光)，并且对KRas标记的抗体进行染色(红色荧光)，并且然后用共聚焦显微镜观察。发现除了CT-ep59以外所有的抗Ras·GTP iMab均具有与细胞内Ras重叠的荧光。
实施例18.引入具有修饰的抗体框架以提高产率的轻链可变区(VL)突变体的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合亲和力的确定
使用共聚焦显微镜和基于细胞的ELISA，观察与使用常规hT4轻链的cytotransmab(TMab4)相比，cytotransmab和引入在以上实施例17中构建的具有修饰的抗体框架以提高产率的轻链可变区(VL)突变体的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力的降低水平。
图11a示出了在37℃下用1μM抗体处理HeLa细胞6小时之后测量的共聚焦显微术的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力和细胞质渗透的降低或去除，并且是示出了定量的Alexa488荧光(绿色荧光)的柱状图。
具体地，将表达HSPG的HeLa细胞系以5×104个细胞/孔接种在含有10％FBS的0.5ml培养基中的24孔板中，并且在5％CO2和37℃下培养12小时。在细胞稳定化后，将PBS、TMab4、阿瓦斯汀(Avastin)、RT22-58、RT22-59、CT-58和CT-59在37℃下以1μM培养6小时。在以与实施例4中相同的方式用PBS和弱酸溶液洗涤之后，将细胞固定，穿孔并且然后封闭。将每种抗体用特异性地识别与Alexa488(绿色荧光)缀合的人Fc的抗体染色。然后，使用Hoechst33342对核进行染色(蓝色荧光)，并且在共聚焦显微镜下观察。
结果显示，通过HSPG定位在细胞质中的抗RasGTP iMab表现出按以下顺序的荧光强度：TMab4(100％)，RT22-58(30％)，CT-58(27％)，CT-59和RT22-59(20％)。
图11b示出了表达HSPG的HeLa细胞系中非特异性细胞表面结合ELISA的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力。
具体地，将HeLa(HSPG+)细胞系在96孔板中培养，使得细胞完全填充孔的底部，并且然后用洗涤缓冲液(HBSS缓冲液，50mM HEPES)洗涤三次。然后将PBS、TMab4、阿瓦斯汀、RT22-58、RT22-59、CT-58和CT-59在封闭缓冲液(HBSS缓冲液，50mM HEPES，1％BSA)中稀释至100、50、25、12.5、6.25和3.125ng/ml的浓度，并且将细胞在4℃下培养2小时。在用洗涤缓冲液洗涤三次之后，使细胞与作为标记抗体的HRP缀合的抗人mAb结合。使细胞与TMB ELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
如与图11a中相同的行为，按TMab4、RT22-58、CT-58、CT-59和RT22-59的顺序测量到细胞表面结合能力。
图11c示出了在用500nM抗体处理HeLa细胞系之后使用FACS进行的流式细胞术的结果，以确定cytotransmab和包含引入CDR1和CDR2的突变体以提高产率和抑制HSPG结合能力的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab的HSPG结合能力。
具体地，针对每个样品制备1x105个HeLa(HSPG+)细胞。将细胞在4℃下在补充500nMTMab4、阿瓦斯汀、RT22-58、RT22-59、CT-58和CT-59的PBSF(PBS缓冲液，2％BSA)中培养1小时。然后，使每种抗体在4℃下与特异性地识别与Alexa488(绿色荧光)缀合的人Fc的抗体反应30分钟。将所得物用PBS洗涤并且使用流式细胞术分析。结果显示，以与共聚焦显微术结果中相同的行为，按TMab4、TMab4、RT22-58、CT-58、CT-59和RT22-59的顺序测量到结合细胞的荧光强度。
结果显示，具有修饰的抗体框架以提高产率的轻链可变区(VL)突变体也不具有HSPG结合能力。
实施例19.肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab的表达和纯化，所述肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab引入了基于RT22的具有改善的亲和力的Ras·GTP特异性重链可变区(VH)和具有特异性地针对肿瘤组织细胞的细胞质渗透和提高的产率的轻链可变区(VL)。
以与实施例4中相同的方式，将RT31、RT36和RT37重链动物表达载体和包含与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合以用于提供肿瘤组织特异性并且具有受抑制的HSPG结合能力和提高的产率的轻链可变区的轻链表达载体瞬时共转染到HEK293F蛋白表达细胞中，并且然后以与实施例4中相同的方式进行纯化抗体的过程。
此外，使用BIACORE2000仪器分析引入了RT31、RT36和RT37重链动物表达载体和与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合以用于提供肿瘤组织特异性并具有受抑制的HSPG结合能力和提高的产率的轻链可变区的抗Ras·GTP iMab对于GppNHp结合的KRasG12D的定量亲和力。
具体地，将RT31-i37 MG、RT31-ep37 MG、RT36-i37 MG、RT36-i38 MG、RT36-i39MG、RT36-ep37 MG、RT36-ep38 MG和RT36-ep39 MG在10mM NaAc缓冲液(pH 4.0)中稀释至20μl/ml的浓度，并且以大约1800个响应单位(RU)固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。随后，以30μl/min的流速分析Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，137mM NaCl，5mMMgCl2，0.01％Tween 20)，并且以50nM至3.125nM的浓度分析完全GppNHp结合的GST-KRasG12D。在结合和解离分析之后，通过使缓冲液(20mM NaOH，1M NaCl，pH 10.0)以30μl/min的流速流动1分钟来进行CM5芯片的再生成。将通过结合3分钟并解离3分钟获得的每个传感图参考空白单元进行归一化并减去空白单元，并且由此计算亲和力。
以下表16示出了引入RT31、RT36和RT37重链动物表达载体和与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合以用于提供肿瘤组织特异性并具有受抑制的HSPG结合能力和提高的产率的轻链可变区的肿瘤组织特异性抗RasGTP iMab的产率，以及使用BIACORE2000仪器基于SPR进行的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab的亲和力分析的结果。
[表16]
Figure GDA0002713334410000681
a将编码每种IgG抗体的HC和LC的2个质粒以等摩尔比共转染到在1L培养基中的HEK293F细胞中。在培养6天之后，使用蛋白质-A亲和柱从细胞培养上清液纯化抗体。
bND.未确定
与RT22-i38MG、RT22-i39 MG、RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG相比，引入基于RT22的具有改善的亲和力的RT31和RT37重链和用于提高产率并抑制HSPG结合能力的轻链可变区(VL)突变体的抗体(RT31-i37 MG，RT31-ep37 MG，RT37-i37 MG)具有低产率的问题，并且引入RT36和具有提高的产率和肿瘤组织特异性细胞质渗透的轻链可变区(VL)突变体的抗体(RT36-i38 MG，RT36-i39 MG，RT36-ep58 MG和RT36-ep59 MG)具有对于Ras·GTP的低亲和力的问题。因此，对于具有高产率和对于Ras·GTP的优异亲和力的RT22-i38 MG、RT22-i39 MG、RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG进行实验。
实施例20.包含与整合素靶向原肽或EpCAM靶向原肽融合并具有特异性地针对肿瘤组织细胞的细胞质渗透的轻链可变区(VL)的抗Ras·GTP iMab对于细胞表面上的整合素或EpCAM的结合能力的确定。
图12a示出了使用FACS进行的测试的结果，以鉴定整合素ανβ3或整合素ανβ5在人结直肠癌细胞系SW480和LoVo以及人血癌细胞系野生型K562和表达整合素ανβ3的K562中的表达。
具体地，针对每个样品制备1×105个SW480、LoVo、K562和K562ανβ3细胞系中的每一种。将细胞在1:100的PE缀合的抗整合素ανβ3或PE缀合的抗整合素ανβ5的稀释度在4℃下培养1小时。将细胞用PBS洗涤并且通过流式细胞术分析。结果显示，ανβ3抗体结合K562ανβ3表达细胞系，并且ανβ5抗体结合SW480和LoVo细胞。
图12b示出了使用FACS进行的测试的结果，以确定对肿瘤组织整合素具有特异性、不具有HSPG结合能力的包含对于Ras·GTP具有改善的亲和力的重链(RT22)的抗Ras细胞渗透抗体(RT22-i38 MG和RT22-i39 MG)和对肿瘤组织整合素具有特异性的常规抗Ras细胞渗透抗体(RT11-i)与细胞表面整合素ανβ3或整合素ανβ5的结合能力。
具体地，针对每个样品制备1×105个SW480、LoVo、K562和K562ανβ3细胞中的每一种。将细胞在4℃下在补充500nM RT11-i、RT22-i38 MG、RT22-i39 MG和CT-i39 MG的PBSF(PBS缓冲液，2％BSA)中培养1小时。然后，使每种抗体在4℃下与特异性地识别与Alexa488(绿色荧光)缀合的人Fc的抗体反应30分钟。将细胞用PBS洗涤并且通过流式细胞术分析。结果显示，测量了与表达ανβ3或ανβ5的SW480细胞、LoVo细胞和K562ανβ3细胞结合的RT11-i、RT22-i38 MG、RT22-i39 MG和CT-i39 MG抗体的荧光强度。
