KR101075123B1

KR101075123B1 - 핵산가수분해 능 및 암세포내 침투능력을 갖는 인간화된 항체 및 그 용도

Info

Publication number: KR101075123B1
Application number: KR1020080104744A
Authority: KR
Inventors: 김용성; 권명희; 김동식
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2008-10-24
Publication date: 2011-10-19
Also published as: KR20100045683A

Abstract

본 발명은 핵산가수분해 능 및 암세포내 침투능력을 갖는 인간화된 항체 및 그 용도에 관한 것이다.

인간화 항체, 핵산결합 항체, 핵산가수분해 항체, 세포내 침투, 암세포 사멸

Description

핵산가수분해 능 및 암세포내 침투능력을 갖는 인간화된 항체 및 그 용도{Humanized antibody with nucleic nucleic acid-hydrolyzing activity and tumor cell-penetrating ability and uses thereof}

본 발명은 핵산에 특이적으로 결합하고, 이를 가수분해하는 인간화 항체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마우스 유래 항-핵산항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위 (CDR)을 안정성이 높은 인간항체 중쇄 및 경쇄의 가변영역에 이식하여 구축된 인간항체가 다양한 핵산에 결합 능과 가수분해 능을 동시에 보유하고 세포 내부로 스스로 침투하는 능력을 가지며, 정상 세포에 비해 암세포에서 현저히 잘 들어가는 선택성을 가지고 암세포에 세포사멸을 유도하는 특징을 가지고 있으면서도 인체 내에서 낮은 면역반응을 나타내는 항체 및 이를 포함하는 여러 가지 질환 치료, 특히 암의 치료용 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 쥐로부터 유래된 항체를 인간의 몸에 주입할 경우 그 항체자체가 인간의 몸에서 항원으로 작용하게 되어 인간의 항체가 쥐 항체를 항원으로 인식하 여 면역반응이 일어나 쥐 항체는 제거되게 된다. 자세히 말하면, 이것은 쥐 항체 아미노산 서열이 인간이 생산해 내는 항체의 일반적인 아미노산 서열과 다름으로 인하여 인간의 신체 내에서 항체로 작용하지 못하고 외부에서 침입된 항원으로 인지되어 인간의 항체와 반응하여 제거 된다. 이러한 반응을 Human Anti-Mouse Antibodies(HAMA)라 한다.(George G., Arch Pathol Lab Med. 124: 921-23, 2000)

이러한 반응으로 인하여 여러 다른 생물에서 유래된 치료능을 항체들이 개량되어서 사용되어지는데 그 중 가장 대표적인 방법은 인간화 방법이다. 이 방법의 기본원리는 기존의 항체가 기능을 갖는 아미노산 부위인 complementary determining region(CDR)부위만을 남겨둔 채 뼈대로 작용하는 Framework region과 Fc region을 인간의 몸에서 유래한 germline amino acid로 바꾸어 주는 것이다.

자세히 설명하면, 항체는 구조적 측면에서 heavy chain과 light chain으로 크게 나뉘고 기능적 측면에서 variable region과 constant region 이러하게 두 가지 부위로 나눌 수 있는데, 이때 항원과 반응성을 갖고 있는 부위는 variable region이다. variable region에서도 두부위로 나뉘는데 두 개의 β-sheets와 이 β-sheets를 연결하는 loop이다. 이 중 세 개의 loop는 그 길이와 아미노산의 구성이 높은 다양성을 갖는데 바로 이 것을 항원과 직접 결합하는 complementary determining regions(CDRs)이라하고, β-sheets와 나머지 loop를 뼈대(framework region)이라 한다. (Amzel L.등, Ann. Rev. Biochem., 48: 961-97, 1979, Chothia C.등, J. Mol. Biol., 196: 901-17, 1987)

인간화를 하기 위해서 항체의 CDRs을 결정해야하는데, CDRs을 정하는 기준은 아미노산 서열을 기준으로 한 kabat numbering(Wu T.등, J. Exp. Med., 132: 211-50, 1970)과 CDRs의 구조를 기준으로 한 chothia numbering(Chothia C.등, J. Mol. Biol., 196: 901-17, 1987)으로 나눌 수 있다. 일반적으로 chothia numbering의 CDRs이 짧기 때문에 xenogeneic 단편(fragment)이 짧아지므로 선호되는 경향이 있다. 이 밖에 인간화를 시킬 때 주의해야 할 지역으로는 vernier zone이 있다. 항체의 CDRs은 loop의 길이와 몇 개의 중요 지역의 아미노산에 따라 canonical 구조가 결정되어진다.(Chothia C.등, J. Mol. Biol., 196: 901-17, 1987, Chothia C.등 Nature., 342: 877-83, 1989, Tramontano A.등 J. Mol. Biol., 215: 175-82, 1990) 이 때 몇 개의 중요 지역의 아미노산을 vernier zone이라 한다. vernier zone이 변하게 되면 항체의 CDRs 또한 변할 가능성이 있으므로 인간화를 시킬 시에 유지 시켜주어야 한다. 인간화는 이렇게 구분되어 지는 비인간 항체의 complementary determining regions(CDRs)와 vernier zone을 인간 germline 아미노산으로 구성되어 있는 뼈대에 옮기는 것을 말하는데, 옮김으로 인하여 CDRs부위는 항원과 결합하는 본래의 아미노산이고 뼈대와 Fc region은 새로운 아미노산이 되는 것이다.

기존의 알려진 인간화 시키는 방법으로는 크게 rational 방법과 empirical방법이 있다.(Juan C.등, Frontiers in Bioscience, 13: 1619-1633, 2008)

rational방법으로는 첫 번째 CDR-grafting이 있다. (Verhoeyen M.등, Science, 239: 1534-1536, 1988)

CDR-grafting은 가장 오래된 방법이고 널리 쓰이는 방법으로써 먼저 항원과 반응하는 최소한의 아미노산을 결정해야 한다. 기존에 연구되어진 자료가 없다면, alanine-scanning mutagenesis(Fuh G.등 J. Biol. Chem., 281: 6625-31, 2006) 또는 combinatorial mutagenesis(Pal G.등, J. Biol. Chem., 281: 22378-85, 2006)방법을 이용하여 알아낼 수 있다. 그 다음으로는 대체할 인간 뼈대를 찾아야 하는데, 기존 본래의 항체 뼈대의 아미노산 염기서열과 인간 germline 뼈대의 아미노산 염기서열의 상동성이 매우 높아야한다. 항체의 CDR은 그 길이와 CDRs의 주변 아미노산에 의하여 4가지 종류의 canonical구조로 분류되어지기 때문에 CDRs을 옮길 때 CDRs의 길이는 유지되므로 아미노산 염기서열의 상동성이 매우 높은 인간항체에 옮김으로써 뼈대의 환경을 본래의 항체와 가장 유사하게 하여 CDRs의 구조가 변하지 않게 하여 항원-항체의 친화도가 감소하는 것을 최소한으로 줄일 수 있다. 인간의 germline 유전자를 모두 볼 수 있는 곳은 International ImMunoGeneTics information system(IMGT ; URL:http://imgt.cines.fr/)이고, 가장 유사한 아미노산 염기서열은 Igblast (URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 이용하여 찾을 수 있다. CDR-grafting의 마지막 단계는 back mutation을 통한 친화도 유지 또는 복원이다. 이전 과정에서 높은 상동성을 갖는 뼈대에 CDRs를 grafting시켰어도 일반적으로 이러한 방법의 인간화 과정에서는 친화도가 기존의 항체보다 감소한다. 상동성이 높다 하지만 구조가 조금씩은 변하기 때문인데, 기존의 항체의 canonical 구조와 전체적인 구조를 새로이 만들어진 항체의 구조를 예상한 것과 비교함으로써 특정부분에 mutation을 주어 구조가 변하는 것을 막을 수 있다. 기존의 존재하는 항체의 구조는 Protein Data Bank(PDB ; URL:http://www.rcsb.org/)에서 알 수 있고(Berman H.등, Nucleic Acids Res., 28: 235-242, 2000), 새로이 만들어 진 항체의 구조는 Web Antibody Modelling(WAM : URL:http://antibody.bath.ac.uk)에서 예상할 수 있는데, 항체의 canonical 구조를 기반으로 예상한다.(Whitelegg N.등, Protein Eng., 13: 819-24, 2000)

Rational 방법의 두 번째는 Resurfacing방법이다. (Padlan E등., Mol. Immunol., 28: 489-98, 1991) 이 방법은 항체의 표출되지 않은 아미노산은 그대로 두고, 표출되어진 아미노산들만 인간의 아미노산으로 바꾸는 것이다. resurfacing은 기존의 항체와 비교하여 친화도는 매우 높게 유지되지만, 아직까지 치료용으로 개발된 사례는 존재하지 않는다.(Staelens S.등, Mol. Immunol., 43, 1243-57, 2006)

Rational방법의 마지막은 Superhumanization방법이다. 이 방법은 CDR-grafting과 달리 기존 항체의 CDRs의 canonical 구조와 유사한 인간 항체의 뼈대에 CDRs를 옮기는 방법으로 CDRs의 canonical구조를 유지시키는 것에 중점을 둔다.(Tan P., J. Immunol., 169: 1119-25, 2002) 기존의 논문에서 위의 방법으로 인간화 시킨 사례가 있으며, 친화도는 감소하였지만 그 기능은 유지되었다고 보고되었다.(Hwang W.등, Methods, 36: 35-42, 2005, Hu W.등, Vaccine., 25: 3210-4, 2007)

Rational방법의 다음으로는 Empirical방법이 있다. Empirical방법은 인간 framework library를 제작하고 이를 screening하여 적합한 뼈대를 찾는 방법으로써 FR(framework) libraries, Guided Selection, FR shuffling으로 나뉜다.

