KR101599370B1 - Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 J1J22 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변부위; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 J1J22 인간 단일클론항체는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 1의 리간드인 Jagged 1에 특이적으로 타켓팅 할 수 있도록 파아지디스플레이를 통해 인간항체 라이브러리에서 스크리닝되어, 마우스에서 만들어진 단일클론항체에서 요구되는 인간화과정이 필요하지 않고 바로 인간에 적용할 수 있으며, 암세포의 성장, 전이(migration) 및 침윤(invasive)능력을 저하시키는 것을 확인하였으므로, Jagged 1 시그널과 관련 암 진단 및 치료용 항체로 용이하게 활용할 수 있다.

Description

Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 J1J22{Human Monoclonal Antibody J1J22 Against Jagged 1}

본 발명은 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변부위 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것이다.

단일클론항체(monoclonal antibody)를 만들어내는 기술이 개발된 이래로 이를 질병의 진단이나 치료에 이용하려는 시도가 지속적으로 이어져 왔다. 그에 따라 진단용 단일클론항체의 경우에는 이미 많은 제품이 개발되어 판매되고 있으나, 치료용 단일클론항체의 경우 여러 가지 제약 조건 때문에 제품화가 늦어지고 있는데, 그 중의 하나가 바로 인체의 면역반응이다.

항체 치료제의 개발은 면역원성을 줄이는 방향으로 진행되어 왔다. 가장 먼저 상업화에 성공한 Orthoclone-OKT3 은 신장이식의 거부반응을 억제하는 면역억제제로 마우스 서열을 가지고 있는 마우스 항체이다. 마우스 항체가 유발할 수 있는 HAMA(human anti-mouse antibody) 반응을 줄이기 위하여 항체의 variable domain의 서열을 제외한 나머지 서열은 인간서열을 포함하고 있는 chimeric antibody가 개발 되었고, CDR(complementarity determining region)을 제외한 나머지 서열이 모두 인간서열을 보유하고 있는 humanized antibody가 순차적으로 개발되었다.

이 기술이 개발된 이래 현재까지 약 10개의 인간화 항체 치료제가 FDA 승인을 받게 되었고 현재 암 및 자가면역질환의 치료제와 바이러스 감염 예방제로 사용되고 있으며, 특히 Her2 결합항체인 Herceptin과 VEGF 중화항체인 Avastin은 암치료제로서 blockbuster 항체 제품이다.

이와 같이 생쥐에서 유래한 항체를 조작하여 최대한 인간 항체와 유사하도록 바꾸어 주는 방법 외에도 아예 인간의 항체서열을 가진 인간 단일클론항체(fully human monoclonal antibody)를 제조하려는 노력도 이루어지고 있다.

완전인간항체를 개발하는 방법은 크게 phage display를 이용하는 방법과 transgenic mouse를 이용하는 방법이 있는데, 기존에 개발된 인간항체기술 중 Cambridge Antibody Technolgy(CAT)와 Dyax등이 보유하고 있는 Phage display 기술은 phage coat protein을 구성하는 pIII 단백질의 일부분에 CDR 서열을 포함하고 있는 항체 단편이 발현되도록 유전자 조작하여 특정 항원에 결합하는 항체 단편을 찾는 방법이며, 반면에 Medarex와 Abgenix등이 보유하고 있는 transgenic mouse 기술은 mouse 항체 발현 유전자를 인간 항체 발현 유전자로 치환시킨 형질전환 mouse를 이용하는 방법이다. VEGFR-2의 항체를 예로 볼 때, Tanibirumab은 phage display 기술을 이용하여 개발된 완전인간항체로 현재 개발되고 있는 다른 VEGFR-2 중화항체와 가장 큰 차이점은 mouse/rat VEGFR-2에 반응한다는 것이며, 현재 개발되고 있는 Imclone사의 Ramucirumab 이나, UCB pharma의 CDP-791의 경우는 모두 mouse의 VEGFR-2와 결합하지 못한다. 따라서, 이 두 개의 항체는 동물모델을 이용한 효과를 제대로 평가하기가 어려운 반면, Tanibirumab의 마우스 VEGFR-2에 대한 결합능력은 동물모델에서의 신생혈관억제 효과를 평가할 수 있다. 이러한 특징은 임상시험개발 과정에서 Tanibirumab에 가장 적절한 indication을 선정하는데 큰 도움이 될 것으로 기대하고 있다. 그 외에 파지 디스플레이 방법에 의하여 제조된 인간 단일클론항체는 TNF-α에 대한 항체(adalimumab, 상품명 Humira)로서 2002년 FDA의 승인을 받아 관절염 치료제로 사용되고 있는 강력한 항체 제품이다.

Notch 신호전달은 진화적으로 잘 보존된 신호전달 체계로 세포 결정, 분화, 증식 및 사멸을 조절하는 것으로 알려져 있으며, Notch 단백질은 단일 막관통 단백질로 세포표면 수용체와 핵 전사조절제의 역할을 한다. Notch 유전자는 초파리 표현형 연구시 초파리 날개끝에 홈(notches)이 있는 것을 발견하고 그와 관련된 유전자를 Notch로 명명하면서 처음 발견되었다. 포유동물은 네 개의 Notch를 가지고 있으며(Notch 1, 2, 3, 4), 각각의 Notch는 300-350 kDa 크기의 단백질로 합성되며 골지체에서 furin-like convertase에 의해 S1 자리가 잘리면서 세포표면에서 heterodimer를 형성한다.

활성화된 Notch 신호전달은 여러 암 모델에서 종양형성을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Wang Z. et al ., Anticancer Res ., 28:3621, 2008; Santagata S. et al., Cancer Res ., 1;64:6854, 2004). 종양형성 과정과 배아 기관 발달은 유사한 방법으로 일어날 것이라는 가설이 있으며, 활성 Notch인 NICD를 쥐의 조혈세포에 발현시켰더니 T-cell leukemia/lymphomas를 일으키고, T-cell acute lymphoblastic leukemia(T-ALL)에선 활성화 된 Notch 1이 50% 정도 발견되었다 (Weng AP. et al ., Science, 306:269, 2004). 또한 유방암 쥐 모델에서도 Notch의 발암효과가 보고 되어있다.

한편, Notch의 리간드인 Jagged 1은 유방암 환자에 있어서는 안 좋은 예후(Reedijk M. et al ., Cancer Res ., 15;65:8530, 2005)와, 전립선암에서는 암 전이와 관련이 있다고 알려져 있으며(Santagata S. et al ., Cancer Res., 64:6854, 2004), Notch/리간드 결합으로 시작되는 Notch 신호전달 체계는 kinase 같은 효소적 신호 증폭이 없어 비교적 정확하게 신호강도를 조절할 수 있어 Notch 신호전달이 암 연구에서 주목을 받고 있다. Notch 신호전달은 Notch/리간드 결합을 방해하는 단일클론항체를 이용해 Notch 신호전달 초기단계에서 억제할 수 있으며, Notch 리간드인 Dll4를 타켓으로 하는 단일클론항체가 개발되어 내피세포에서의 Notch 신호전달을 억제해 혈관 생성을 제한한다는 보고가 있고(Ridgway J. et al ., Nature , 444:1083, 2006), 현재 Notch와 관련된 암 진단을 위한 항체 및 Notch 신호전이를 방해할 수 있는 많은 단일클론항체들이 개발중이다 (Yan M. et al ., Nature, 464:1052, 2010).