图12c示出了使用FACS进行的测试的结果，以确定EpCAM在人结直肠癌细胞系SW480和LoVo以及人宫颈癌细胞系HeLa中的表达。
具体地，针对每个样品制备1×105个SW480、LoVo、K562和K562ανβ3细胞中的每一种。将抗EpCAM抗体以1:200稀释并且在4℃下培养1小时。然后，使一抗在4℃下与特异性地识别与Alexa488(绿色荧光)缀合的鼠Fc的抗体反应30分钟。将细胞用PBS洗涤并且通过流式细胞术分析。由此，测量了结合K562ανβ3细胞的ανβ3抗体和结合SW480和LoVo细胞的ανβ5抗体的荧光强度。
图12d示出了使用FACS进行的测试的结果，以确定不具有HSPG结合能力并包含对Ras·GTP具有改善的亲和力的重链(RT22)的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras细胞渗透抗体(RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG)与细胞表面EpCAM的结合能力。
具体地，针对每个样品制备1×105个SW480、LoVo和HeLa细胞中的每一种。将细胞在4℃下在补充500nM RT22-ep58 MG、RT22-ep59 MG和CT-ep59 MG的PBSF(PBS缓冲液，2％BSA)中培养1小时。然后，使每种抗体在4℃下与特异性地识别与Alexa488(绿色荧光)缀合的人Fc的抗体反应30分钟。然后，将细胞用PBS洗涤并且通过流式细胞术分析。由此，测量了与表达EpCAM的SW480和LoVo细胞结合的RT22-ep58 MG、RT22-ep59MG和CT-ep59 MG抗体的荧光强度。
实施例21.包含具有提高的产率和肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)与对于Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区的组合的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab对贴壁细胞的生长抑制的确定
图13a是示出了细胞生长抑制能力的图，所述细胞生长抑制能力在若干Ras突变体和野生型细胞系中在37℃下用与融合了整合素靶向原肽并具有提高的产率和肿瘤组织细胞特异性细胞质渗透的轻链可变区组合的0.5μM抗Ras·GTP iMab处理48小时之后通过WST测定确定。
具体地，将细胞系以1x104个细胞/孔的密度在0.2ml含有10％FBS的培养基中在96孔板中稀释，并且在37℃下和在5％CO2下培养24小时。然后，将所得的细胞用0.5μM TMab4-i、RT11-i、RT22-i38 MG和RT22-i39 MG处理48小时，之后向其中添加10μl WST溶液(Dojindo)，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
如可以从图13a示出，不同Ras突变体细胞系中的RT22-i38 MG和RT22-i39 MG表现出比用作对照组的未修饰的抗Ras·GTP iMab RT11-i显著更高的细胞生长抑制活性。此外，在野生型细胞系Colo320DM中在抗Ras·GTP iMab与用作对照组的不具有Ras抑制能力的细胞质渗透抗体(cytotransmab，TMab4-i)之间没有差异。
图13b是示出了细胞生长抑制能力的图，所述细胞生长抑制能力在若干Ras突变体和野生型细胞系中在37℃下用与融合了EpCAM靶向原肽并具有提高的产率和受抑制的HSPG结合能力的轻链可变区组合的1μM抗Ras·GTP iMab处理48小时之后通过WST测定确定。
具体地，将细胞系以1x104个细胞/孔的密度在0.2ml含有10％FBS的培养基中在96孔板中稀释，并且在37℃下在5％CO2下培养24小时。然后，将所得的细胞用1μM CT-ep59、RT11、RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG处理36小时，之后向其中添加10μl WST溶液(Dojindo)，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
如可以从图13b示出，表达EpCAM的不同Ras突变体细胞系中的RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG表现出比用作对照组的未修饰的抗Ras·GTP iMab RT11显著更高的细胞生长抑制活性。此外，在野生型细胞系FaDu和HT-29中在抗Ras·GTP iMab与用作对照组的不具有Ras抑制能力的细胞质渗透抗体(cytotransmab，CT-ep59)之间没有差异。
由此，当与体外常规抗Ras·GTP(RT11，RT11-i)进行比较时，RT22-i38MG、RT22-i39 MG、RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG具有特异性地针对Rsa突变体细胞系的改善的细胞生长抑制作用。因此，进行后续实验以确定通过抗体抑制肿瘤生长的作用在体内动物模型中是否也得到改善。
实施例22.肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab的改善的肿瘤生长抑制能力的确定
图14a示出了测试的结果，以便在以2天间隔，总计9次将与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的20mg/kg抗Ras细胞渗透抗体(RT22-i38MG、RT22-i39 MG)和与整合素靶向原肽融合的常规抗Ras细胞渗透抗体(RT11-i)静脉内注射到人结直肠癌KRas突变体细胞系LoVo和SW480异种移植物小鼠中时比较肿瘤生长抑制作用。
图14b是示出了所提取的肿瘤的重量的图，以及示出了在用与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体处理之后的肿瘤的图像。
图14c是示出了进行测量以确定与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体的非特异性副作用的小鼠的重量的图。
具体地，为了确定与体内常规肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab即RT11-I相比，具有改善的亲和力且不具有HSPG能力的肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab即RT22-i38 MG和RT22-i39 MG的改善的肿瘤生长抑制能力，将KRasG12V突变体人结直肠癌细胞系SW480以5×106个细胞/小鼠的密度皮下注射到BALB/c裸小鼠中，并且将KRasG13D突变体人结直肠癌细胞系LoVo以2×106个细胞/小鼠的密度皮下注射到BALB/c裸小鼠中。在约10天之后，当肿瘤体积达到约50至80mm3时，以20mg/kg静脉内注射相等体积的PBS媒介物对照组、对照组CT-i39 MG(TMab4 VH)和实验组RT11-i、RT22-i38MG和RT22-i39 MG。每2天进行总计8次静脉内注射，并且使用卡尺测量肿瘤体积，持续16天。
如可以从图14a示出，与对照组CT-i39 MG相比，RT11-i、RT22-i38 MG和RT22-i39MG抑制癌细胞生长，并且RT22-i38 MG和RT22-i39 MG比RT11-i更有效地抑制肿瘤生长。相对于媒介物对照组，定量的肿瘤生长抑制被确定为CT-i39(0％)、RT11-i(46％)、RT22-i38(59.7％)和RT22-i39(69.8％)。
图14b示出了基于提取肿瘤的体重获得的肿瘤生长抑制率的结果，并且肿瘤生长抑制率被确定为CT-i39(0％)、RT11-i(38.1％)、RT22-i38(47.1％)和RT22-i39(68.2％)。
此外，如可以从图14d所见，RT22-i38 MG和RT22-i39 MG实验组小鼠没有体重变化，这意味着没有其他毒性。
实施例23.肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab的肿瘤生长抑制能力的确定
图15a示出了测试的结果，以便在以2天间隔，总计9次将与EpCAM靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的20mg/kg抗Ras细胞渗透抗体(RT22-ep58 MG、RT22-ep59 MG)静脉内注射到人结直肠癌细胞系LoVo和SW480异种移植物小鼠中时比较肿瘤生长抑制作用。
图15b是示出了所提取的肿瘤的重量的图，以及示出了在用与EpCAM靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体处理之后的肿瘤的图像。
图15c是示出了进行测量以确定与EpCAM靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体的非特异性副作用的小鼠的重量的图。
具体地，为了确定肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab即RT22-ep58MG和RT22-ep59 MG的体内肿瘤生长抑制，将KRasG12V突变体人结直肠癌细胞系SW480以5×106个细胞/小鼠的密度皮下注射到BALB/c裸小鼠中，并且将KRasG13D突变体人结直肠癌细胞系LoVo以2×106个细胞/小鼠的密度皮下注射到BALB/c裸小鼠中。在约10天之后，当肿瘤体积达到约50至80mm3时，以20mg/kg静脉内注射相等体积的PBS媒介物对照组、对照组CT-ep59 MG以及实验组RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG。每2天进行总计9次静脉内注射，并且使用卡尺测量肿瘤体积，持续18天。