첫 번째로 FR libraries 방법은 CDR-grafting하기 위해 적합한 뼈대를 선택 한 후 특정 아미노산을 선택하고 library를 제작하여 다양한 뼈대를 만들고 후 screening을 통하여 적합한 것을 고르는 방법인데, 이 방법의 장점은 수많은 뼈대를 얻을 수 있으므로 CDR-grafting 방법에서 필요한 back mutation단계를 하지 않아도 된다는 것이다. (Rosok M등, J.Biol.Chem, 271: 22611-18, 1996)

두 번째로 Guided selection방법은 인간 VH 또는 VL library의 부분적인 epitope을 위해 주어진 비인간 항체의 VH 또는 VL domain과 항원에 결합하기 위해 선택되어진 인간 V domain과의 결합으로 구성된다.(Jespers L.등, Biotechnology., 12: 899-903, 1994) 즉, 하나의 domain은 항원 결합에 이용하기 위하여 library를 제작한 뒤 screening하고, 다른 domain은 인간 domain으로 항원결합능을 가진 domain을 보완해주는 역할을 한다.

세 번째로 Framework shuffling 방법은 특정 아미노산만을 제한하여 만든 Framework libraries방법과 다르게 전체 뼈대를 shuffling하여 libraries를 제작한 뒤 screening을 통하여 얻는 방법이다. (Dall'Acqua W.등, Methods., 36: 43-60, 2005)

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 인간화 항체 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 인간화 항체 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 인간화 항체 단백질을 발현, 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 안정한 뼈대에 CDR-grafting을 통한 인간화 항체 생성방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간화 된 핵산가수분해능을 가진 항체의 유효량을 동물, 바람직하게는 사람에게 투여함을 포함하여, 질환 또는 장애, 특히 암 및 기타 면역질환관련 질환을 예방, 탐지, 진단, 치료 또는 경감하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 중쇄가변영역(VH) 및 경쇄가변영역(VL)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 항원 결합부위를 포함하고 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 면역글로불린 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 면역글로불린은 면역글로불린 G 인 것이 바람직하고, 상기 면역글로불린 G는 인간화 된 3D8항체(humanized 3D8 이하 h3D8이라 칭함)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 VH는 서열번호 15에 기재된 서열로 구성된 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 서열번호 15에 기재된 서열로부터 유래되는 다양한 변이체도 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 VL은 서열번호 16에 기재된 서열로 구성된 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 서열번호 16에 기재된 서열로부터 유래되는 다양한 변이체도 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 단일 측쇄 항체(scFv) 절편은 링커를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 14에 기재된 서열로 구성된 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 서열번호 14에 기재된 서열로부터 유래되는 다양한 변이체도 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 VH를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 12에 기재된 서열로 구성된 유전자인 것이 바람직하나, 예를 들어 본 발명의 VH 영역에 대한 유전자 코드 디제너러시 등으로 인하여 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 서열 번호 12 이외에 기재된 서열도 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 VL를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 13에 기재된 서열로 구성된 유전자인 것이 바람직하나, 예를 들어 본 발명의 VL 영역에 대한 유전자 코드 디제너러시 등으로 인하여 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 서열 번호 13 이외에 기재된 서열도 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 scFv를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 11에 기재된 서열로 구성된 유전자인 것이 바람직하나, 예를 들어 본 발명의 scFv에 대한 유전자 코드 디제너러시 등으로 인하여 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 서열 번호 11 이외에 기재된 서열도 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 항 바이러스 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 기재된 "핵산"이란 세포 내의 핵산인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 있어서 기재된 " 핵산 가수분해능"이란 디옥시리보핵산 (Deoxyribonucleic acid: DNA) 및 리보핵산 (ribonucleic acid: RNA) 가닥의 인산에스테르결합 (3- and 5-phosphoester bonds)을 가수분해 반응으로 끊을 수 있는 능력을 의미한다.

본 발명에 있어서 기재된 "세포침투능"이란 단백질의 인위적인 변형, 조작 및 다른 분자와의 결합이 없이도, 단백질 자체로 동물세포막을 통과하여 세포 내로 들어갈 수 있는 능력을 의미한다.

본 발명에서 이용된 인간화 항-핵산 가수분해 항체는 H3D8 scFv (recombinant single chain variable fragment)으로서 이는 DNA에 결합하여 이를 분해하는 능력이 있다. 뿐만 아니라 단백질 스스로가 세포내로 침투하여 세포사멸을 유발하므로, 암 치료제 또는 항바이러스제로서 개발될 가능성이 있다.

본 발명의 항체는 세포 내의 핵산 사슬에 대해서 분해능을 보유한다.

본 발명의 약학 조성물에 의하여 예방 또는 치료 가능한 암은 예를 들면 유방암, 결장암, 뇌종양, 신경교종, 난소암, 자궁내막암, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활액암, 췌장암 및 육종암 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항바이러스제로서의 용도에 대해서는 본 발명자에 의하여 전에 특허출원하였던 대한민국특허 공개공보(10-2008-0026064)에 기재된 내용으로부터 잘 알 수 있다. 공개공보(10-2008-0026064)에 기재된 내용은 동물 세포에 침입하는 외래 유래의 핵산 사슬에 대해서 결합능과 그 분해능을 동시에 보유하고, 동물 세포 자신에 대해서는 세포독성이 없는 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징을 하는 동물 세포 감염 바이러스에 대한 항바이러스제를 의미하며, 이러한 기능을 가진 단백질의 일 예로서 본 발명자들이 분리 및 정제한 3D8 단백질에 대해 동물 세포 감염 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 조사한 결과, 공개공보(10-2008-0026064)에 기재된 실시예 1 내지 3에서 보듯이 동물 세포 감염 바이러스에 대해 항바이러스 효능이 있음을 확인할 수 있었고, 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다. 또한 공개공보(10-2008-0026064)의 실험예 2 및 실험예 5에서 보듯이 서열 특이성이 없이 핵산 사슬에 결합하므로 핵산분해활성이 요구되는 연구개발분야에 광범위하게 적용될 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 약학은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들 수 있다. 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같이 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체, 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌 [Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991]에 기재되어 있다.

또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

이러한 목적에 적합한 제형으로는 정제, 환제, 당제 (dragee), 산제, 캡슐제, 시럽제, 용액제, 겔제, 현탁제, 에멀젼, 마이크로에멀젼 등의 다양한 경구투여용 제제; 및 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입제 및 하이포스프레이 (hypospray)와 같은 분무제 등과 같은 비경구투여용 제제가 바람직하다. 주사 또는 주입용 제제의 경우에는 현탁액, 용액 또는 에멀젼 등의 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체 분자는 사용 전에 적절한 무균 액체롤 재조정하여 사용할 수 있는 건조된 형태로 제제화될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 위장관 내에서 분해되기 쉬운 항체 분자를 포함하므로, 상기 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의하여 투여되어야 하는 경우에는 분해로부터 항체를 보호하고, 항체를 방출한 후에는 위장관으로 흡수되는 약제를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 또한 본 발명의 항체를 상기에 기재된 바와 같은 다양한 방법으로 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 사람에게 투여되는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 암을 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 조성물 또는 약학적 제제는 단독 또는 다른 항암 치료제, 예를 들면 TRAIL 또는 기타 당분야에서 통상적으로 사용되는 화학적 항암 치료제 등과 함께 병용 처리될 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 유전자 치료법에 의하여 투여될 수도 있다. 이를 위해서는. 본 발명의 항체 분자가 이의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열로부터 발현되어 그 자리에서 (in situ) 조합될 수 있도록 당분야의 통상적인 유전자 치료법에 따라 환자에게 도입되어야 한다.