이에, 본 발명자들은 새로운 항암치료의 주요 타겟이 될 수 있는 Notch 1의 리간드인 Jagged 1의 단일클론항체를 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 인간 항체 라이브러리에서 Jagged 1에 특이적으로 결합하는 항체 J1J22을 선별하여 암세포의 성장, 전이(migration) 및 침윤(invasive)능력을 저하시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 Jagged 1에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합세포를 배양하여 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물 및 암 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변부위; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 유전자 또는 재조합벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합세포 및 상기 재조합세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물 및 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 J1J22 인간 단일클론항체는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 1의 리간드인 Jagged 1에 특이적으로 타켓팅 할 수 있도록 파아지디스플레이를 통해 인간항체 라이브러리에서 스크리닝되어, 마우스에서 만들어진 단일클론항체에서 요구되는 인간화과정이 필요하지 않고 바로 인간에 적용할 수 있으며, 암세포의 성장, 전이(migration) 및 침윤(invasive)능력을 저하시키는 것을 확인하였으므로, Jagged 1 시그널과 관련 암 진단 및 치료용 항체로 용이하게 활용할 수 있다.

도 1은 3차 및 4차 패닝으로부터 Jagged 1- 펩타이드에 선택적으로 결합하는 J1J22 항체를 선별한 데이터이다.
도 2는 J1J22 항체의 경쇄 가변부위 및 중쇄 가변부위 아미노산 서열과 CDR 부위를 나타낸 모식도이다.
도 3은 Fab형태의 J1J22항체를 whole IgG 형태로 전환한 후 정제한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 4는 J1J22항체에 의한 OVCAR3 세포주의 성장억제정도를 나타낸 데이터이다.
도 5는 J1J22항체에 의한 SKOV3 세포주의 성장억제정도를 나타낸 데이터이다.
도 6은 J1J22항체에 의한 OVCAR3 세포주의 전이 및 침윤 억제정도를 나타낸 데이터이다.
도 7은 J1J22항체에 의한 SKOV3 세포주의 전이 및 침윤 억제정도를 나타낸 데이터이다.
도 8은 Notch 시그널을 나타낸 모식도이다.
도 9는 OVCAR3 세포주에서 J1J22 항체에 의한 Notch 시그널의 mRNA 발현 저해정도를 나타낸 데이터이다.
도 10은 SKOV3 세포주에서 J1J22 항체에 의한 Notch 시그널의 mRNA 발현 저해정도를 나타낸 데이터이다.
도 11은 OVCAR3 세포주에서 J1J22 항체에 의한 Notch 시그널의 단백질 발현 저해정도를 나타낸 데이터이다.
도 12는 SKOV3 세포주에서 J1J22 항체에 의한 Notch 시그널의 단백질 발현 저해정도를 나타낸 데이터이다.
도 13은 J1J22 항체가 투여된 마우스의 종양 크기를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 14는 J1J22 항체가 투여된 마우스의 몸무게 변화와 먹이량 변화를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 15는 in vivo 상에서 J1J22 항체의 항암효과를 확인한 데이터이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변부위; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 'Jagged 1'은 노치 리셉터(notch receptor) 리간드(ligand)에 해당하며, 'Jagged 1'은 본 명세서에서 사용되는 용어 'Jag 1'과 혼용된다.

본 발명에서 '항체(antibody)'는 항원(antigen)과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질을 의미한다. 항체에는 immunoglobulin(Ig)M, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체기술에서는 주로 IgG가 사용되는데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 isotype이 있으며, 각각의 구조 및 기능적 특성은 다르다.

IgG는 중쇄(heavy chain, 50 kDa) 단백질 2개와 경쇄(light chain, 25 kDa) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 매우 안정된 구조(분자량, 150 kDa)를 형성하고 있다. 항체의 경쇄와 중쇄는 아미노산 서열이 항체들마다 서로 다른 가변영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉘어져 있으며, 중쇄 불변영역에는 CH1, H(hinge), CH2, CH3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-sheet로 구성되어 있고 이들사이에 intramolecular disulfide bond가 연결되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성되며, 이 부위는 Y자 모양의 양 팔에 각각 한 개씩 존재하는데 이러한 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment)이라 하고, 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystalizable fragment)라고 한다. Fab과 Fc은 유연한 hinge region으로 연결되어 있다.

항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에는 항체마다 아미노산 서열이 특히 다른 부분이 있는데 이를 hypervariable region이라고 부르며, 항원과 결합하는 부위를 구성하고 있기 때문에 상보성 결정영역 (complementarity determining regions, CDRs)이라고도 부른다. 항체의 입체 구조를 살펴보면, 이들 CDRs은 항체의 표면에서 고리(loop) 모양을 하고 있고 고리 아래에는 이를 구조적으로 지지해주는 FR(framework region)이 존재한다. 중쇄와 경쇄에는 각각 세 개씩의 고리구조가 존재하며, 이들 여섯 개의 고리 지역 구조는 서로 합쳐져서 항원과 직접적으로 접촉하고 있다.

본 발명의 인간 항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나, 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

파지 디스플레이는 1985년 G. Smith에 의해 처음 도입된 개념으로, 1990년 영국 MRC에 의해 처음으로 항체의 제조에 응용되었다. 박테리오파지(bacteriophage)란 대장균(Escherichia coli)에 기생하는 바이러스의 일종으로 이 기술에서는 주로 실사형 박테리오파지(filamentous bacteriophage)인 M13이 사용되고 있다.

항체의 phage display는 인체 내에 수많이 존재하는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 각각 PCR로 증폭시켜 phagemid vector 안에 들어있는 파지 표면 단백질(pIII)에 융합시킨 형태로 클로닝하여 대장균에서 발현시킨 후 helper 파지를 감염시키면, 파지의 표면에 display된 다양한 조합의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 항체 라이브러리(library)를 제작할 수 있는 기술을 말한다. 이때 사용하는 항체의 형태는 scFv나 Fab이다. 이 라이브러리로부터 패닝(panning) 방법에 의하여 특정 항원에 결합하는 인간 단일클론항체를 분리 제작할 수 있다. 패닝은 특정 항원(target antigen)에 파지를 결합시키고 결합하지 않은 파지를 제거한 후, 결합된 파지를 회수하여 대장균에 감염시킴으로써 파지 수를 증폭하고, 이 과정을 2-4회 반복하는 과정이다. 이 기술을 이용하면 단 몇 주만 인간 단일클론항체를 분리할 수 있다. 위와 같이 인체에 이미 존재하는 항체 유전자로부터 항체의 다양성을 창조한 것을 naive antibody library라 하고, 항체의 CDRs에 무작위 합성 서열을 넣어 다양성을 창조한 것을 synthetic antibody library라고 한다. Native library는 분리한 항체의 친화력이 그리 높지 않지만 제작비용이 많이 들지 않고, synthetic library는 분리한 항체의 친화력이 높은 반면 제작비용이 많이 든다. 분리된 항체클론들의 친화력이 높지 않을 경우, 항체의 CDRs 및 FRs의 잔기들을 변이시킨 후 파지 디스플레이 방법을 사용하여 친화력이 보다 높은 항체 클론들을 다시 선별하는 친화력 성숙 과정(in vitro affinity maturation)을 거친다.