如可以从图15a所示，与对照组CT-ep59 MG相比，RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG表现出抑制的癌细胞生长。相对于媒介物对照组，定量的肿瘤生长抑制被确定为CT-ep59(16.2％)、RT22-ep58(49.2％)和RT22-ep59(75.4％)。
图15b示出了基于提取肿瘤的体重获得的肿瘤生长抑制率的结果，并且具体地，肿瘤生长抑制率被确定为CT-ep59(8.1％)、RT22-ep58(47.3％)和RT22-ep59(70.2％)。
此外，如可以从图15c所见，RT22-ep58 MG和RT22-ep59 MG实验组小鼠没有体重变化，这意味着没有其他毒性。
实施例24.根据剂量、给予间隔和给予途径，确定肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab的肿瘤生长抑制能力
图16a示出了测试的结果，以便在人结直肠癌KRas突变体细胞系LoVo异种移植物小鼠中根据与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体(RT22-i39 MG)的剂量、给予间隔和给予途径来比较肿瘤生长抑制能力。
图16b是示出了所提取的肿瘤的重量的图，以及示出了在用与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体处理之后的肿瘤的图像。
图16c是示出了进行测量以确定与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体的非特异性副作用的小鼠的重量的图。
具体地，图16c示出了体内测试的结果，以便根据具有改善的亲和力且不具有HSPG结合能力的肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab(RT22-i39MG)的剂量、给予间隔和给予途径比较肿瘤生长抑制作用。
为了确定肿瘤生长抑制作用，将KRasG13D突变体人结直肠癌细胞系LoVo以2×106个细胞/小鼠的密度皮下注射到BALB/c裸小鼠中。在约10天之后，当肿瘤体积达到约50至80mm3时，以5、10和20mg/kg静脉内或腹膜内注射相等体积的PBS媒介物对照组、对照组CT-i39 MG(TMab4 VH)和实验组RT22-i39 MG。每2天进行总计9次静脉内注射，或者每周进行总计6次静脉内注射，并且使用卡尺测量肿瘤体积，持续18天。
如可以从图16a所示，与对照组CT-i39 MG相比，RT22-i39 MG表现出抑制的癌细胞生长。根据剂量、给予间隔或给予途径，肿瘤生长抑制作用没有大差异。与媒介物对照组相比，定量的肿瘤生长抑制被确定为CT-i39 20mg/kg i.v.每两周一次(-2.8％)，RT22-i3920mg/kg i.v.每两周一次(65.3％)，CT-i39 20mg/kg i.p.(-5.8％)，RT22-i39 20mg/kgi.p.(70.4％)，RT22-i39 10mg/kg i.p.(72.4％)，RT22-i39 10mg/kg i.v.(66.9％)和RT22-i39 5mg/kg i.v.(64.3％)。
图16b示出了基于提取肿瘤的体重获得的肿瘤生长抑制率的结果，具体地，肿瘤生长抑制率被确定为CT-i39 20mg/kg i.v.每两周一次(4.5％)，RT22-i39 20mg/kg i.v.每两周一次(65.7％)，CT-i39 20mg/kg i.p.(1.2％)，RT22-i39 20mg/kg i.p.(69.3％)，RT22-i39 10mg/kg i.p.(70％)，RT22-i39 10mg/kg i.v.(72.5％)和RT22-i39 5mg/kgi.v.(70.6％)。
此外，如可以从图16c所见，RT22-i39 MG实验组小鼠没有体重变化，这意味着没有其他毒性。
实施例25.根据剂量、给予间隔和给予途径，确定肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab的肿瘤生长抑制能力
图17a示出了测试的结果，以便在人结直肠癌KRas突变体细胞系LoVo异种移植物小鼠中根据与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体(RT22-ep59 MG)的剂量、给予间隔和给予途径来比较肿瘤生长抑制能力。
图17b是示出了所提取的肿瘤的重量的图，以及示出了在用与EpCAM靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体处理之后的肿瘤的图像。
图17c是示出了进行测量以确定与整合素靶向原肽融合且不具有HSPG结合能力的抗Ras细胞渗透抗体的非特异性副作用的小鼠的重量的图。
具体地，为了确定根据剂量、给予间隔和给予途径，肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab即RT22-ep59 MG的体内肿瘤生长抑制，将KRasG13D突变体人结直肠癌细胞系LoVo以2×106个细胞/小鼠的密度皮下注射到BALB/c裸小鼠中。在约10天之后，当肿瘤体积达到约50至80mm3时，以5、10、20mg/kg静脉内或腹膜内注射相等体积的PBS媒介物对照组、对照组CT-ep59 MG和实验组RT22-ep59 MG。每2天进行总计9次静脉内注射，或者每周进行总计6次静脉内注射，并且使用卡尺测量肿瘤体积，持续18天。
如可以从图17a示出，与对照组CT-ep59 MG相比，RT22-ep59 MG抑制癌细胞生长。根据剂量、给予间隔或给予途径，肿瘤生长抑制作用没有大差异。相对于媒介物对照组，定量的肿瘤生长抑制被确定为CT-ep59 20mg/kg i.v.每两周一次(3.7％)，RT22-ep59 20mg/kg i.v.每两周一次(80.6％)，CT-ep5920mg/kg i.p.(2.3％)，RT22-ep59 20mg/kg i.p.(78.8％)，RT22-ep59 10mg/kg i.p.(76％)，RT22-ep59 10mg/kg i.v.(75％)和RT22-ep595mg/kg i.v.(77.8％)。
图17b示出了基于提取肿瘤的重量获得的肿瘤生长抑制率的结果，并且具体地，相对于媒介物对照组，肿瘤生长抑制率被确定为CT-ep59 20mg/kg i.v.每两周一次(-3.6％)，RT22-ep59 20mg/kg i.v.每两周一次(67.3％)，CT-ep5920mg/kg i.p.(-1.6％)，RT22-ep59 20mg/kg i.p.(71.1％)，RT22-ep59 10mg/kg i.p.(64.7％)，RT22-ep59 10mg/kg i.v.(70.1％)和RT22-ep59 5mg/kg i.v.(61.3％)。
此外，如可以从图17c所见，RT22-ep59 MG实验组小鼠没有体重变化，这意味着没有其他毒性。
实施例26.改善抗Ras·GTP iMab的细胞质内稳定性、体内持久性和肿瘤组织靶向能力的重链修饰变体的设计和表达/纯化
通常通过泛素-蛋白酶体机制来降解细胞质内蛋白质。同样，细胞质中的完整免疫球蛋白型抗体结合TRIM21 E3连接酶，并且通过泛素-蛋白酶体机制降解，并且在将突变引入到结合TRIM21的抗体的CH3区中的N434氨基酸中时，抗体的降解被抑制。因此，为了改善抗Ras·GTP iMab的细胞质内稳定性，构建了完整免疫球蛋白型抗体，其为其中将N434D突变引入到CH3区中的变体。具体地，以与实施例4中相同的方式，将具有改善的细胞质内稳定性的抗Ras·GTP iMab的细胞质渗透人源化轻链表达载体(hT4-ep59 MG LC)和重链表达载体(RT22 IgG1 N434D)瞬时共转染到表达HEK293F蛋白的细胞中，以表达具有改善的细胞质内稳定性的抗Ras·GTP iMab突变。
此外，免疫球蛋白型抗体结合身体中的免疫细胞的Fc受体，并且通过ADCC机制被去除。在IgG亚类别中，IgG2和IgG4具有与Fcγ受体的弱结合力，并且因此此功能受到抑制。因此，为了改善抗Ras·GTP iMab的体内稳定性，构建了完整免疫球蛋白IgG1抗体，其为引入IgG4的重链恒定区(CH1至CH3)的变体。此时，还将S228P突变引入到铰链位点中，使得IgG4所特有的Fab-臂交换不在体内发生。具体地，以与实施例4中相同的方式，将具有改善的体内持久性的抗Ras·GTP iMab的细胞质渗透人源化轻链表达载体(hT4-ep59MG LC)和重链表达载体(RT22 IgG4 S228P)瞬时共转染到表达HEK293F蛋白的细胞中，以表达具有改善的体内持久性的抗Ras·GTP iMab突变。
以下表17示出了被修饰以改善抗Ras·GTP iMab细胞质内稳定性和体内持久性的重链恒定区(CH1-CH3)序列信息。
[表17]
Figure GDA0002713334410000771
此外，为了改善抗Ras·GTP iMab的肿瘤组织靶向能力，构建、表达并纯化了与具有对于抗Ras·GTP iMab重链可变区的N末端的EpCAM靶向能力的ep133肽结合的克隆。具体地，以与实施例4中相同的方式，将具有改善的肿瘤组织靶向能力的抗Ras·GTP iMab的细胞质渗透人源化轻链表达载体(hT4-ep59 MG LC)和重链表达载体(epRT22 GS，epRT22 MG，epRT22(G4S)2)瞬时共转染到表达HEK293F蛋白的细胞中，以表达具有改善的肿瘤组织靶向能力的抗Ras·GTP iMab突变。
以下表18示出了具有改善的肿瘤组织靶向能力的抗Ras·GTP iMab的重链可变区序列。
[表18]
Figure GDA0002713334410000781
以下表19示出了具有改善的细胞质内稳定性、体内持久性和肿瘤组织靶向能力的抗Ras·GTP iMab的产率
[表19]
Figure GDA0002713334410000782