본 발명의 조성물 또는 약학적 제제의 유효성분으로서 상기 항체는 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.01 내지 50 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 예방 또는 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별, 약제조합, 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 인간화 항체는 사람 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 사람 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 의미한다.본 발명의 인간화 CDR 이식 항체는 사람 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 임의의 사람 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 V 영역을 암호화하는 cDNA를 작제하고, 사람 항체의 CH 및 H쇄 C영역(이하, CL로 표기한다)을 암호화하는 DNA를 갖는 동물세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간화 CDR 이식 항체 발현 벡터를 작제하고, 동물세포로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

사람 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 서열을 선택하는 방법으로는 사람 항체 유래의 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, 단백질 데이터 뱅크 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 사람 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 서열 또 는 사람 항체의 VH 및 VL의 FR 각 아그룹의 공통 아미노산 서열[참조: Sequences of proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991] 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체의 CH로는 사람 면역글로불린(이하, hIg로 표기한다)에 속하면 어떠한 것도 가능하지만, hIgG 부류의 것이 적절하고, 또한 hIgG 부류에 속하는 γ1, γ2, γ3, γ4라고 아부류의 어느 것이나 사용할 수 있다. 또한, 인간화 CDR 이식 항체의 CL로는 hIg에 속하면 어떤 것이라도 바람직하고, κ부류 또는 λ부류의 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 항체의 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 또는 삽입되고, 또한 핵산가수분해 능 및 암세포내 침투능력을 갖는 항체 또는 항체 단편도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된다는 것은, 동일 서열중 임의의 하나 또는 수개의 아미노산 서열의 위치에 있어서, 하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있다는 것을 의미하고, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 있을 수 있으며 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형을 불문한다. 천연형 아미노산 잔기로는 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소로이신, L-로이신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다.

하기에 서로 치환될 수 있는 아미노산 잔기의 바람직한 예를 기재한다. 동일 그룹에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환될 수 있다.

A 그룹: 로이신, 이소로이신, 노르로이신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 사이클로헥실알라닌

B 그룹: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산

C 그룹: 아스파라긴, 글루타민

D 그룹: 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산

E 그룹: 프롤린, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린

F 그룹: 세린, 트레오닌, 호모세린

G 그룹: 페닐알라닌, 티로신

본 발명의 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab') 2 , scFv, Diabody, dsFv, CDR을 함유하는 펩타이드 등을 들 수 있다.

Fab는 IgG를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단된다),H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디설파이드 결합(S-S 결합)으로 결합된 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Fab는 본 발명의 인간화 항체를 단백질 분해효소 파파인으로 처

리하여 수득할 수 있다. 또는 당해 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 Fab를 제조할 수 있다.

F(ab') 2 는 IgG를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단된다), Fab가 힌지영역의 S-S 결합을 개재하여 결합된 것보다 약간 큰 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 F(ab') 2 는 본 발명의 인간화 항체를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 S-S 결합시켜 작제할 수 있다.Fab'는 상기 F(ab') 2 의 힌지영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

scFv는 1개의 VH와 1개의 VL을 12잔기 이상의 적당한 펩타이드 링커(P)를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩타이드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 scFv는 본 발명의 인간화 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

Diabody는 항원 결합 특이성이 동일하거나 상이한 scFv가 이량체를 형성한 항체 단편이고, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 상이한 항원에 대한 2특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명의 Diabody는 예를 들면, 본 발명의 인간화 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, 3 내지 10잔기의 폴리펩타이드 링커를 갖는 scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 Diabody를 발현시켜 제조할 수 있다.

dsFv는 VH 및 VL 중 각각 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩타이드를 당해 시스테인 잔기간의 S-S 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 Reiter 등에 의해 기재된 방법[참조: Protein Engineering, 7, 697(1994)]에 따라서 항체의 입체구조 예측에 근거하여 선택할 수 있다.

본 발명의 dsFv는 본 발명의 인간화 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, dsFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

CDR을 함유하는 펩타이드는 VH 또는 VL의 CDR 1영역 이상을 포함하여 구성된다. 다수의 CDR을 함유하는 펩타이드는 직접 또는 적당한 펩타이드 링커를 개재하여 결합시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 CDR을 함유하는 펩타이드는 본 발명의 인간화 항체의 VH 및 VL의 CDR을 암호화하는 cDNA를 작제하고, 당해 cDNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다. 또한, CDR을 함유하는 펩타이드는 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카보닐법), tBoc법(T-부틸옥시카보닐법) 등의 화학합성법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 항체에 방사성 동위원소, 단백질 또는 약제 등을 화학적 또는 유전공학적으로 결합시킨 항체의 유도체를 포함한다.

본 발명의 항체 유도체는 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 H쇄 또는 L쇄의 N 말단측 또는 C 말단측, 항체 또는 항체 단편중 적당한 치환 그룹 또는 측쇄, 또한 항체 또는 항체 단편중 당쇄에 방사성 동위원소, 단백질 또는 약제 등을 화학적 방법[참조: 항체공학입문, 가네미쓰 오사무저, (주)구니토모쇼칸(1994)]에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.

또는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 DNA와, 목적하는 결합 단백질을 암호화하는 DNA를 연결시켜 발현 벡터에 삽입하고, 당해 발현 벡터를 숙주세포로 도입한다. 상기과 같은 유전공학적방법에 따라 제조할 수 있다.

방사성 동위원소로는 ¹³¹I, ¹²⁵ I 등을 들 수 있고, 예를 들면, 클로라민 T법 등에 의해 항체에 결합시킬 수 있다.

하기에 본 발명의 인간화 항체의 작제방법 등에 대하여 설명한다.

1. 인간화 항체의 작제

(1) 사람화 항체 발현용 벡터의 작제

사람화 항체 발현용 벡터란 사람 항체의 CH 및 CL을 암호화하는 DNA가 삽입된 동물세포용 발현 벡터이고, 동물세포용 발현 벡터에 사람 항체의 CH 및 CL을 암호화하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 작제할 수 있다.

사람 항체의 C 영역은 임의의 사람 항체의 CH 및 CL일 수 있고, 예를 들면, 사람 항체의 γ1 아부류의 CH 및 γ부류의 CL 등을 들 수 있다. 사람 항체의 CH 및 CL을 암호화하는 DNA로는 엑손과 인트론으로 이루어진 염색체 DNA를 사용할 수 있고, 또한 cDNA를 사용할 수 있다. 동물세포용 발현 벡터로는 사람 항체의 C 영역을 암호화하는 유전자를 삽입하여 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, pAGE107[참조: Cytotechnol., 3, 133(1990)], pAGE103[참조: J.Biochem., 101, 1307(1987)], pHSG274[참조: Gene, 27, 223(1984)], pKCR[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 1527(1981)], pSG1βd2-4[참조: Cytotechnol.,4,173 (1990)], pSE1UK1Sed1-3[참조: Cytotechnol., 13, 79(1993)] 등을 들 수 있다. 동물세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터와 인핸서로는 SV40의 초기 프로모터[참조: J. Biochem., 101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이 러스의 LTR[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)], 면역 글로불린 H쇄의 프로모터[참조: Cell, 41, 479(1985)]와 인핸서[참조: Cell, 33, 717(1983)] 등을 들 수 있다.

사람화 항체 발현용 벡터는 항체 H쇄 및 L쇄가 각각의 벡터상에 존재하는 타입 또는 동일 벡터상에 존재하는 타입[참조: 탄뎀형]의 어느 것도 사용할 수 있지만, 사람화 항체 발현 벡터의 작제 용이성, 동물세포로의 도입 용이성, 동물세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스 균형 등의 점에서 탄뎀형의 사람화 항체 발현용 벡터가 바람직하다[참조: J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)]. 탄뎀형의 사람화 항체 발현용 벡터로는 pKANTEX93(WO 제97/10354호), pEE18[참조:Hybridoma, 17, 559(1998)] 등을 들 수 있다.

작제된 사람화 항체 발현용 벡터는 인간화 CDR 이식 항체의 동물세포에서의 발현에 사용할 수 있다.

(2) 인간화 CDR 이식 항체의 V 영역을 암호화하는 cDNA의 작제

인간화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA는 하기와 같이 작제할 수 있다. 우선, 목적하는 사람 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR 아미노산 서열을 이식하는 사람 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 서열을 선택한다.

사람 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 서열로는 사람 항체 유래의 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, 단백질 데이터 뱅크 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 사람 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 서열, 사람 항체의 VH 및 VL의 FR 각 아그룹의 공통 아미노산 서열[참조: Sequences of proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services, 1991] 등을 들 수 있지만 이들 중에서도 충분한 활성을 갖는 인간화 CDR 이식 항체를 작제하기 위해서는 목적하는 사람 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.