본 발명에서 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파지는, 예를 들면 필라멘트성 파지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파지가 있으나, 상기 예들에 의하여 본 발명에서 사용 가능한 파지의 종류가 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터의 예로는, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8, pKRIBB-Fab 또는 pSEX 등의 파지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서는 pKRIBB-Fab 파지미드 벡터를 사용하였다.

또한, 증폭을 위한 재조합 파지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에서는 Jagged 1의 항원을 인간항체 라이브러리를 디스플레이하고 있는 파지와 1시간 동안 반응시켰고, 1차 패닝의 경우 10회, 2차 패닝의 경우 20회, 3차 패닝의 경우 30회, 4차 패닝의 경우 40회 세척하였다. 세척 후 항원에 결합하고 있던 파지-항체들을 분리시킨 다음 TG1 대장균에 감염시키고 하룻밤 배양하였다. 이때 각 패닝 초기에 사용한 파지의 수를 인풋(input)으로, 세척과정을 마친 이후 글라이신 용액에 의하여 분리된 후 TG1 대장균을 통하여 만들어진 콜로니의 수를 아웃풋(output) 파지의 수로 계산하여, 항원결합능이 있는 항체의 증폭 정도의 지표로 삼았고, 1차 패닝 결과 얻어진 콜로니들을 모아 배양한 후 같은 방법으로 보조 파지를 넣고 배양하여 항체가 디스플레이드된 파지를 만들었고, 동일한 양의 항원에 대하여 2차, 3차, 4차 패닝을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가됨에 따라 항원결합능이 높은 항체들이 증폭되고 있는지 확인하기 위하여, 라이브러리와 1차, 2차, 3차 패닝 후에 정제한 항체들의 항원결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정하였고, 그 결과, 3차 패닝 후 Jagged 1-peptid에 특이적인 항체가 농축되는 것을 확인하였다.

또한, 대조군(negative control)에는 결합하지 않고 Jagged 1-펩타이드에 선택적으로 결합하는 7개의 양성 클론을 선별하였으며, 그 중에서도 Jagged 1-펩타이드에 결합력이 뛰어난 클론을 선택하여 J1J22으로 명명하고(도 1), 선별된 J1J22 항체의 염기서열 및 아미노산 서열을 분석한 결과, J1J22 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위로 구성되며, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 포함하는 것을 확인하였다. 또한, 경쇄 가변부위는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하고, 중쇄 가변부위는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 것으로 분석되었다(도 2).

본 발명의 J1J22 항체의 염기서열을 인간 점라인(germline) 염기서열과 비교 분석한 결과, J1J22의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 IMGT 데이터 베이스(IMGT data base)에 있는 어느 중쇄 및 경쇄 서열과 100% 동일하지는 않아, J1J22이 점라인 항체가 아니고 인체 내에서 성숙과정을 거친 새로운 항체임을 확인하였다.

항체절편은 항체 분자에서 effector function을 나타내는 Fc region을 제외한 항원결합 도메인들을 말하며, 주로 Fab, single-chain antibody fragment(scFv) 및 3세대 항체절편(예, single domain, minibody 등)이 포함된다.

항체절편은 whole IgG에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점이 있으며, Fc가 없기 때문에 effector function을 원하지 않는 경우에 사용한다. 항체절편은 인체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하지만, 항체를 이루고 있는 아미노산 중 일부 염기성, 산성 혹은 중성 아미노산을 상호 교체할 경우 그 항체만의 고유한 등전점(isoelectric point)이 바뀔 수 있는데, 이러한 항체의 등전점 변화가 항체의 생체 내 독성 부작용을 경감한다거나 수용성을 증가시키는 등의 변화를 유도할 수 있으므로 치료용 항체의 경우 친화도나 구조적 형태를 고려하여 whole IgG를 사용하게 된다.

본 발명은 다른 관점에서, Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 유전자 또는 상기 재조합벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 생산능을 가지는 재조합세포에 관한 것이다.

본 발명에서, '벡터 (vector)'는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 '플라스미드(plasmid)' 및 '벡터(vector)'는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션 (ligation)할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합세포는 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 숙주세포의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합벡터를 숙주세포의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 인간 단일클론항체를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, gt10과 gt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.

본 발명의 재조합벡터를 적절한 숙주세포, 예를 들어 효모 세포, 동물 세포 등에 형질전환시킨 후 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명의 인간 항체 또는 이의 단편을 대량 생산할 수 있다.

상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7:monkey kidney cells)세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO:chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않으며, 더 바람직하게는 HEK293 세포이다.

본 발명의 재조합벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, microinjection(세포에 DNA를 직접 넣는 것), liposome, directed DNA uptake, receptor~mediated DNA transfer 또는 Ca⁺⁺을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement : 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위의 세포들에서 사용할 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 '작동가능하게 연결(operably linked)'된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, '작동가능하게 연결된'은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 생산능을 가지는 재조합세포를 배양하여 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 회수하는 단계를 포함하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득하는 것이 바람직한데, 구체적으로는 항체의 중쇄 가변영역 또는 중쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열 및 경쇄 가변영역 또는 경쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열을 하나의 벡터 또는 2개의 벡터에서 따로 발현시킬 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체의 제조방법은 본 발명의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 배양하는 단계; 상기 배양된 형질전환체로부터 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 분리, 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적으로, 재조합벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

상기와 같이 재조합적으로 생산된 펩타이드 또는 단백질은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다.

항체 발현에 사용된 세포는 동결-해동 순화, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다 (Sambrook et al ., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 생산하기 위한 재조합세포의 배양 및 회수과정은 당업계에 통상적으로 알려진 배양 방법 및 재조합 단백질의 분리 정제 방법이라면 특별한 제한 없이 모두 적용가능하다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 Fab 형태의 J1J22을 whole IgG 형태로 전환하기 위하여 J1J22로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭시켰고, HEK293T 세포에 형질전환시켜 J1J22 항체를 정제하였다 (도 3).