a将编码每种IgG抗体的HC和LC的2个质粒以等摩尔比共转染到在1L养基中的HEK293F细胞中。在培养6天之后，使用蛋白质-A亲和柱从细胞培养上清液纯化抗体。
bND.未确定
在以上表19中，将常规RT22-ep59 MG新命名为“epRas03 MG”，将RT22-i39 MG命名为“inRas03”，并且基于这些命名重链恒定区变体。
实施例27.具有改善的细胞质内稳定性的抗Ras·GTP iMab的减少的细胞质内降解和非贴壁细胞生长抑制的确定
使用改进的分裂绿色荧光蛋白互补系统(韩国专利申请号10-2015-0143278)确定在实施例25中构建的具有改善的细胞质内稳定性的抗Ras·GTP iM ab的降解的减少。出于此目的，构建具有与epRas03 MG和epRas13 MG的重链C末端融合的GFP11-SBP2肽的epRas03-GFP11-SBP2 MG和epRas13-GFP11-SBP2 MG。
图18a示出了使用改进的分裂绿色荧光蛋白互补系统确定肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab的减少的细胞质内降解的结果。
具体地，将在96孔测定板中在1x104个细胞/孔的密度下的表达SA-GFP1-10的SW480细胞系在0.1ml含有10％FBS的培养基中稀释，并且在37℃和5％CO2下培养24小时。然后，将细胞用2μM epRas03 MG、epRas03-GFP11-SBP2 MG和epRas13-GFP11-SBP2 MG处理6小时，并且然后用新鲜培养基替换培养基。然后，将细胞培养0、2、4和6小时，并且使用荧光板读取器定量在485nm激发波长和528nm发射波长下的绿色荧光。
如图18a中所示，具有减少的细胞质降解的epRas13-GFP11-SBP2 MG在6小时之后仍然保留原始绿色荧光的60％；但是对照组epRas03-GFP11-SBP2MG仅保留其原始绿色荧光的5％，这指示几乎所有的抗体被降解。对照组epRas03 MG表现出很少的绿色荧光。这指示epRas13 MG具有改善的细胞质内稳定性。
图18b示出了软琼脂集落形成方法的结果，所述软琼脂集落形成方法用以确定人结直肠癌细胞系中具有改善的细胞质内稳定性的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras GTP iMab对非贴壁细胞生长的抑制活性。
具体地，将1.2％琼脂糖溶液和2X RPMI+20％FBS培养基的1:1比率的0.2ml混合物涂布在24孔板上。在底部琼脂硬化之后，将0.7％琼脂糖溶液与2X RPMI+20％FBS(含有1x103个细胞+1μM或4μM抗体)的培养基以1:1的比率混合，并且将0.2ml的混合物涂布在底部琼脂上。在顶部琼脂固化之后，向其中添加0.2ml培养基。随后，每3天用含有0.5μM或2μM抗体的培养基替换培养基。在2至3周之后，用BCIP/NBT溶液对集落进行染色，并且然后测量具有200μm或更大的大小的集落的数量。
如图18b中所示，发现在Ras突变体细胞系SW480和Lovo中具有改善的细胞质内稳定性的epRas13 MG具有优于用作对照组的epRas03 MG的细胞生长抑制能力。此外，野生型细胞系Colo320DM与用作对照组的不具有Ras抑制能力的细胞质渗透抗体(epCT03 MG)没有差异。
图18c示出了为了确定人结直肠癌细胞系中具有改善的细胞质内稳定性的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab对非贴壁细胞生长的抑制活性而实施的失巢凋亡方法的结果。
具体地，将细胞系以1x103个细胞/孔的密度在0.1ml 10％FBS的培养基中在低吸附96孔板中稀释，并且在37℃和5％CO2下与0.5μM或2μM浓度的抗体一起培养48小时。随后，将细胞用0.5和2μM抗体浓度进一步处理并培养48小时。在培养总计96小时之后，添加50μlCellTiterGlo(Promega)以定量荧光。
如图18c中所示，发现在Ras突变体细胞系SW480和LoVo中具有改善的细胞质稳定性的epRas13 MG具有优于用作对照组的epRas03 MG的细胞生长抑制能力。此外，野生型细胞系Colo320DM与用作对照组的不具有Ras抑制能力的细胞质渗透抗体(epCT03 MG)没有差异。
图18d示出了为了确定人肺癌细胞系中具有改善的细胞质内稳定性的肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab对非贴壁细胞生长的抑制活性而实施的失巢凋亡方法的结果。
具体地，将细胞系以1x103个细胞/孔的密度在0.1ml含有10％FBS的培养基中在低吸附96孔板中稀释，并且在37℃和5％CO2下与2μM抗体一起培养48小时。随后，将细胞用2μM抗体进一步处理并培养48小时。在培养总计144小时之后，添加50μl CellTiterGlo(Promega)以定量荧光。
如图18d中所示，发现在Ras突变体细胞系中具有改善的细胞质稳定性的inRas13具有优于用作对照组的inRas03的细胞生长抑制能力。此外，野生型细胞系与用作对照组的不具有Ras抑制能力的细胞质渗透抗体(inCT03)没有差异。
结果显示，epRas13 MG和inRas13均具有优于常规epRas03 MG和inRas03的细胞质稳定性，并且因此表现出特异性地针对Ras突变体细胞系的改善的细胞生长抑制作用。
实施例28.具有改善的体内持久性的抗Ras·GTP iMab的药代动力学评价
图19a示出了在纯化具有改善的体内持久性的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras GTP之后在还原或非还原条件下通过12％SDS-PAGE进行的分析的结果。
具体地，发现epRas03 MG和epRas03 MG IgG4两者在非还原条件下具有约150kDa的分子量，并且在还原条件下发现重链的分子量和轻链的分子量分别为50kDa和25kDa。这指示，表达并纯化的单独克隆在溶液中作为单体存在(单独地)，并且不通过非天然二硫键形成二体或寡聚物。
图19b示出了在BALB/c裸小鼠中具有改善的体内持久性的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras GTP的药代动力学评价的结果。
具体地，将20mg/kg实验组epRas03 MG IgG4和对照组epRas03 MG静脉内注射到BALB/c裸小鼠中。在0.5小时、1小时、4小时、8小时、12小时和24小时以及2天、4天、7天、14天、21天和28天之后，采集小鼠血。将采集的血在4℃下在12,000rpm下离心10分钟，并且将上清液血浆储存在-80℃下。之后，进行ELISA以分析血浆中epRas03 MG IgG4和epRas03 MG的浓度。具体地，使抗人Fab抗体(Sigma)在室温下以2.5μg/ml的浓度与96孔半区板(Corning)结合1小时，并且用0.1％PBST(PBS，pH 7.4，0.1％Tween20)洗涤三次。使抗体与1％PBSB(PBS，pH 7.4，1％BSA)结合1小时，并且将采集的血和纯化抗体(用于参考曲线)在1％PBSB中稀释，结合2小时，并且然后用0.1％PBST洗涤三次。然后，使HRP缀合的抗人IgGFc抗体(Sigma)作为标记抗体结合1小时，接着用0.1％PBST洗涤3次。使所得物与TMB ELISA溶液反应，用硫酸溶液使反应停止，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
如可以从图19b所见，具有改善的体内持久性的epRas03 MG IgG4具有的半衰期是对照组epRas03 MG的两倍高。
实施例29.具有改善的肿瘤组织靶向能力的肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTPiMab的EpCAM靶向能力改善的确定
图20a示出了使用FACS进行的测试的结果，以确定与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的抗Ras·GTP iMab即epRas23 MG与细胞表面EpCAM的结合能力。
具体地，针对每个样品制备1×105个LoVo细胞。将细胞在4℃下在补充100nMRas03、epRas03 MG和epRas23 MG的PBSF(PBS缓冲液，2％BSA)中培养1小时。然后，使每种抗体在4℃下与特异性地识别与Alexa488(绿色荧光)缀合的人Fc的抗体反应30分钟。然后，将细胞用PBS洗涤并且通过流式细胞术分析。由此，测量了与表达EpCAM的LoVo细胞结合的epRas03 MG和epRas23 MG抗体的荧光强度，并且与更多EpCAM靶向肽融合的epRas23 MG具有更高的荧光强度。
图20b示出了为了分析包含与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的抗Ras·GTP iMab与25、50和100nM Avi-KRasG12D·GppNHp或100nMAvi-KRasG12D·GDP的结合能力而进行的ELISA的结果。
具体地，以与实施例4中相同的方式进行ELISA，并且将包含与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab即epRas03 MG和epRas23 MG固定在96孔EIA/RIA板上，之后使GppNHp结合的KRas蛋白以100nM、50nM和25nM的不同浓度结合，并且使GDP结合的KRas蛋白以100nM的浓度结合，并且然后结合作为标记抗体的HRP缀合的抗his抗体(HRP缀合的抗his mAb)。使所得物与TMBELISA溶液反应，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
结果显示，使EpCAM靶向肽与重链可变区的N末端融合不产生对于Ras的亲和力的差异。