이어서, 선택된 사람 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 서열에 목적하는 사람 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR 아미노산 서열을 이식하여 인간화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 설계한다. 설계된 아미노산 서열을 항체 유전자의 염기서열에 보이는 코돈의 사용빈도[참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991] 또는 목적하는 사람 이외의 동물 항체의 염기서열을 고려하여 염기서열에서 변환하고, 인간화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 설계한다. 설계한 염기 서열에 근거하여 100 내지 200 염기 전후의 길이로 이루어진 수개의 합성 DNA를 합성하고, 이들을 사용하여 PCR법을 실시한다. 이 경우, PCR에서의 반응효율 및 합성할 수 있는 DNA의 길이로부터 VH, VL 모두 4개 또는 6개 정도의 합성 DNA를 설계하는 것이 바람직하다. 또한, 양쪽 말단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한효소의 인식 서열을 도입하는 것으로, 본항 1의 (1)에서 작제된 사람화 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript II SK(-)(Stratagene사제) 등의 플라스미드 벡터에 클로닝하여 염기서열을 결정하고,

목적하는 인간화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 플라스미드를 수득한다.

(3) 인간화 CDR 이식 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 변형

인간화 CDR 이식 항체는 목적하는 사람 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 사람 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것 뿐만 아니라, 이의 항원 결합활성은 원래의 사람 이외의 동물 항체와 비교하여 저하되는 것으로 공지되어 있다[참조: BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)]. 이의 원인으로는 원래의 사람 이외의 동물 항체 의 VH 및 VL에서는 CDR 뿐만 아니라 FR 몇개의 아미노산 잔기가 직접적 또는 간접적으로 항원 결합활성에 관여하고 있고, 이들 아미노산 잔기가 CDR의 이식에 따라 사람 항체의 VH 및 VL의 FR이 상이한 아미노산 잔기로 변화되는 것으로 간주된다.

이러한 문제를 해결하기 위해 인간화 CDR 이식 항체에서는 사람 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 서열 중에서 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기 또는 CDR 아미노산 잔기와 상호작용하거나 항체의 입체구조를 유지하여 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하고, 이들을 원래의 사람 이외의 동물의 항체에서 발견되는 아미노산 잔기로 변형시켜 저하된 항원 결합활성을 상승시키고 있다[참조: BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)]. 인간화 CDR 이식 항체의 작제에 있어서는 이들 항원 결합활성에 관계하는 FR 아미노산 잔기를 어떻게 효율적으로 동정하느냐가 가장 중요한 점이고, 이를 위해서 X선 결정해석[참조: J. Mol. Biol., 112, 535(1977)] 또는 컴퓨터 모델링[참조: Protein Engineering, 7, 1501(1994)] 등에 의한 항체의 입체구조 작제 및 해석이 이루어지고 있다. 이들 항체의 입체구조 정보는 인간화 CDR 이식 항체의 작제에 많은 유익한 정보를 제공하지만, 한편으로는 모든 항체에 적응할 수 있는 인간화 CDR 이식 항체의 작제법은 아직 확립되어 있지 않으며 현재 상황으로는 각각의 항체에 관해서 수종류의 변형체를 작제하여 각각의 항원 결합활성과의 상관성을 검토하는 등의 각종 시행착오가 필요하다.

사람 항체의 VH 및 VL의 FR 아미노산 잔기의 변형은 변형용 합성 DNA를 사용하여 PCR법을 실시함으로써 달성할 수 있다. PCR후의 증폭 산물에 관해서 본항 1 의 (2)에 기재된 방법에 따라 염기서열을 결정하고, 목적하는 변형이 이루어졌는지를 확인한다.

(4) 인간화 CDR 이식 항체 발현벡터의 작제

본 발명에 기재된 상기의 사람화 항체 발현용 벡터의 사람 항체의 CH 및 CL을 암호화하는 DNA의 상류에 본발명의 인간화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 클로닝하고, 인간화 CDR 이식 항체발현 벡터를 작제할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 상기 (2) 및 (3)에서 인간화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL의 작제시 사용하는 합성 DNA 중에서 양쪽 말단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 도입하는 것으로써, 상기 (1)에 기재된 사람화 항체 발현용 벡터의 사람 항체 CH 및 CL을 암호화하는 DNA의 상류에 이들이 적절한 형으로 발현하도록 클로닝할 수 있다.

이하 본 발명을 간단하게 설명한다.

본 발명에서는 특정 염기서열에 상관없이 다양한 핵산 (DNA, RNA)을 가수분해 하는 능력을 지닌 핵산 가수분해 항체를 인간화 하여 그 기능이 그대로 유지되고, 암세포 내부로 스스로 침투할 수 있는 기능 또한 유지되어, 이러한 능력을 지 닌 핵산가수분해 인간화 항체가 암세포 내로 유입되면 암세포의 핵산 사슬, 즉 유전정보의 손상을 초래하여 결국 암세포에 세포 독성을 보여 항암효과를 보인다는 것이며, 이러한 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가진 인간화 항체를 이용한 암 치료용 또는 예방용으로 쓰기 위함이다. 또한 이와 같은 특성을 이용하여 항바이러스제로서의 용도 또한 당업자가 용이하게 본 발명으로부터 예측될 수 있으며, 이에 대해서도 본 발명에서 기재한다.

한편, 본 발명에 있어 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 인간화 항체 단백질은 바람직하게 면역글로불린 또는 그 단편 및/또는 유도체으로서 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 단편이 사용될 수 있다.

본 발명은 핵산에 특이적으로 결합하고, 이를 가수분해하는 인간화 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 마우스 유래 항-핵산항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 상보성 결정부위 (CDR)을 안정성이 높은 인간항체 중쇄 및 경쇄의 가변영역에 이식하여 구축된 인간화 항체이며, 더욱 상세하게는 다양한 핵산에 결합 능과 가수분해 능을 동시에 보유하고 세포 내부로 스스로 침투하는 능력을 가지며, 정상 세포에 비해 암세포에서 현저히 잘 들어가는 선택성을 가지고 암세포에 세포사멸을 유도하는 특징을 가지고 있으면서도 인체 내에서 낮은 면역반응을 나타내므로, 여러 가지 질환 치료, 특히 암의 치료용 또는 예방용 조성물 또는 항바이러스제로 사용될 수 있다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1) 안정한 뼈대에 CDR-grafting을 통한 인간화 항체 구축방법

앞서 기술했듯이 인간화 방법 중 CDR-grafting방법은 항체를 인간화 시킬 경우 가장 유사한 뼈대를 갖는 인간 항체에 CDR을 옮김으로써 CDR의 구조를 변화시키지 않게 하여 그 기능을 유지하게 하는데, 이 때에 가장 유사한 뼈대는 동일한 항체 뼈대의 subtype을 의미한다. 인간 항체의 variable region은 아미노산 서열에 따라서 heavy chain 7가지 (VH1,VH2,VH3,VH4,VH5,VH6,VH7), light chain 17가지(κ1,κ2,κ3,κ4,κ5,κ6,λ1,λ2,λ3,λ4,λ5,λ6,λ7,λ8,λ9,λ10,λ11)로 나뉜다. 이렇게 나뉜 각각의 subtype은 또 다시 구조에 따라 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 구조적 subtype으로 나뉜다. 아미노산 서열이 서로 다르기 때문에 생물리학적 구조가 다르고 그에 따라 안정성도 서로 다르게 된다. 일반적인 CDR-grafting방법을 이용하면 상동성이 매우 높은 인간 뼈대에 옮기는데, 이는 동일한 subtype으로 옮긴다는 것을 의미한다. 이 때 생기는 단점으로는 기존의 항체의 subtype이 안정성이 낮다면, 옮겨지는 인간화 항체의 subtype이 같으므로 안정성이 낮은 채로 유지 된다는 것이다.

본 발명은 항체의 CDR-grafting방법을 이용하지만 뼈대의 상동성이 매우 높은 인간 뼈대에 옮기는 것이 아닌, 더 안정한 subtype의 뼈대에 옮김으로써 항체의 안정성을 높이고 CDRs의 구조에 영향을 주는 아미노산의 상동성만 유지시켜주고 뼈대의 나머지 아미노산의 상동성은 어느 정도 배제시켜 항체의 기능과 친화도를 유 지할 수 있는 효과를 얻을 수 있다. 기존의 마우스 항체인 m3D8 scFv(mouse 3D8, 이하 m3D8이라 칭함)는 VH1-Vκ8 type을 갖고 있는데, 옮겨지는 인간항체 뼈대는 가장 안정하다고 알려진 VH3-Vκ3 type이다.