본 발명은 다른 관점에서 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체(J1J22)를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, '항암'이란 '예방' 및 '치료'를 포함하며, 여기서 '예방'이란 본 발명의 항체를 포함하는 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위을 의미하고, '치료'란 본 발명의 항체 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, Notch, 특히 Jagged 1를 리간드로 포함하는 Notch 1의 시그널이 비정상적으로 발현되는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에서는 Jagged 1에 대한 인간항체인 J1J22 항체가 암 치료 효과가 있는지 확인하기 위하여, 난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포인 OVCAR-3 세포주와 난소 암종(ovarian carcinoma) 세포인 SKOV3 세포주를 이용하여 암세포의 성장(proliferation), 전이(migration) 및 침윤(invasion) 능력의 저해 효과를 확인하였다. J1J22항체를 암세포에 처리하여 24 시간, 48시간, 72시간 후에 세포 생존율을 확인해 본 결과, 대조군에 비해 OVCAR 세포는 약 70% 정도 생존율이 감소하는 것을 확인하였으며 (도 4), SKOV 3 세포는 약 60% 정도 생존율이 감소하는 것을 확인하여 (도 5), J1J22 항체에 의해 암세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, in vitro상에서 J1J22항체에 의한 암세포의 전이 및 침윤 능력을 확인해본 결과, J1J22항체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 OVCAR3 (도 6) 및 SKOV3 (도 7) 의 전이 및 침윤이 억제된 것을 확인하여, J1J22 항체에 의해 암세포의 전이 및 침윤 능력이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 J1J22 항체에 의한 Notch 시그널의 저해정도를 확인하기 위해, Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD 3, Jagged 1, Hes 1, Hey 1의 mRNA 및 단백질 발현정도를 확인하였다. 도 8에서 나타낸 바와 같이, 활성화된 Notch 신호전달은 NICD 1, Hes 1/Hey 1을 활성화 시키므로, J1J22 항체에 의해 Notch 1의 리간드인 Jagged 1이 차단되면, Notch 1, NICD 1 및 Hes 1/Hey 1의 발현이 감소하게 된다. 본 발명의 J1J22 항체를 처리하였을 때, OVCAR3 (도 9) 및 SKOV3 (도 10)에서 Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD 3, Jagged 1, Hes 1, Hey 1의 mRNA 발현이 크게 감소하는 것을 확인하였으며, OVCAR3에서 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD 3, Hey 1, Hes 1의 단백질 발현이 크게 감소하고 (도 11), SKOV3 세포에서 Notch 1, Notch 3, NICD 3, Jagged 1, Hey 1, Hes 1의 단백질 발현이 크게 감소하는 것을 확인하였다 (도 12).

본 발명의 또 다른 양태에서 난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포인 OVCAR-3를 이종이식한 마우스 모델에서의 J1J22 항체의 항암효과를 확인한 결과, J1J22 항체를 주입한 그룹에서 종양 부피가 줄어든 것을 확인할 수 있었고 (도 13), H&E 염색을 통해 J1J22 항체를 처리한 군에서 세포의 핵이 줄어든 것을 확인하였으며, TUNEL 염색을 통해 J1J22 항체를 처리한 군에서 세포사멸(apoptisis)이 일어나는 것을 확인하였다 (도 15).

즉, 본 발명의 J1J22 항체는 암 세포의 성장, 전이 및 침윤 능력을 감소시키고, Notch 시그널을 저해하므로, 암 치료제로 활용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 항암 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 항암 조성물은 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체, 또는 인간 단일클론항체를 포함한 조성물을 개체에 투여하여 암을 치료하고 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여, 또는 암의 성장을 억제하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서, '개체'는 본 발명의 항체를 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.

본 발명에서, '투여'는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하면 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체(J1J22)를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 Jagged 1의 발현을 검출하여 진단 가능한 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암 등을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 J1J22은 Jagged 1 또는 Jagged 1 펩타이트를 고민감도로 인지할 수 있으므로, Notch, 특히 Jagged 1를 리간드로 포함하는 Notch 1의 시그널과 관련된 질병을 진단할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함함을 특징으로 하는, Jagged 1 또는 그 발현의 억제제, 촉진제 및/또는 억제제를 처리한 환자를 모니터링하는데 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 암 진단은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 면역침강법(immunoprecipitation), 이뮤노 도트(immunodot) 또는 글라스 칩(glass chip) 등을 이용한 바이오센서를 이용하여 수행할 수 있으며, 특히 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 바이오센서는 정성적인 정보(두 분자들이 특이적으로 결합을 하는지)와 정량적인 정보(반응 속도, Kinetics와 평형상수, equilibrium constants)를 제공할 뿐만 아니라 형광으로 표지할 필요 없이 실시간으로 감지할 수 있어, 항원과 항체 결합을 측정하는데 특히 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1 :인간항체 라이브러리 제조 및 Jagged 1에 결합하는 항체 선별

1-1 : 파지 디스플레이 인간 항체 라이브러리 제조

Jagged 1에 결합하는 항체를 선별하기 위해 인간 항체 라이브러리를 클로닝법을 이용하여 제조하였으며, pKB-Fab100 파지미드 벡터를 제한효소 Apa(New England Biolabs)와 EcoR-HF(New England Biolabs)으로 절단한 후 경쇄, 중쇄 유전자들을 그 자리에 클로닝하여 라이브러리를 제조하여 클로닝하였다.

먼저, 라이브러리를 구축하기 위하여 pKB-Fab100 파지미드 벡터에 제한 효소 Apa(New England Biolabs)을 25℃에서 1시간, EcoR-HF(New England Biolabs)를 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단하고, 1.5% 아가로스 젤(Agarose gel(Cambrex))을 이용하여 분리 정제하였다. 정제된 벡터와 정제된 유전자들을 몰/2몰 비율로 사용하여 20㎕의 10 x 리가아제(ligase) 완충용액, 10㎕의 T4 DNA 리가아제(ligase)와 살균 증류수를 넣어 200㎕가 되도록 한 후, 16℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날 라이게이션(ligation) 산물을 글리코겐을 가하고 에탄올 침전법으로 농축한 후 대장균의 형질전환에 사용하였다.

대장균의 형질전환(transformation)은 전기천공(electoporation)을 이용하였다. 전기천공 수용성 대장균(Electrocompetent E. coli ; TG1)에 상기에서 만들어진 라이게이션 산물을 2.5 kV, 200 O, 25 D 조건으로 엘렉트로포레이션(BioRad Gene Pulser Xcell 이용) 하였다. 이렇게 형질전환된 대장균은 23.5 cm x 23.5 cm x20.0 cm 의 암피실린(ampicilin)과 글루코오스(glucose), 마그네슘(magnesium)을 함유하고 있는 SOB 고형 배지 플레이트에 도말하여 밤새 37℃에서 키운 후 암피실린과 글루코즈, 마그네슘을 함유하고 있는 2YT 액체 배지를 이용하여 회수하였고 글리세롤을 최종 농도 20%로 가하여 -80℃에 보관하였다. 이때 만들어진 라이브러리의 크기는 전기천공 후 얻어진 대장균을 다단계로 희석하여 암피실린을 함유한 2YT 플레이트에 도말한 다음 37℃에서 밤새 키운 후 얻어진 cfu(colony forming unit)의 개수를 측정함으로써 결정하였으며, 2 x 10⁹cfu의 라이브러리를 얻을 수 있었다.