图20c示出了为了确定人肺癌细胞系中具有与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的抗Ras·GTP iMab即epRas23MG对非贴壁细胞生长的抑制活性而实施的失巢凋亡方法的结果。
具体地，将LoVo、DLD-1和HCT116细胞系各自以1x103个细胞/孔的密度在0.1ml10％FBS的培养基中在低吸附96孔板中稀释，并且在37℃下在5％CO2下与0.5或2μM抗体一起培养48小时。随后，将细胞用0.5或2μM抗体进一步处理并培养48小时。在培养总计96小时之后，向其中添加50μl CellTiterGlo(Promega)以定量荧光。
如图20c中所见，发现在Ras突变体细胞系LoVo、DLD-1和HCT116中具有改善的细胞质稳定性的epRas23 MG具有优于用作对照组的epRas03 MG的细胞生长抑制能力。
图20d是示出了包含与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的抗Ras·GTP iMab即epRas23 MG在小鼠中的生物分布的图像，以及示出了肿瘤和整个身体的荧光的图。
具体地，将20μg的经DyLight荧光标记的抗Ras·GTP iMab即Ras03、epRas03 MG和epRas23 MG注射到BALB/c裸小鼠中，并且用IVIS Lumina XRMS系列III(Perkin Elmer)在0、6、12、24、48和72小时观察从小鼠的整个身体发射的荧光。此时，使用1.5％-2.5％异氟烷(Piramal Critical Care)对小鼠进行麻醉。每个图像示出了使用Living Image软件(Perkin Elmer)定量的整体身体的荧光值。
如可以从图20d所见，epRas03 MG和epRas23 MG比未与EpCAM靶向肽融合的Ras03具有更大量的存在于肿瘤组织中的抗体。此外，可以看到，在抗体注射之后，epRas23 MG随时间推移具有比epRas03 MG更大量的存在于肿瘤组织中的抗体。
图20e是示出了包含与重链可变区的N末端融合以便改善肿瘤组织靶向能力的EpCAM靶向肽的抗Ras·GTP iMab即epRas23 MG在小鼠中的生物分布的图像，以及示出了使用所提取的器官定量的荧光的图。
具体地，在实验之后，在抗体注射之后72小时，对小鼠进行安乐死，提取肿瘤、心脏、肺、肝、肾、胰腺和脾脏并且使用Living Image软件(Perkin Elmer)定量这些器官中每个中的荧光。
如可以从图20e所见，epRas03 MG和epRas23 MG比未与EpCAM靶向肽融合的Ras03具有更大量的存在于肿瘤组织中的抗体和更少量的存在于其他器官中的抗体。此外，肿瘤组织中的抗体的量按epRas23 MG、epRas03 MG和Ras03的顺序增加。
实施例30.改善抗Ras·GTP iMab的体内持久性的重链修饰变体的设计和表达/纯化
免疫球蛋白型抗体结合身体中的免疫细胞的Fc受体，并且通过ADCC机制被去除。由于引入L234A、L235A和P239G突变，IgG1具有与Fcγ受体的弱结合力，并且因此此功能受到抑制。因此，为了改善抗Ras·GTP iMab的体内稳定性，构建了完整免疫球蛋白IgG1抗体，其为其中将L234A、L235A和P239G突变(LALA-PG)引入到IgG1的重链恒定区(CH1至CH3)中的突变体(IgG1 LALA-PG)。具体地，以与实施例4中相同的方式，将具有改善的体内持久性的抗Ras·GTP iMab的细胞质渗透人源化轻链表达载体(hT4-ep59GSSG LC)和重链表达载体(RT22 IgG1 LALA-PG或RT22 IgG1 LALA-PG，N434D)瞬时共转染到表达HEK293F蛋白的细胞中以表达具有改善的体内持久性的抗Ras·GTP iMab突变体。
以下表20示出了引入LALA-PG突变体以改善抗Ras·GTP iMab体内持久性的重链恒定区(CH1-CH3)序列信息。
[表20]
Figure GDA0002713334410000841
实施例31.改善肿瘤特异性抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体的药代动力学评价
图21a示出了尺寸排阻色谱的结果，以确定改善肿瘤组织特异性抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体是否是多聚体。
具体地，使用Agilent Technologies HPLC 1200系列进行尺寸排阻色谱。本文所用的柱是
Figure GDA0002713334410000842
SEC-300柱。在1ml/min的流速下进行实验。流动相包括150mM磷酸钠(pH7.0)。稀释剂是流动相，并且使用280nm UV进行分析。鉴定得出抗体由所有的iMab被纯化为单体而不是多聚体。
图21b示出了改善肿瘤组织EpCAM特异性抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体在BALB/c裸小鼠中的药代动力学评价的结果。
具体地，将epRas03、epRas13、epRas33和epRas83以20mg/kg静脉内注射到BALB/c裸小鼠中。在0.5小时、1小时、4小时、8小时、12小时和24小时以及2天、4天、7天、14天、21天和28天之后，采集小鼠血。将采集的血在4℃下在12,000rpm下离心10分钟，并且仅将上清液血浆储存在-80℃下。然后，进行ELISA以分析血浆中epRas03、epRas13、epRas33和epRas83的浓度。具体地，以与实施例28中相同的方式，使抗人Fab抗体(Sigma)在室温下以2.5μg/ml的浓度在96孔半区板(Corning)上结合1小时，并且然后用0.1％PBST(PBS，pH 7.4，0.1％Tween20)洗涤三次。在与1％PBSB(PBS，pH7.4，1％BSA)结合1小时之后，将采集的血和纯化抗体(用于参考曲线)在1％PBSB中稀释，结合2小时，并且然后用0.1％PBST洗涤三次。然后，使抗体与作为标记抗体的HRP缀合的抗人IgG Fc抗体(Sigma)结合1小时，并且然后用0.1％PBST洗涤3次。使所得物与TMB ELISA溶液反应，用硫酸溶液使反应停止，并且对在450nm处的吸光度进行定量。
如可以从图21所见，引入LALA-PG突变体的epRas33和epRas83比对照组epRas03具有更长的半衰期，并且与epRas03相比，epRas13具有稍微减少的半衰期。
实施例32.改善抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体与GppNHp结合的KRasG12D和新生儿Fc受体(FcRn)的结合能力的评价
使用Biacore2000仪器基于SPR(表面等离子体共振)分析结合能力，以便确定改善抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体维持了与GppNHp结合的KRasG12D的结合能力并且对于与FcRn的结合能力没有影响。
具体地，为了确定与GppNHp结合的KRasG12D的结合能力，将epRas03、epRas13、epRas83、inRas03 MG、inRas13 MG和inRas83 MG在10mM NaAc缓冲液(pH 4.0)中稀释至20μl/ml的浓度，并且以大约1800个响应单位(RU)固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。随后，以30μl/min的流速分析Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，137mM NaCl，5mMMgCl2，0.01％Tween 20)，并且以100nM至6.25nM的浓度分析完全GppNHp结合的GST-KRasG12D。在结合和解离分析之后，通过使缓冲液(20mM NaOH，1M NaCl，pH 10.0)以30μl/min的流速流动1分钟来进行CM5芯片的再生成。将通过结合3分钟并解离3分钟获得的每个传感图参考空白单元进行归一化并减去空白单元，并且由此计算亲和力。
具体地，为了确定与FcRn的结合能力，将FcRn在10mM NaAc缓冲液(pH4.0)中稀释至20μl/ml的浓度，并且以大约650个响应单位(RU)固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。随后，以30μl/min的流速分析磷酸盐缓冲液(12mM磷酸盐，pH 6.0，137mM NaCl，0.01％Tween 20)，分析浓度为200nM至6.25nM的epRas03，并且分析浓度为2000nM至62.5nM的epRas13和epRas83。在结合和解离分析之后，通过使磷酸盐缓冲液(12mM磷酸盐，pH 7.4，137mM NaCl，0.01％Tween 20)以30μl/min的流速流动3分钟来进行CM5芯片的再生成。将通过结合3分钟并解离6分钟获得的每个传感图参考空白单元进行归一化并减去空白单元，并且由此计算亲和力。
以下表21示出了使用BIACORE2000仪器基于SPR来分析改善抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体对于完全GppNHp结合的KRasG12D和FcRn的亲和力的结果。
[表21]
Figure GDA0002713334410000861
hND.未确定
实施例33.改善肿瘤整合素特异性抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体的肿瘤生长抑制能力的确定
图22a示出了尺寸排阻色谱的结果，以确定改善肿瘤组织整合素特异性抗Ras·GTP iMab的体内持久性的LALA-PG突变体中作为多聚体的存在。
具体地，使用Agilent Technologies HPLC 1200系列进行尺寸排阻色谱。本文所用的柱是
Figure GDA0002713334410000871
SEC-300柱。在1ml/min的流速下进行实验。流动相包括150mM磷酸钠(pH7.0)。稀释剂是流动相，并且使用280nm UV进行分析。鉴定得出在所有iMab的95％或更多中，抗体被纯化为单体。