기존 항체의 VL single domain은 Vκ8 type을 갖는다. Vκ8 type은 쥐 항체에서는 존재할 수 있으나, 인간항체에서는 존재하지 않는 subtype이다. 그러므로 다른 subtype의 항체로 옮겨져야 하는데, Igblast (URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 인간항체 중 상동성이 높은 Vκ4와 Vκ3 type을 찾을 수 있었고, 안정성이 높은 Vk3 type을 선택하였다. 선택되어진 인간항체인 HW20 VL single domain은 위에 서 알 수 있듯이 m3D8 VL single domain과 가장 높은 상동성을 갖는 항체는 아니다. 그러나 본 발명은 VL single domain의 경우 가장 높은 상동성을 갖는 인간 항체가 아닌 항체의 안정성에 관계하고 CDRs의 구조에 영향을 주는 아미노산 잔기를 유지 또는 보완하고 뼈대의 나머지 아미노산의 상동성은 어느 정도 배제시켰다.

인간화를 시킬 시에 먼저 항체의 subtype을 결정하는 아미노산 잔기인 charged cluster, central core, upper core, lower core는 m3D8 scFv의 경우 Vκ8 type이므로 Vκ3 type으로 바꾸어 주어야 한다. 그리고 항체의 subtype을 결정하지 않지만 안정성에 영향을 주는 VH/VL interface는 항체의 표면이 아닌 내부에 존재하는 지역으로 대부분의 항체가 동일한 아미노산 잔기로 이루어져 있으므로 기존의 항체와 인간항체의 아미노산 잔기가 동일하여 인간화를 시킬 시에 큰 영향을 끼치지 않는다. charged cluster는 항체의 안정화에 크게 기여하는데 Vk3 type이 가장 안정성이 높은 잔기로 구성되어 있다. 항체의 Upper core와 Lower core를 나누어 주는 역할을 하는 Central core의 경우 disulfide bond와 6번, 43번잔기가 완벽히 보존되어 있으므로 그대로 유지하였다. Upper core의 경우 항체의 CDRs구조에 영향을 끼치므로 아미노산 잔기가 변하는 것을 최소화해야 한다.(Stefan E.등, Methods., 34:184-99, 2004) 인간화 과정에서 두 개의 아미노산이 대체되었지만 유사한 성질을 갖는 아미노산이고 CDRs구조를 예측할 수 있는 bioinf site(http://www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html)를 통하여 확인한 결과 CDRs의 구조가 변함없음을 확인하였다.

Charged cluster

Upper core

Lower core

Central core

45

53

77

97

99

100

2

4

41

80

82

89

108

19

74

78

93

104

6

23

43

106

Vκ3

Q

R

E

D

I

L

G

F

Q

A

I

F

I

Y

Q

C

W

C

m3D8 VL

Q

K

R

Q

E

D

L

M

L

G

F

Q

V

F

I

Y

Q

C

W

C

h3D8 VL

Q

R

E

D

I

L

G

F

Q

A

I

F

I

Y

Q

C

W

C

상기 표는 기존항체와 인간항체의 subtype을 결정하는 아미노산 잔기 변화비교를 나타낸 표이다.

다음으로 m3D8의 VH single domain은 VH1 type을 갖는데, 옮겨질 인간항체는 HW20으로써 subtype은 가장 안정한 VH3 type이다. 인간화를 시키는 과정에서 유의해야할 아미노산 잔기들은 VL single domain을 인간화 시킬 때와 동일하게 진행하였다. 항체의 안정화에 크게 기여하는 charged cluster는 VH3 type이 가장 안정성이 높은 잔기로 구성되어 있다. 항체의 Upper core와 Lower core를 나누어 주는 역할을 하는 Central core의 경우 disulfide bond와 43번잔기가 완벽히 보존되어 있고 6번 잔기는 VH3 type에서 glutamic acid와 glutamate모두 올 수 있으나, glutamic acid일때 더 안정하다. Upper core의 경우 항체의 CDRs구조에 영향을 끼치므로 아미노산 잔기가 변하는 것을 최소화해야 한다. 인간화 과정에서 세 개의 아미노산이 대체되었지만 대체된 아미노산잔기가 영향을 끼치는 HCDR2는 기존 항체와 인간화 항체를 modelling분석을 해본 결과 가수분해능과 결합능에 영향력을 크게 끼치지 않을 것으로 판단되었다.

Charged cluster

Upper core

Lower core

Central core

45

53

77

97

99

100

2

4

25

80

82

89

108

19

74

78

93

104

6

23

43

106

VH3

R

E

R

E

D

V

L

A

I

R

L

R

L

V

F

M

Y

Q/E

C

W

C

m3D8 VH

K

E

K

T

E

D

V

L

A

L

S

A

R

V

F

A

L

Y

Q

C

W

C

h3D8 VH

R

E

R

E

D

V

L

I

R

L

R

L

V

F

M

Y

E

C

W

C

실시예 2) 박테리아 발현벡터에 H3D8 scFv (단일사슬 가변영역) 유전자 클로닝

m3D8 scFv를 인간화 시키기 위해서 우선 3개의 단편을 제작하였다. 인간항체인 HW20 유전자를 주형으로 삼고, 첫 번째 단편은 정방향 프라이머로 서열번호1을 역방향 프라이머로 서열번호2를 사용하여 PCR방법으로 제작하였다. 두 번째 단편은 정방향 프라이머로 서열번호3을 역방향 프라이머로 서열번호4를 사용하여 PCR방법으로 제작하였다. 세 번째 단편은 정방향 프라이머로 서열번호5를 역방향 프라이머로 서열번호6을 사용하여 PCR방법으로 제작하였다. PCR은 pfu중합효소(intron, 한국)를 이용하여 수행하였으며 94℃에서 1분, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 25번 반복하였다. 각각 제작된 단편들은 0.7% 아가로스(promega, 미국) 젤에서 전기영동하여 아가로스젤 정제 키트(intorn, 한국)를 이용하여 정제하였다. 정제 된 세 개의 단편 중 두 번째와 세 번째 단편을 10μM씩 동량으로 섞고, 정방향 프라이머는 서열번호 3을 역방향 프라이머는 서열번호 8을 사용하여 94℃에서 1분, 55℃에서 20초, 72℃에서 40초의 반응을 25번 반복하여 overlapping PCR을 수행하였다. 얻어진 두 번째와 세 번째 단편을 합한 네 번째 단편을 0.7%아가로스 젤에서 전기영동하여 아가로스젤 정제 키트(Intron,한국)를 이용하여 정제하였다. 정제 된 네 번째 단편을 이미 정제 된 첫 번째 단편과 10μM씩 동량으로 섞고, 정방향 프라이머는 서열번호7을 역방향 프라이머는 서열번호8를 사용하여 94℃에서 1분, 55℃에서 20초, 72℃에서 50초의 반응을 25번 반복하여 overlapping PCR을 수행하였다. 얻어진 첫 번째와 네 번째 단편을 합한 다섯 번째 단편 즉, 최종 단편을 0.7%아가로스 젤에서 전기영동하여 아가로스젤 정제 키트(Intron,한국)를 이용하여 정제하였다. 다음으로 정제 된 최종 단편을 제한효소 NheⅠ과 BamHⅠ(New England Biolab, 미국)으로 4시간동안 반응시켜 절단하고, 최종단편과 연결할 벡터인 pIg20벡터(Stollar BD.,Methods., 11(1): 12-19, 1997) 역시 NheⅠ과 BamHⅠ(New England Biolab, 미국)으로 4시간 동안 반응시켜 절단하였다. 그 다음 제한효소 처리를 한 최종 단편과 연결할 벡터를 0.7%아가로스젤에서 전기영동하여 아가로스젤 정제 키트를 이용하여 정제하였고, T4 DNA 연결효소(Solgent,한국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 연결하여 m3D8 scFv의 인간화 유전자 pIg20 - h3D8 scFv를 제조하였다.

실시예 3) 박테리아 발현벡터에 h3D8 VH 유전자 클로닝

h3D8 VH single domain을 만들기 위해서, h3D8 scFv를 주형으로 삼고 정방향 프라이머로 서열번호7을 역방향 프라이머로 서열번호10을 사용하여 PCR방법으로 제작하였다. PCR은 pfu중합효소를 이용하여 수행하였으며 94℃에서 1분, 55℃에서 20초, 72℃에서 30초의 반응을 25번 반복하였다. 각각 제작된 단편들은 0.7%아가로스 젤에서 전기영동하여 아가로스젤 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제 된 단편을 제한효소 NheⅠ과 BamHⅠ(New England Biolab, 미국)으로 4시간동안 반응시켜 절단하고, 단편과 연결할 벡터인 pIg20벡터 역시 NheⅠ과 BamHⅠ(New England Biolab, 미국)으로 4시간 동안 반응시켜 절단하였다. 그 다음 제한효소 처리를 한 최종 단편과 연결할 벡터를 0.7%아가로스젤에서 전기영동하여 아가로스젤 정제 키트(Intron,한국)를 이용하여 정제하였고, T4 DNA 연결효소(Solgent,한국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 연결하여 pIg20- h3D8 VH single domain 유전자를 제조하였다.