인간 항체 library(CDR3-24)를 포함하고 있는 대장균 세포를 OD₆₀₀ 값이 0.6-0.7이 되도록 배양한 후, 헬퍼 파지(helper phage; VCSM13)를 첨가하여 약 30분 동안 방치(standing), 약 30분 동안 흔들어(shaking) 준 다음, 카나마이신(70㎍/㎖)을 넣은 뒤 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한 다음, 배양액으로부터 라이브러리 파지를 회수하였다.

1-2 : 제조된 항체 라이브러리로부터 Jagged 1 펩타이드에 결합하는 항체의 선발

Jagged 1-펩타이드(서열번호 11; RCGPDCFDNYGRYKYCF) 100㎍을 코팅 완충용액 (15mM Na₂CO₃, 34.84 mM NaHCO₃, pH 9.6) 1㎖에 섞어 면역튜브 (Maxisorp Immunotube, Nunc 사) 에 넣고 4℃에서 밤새 코팅한 다음, 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS 용액(PBST)으로 2번 세척하고 4% 탈지분유로 1시간 동안 실온에서 블로킹하였다. 다시 2번 세척한 후, 실시예 1에서 제조된 항원과 인간 항체 라이브러리를 디스플레이하고 있는 파지(3.8 x 10¹²)를 최종 농도 2% 탈지분유에 섞어 1㎖ 면역튜브에 넣고 37℃에서 1시간 동안 항원과 반응시켰다. 다음 0.5% Tween20이 첨가된 PBS로 1차 패닝의 경우 10회, 2차 패닝의 경우 20회, 3차 패닝의 경우 30회, 4차 패닝의 경우 40회 세척하였다, 1회 세척은 1㎖의 세척용액을 넣은 후 1㎖용 피펫만(pipetman) 을 사용하여 용액을 파이펫팅(up and down) 10번 한 후 4㎖의 세척 용액을 더 넣고 5분간 정치하여 두는 것을 의미한다. 세척 후 항원에 결합하고 있던 파지-항체들을 0.1M 글라이신(pH 2.5) 1㎖을 사용하여 분리시킨 다음 60㎕의 2 M Tris HCl pH 9.0를 가하여 중화한 후 즉시 OD₆₀₀ 값이 0.8이 되도록 키운 TG1 대장균에 감염시키고 암피실린(100㎍/㎖)을 함유하고 있는 2YT(2YTA) 고체배지에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 때 각 패닝 초기에 사용한 파지의 수를 인풋(input)으로, 세척과정을 마친 이후 글라이신 용액에 의하여 분리된 후 TG1 대장균을 통하여 만들어진 콜로니의 수를 아웃풋(output) 파지의 수로 계산하여, 항원결합능이 있는 항체의 증폭 정도의 지표로 삼았다.

Jagged 1-펩타이드를 항원으로 한 패닝의 인풋 및 아웃풋 파지의 수

1차 panning	input	3.8×1012/㎖
	output	5.28×104
2차 panning	input	7.9×1012/㎖
	output	6.05×105
3차 panning	input	1.27×1013/㎖
	output	5.28×106
4차 panning	input	1.08×1013/㎖
	output	9.79×107

1차 패닝 결과 얻어진 콜로니들을 모아 배양한 후 같은 방법으로 보조 파지를 넣고 배양하여 항체가 디스플레이드된 파지를 만들었고, 동일한 양의 항원에 대하여 2차, 3차, 4차 패닝을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가됨에 따라 항원결합능이 높은 항체들이 증폭되고 있는지 확인하기 위하여, 라이브러리와 1차, 2차, 3차, 4차 패닝 후에 선택된 콜로니들을 모아 OD₆₀₀ 값이 0.8이 되도록 37℃에서 키운 후 IPTG를 최종농도 1mM로 가하여 28℃에서 밤새 발현시킨 다음 상층액에 존재하는 항체들의 항원결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정하였다.

간접 ELISA는, Jagged 1-펩타이드를 96 웰 플레이트(MaxiSorp, Nunc)에 코팅한 후 상기 배양 상층액 100㎕를 각 웰에 넣고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이어서 PBST로 3번 세척한 다음, 1차 항원인 KR127을 0.05% PBST 에 1:3000으로 희석한 후 37℃에서 1시간 동안 부착시킨 다음, PBST로 3번 세척하였고, 2차 항원 mouse Fc-HRP(2^nd antibody mouse Fc-HRP)를 0.05% PBST 에 1:3000으로 희석한 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음 다시 PBST로 3번 세척한 후, TMB(BD) 와 과산화수소수를 1:1의 비율로 섞어 100㎕ 씩 웰에 넣고 5분간 반응시킨 다음 2M H2SO4를 50㎕ 가하여 반응을 정지시켰다. 흡광 분석기(VERSA max 사의 microplate reader)를 이용하여 450nm 파장에서의 흡광도를 읽어 항체의 발현을 측정하였다.

그 결과, 3차 패닝 후, Jagged 1-펩타이드에 특이적인 항체가 농축되는 것을 확인하였다.

1-3 : 양성 항체 선발

Jagged 1-펩타이드에 결합하는 클론들을 선별하기 위해, 3차, 4차 패닝 후 용출된 파지들을 희석하여 TG1 대장균에 감염시킨 후 2YTA 고체배지에 도말하여 37℃ 항온기에 넣고 약 1000개의 단일 콜로니가 되도록 배양하였다. 단일 콜로니를 각각 2YTA 액체 배지 3㎖에 접종하고 37℃ 항온기에서 진탕 배양하면서 각 클론의 흡광도가 600nm에서 0.6 과 0.7 사이가 될 때까지 배양하였다. 다음, IPTG를 최종 농도 1 mM로 가하고 28℃ 항온기에서 밤새 진탕 배양한 후, 배양 상층액을 회수하였다.

상층액에 존재하는 항체들의 항원결합능을 측정하기 위해, 실시예 1-2의 간접 ELISA 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

이러한 ELISA 과정을 통하여 대조군(negative control)에는 결합하지 않고 Jagged 1-펩타이드에 선택적으로 결합하는 7개의 양성 클론을 선별하였으며, 그 중에서도 Jagged 1-펩타이드에 결합력이 뛰어난 클론을 선택하여 J1J22으로 명명하고(도 1), 플라스미드 DNA를 분리한 후 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 선별된 J1J22 항체는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 포함하는 것으로 분석되었으며, 아미노산 서열을 분석한 결과, J1J22 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위로 구성되는 것을 확인하였다. 또한, 경쇄 가변부위는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하고, 중쇄 가변부위는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 것으로 분석되었다.

실시예 2: Jagged 1에 대한 항체의 염기서열 및 아미노산 서열 분석

실시예 1에서 선별한 J1J22 항체의 염기서열을 IMGT 소프트웨어(http://imgt.cines.fr/ IMGT_vquest /share/textes/)를 이용하여 인간 점라인 (germline) 염기서열과 비교 분석한 결과, 경쇄 가변영역은 ~ 으로부터 유래된 것으로 분석되었다. J1J22의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 IMGT 데이터 베이스(IMGT data base)에 있는 어느 중쇄 및 경쇄 서열과 100% 동일하지는 않았다. 이는 J1J22이 점라인 항체가 아니고 인체 내에서 성숙과정을 거친 새로운 항체임을 증명하는 것이다.