图22b示出了测试的结果，以在人结直肠癌KRas突变体细胞系LS1034异种移植物小鼠中比较改善肿瘤组织整合素特异性抗Ras细胞渗透抗体的体内持久性的LALA-PG突变体的肿瘤生长抑制作用。
具体地，将KRasA146T突变体人结直肠癌细胞系LS1034以1×107个细胞/小鼠的密度皮下注射到BALB/c裸小鼠中。在约14天之后，当肿瘤体积达到约120mm3时，以20mg/kg静脉内注射相等体积的PBS媒介物对照组、对照组(inCT03 MG、inCT13 MG、inCT33 MG、inCT83MG)和实验组(inRas03MG、inRas13 MG、inRas33 MG、inRas83 MG)。每3至4天(即，一周两次)进行总计7次静脉内注射，并且使用卡尺测量肿瘤体积，持续24天。
如可以从图22b所见，在给予inRas03 MG(对照：inCT03 MG)、inRas13MG(对照：inCT13 MG)和inRas33 MG(对照：inCT33 MG)的小鼠中癌细胞生长受抑制。另一方面，可以看到，在给予inRas83(对照：inCT83 MG)的小鼠中癌细胞生长未受到抑制。
图22c示出了测试的结果，以在人结直肠癌KRas突变体细胞系SW403异种移植物小鼠中比较改善肿瘤组织整合素特异性抗Ras细胞渗透抗体的体内持久性的LALA-PG突变体的肿瘤生长抑制作用。
具体地，将KRasG12V突变体人结直肠癌细胞系SW403以1×107个细胞/小鼠的密度皮下注射到BALB/c裸小鼠中。在约14天之后，当肿瘤体积达到约120mm3时，以20mg/kg静脉内注射相等体积的PBS媒介物对照组、对照组(inCT03 MG、inCT13 MG、inCT33 MG、inCT83 MG)和实验组(inRas03MG、inRas13 MG、inRas33 MG、inRas83 MG)。每3至4天(即一周两次)进行总计5次静脉内注射，并且使用卡尺测量肿瘤体积，持续17天。
如可以从图22c所见，在给予inRas33 MG(对照：inCT33 MG)的小鼠中癌细胞生长受抑制。另一方面，可以看到，在给予inRas03 MG(对照：inCT03MG)、inRas13 MG(对照：inCT13 MG)或inRas83(对照：inCT83 MG)的小鼠中癌细胞生长未受到抑制。
如可以从图22所见，inRas33 MG改善肿瘤生长抑制能力，而inRas13 MG和inRas83MG具有相似或恶化的肿瘤生长抑制能力。
实用性
由本公开文本提供的用于改善以完整免疫球蛋白的形式特异性地渗透到肿瘤组织细胞的细胞质中以直接抑制细胞内Ras·GTP的抗体的肿瘤抑制效率的方法通过以下来实现：选择对于Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区，并且开发具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力、并且能够靶向位于某些肿瘤细胞中且总是通过突变而活化的Ras·GTP并且能够有效地抑制Ras·GTP活性的轻链可变区。
此外，由本公开文本提供的为抗体赋予改善的肿瘤组织特异性细胞质渗透能力的轻链可变区或包含所述轻链可变区的抗体降低对于在大部分正常细胞中表达的HSPG的结合能力，并且从而使得能够通过经融合用于靶向肿瘤组织的肽提供了经由特异性针对肿瘤组织表达的受体的胞吞作用和内体逃逸，并且当抗体到达细胞质时，对于Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区(VH)具有改善的Ras抑制能力。所述抗体以包含修饰的轻链可变区和重链可变区的组合的完整免疫球蛋白的形式特异性地渗透到肿瘤组织细胞的细胞质中并且直接抑制细胞内Ras·GTP，因此表现出改善的肿瘤生长抑制能力。
根据本公开文本的包含改进的轻链可变区和重链可变区的组合的细胞质渗透Ras抑制抗体由于高产率而可以易于开发成治疗性药物，能够通过肿瘤组织特异性细胞质渗透而有效地抑制突变体Ras，并且因此预期通过使用单一药物或其与常规治疗性药物的组合进行治疗可发挥有效的抗癌活性。
序列表自由文本
附有电子文件。
<110> 奥隆制药
<120> 通过内化到细胞胞浆中抑制细胞中活化的Ras的抗体及其用途
<130> PP-B2124
<150> KR 17/152,998
<151> 2017-11-16
<160> 69
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
<223> RT11 VH
<400> 19
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Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<220>
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<400> 20
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Arg Thr Ser His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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<220>
<223> RT22 VH
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
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Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Arg Thr Ser His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Phe Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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Val Ser Ser
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
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Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Arg Thr Ser His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Phe Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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65 70 75 80
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100 105 110
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100 105 110
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Arg Asp Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
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Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
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100 105 110
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100 105 110
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100 105 110
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Val Glu Ile Lys Arg
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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130
<210> 50
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep33 MG VL
<400> 50
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
<210> 51
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep34 MG VL
<400> 51
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
<210> 52
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep35 MG VL
<400> 52
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Arg Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Leu Ser Tyr Arg Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