실시예 4) 박테리아 발현벡터에 h3D8 VL 유전자 클로닝

h3D8 VL single domain을 만들기 위해서, h3D8 scFv를 주형으로 삼고 정방향 프라이머로 서열번호9를 역방향 프라이머로 서열번호8을 사용하여 PCR방법으로 제작하였다. PCR은 pfu중합효소를 이용하여 수행하였으며 94℃에서 1분, 55℃에서 20초, 72℃에서 30초의 반응을 25번 반복하였다. 각각 제작된 단편들은 0.7%아가로스 젤에서 전기영동하여 아가로스젤 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제 된 단편을 제한효소 NheⅠ과 BamHⅠ(New England Biolab, 미국)으로 4시간동안 반응시켜 절단하고, 단편과 연결할 벡터인 pIg20벡터 역시 NheⅠ과 BamHⅠ(New England Biolab, 미국)으로 4시간 동안 반응시켜 절단하였다. 그 다음 제한효소 처리를 한 최종 단편과 연결할 벡터를 0.7%아가로스젤에서 전기영동하여 아가로스젤 정제 키트(Intron,한국)를 이용하여 정제하였고, T4 DNA 연결효소(Solgent, 한국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 연결하여 pIg20 - h3D8 VL single domain 유전자를 제조하였다.

서열번호	방향	염기서열
1	F	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCA
2	R	CGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGGGTTTTCCTGGAATTGTCTCTGGAGATGGTGAACCGGCCTTTCACGGAGTCCGCATAGTAATTACCATCATTGTAAGGATTGATGGCTGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCC
3	F	GAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGCCTATAAAAGGGGATATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTC
4	R	ATAGATGAGGAGCCTGGGAGCCTGGCCAGGTTTCTGCTGGTACCAAGCCAAGTAGTTCTTTCGGGTTCTACTGTTGAACAGACTCTGACTGGATTTGCAGGAGAGGGTGGCTCTTTCCCC
5	F	CAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGC
6	R	AGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTAAGCAATCTTATTATCACATGTATACGTTCGGCCAAGGGACAAAGGTGGAAATCAAACGT
7	F	TCCGCTAGCGAGGTGCAGCTGGTG
8	R	CGTGGATCCACGTTTGATTTCCACCTTTGTCCC
9	F	TCCGCTAGCGATATTGTATTGACCCAGTCTCCAGC
10	R	CGTGGATCCTGAAGAAACGGTGACCGTGGTCCC

상기 표는 유전자 클로닝에 사용된 프라이머를 나타낸다.

서열번호	단편	핵산염기서열
11	h3D8 scFv	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCCATCAATCCTTACAATGATGGTAATTACTATGCGGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGCCTATAAAAGGGGATATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTTTCTTCAGGCTCTACTTCCGGTAGCGGCAAACCCGGGAGTGGTGAAGGTAGCACTAAAGGTGATATTGTATTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGTTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTAAGCAATCTTATTATCACATGTATACGTTCGGCCAAGGGACAAAGGTGGAAATCAAACGT
12	VH	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCCATCAATCCTTACAATGATGGTAATTACTATGCGGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGCCTATAAAAGGGGATATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTTTCTTCA
13	VL	GATATTGTATTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGTTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTAAGCAATCTTATTATCACATGTATACGTTCGGCCAAGGGACAAAGGTGGAAATCAAACGT

상기 표는 h3D8 scFvD8 scFv, VH, VL single domain의 핵산염기서열을 나타낸다.

서열번호	단편	아미노산 서열
14	h3D8 scFv	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWVSAINPYNDGNYYADSVKGRFTISRDNSRKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAYKRGYAMDYWGQGTTVTVSS GSTSGSGKPGSGEGSTKG DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCKQSYYHMYTFGQGTKVEIKR
15	VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWVSAINPYNDGNYYADSVKGRFTISRDNSRKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAYKRGYAMDYWGQGTTVTVSS
16	VL	DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCKQSYYHMYTFGQGTKVEIKR

상기 표는 h3D8 scFv, VH, VL single domain의 아미노산 서열을 나타낸다.

실시예 5) m3D8 scFv 인간화 항체 h3D8 scFv, h3D8 VH 및 h3D8 VL 단백질 발현 및 정제

구축된 pIg20-h3D8 scFv와 pIg20-h3D8 VH, pIg20-h3D8 VL 을 E.coli BL21(DE3)pLysE (Novagen, 미국)에 형질전환 시키고 Ampicillin(100㎍/ml)을 포함한 1L Luria-Bertani 배지에 37℃에서 흡광도 A600값이 0.8에 이르기까지 배양하였다. 단백질 발현을 위하여 0.25mM Isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)(Calbiochem, 미국)를 넣어주고 25℃에서 20시간을 추가로 배양한 후 단백질이 발현된 세포를 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액을 IgG-Sepharose column(GE healthcare,미국)에 통과시키고 (1 ml/min), 인산완충용액 (PBS, pH 7.4)와 암모늄 아세테이트 (ammonium acetate, pH 5.0)로 세척한 후, 0.1 M 아세트산 (pH 3.4)으로 단백질을 용리 (elution)하였다.

도 6은 마우스 유래 m3D8 scFv을 인간화 시킨 h3D8 scFv와 h3D8 VH, h3D8 VL 을 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 15% SDS-PAGE를 통해 분석한 것이다. h3D8 scFv와 VH, VL은 90%이상의 순도로 정제되었다. h3D8 scFv-SPA는 38kDa, VH single domain-SPA는 23.4kDa VL single domain-SPA는 23.2kDa의 크기에서 관찰됨을 알 수 있었다.

단백질의 농도는 280nm파장을 이용한 흡광도를 측정하고, 농도결정은 아미노산 서열에 따라서 결정되는 Extinction coefficient상수를 이용해 결정하였다. h3D8 scFv-1.522, VH single domain-1.468, VL single domain-1.057

실시예 6) 아가로스 젤을 이용한 h3D8의 DNA가수분해 활성 검증

아가로스 젤 DNA가수분해 검증실험은 아가로스 젤을 통하여 DNA와 단백질을 반응시키고 반응시킨 시료를 아가로스 젤에 전기 영동함으로 DNA의 band가 나타나는 것을 통하여 가수분해를 검증하는 실험이다. DNA의 band가 나타나지 않음으로써 DNA 가수분해능을 검증할 수 있다. (Kim YR.등, The Journal of Biological Chemistry, 281:1 5287-15295,2006)

plasmid purification kit(intron, 한국)를 이용하여 정제된 pUC19을 기질로 사용하였다. DNA 가수분해 실험은 h3D8 scFv 단백질 0.8μM, m3D8 scFv 단백질 0.8μM, h3D8 VH 단백질 5μM, h3D8 VL단백질 5μM을 pUC19 plsmid 40ng/ml과 함께 TBS반응 버퍼(50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, pH7.4)에 넣어 반응 시킨다. 이때 TBS버퍼에는 2mM MgCl₂를 넣어주고 또 다른 버퍼에는 50mM EDTA(Sigma-aldrich, 미국)를 넣어주어 대조군으로 사용한다. 이는 DNA 가수분해능을 가진 대부분의 DNase들은 금속 이온과의 결합을 통하여 DNA를 가수분해 하기 때문이다. 이러한 원리로 metal-chealating 기능을 갖는 EDTA를 넣음으로써 DNA가수분해를 막아 대조군으로 사용할 수 있다. 이렇게 제조한 시료를 37℃에서 반응시키고 1시간 후 결과를 관찰한다.