실시예 3: J1J22 의 whole IgG 로 전환 및 생산

선택된 J1J22를 보다 정밀하게 분석하기 위해, 먼저 이를 whole form으로 전환하여 293T cell에서 transfection expression 한 뒤, protein A column을 이용하여 정제하였다.

Fab 형태의 J1J22를 whole form 형태로 전환하기 위하여 Fab J1J22로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭시켰고 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 을 통하여 분리한 다음 Zymo 겔 추출 키트(Zymoresearch, 미국)을 이용하여 정제하였다. 이때 사용한 프라이머는 경쇄 가변영역의 경우 서열번호 12와 서열번호 13이었고, 중쇄 가변영역의 경우 서열번호 14와 서열번호 15였다.

[서열번호 12] 5'-TTGTCTGGTGTTGAAGGAGACATCCAGATGACCCAG-3'

[서열번호 13] 5'-GCAGCCGCCGTACGTTTGATCTCCACTTTGGTCCCTTGGCC-3'

[서열번호 14] 5'-ACTACAGGTGTCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAG-3'

[서열번호 15] 5'-CACCGGTTCGGGGAAGT-3'

다음 항체를 동물세포에서 발현 생산할 수 있도록 pdCMV-dhfrC(대한민국 특허 등록번호 제10-0476363호)로부터 중쇄와 경쇄의 리더 시퀀스를 PCR에 의하여 합성하고 분리하고 1.5% 아가로즈 겔(Cambrex) 과 Zymo 겔 추출 키트 (Zymoresearch)를 통하여 분리 정제하였다. 이때 사용한 프라이머는 경쇄 리더 시퀀스의 경우 서열번호 16과 서열번호 17이었고, 중쇄 리더 시퀀스의 경우 서열번호 18과 서열번호 19였다. 다음 중쇄 리더 시퀀스와 중쇄 가변영역을, 경쇄 리더 시퀀스와 경쇄 가변영역을 각각 재조합(recombination) PCR을 이용하여 연결시켰고, 1.5% 아가로즈 겔(Cambrex)과 Zymo 겔 추출 키트를 통하여 분리 정제하였다.

[서열번호 16] 5'-TGCAAAGCTTCGGCACGAGCA-3'

[서열번호 17] 5'-TCCTTCAACACCAGACAAC-3'

[서열번호 18] 5'-GACGAATTCACTCTAACCATGGAA-3'

[서열번호 19] 5'-GGAGTGGACACCTGTAG-3'

이것을 중쇄는 제한효소 EcoRI(Roche, 스위스)과 ApaI(Roche, 스위스)으로, 경쇄는 HindⅢ(Roche, 스위스)와 BsiWI(Roche, 스위스)로 잘라 동일한 제한효소로 절단하고 정제한 pdCMV-dhfrC 벡터의 중쇄와 경쇄 불변영역 위쪽에 각각 클로닝하고 pdCMV-dhfrC-J1J22라 명명하였다.

상기 pdCMV-dhfrC-J1J22 DNA를 HEK293T 세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 미국)을 사용하여 형질전환하였다. 4-6시간 동안 37℃ 5% CO2 항온 배양기에서 배양한 후 혈청을 함유하고 있지 않은 배지 CD293(Gibco,미국)로 바꾸어 3일간 동일한 항온 배양기에서 배양하여 J1J22 생산하는 상청액을 모으기 시작했다. 상기에서 얻어진 상청액 으로부터 protein A 아가로즈 컬럼(Upstate, 미국)을 통하여 J1J22 항체를 정제하였다. 그 결과, 이 항체를 환원시켰을 때에 항체의 중쇄 및 경쇄의 분자량으로 알려진 55 KDa, 25 KDa의 분자량을 갖는 단백질 밴드를 관찰하였다 (도 3).

실시예 4: J1J22 항체의 암세포 성장 억제능력 확인

실시예 3에서 정제한 whole form의 J1J22항체의 암세포 성장 억제 능력을 확인하였다.

먼저, OVCAR3(KCLB No. 30161), SKOV3(KCLB No. 30077) 각각의 세포를 96 웰 플레이드의 각 웰 당 1x10³이 되도록 깔아준 후, 대조군 항체 IgG(Thermo Cat No.31414)와 J1J22항체의 농도가 20㎍/㎖이 되도록 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지와 혼합하여 100㎕/well로 처리하였다. 그 다음, 5% CO_{2 ,} 37℃조건의 배양기에서 배양하였으며, 배양 24시간, 48시간, 72시간 후에 MTT assay를 통해 세포 생존율을 확인해 보았다.

MTT assay는 MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)를 DPBS에 0.5㎎/㎖이 되도록 녹인 후, 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지에 6배 희석하여 각 웰에 120㎕/well로 처리하였으며, 그 다음 5% CO_{2 ,} 37℃조건의 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, 배지 제거 후, 100㎕/well의 DMSO를 처리하여 562nm에서 흡광도 측정하였다.

J1J22항체를 처리하여 24 시간, 48시간, 72시간 후에 세포 생존율을 확인해 본 결과, 대조군에 비해 OVCAR3 세포는 약 70% 정도 생존율이 감소하는 것을 확인하였으며(도 4), SKOV3 세포는 약 60% 정도 생존율이 감소하는 것을 확인하여(도 5), J1J22 항체에 의해 암세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 5: J1J22 항체의 암세포 전이( migration ) 및 침윤( invasive )능력 저해 효과확인

in vitro상에서 J1J22항체에 의한 암세포의 전이 및 침윤 능력을 확인해 보았다. 전이와 침윤은 침윤 현상을 관찰하기 위해서 Matrigel(BD Science Cat No. 356234)를 DPBS에 100배 희석하여 Transwell(Corning costar Cat No. 3422) 위쪽 면에 상온에서 1시간 동안 코팅한 후에 실험을 수행하였다.

OVCAR3(KCLB No. 30161), SKOV3(KCLB No. 30077) 각각의 세포를 코팅한 tranwell에 OVCAR3의 경우 4x10⁴ cells/well, SKOV3의 경우 2x10⁴ cells/well로 깔아준 후 대조군 항체 IgG(Thermo Cat No.31414)와 J1J22항체의 농도가 20㎍/㎖이 되도록 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지와 혼합하여 150㎕/well로 처리하였다. 그 다음 5% CO_{2 ,} 37℃조건의 배양기에서 OVCAR3의 경우 20시간, SKOV3의 경우 24시간 동안 배양한 후 암세포의 전이 및 침윤 정도를 현미경으로 관찰하였다.