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<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep36 MG VL
<400> 53
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Asp Asp Arg Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Leu Ser Tyr Arg Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 54
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Leu Ser Tyr Arg Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
<210> 55
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 55
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Arg Thr Gly Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
<210> 56
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep39 MG VL
<400> 56
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Arg Asp Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
<210> 57
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep58 MG VL
<400> 57
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Arg Thr Gly Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
<210> 58
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep59 MG VL
<400> 58
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Arg Asp Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
<210> 59
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep59 GSSG VL
<400> 59
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
20 25 30
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
35 40 45
Arg Asp Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg
130
<210> 60
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hT4-ep33 (G4S)2 VL
<400> 60
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
100 105 110
Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
130 135
<210> 61
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> epRT22 GS
<400> 61
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Gly Ser Glu Val
1 5 10 15
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
20 25 30
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Ser Met
35 40 45
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr
50 55 60
Ile Ser Arg Thr Ser His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
85 90 95
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
100 105 110
Gly Phe Lys Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 62
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> epRT22 MG
<400> 62
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Met Gly Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
35 40 45
Asp Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Ser Tyr Ile Ser Arg Thr Ser His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Lys Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 63
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> epRT22 (G4S)2
<400> 63
Glu His Leu His Cys Leu Gly Ser Leu Cys Trp Pro Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Ser Asp Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Arg Thr Ser His Thr Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Lys Met Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 64
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1
<400> 64
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 65
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1 N434D
<400> 65
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asp His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 66
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4 S228P
<400> 66
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 67
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4 S228P, N434D
<400> 67
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asp His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 68
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1 LALA-PG
<400> 68
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 69
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1 LALA-PG, N434D
<400> 69
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asp His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330

Claims (27)

1.一种重链可变区，其特异性地结合通过与Ras结合的GTP活化的Ras(Ras·GTP)，所述重链可变区包含：
具有由以下式1表示的氨基酸序列的CDR1；
具有由以下式2表示的氨基酸序列的CDR2；以及
具有由以下式3表示的氨基酸序列的CDR3，
[式1]
D-X11-SMS
其中X11是F或Y，
[式2]
YISRTSHT-X21-X22-YADSVKG
其中X21是T、I或L，并且X22是Y、C、S、L或A，
[式3]
G-F-X31-X32-X33-Y
其中X31是K、F、R或N，X32是M或L，并且X33是D或N。
2.根据权利要求1所述的重链可变区，其中
具有由以下式1表示的氨基酸序列的CDR1；
具有由以下式2表示的氨基酸序列的CDR2；以及
具有由以下式3表示的氨基酸序列的CDR3，
[式1]
D-X11-SMS
其中X11是F或Y，
[式2]