도 7은 h3D8 scFv, h3D8 VH, h3D8 VL의 DNA가수분해능을 0.7% 아가로스 젤을 Ethidium bromide(Biobasic, 미국)에 염색시킨 것을 통하여 분석한 것으로써 1번 lane은 M3D8의 가수분해능 을 알아 본 Mg²⁺을 함유한 시료, 2번 lane은 대조군인 EDTA를 함유한 시료이다. 3번 lane은 Marker이고, 4번 lane은 단백질을 넣지 않고 버퍼만 있는 대조군, 5번 lane은 H3D8의 가수분해능 을 알아 본 Mg²⁺을 함유한 시료, 6번 lane은 대조군인 EDTA를 함유한 시료이다. 7번 lane은 VH의 가수분해능 을 알아 본 Mg²⁺을 함유한 시료, 8번 lane은 대조군인 EDTA를 함유한 시료이다. 9번 lane은 VL의 가수분해능 을 알아 본 Mg²⁺을 함유한 시료, 10번 lane은 대조군인 EDTA를 함유한 시료이다. 실험결과를 통하여 h3D8 scFv와 h3D8 VH, h3D8 VL lane에서 Mg²⁺를 함유시킨 시료의 lane에서 DNA band가 없거나 끌리는 것을 보아 모두 DNA 가수분해능을 갖고 있는 것으로 확인 되었다.

실시예 7) in situ gel DNA 가수분해 활성 검증

아가로스 젤 DNA가수분해 검증실험은 아가로스 젤을 통하여 DNA의 band가 나타나는 것을 통하여 가수분해를 검증하는 실험이다. 하지만 이는 다른 시료의 오염에 따라서 DNA가 잘렸을 경우 그것을 확인할 수 없다. 하지만 In situ gel DNA가수분해 검증실험은 DNA를 함유한 SDS-PAGE에 단백질을 loading한 후 ETBR염색을 통하여 DNA가수분해 능을 갖는 단백질 부분은 DNA가 가수분해 되어 염색이 되지 않고, 가수분해 능을 갖지 않는 단백질 부분은 DNA가 염색되어 보임으로써, 단백질의 가수분해능을 검증하는 방법이다. (Andrey G.등, Immunology Letter, 76:163-167,2001; Michael A.등, International Immunology, 20:1031-1040, 2008)

15% SDS-PAGE 제조 시 20㎍/ml의 DNA를 함유시킨다. 이 때 DNA는 plasmid purification kit를 이용하여 정제한 이중가닥 DNA를 사용하는데, 여러 다른 길이의 DNA가 섞여도 무방하다. 그 후 SDS-PAGE well에 적정량의 단백질을 넣고 100V의 전압을 걸어 전기영동시킨다. 전기영동이 끝난 후 SDS gel을 7M UREA(Biobasic, 미국)에 담아 상온에서 1시간동안 shaking incubator를 이용해 반응시켜 SDS를 제거한다. 그 후 10mM Tris(Biobasic, 미국), 10mM MgCl₂(Biobasic, 미국), 50mM NaCl(Daejung, 한국) pH7.4, TritonX-100(Sigma-Aldrich, 미국) 용액에 담아 상온에서 20분동안 shaking incubator를 이용해 SDS를 추가적으로 제거한다. 위 과정을 3번 반복한다. 그 후, 10mM Tris, 10mM MgCl₂, 50mM NaCl pH7.4 용액에 담아 상온에서 20분동안 shaking incubator를 이용해 SDS를 또다시 추가적으로 제거한다. 위의 과정이 끝나면 gel에서 SDS가 완전히 제거 되므로 gel이 함유하고 있는 단백질들이 gel상에서 refolding이 된다. 단백질이 refolding에 된 gel은 DNA를 함유하고 있는데, 단백질의 가수분해능을 활성화하기 위하여, 10mM Tris, 10mM MgCl₂, 50mM NaCl pH7.4 용액에 담아 37℃ incubator에서 7시간동안 반응시킨다.

도 8은 in situ gel을 이용한 가수분해능 단백질을 검증한 것으로써 EtBr염색을 통하여 DNA의 유무를 확인하는데 DNA가 가수분해 된 부분은 EtBr 염색이 되지 않는다. 이는 EtBr로 확인 뒤 gel을 DDW에 20분 담그어 두어 EtBr을 제거한 후 coomassie blue염색약을 이용 gel을 염색시켜 DNA가 가수분해 된 부분과 단백질 부분이 일치하는지 알아보아 확인할 수 있다. 실험결과 EtBr 염색이 되지 않은 부분과 coomassie blue(Biobasic, 미국)로 염색된 h3D8 scFv, h3D8 VH, h3D8 VL이 일치함으로써 DNA 가수분해능을 갖는다는 것을 확인하였다. 대조군으로 사용 된 HW20 scFv항체는 h3D8과 Framework는 같지만, CDRs이 다른 항체(HW1의 CDR을 갖음, 대한민국특허 제10-0847010호)이므로 핵산결합 및 가수분해능이 없는 항체이므로 실험결과에서 핵산을 가수분해 시키지 않았다.

실시예 8) h3D8 scFv 및 h3D8 VH, h3D8 VL의 DNA에 대한 정량적인 결합력 측정

정제한 VH, VL, 및 scFv 단백질의 DNA에 대한 정량적인 결합력을 Biacore2000 SPR(Surface Plasmon Resonance)(GE healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다. 3'-말단에 비오틴 (biotin)이 표지된 40 mer 길이의 합성된 이중가닥 DNA 단편을 스트랩타비딘이 코팅된 센서칩 (streptavidin-coated sensor chip)(GE healthcare,미국)에 고정시킨 후, HES 완충용액 (10 mM HEPES, pH7.4 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 scFv (3 ~ 200 nM), VH (0.15 ~ 10 μM) 및 VL (0.15 ~ 80 μM) 단백질을 3분 동안 90 ㎕/min 속도로 흘려주고, 25nM NaCl / 50mM NaOH를 3분 동안 30 ㎕/min 속도로 흘려줌으로써 DNA에 결합된 단백질 해리를 유도하였다. BIA evaluation ver.3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를 운동속도 상수 (k_on 및 k_off)와 평형해리상수 (K_D)로 얻었다. 도5는 정량적인 결합력을 측정한 것에 대한 결과로서 기존 논문(Kim YR.등, The Journal of Biological Chemistry, 281:1 5287-15295,2006)에서 얻은 실험결과와 비교하였는데, 기존의 마우스 항체와 유사한 결합력을 갖는 것을 알 수 있었다.

	K_on	K_off	K_D
m3D8 scFv	4.32X10⁵	7.13X10^-3	1.65X10^-8
h3D8 scFv	3.0X10⁵	2.78X10^-3	9.25X10^-8
h3D8 VH	3.32X10³	1.07X10^-2	3.24X10^-6
h3D8 VL	4.48X10²	9.47X10^-3	2.11X10^-5

표 6은 Biacore 2000 SPR을 이용하여 측정한 m3D8 scFv, VH, VL과 h3D8 scFv, VH, VL의 운동속도 상수와 평형해리상수를 나타낸 것이다.

실시예 9) GdnHCl농도에 따른 h3D8 scFv와 m3D8 scFv의 안정성 변화

h3D8 scFv의 m3D8 scFv에 대한 안정성 향상 여부를 형광 분광광도계(fluorescence spectrometer, JASCO사, 일본)를 이용하여 측정하였다. H3D8scFv와 M3D8scFv를 준비하고, 준비된 단백질을 각각 0 M부터 6M까지 0.3 M 단위로 하여 구아니딘HCl (guanidine HCl)에 해리하여 최종 10 ㎍/㎖의 단백질 농도로 상온에서 24시간 반응시킨 후, 자극파장(excitation wave length) 280 nm, 방출파장 (emission wave length) 290 nm ~ 400 nm, 측정속도는 250 nm/분으로 하여 3회 반복 측정하였다. 이렇게 측정된 값 중 각 구아니딘HCl 농도별로 가장 높은 값을 가질 때의 파장을 정상화 (normalization)하여 상대적인 최대 파장 (normalized λ_max)을 도식화하여 도 6에 나타내었다.

h3D8은 GdnHCl 변성 중간 값이 약 2.1 M(단백질 변성 50%를 일으키는 GdnHCl농도), m3D8은 약 1.8 M이다. 알려진 문헌 (Ewert S 등, Biochemistry, 42:1517-1528, 2003)에 의하면 구아니딘HCl과 같은 단백질 변성시료에 의해 단백질이 변성될수록 상대적인 최대파장은 커진다. 따라서, 이를 토대로 도 6을 분석하였을 때, m3D8에 비하여, h3D8은 그 안정성이 상대적으로 높음을 알 수 있다.