J1J22항체에 의한 암세포의 전이 및 침윤 능력을 확인해본 결과, J1J22항체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 OVCAR3(도 6) 및 SKOV3(도 7) 의 전이 및 침윤이 억제된 것을 확인하여, J1J22 항체에 의해 암세포의 전이 및 침윤 능력이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: J1J22 항체에 의한 notch 시그널 변화 확인

6-1 : notch 시그널의 mRNA 발현 변화 확인

Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD3, Jagged 1, Hes 1, Hey 1의 mRNA 발현정도를 관찰하기 위해, 각각의 OVCAR3(KCLB No. 30161) 및 SKOV3(KCLB No. 30077) 세포를 10% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지를 사용하여 5% CO_{2 ,} 37℃조건의 배양기에서 72시간 안정화시켰다. 그 후, 각각의 세포를 6well plate(Coning Costar Cat No. CLS3516)에 3x10³ cells/well로 깔아준 후 대조군 항체 IgG(Thermo Cat No.31414)와 J1J22항체의 농도가 20㎍/㎖이 되도록 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지와 혼합하여 2㎖/well로 처리하였다. 그 다음 5% CO_{2 ,} 37℃조건의 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 RNA를 추출하였다.

RNA는 RIzol®RNA Isolation Reagents(ambion Life technology Cat No. 15596018)를 사용하였으며, 그에 준하는 프로토콜에 의해 추출하였다. 추출 후, SuperScript First-Strand(Invitrogen Cat No. 11904-018)를 사용하여 역전사 (Reverse Transcription) 시켜 생성된 DNA 50ng을 주형가닥으로 하여, 각 유전자들에 2㎕의 2pmol 프라이머와 aldAmp GT PCR Master Mix(TaKaRa Cat No. RR310A)를 섞어 94℃에서 5분간 전처리반응을 시킨 다음, 94℃에서 30초간 DNA를 변성시키고, 55℃에서 30초간 프라이머를 결합시킨다. 72℃에서 30초간 DNA를 합성시키는 과정을 25회 반복하였고, 마지막 단계에서는 72℃에서 7분간 반응시켜 효소가 충분히 활성을 발휘하도록 하여 유전자를 증폭하였다.

유전자 증폭에 사용한 프라이머는 각 유전자를 증폭할 수 있도록 디자인하여 합성하였다 ((주)바이오니아, 한국)

Human GAPDH 프라이머

[서열번호 20] 5'-GAGCTGAACGGGAAGCTCACTGG-3'

[서열번호 21] 5'-CAACTGTGAGGAGGGGAGATTCAG-3'

Human β-actin 프라이머

[서열번호 22] 5'-GCGAGAAGATGACCCAGATCATGTT-3'

[서열번호 23] 5'-GCTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'

Human Jagged-1 프라이머

[서열번호 24] 5'-CAACCGTGCCAGTGACTATTTCTGC-3'

[서열번호 25] 5'-TGTTCCCGTGAAGCCTTTGTTACAG-3'

Human Hes1 프라이머

[서열번호 26] 5'-TACCTCTCTCCTTGGTCCTGGAAC-3'

[서열번호 27] 5'-CAGATGCTGTCT TTGGTTTATCCG-3'

Human NOTCH3 프라이머

[서열번호 28] 5'-gttcatgcattgacctcgtg-3'

[서열번호 29] 5'-gtagccaggaagacactcac-3'

Human NOTCH1 프라이머

[서열번호 30] 5'-tccaccagtttgaatggtca-3'

[서열번호 31] 5'-ggacttgcccaggtcatcta-3'

Human NICD3 프라이머

[서열번호 32] 5'-AGCACTTTGGGAATTCTGGA-3'

[서열번호 33] 5'-ACGTCCTTGTGCAGTGAGAA-3'

Human NICD1 프라이머

[서열번호 34] 5'-cctgagggcttcaaagtgtc-3'

[서열번호 35] 5'-cggaacttcttggtctccag-3'

Human HEY1 프라이머

[서열번호 36] 5'-CATCGAGGTGGAGAAGGAGA-3'

[서열번호 37] 5'-CGAAATCCCAAACTCCGATA-3'

상기 증폭된 유전자를 전기영동(1.5% Agarose gel, 100V 15분)하여, Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD 3, Jagged 1, Hes 1, Hey1의 mRNA 발현정도를 확인해본 결과, J1J22 항체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 OVCAR3(도 9) 및 SKOV3(도 10)의 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD 3, Jagged 1, Hes 1, Hey 1의 mRNA 발현이 크게 감소하는 것을 확인하여, 본 발명의 J1J22 항체가 Notch 시그널을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

6-2 : notch 시그널의 단백질 발현 변화 확인

Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD 3, Jagged 1, Hes 1, Hey 1의 단백질 발현정도를 관찰하기 위해, 각각의 OVCAR3(KCLB No. 30161) 세포를 10% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지를 사용하여 5% CO_{2 ,} 37℃조건의 배양기에서 72시간 안정화시켰다. 그 후, 각각의 세포를 6well plate(Coning Costar Cat No. CLS3516)에 3x10³ cells/well로 깔아준 후 대조군 항체 IgG(Thermo Cat No.31414)와 J1J22항체의 농도가 20㎍/㎖이 되도록 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지와 혼합하여 2㎖/well로 처리하였다. 그 다음 5% CO_{2 ,} 37℃조건의 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 단백질을 추출하였다.

단백질은 Laemmli's Sample Buffer Reducing(GenDEPOT Cat No. L1100-011)와 3:1비율로 섞어 95℃에서 5분 반응하여, 전기영동(10% acrylamide gel, 90V 180분)하였다. 그 후 PVDF membrane(Roche Cat No. 03010040001)으로 옮겨 웨스턴 블럿을 하였다. 이때, 1차 항체는 NOTCH1(Santacruz SC-37389), NOTCH3(Santacruz SC-5596), Jagged1(Santacruz SC-135955), Hes1(Santacruz SC-166410), NICD1(Cellsignaling 2421S) 및 GAPDH(Santacruz SC-166574)를 사용하였으며, 2차 항체는 goat anti-rabbit IgG-HRP(Santacruz SC-2004) 및 goat anti-mouse IgG-HRP(Santacruz SC-2005)를 사용하였다.

Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD3, Jagged 1, Hes 1, Hey 1의 단백질 발현정도를 확인해본 결과, J1J22 항체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 OVCAR3 세포에서 Notch 1, NICD 1, Notch 3, NICD 3, Hey 1, Hes 1의 단백질 발현이 크게 감소하고(도 11), SKOV3 세포에서 Notch 1, Notch 3, NICD 3, Jagged 1, Hey 1, Hes 1의 단백질 발현이 크게 감소하는 것을 확인하여(도 12), 본 발명의 J1J22 항체가 Notch 시그널을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: in vivo 상에서 J1J22 항체의 항암효과 확인

난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포인 OVCAR-3를 이종이식한 마우스 모델(nude mouse; 5주령 BALB/c-nu)에서의 J1J22 항체의 항암효과를 확인하였다.

인간 암세포는 난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포인 OVCAR-3 세포주를 사용하였으며, 종양 세포 주입은 (day 0) 4 x 10⁶ 세포 (DPBS) / 100㎕의 세포농도로 마우스의 좌측 옆구리에 피하주사(s.c. inject) 하였다.