YISRTSHT-X21-X22-YADSVKG
其中X21-X22是TY、IY、TC、TS、IS、LC、LL或IA，
[式3]
G-F-X31-X32-X33-Y
其中X31-X32-X33是KMD、RMD、FMN、RLD或NLD。
3.根据权利要求1所述的重链可变区，其中所述重链可变区的CDR1序列选自由SEQ IDNO:2至4表示的氨基酸序列，所述重链可变区的CDR2序列选自由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10至16表示的氨基酸序列，并且所述重链可变区的CDR3序列选自由SEQ ID NO:6至9和SEQID NO:17至18表示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的重链可变区，其中所述重链可变区选自：
i)包含SEQ ID NO:2的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3的重链可变区；
ii)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3的重链可变区；
iii)包含SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:8的CDR3的重链可变区；
iv)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:9的CDR3的重链可变区；
v)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:8的CDR3的重链可变区；
vi)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:10的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3的重链可变区；
vii)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:11的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3的重链可变区；
viii)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:12的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3的重链可变区；
ix)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:13的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3的重链可变区；
x)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:14的CDR2和SEQ ID NO:17的CDR3的重链可变区；
xi)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:18的CDR3的重链可变区；以及
xii)包含SEQ ID NO:3的CDR1、SEQ ID NO:16的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3的重链可变区。
5.根据权利要求1所述的重链可变区，其中所述重链可变区选自由SEQ ID NO:20至32表示的氨基酸序列。
6.一种完整免疫球蛋白抗体，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的重链可变区。
7.根据权利要求6所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述抗体具有细胞质渗透能力。
8.根据权利要求6所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述抗体的轻链可变区选自由SEQID NO:34至43表示的氨基酸序列。
9.根据权利要求6所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述抗体的轻链可变区或重链可变区与靶向EpCAM(上皮细胞粘附分子)、整合素αvβ3或整合素αvβ5的肽融合。
10.根据权利要求9所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述轻链可变区或所述重链可变区选自由SEQ ID NO:44至63表示的氨基酸序列。
11.根据权利要求6所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述抗体包含源自人免疫球蛋白的重链恒定区或轻链恒定区，所述人免疫球蛋白选自IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。
12.根据权利要求11所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述重链恒定区包含CH3的N434D、CH2的L234A、L235A和P329G中的至少一个突变，其中所述氨基酸位置根据EU编号确定。
13.根据权利要求12所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述重链恒定区的突变选自由SEQ ID NO:65至69表示的氨基酸序列。
14.根据权利要求6所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述抗体选自所述抗体的单链Fv(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFV)和表位结合片段。
15.根据权利要求6所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述抗体是双特异性抗体(双特异性Ab)。
16.根据权利要求6所述的完整免疫球蛋白抗体，其中所述抗体与选自以下的一种或多种融合：蛋白质、肽、小分子药物、毒素、酶、核酸和纳米颗粒。
17.一种用于制备具有对于细胞内Ras·GTP的改善的亲和力和肿瘤组织特异性细胞质渗透能力的完整免疫球蛋白型抗体的方法，所述方法包括：
(1)制备用核酸克隆的内体逃逸重链表达载体，所述核酸被由包含在含有人重链可变区(VH)和人重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的重链中的重链可变区(VH)人源化的对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区(VH)取代；
(2)制备用核酸克隆的细胞质渗透轻链表达载体，所述核酸被由包含在含有人轻链可变区(VL)和人轻链恒定区(CL)的轻链中的轻链可变区(VL)人源化的具有细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)和人源化的具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)取代；
(3)将所制备的重链表达载体和轻链表达载体共转化到用于蛋白质表达的动物细胞中，以表达完整免疫球蛋白型抗体，所述完整免疫球蛋白型抗体包含对于细胞内Ras·GTP具有改善的亲和力的重链可变区(VH)和具有特异性地针对肿瘤组织的细胞质渗透能力的轻链可变区(VL)；以及
(4)纯化并回收所表达的完整免疫球蛋白型抗体。
18.一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的抗体。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述癌症具有与活化的细胞内Ras相关联的突变。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中与所述活化的细胞内Ras相关联的所述突变是具有在所述Ras的第12、13或61个氨基酸中的突变的癌症。
21.根据权利要求18所述的组合物，其中所述预防或治疗癌症的特征在于，根据权利要求5至15中任一项所述的抗体抑制细胞质中活化的Ras(Ras·GTP)与B-Raf、C-Raf或PI3K的结合。
22.一种用于诊断肿瘤的组合物，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的抗体。
23.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至16中任一项所述的抗体。
24.一种载体，其包含根据权利要求23所述的多核苷酸。
25.一种用于构建特异性地结合Ras·GTP并且对其具有改善的亲和力的重链可变区文库的方法，所述方法包括：
(1)确定参与RT11重链可变区(VH)文库模板的抗原结合的三个互补决定区(CDR)中具有结合细胞内Ras·GTP的高潜力的氨基酸位点；
(2)设计能够编码需要在所确定的氨基酸位点处包含在文库中的氨基酸的简并密码子引物；以及
(3)使用酵母表面表达系统表达呈scFab或Fab形式的所设计文库的重链可变区。
26.一种特异性地结合Ras·GTP并且对其具有改善的亲和力的重链可变区的文库，其通过根据权利要求25所述的方法构建。
27.一种用于筛选特异性地结合Ras·GTP并且对其具有改善的亲和力的重链可变区的方法，所述方法包括：
(1)使用酵母表面表达系统表达根据权利要求25中的(3)制备的能够结合Ras·GTP的重链可变区文库；
(2)构建呈稳定形式而不在生物素化期间变形的结合作为GTP类似物的GppNHp的Avi-KRasG12D；
(3)使所述重链可变区文库与所述GppNHp结合的Avi-KRasG12D结合；以及
(4)测量所述重链可变区文库与所述GppNHp结合的Avi-KRasG12D之间的结合亲和力。
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