실시예 10) h3D8 scFv 스스로의 세포 내 유입 여부 확인

h3D8 scFv를 세포에 처리했을 때 스스로 세포내로 들어가는 것을 공초점 현미경법 (confocal microscopy)을 통하여 분석하였다. 공초점 현미경법에 있어서, 인간 자궁경부암세포주인 HeLa 세포를 멸균된 커버 글라스를 넣은 24-웰 플레이트 웰에 넣고 [2×10⁵세포/웰 (well)] 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, TOM배지로 1번 세척 후, TOM배지로 30분간 정치한 후 웰마다 h3D8을 10 uM 처리하고 4시간 배양하였다. 배양 후 세포내로 유입된 h3D8 scFv 단백질을 현미경으로 관찰하기 위하여 면역형광염색을 행하였다. 즉 각 웰에서 배지를 제거한 후, PBS 완충액으로 세포를 3 회 세척하고 고정(Fixation)용액 4% 파라포름알데히드 200 ul를 넣고 실온에서 10분 동안 정치하였다. PBS 완충액으로 2 회 세척 후, 0.1% 사포닌과 2% BSA가 포함된 PBS 세포투과 용액 200 ul 넣고 실온에서 10 분 동안 정치하였다. mouse 항-히스티딘 항체가 포함된 토끼 혈청 200 ul (세포투과 용액에 1:500 으로 희석)를 넣어 실온에서 60분 동안 반응시키고 PBS 완충액으로 3 회 세척하였다. 이에 형광물질 FITC가 공유결합된 anti-mouse 항체 (세포투과 용액에 1:1000으로 희석) 200ul 넣어 실온에서 30분 동안 반응시키고 PBS 완충액으로 3회 세척 후 준비한 슬라이드 글라스에 핵을 청색으로 염색시키는 시약인 DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole)가 포함된 고정용액 (Invitrogen 사)을 20 ug/ml의 농도로 첨가한 후 상온에서 20분간 정치하였다. 새 슬라이드글라스를 준비하고 그 위에 Mounting 용액(VECTOR사) 한 방울을 떨어뜨려 커버글라스를 그 위에 얹었다. 그 주변을 고정액으로 봉합하여 공초점 현미경 (confocal microscope)으로 세포내의 h3D8 scFv 단백질 (녹색형광)를 관찰하였다. h3D8 scFv를 5 uM 농도로 4시간 처리했을 때 HeLa 세포의 세포질로 스스로 잘 유입됨이 확인된 것을 도7에 나타내었다. 유입된 h3D8 scFv가 세포질에 위치함을 공초점 현미경법의 Z-section을 통해 재확인하였다.

실시예 11) HeLa 세포주에서의 h3D8 scFv에 의한 세포독성 확인

HeLa 세포에 h3D8 scFv를 처리했을 때 세포사멸이 일어나는지 알아보기 위하여 96-well plate에 cell의 농도를 한 well당 5x10³이 되도록 DMEM((Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 웰진, 한국) low glucose, with 1000mg/L D-glucose, L-glutamine, 110mg/L sodium pyruvate)에서 하루정도 키우고, TOM(Transfection Optimized Medium, 웰진, 한국)배지로 1번 세척 후, TOM배지로 30분간 정치한 후 h3D8 scFv를 5,10μM 농도로 각각 처리한다. 2시간 후 다시 DMEM으로 배지를 교체하고 48 시간 후, MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 단백질 농도가 증가 할수록 세포독성이 증가하며, HeLa세포에 세포독성이 h3D8 scFv농도에 비례하여 나타남을 확인한 것을 도8과 도9에 나타내었다.

도 1은 본 발명의 인간화 항체인 h3D8 scFv (humanized 3D8)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로 VH 및 VL의 Frameworks, CDRs부분을 나타내었다. VH 및 VL의 Linker 부분도 나타내었다.

도 2는 박테리아에서 발현, 정제한 본 발명의 h3D8 scFv, h3D8 VH 및 h3D8 VL 단백질의 순도를 보여주는 위한 환원성, 비환원성 조건에서의 SDS-PAGE 결과이다. M은 size marker를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 h3D8 scFv, h3D8 VH 및 h3D8 VL 단백질의 이중가닥 DNA 분해활성이 Mg²⁺이온에 의존적임을 나타내는 아가로스겔 전기영동 결과이다. M은 size marker를 나타내고, Bu은 버퍼 control을 나타낸다. Mg은 Mg²⁺을 첨가한 것이고, E은 EDTA을 첨가한 샘플을 의미한다.

도 4는 본 발명의 h3D8 scFv, h3D8 VH 및 h3D8 VL 단백질의 dsDNA 분해활성이 이들 단백질 고유의 활성임을 보여주는 인 시추 하이드로라이시스 (in situ hydrolysis) 분석 결과이다. M은 size marker를 나타낸다.

도 5는 본 발명의 h3D8 scFv, h3D8 VH, 및 h3D8 VL이 여러 농도에서 이중가닥 핵산 (ds DNA) 에 대한 친화도를 SPR로 분석한 결과이다. (A) m3D8 scFv, (B) h3D8 scFv, (C) h3D8 VH, (D) h3D8 VL.

도 6은 h3D8 scFv와 m3D8 scFv의 열안정성을 GdnHCl농도에 따른 Trp fluorescence의 방출 (emission) 스펙트럼의 최고 intensity를 보여주는 파장 (λ max)값을 측정하여, 상대적으로 분석한 결과이다.

도 7은 h3D8 scFv 단백질을 (히스티딘이 융합된 단백질) TOM배지에서 HeLa 세포주에 처리 후, 단백질이 세포 내로 유입된 정도를 항-히스티딘 단백질 항체로 염색한 후, 공초점 형광현미경법 (confocal microscopy)으로 확인한 결과이다.

도 8은 h3D8 scFv 단백질을 TOM 배지에서 여러농도로 HeLa 세포주에 처리 후 MTT 시약을 이용하여 세포독성을 측정한 결과이다.

도 9는 h3D8 scFv 단백질을 TOM 배지에서 여러농도로 HeLa 세포주에 처리 후 세포사멸이 유도되는 것을 보여준다.

<110> Ajou University Industry Cooperation Foundation <120> Humanized antibody with nucleic nucleic acid-hydrolyzing activity and tumor cell-penetrating ability and uses thereof <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt ccgccaggct 120 cca 123 <210> 2 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 cgcacagtaa tacacagccg tgtcctcggc tctcaggctg ttcatttgca gatacagggt 60 tttcctggaa ttgtctctgg agatggtgaa ccggcctttc acggagtccg catagtaatt 120 accatcattg taaggattga tggctgagac ccactccagc cccttccc 168 <210> 3 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga ggggcctata aaaggggata tgctatggac 60 tactggggcc aagggaccac ggtc 84 <210> 4 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 atagatgagg agcctgggag cctggccagg tttctgctgg taccaagcca agtagttctt 60 tcgggttcta ctgttgaaca gactctgact ggatttgcag gagagggtgg ctctttcccc 120 120 <210> 5 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 caggctccca ggctcctcat ctattgggca tccactaggg aatctggcat cccagacagg 60 ttcagtggc 69 <210> 6 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtaagc aatcttatta tcacatgtat 60 acgttcggcc aagggacaaa ggtggaaatc aaacgt 96 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 tccgctagcg aggtgcagct ggtg 24 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 cgtggatcca cgtttgattt ccacctttgt ccc 33 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 tccgctagcg atattgtatt gacccagtct ccagc 35 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 cgtggatcct 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<210> 12 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 12 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcc atcaatcctt acaatgatgg taattactat 180 gcggactccg tgaaaggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggaa aaccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggcc 300 tataaaaggg gatatgctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtttcttca 360 360 <210> 13 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 13 gatattgtat tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctattgggc atccactagg 180 gaatctggca tcccagacag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt cactctcacc 240 atcagcagcc tagagcctga agattttgca gtttattact gtaagcaatc ttattatcac 300 atgtatacgt tcggccaagg gacaaaggtg gaaatcaaac gt 342 <210> 14 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h3D8 scFv <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys 115 120 125 Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 145 150 155 160 Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 165 170 175 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 180 185 190 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 210 215 220 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr 225 230 235 240 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 245 250 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 16 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg

Claims

서열번호 15에 기재된 서열로 구성된 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 16에 기재된 서열로 구성된 경쇄가변영역(VL)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 항원 결합부위를 포함하고 핵산가수분해능과 세포 침투능을 동시에 가지는 면역글로불린 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편.
제 1항에 있어서, 상기 면역글로불린은 면역글로불린 G 인 면역글로불린 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 G는 인간화 된 3D8항체인 면역글로불린 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 14에 기재된 서열로 구성된 단백질인 면역글로불린 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편.
제 1항에 있어서, 상기 VH를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 12에 기재된 서열로 구성된 유전자인 면역글로불린 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편.
제 1항에 있어서, 상기 VL를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 13에 기재된 서열로 구성된 유전자인 면역글로불린 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편.
제 1항 또는 제6항에 있어서, 상기 scFv를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 11에 기재된 서열로 구성된 유전자인 면역글로불린 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편.
삭제
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 항 바이러스 약학 조성물.