J1J22 항체는 정맥주사(I. V. injection)하였으며, 종양 세포를 주사한 'day 0'으로 부터 24시간 후의 'day 1'으로 하여 day 7부터 항체를 주사를 시작하였으며, 1회/2일의 스케줄로 행하여 3주동안 총 11회를 주사하였다. 마우스 7 마리를 1 그룹으로 하여, 2가지 그룹으로 나누어 실험을 실시하였다. 그룹 1은 Fc 그룹(대조군)(= 10㎎/㎏)을 주사하였고, 그룹 2는 100㎍/ea (= 10㎎/㎏)으로 J1J22 항체를 주사하였다.

그 후, 마우스의 조직을 분리하였으며, 분리된 조직(종양)의 크기는 다음과 같은 공식으로 측정하였다.

TV(Tumor Volume)=[(width)²×length]/2

그 결과, 종양의 크기가 유의적인 차이를 나타내어, Fc 대조군 그룹에 비해 J1J22 항체를 주입한 그룹에서 종양 생성이 억제된다는 것을 확인할 수 있었고 (도 13), 이에 따라 J1J22 항체를 주입한 마우스의 무게도 대조군보다 작게 나타났다 (도 14).

분리된 조직의 염색을 위해, 분리된 조직을 30% 포르말린에 고정한 후, 70% EtOH 1시간, 80% EtOH 1시간, 90% EtOH 1시간, 100% EtOH 1시간, 100% EtOH 1시간, EtOH 1 : Xylene 1 1시간, Xylene 1시간, Paraffin 1 : Xylene 1 1시간의 탈수 및 투명과정을 거친 후 paraffin으로 블록을 만들었다. 이 후, 10㎛로 박절하였다. 박절한 조직을 ottix plus 5분, ottix plus 15분, ottix shaper 3분, runing water 5분, hematoxylin 10분, running water 30초, ottix shaper 1분, eosin 20초, ottix shaper 3분, ottix plus 5분, ottix plus 10분 과정을 통해 H&E staining하였다. TUNEL staining은 박절한 조직을 10mM citric acid로 370W 5분 반응한 후, In situ Cell Death Detection Kit, POD(Roche Cat No. 11684817910)로 TUNEL staining하였다.

그 결과, H&E 염색을 통해, J1J22 항체를 처리한 군에서 세포의 핵이 줄어든 것을 확인하였으며, TUNEL 염색을 통해 J1J22 항체를 처리한 군에서 세포사멸(apoptisis)이 일어나는 것을 확인하였다 (도 15).

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> : KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Human Monoclonal Antibody J1J22 Against Jagged 1 <130> P14-P117 <160> 37 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable light chain <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Leu Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable heavy chain <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Cys Asp Asn Ser Arg Arg Ala Cys Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable light chain CDR1 <400> 3 Arg Ala Ser Gln Ser Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable light chain CDR2 <400> 4 Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable light chain CDR3 <400> 5 Gln Gln Tyr Asn Asn Leu Pro Thr Thr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable heavy chain CDR1 <400> 6 Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable heavy chain CDR2 <400> 7 Arg Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable heavy chain CDR3 <400> 8 Phe Cys Asp Asn Ser Arg Arg Ala Cys Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable light chain <400> 9 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgcgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggttggtaaa tcttacctag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcccct gatctatttg gcatccaaca gggcaagtgg ggtcccatca 180 cgcttcagtg gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag tactactctg ttccttttac gttcggccaa 300 gggaccaaag tggagatcaa a 321 <210> 10 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J22 variable heavy chain <400> 10 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttctct gactacgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcttgg atttatccgg ctaacggtga tactaactac 180 gcagactctg tgaagggccg tttcaccatc tcccgggaca actctaagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtct attactgtgc gaaactgagc 300 gacaaggact tcgcggacgg gtatgcgatg gattattggg gccaaggcac cctggtcacc 360 gtctcctcgg ccagc 375 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Jagged 1 peptide <400> 11 Arg Cys Gly Pro Asp Cys Phe Asp Asn Tyr Gly Arg Tyr Lys Tyr Cys 1 5 10 15 Phe <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL primer forward <400> 12 ttgtctggtg ttgaaggaga catccagatg acccag 36 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL primer reverse <400> 13 gcagccgccg tacgtttgat ctccactttg gtcccttggc c 41 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH primer forward <400> 14 actacaggtg tccactccga agtgcagctg gtggag 36 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH primer reverse <400> 15 caccggttcg gggaagt 17 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL leader sequence primer forward <400> 16 tgcaaagctt cggcacgagc a 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL leader sequence primer reverse <400> 17 tccttcaaca ccagacaac 19 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH leader sequence primer forward <400> 18 gacgaattca ctctaaccat ggaa 24 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH leader sequence primer reverse <400> 19 ggagtggaca cctgtag 17 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH primer forward <400> 20 gagctgaacg ggaagctcac tgg 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH primer reverse <400> 21 caactgtgag gaggggagat tcag 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human b-actin primer forward <400> 22 gcgagaagat gacccagatc atgtt 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human b-actin primer reverse <400> 23 gcttctcctt aatgtcacgc acgat 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Jagged 1 primer forward <400> 24 caaccgtgcc agtgactatt tctgc 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Jagged 1 primer reverse <400> 25 tgttcccgtg aagcctttgt tacag 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Hes1 primer forward <400> 26 tacctctctc cttggtcctg gaac 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Hes1 primer reverse <400> 27 cagatgctgt ctttggttta tccg 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH3 primer forward <400> 28 gttcatgcat tgacctcgtg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH3 primer reverse <400> 29 gtagccagga agacactcac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH1 primer forward <400> 30 tccaccagtt tgaatggtca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH1 primer reverse <400> 31 ggacttgccc aggtcatcta 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NICD3 primer forward <400> 32 agcactttgg gaattctgga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NICD3 primer reverse <400> 33 acgtccttgt gcagtgagaa 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NICD1 primer forward <400> 34 cctgagggct tcaaagtgtc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NICD1 primer reverse <400> 35 cggaacttct tggtctccag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human HEY1 primer forward <400> 36 catcgaggtg gagaaggaga 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human HEY1 primer reverse <400> 37 cgaaatccca aactccgata 20

Claims (13)

1. 삭제
2. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 것을 특징으로 하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체.
   
3. 제2항의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 코딩하는 유전자.
   
4. 제3항에 있어서, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
   
5. 제3항의 유전자를 함유하는 재조합벡터.
   
6. 제3항의 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 생산능을 가지는 재조합세포.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 HEK293인 것을 특징으로 하는 재조합세포.
   
8. 다음의 단계를 포함하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체의 제조방법:
   (a) 제7항의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 생산능을 가지는 재조합세포를 배양하여 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 생성하는 단계; 및
   (b) 생성된 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 회수하는 단계.
   
9. 제8항에 있어서, Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체는 Protein A 친화성 컬럼, SP-sepharose 컬럼 및 크기배제크로마토그래피를 가지고 FPLC를 이용해서 추가로 정제하는 것을 특징으로 하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체의 제조 방법.
   
10. 제2항의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 치료용 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
    
12. 제2항의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.

Images