CN109844122A - 包括双质粒载体的靶向脂肪细胞的非病毒性基因递送复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括sh(FABP4+FABP5)双质粒载体的靶向脂肪细胞的非病毒性基因递送复合物以及利用其的肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗，更详细地，所述基因递送复合物包括：靶向脂肪细胞的序列；九聚精氨酸(R9)肽；以及包括肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因的双质粒载体，所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因是抑制FABP4基因及FABP5基因的基因表达的碱基序列。本发明为治疗肥胖疾病，制备了能够同时抑制FABP4基因及FABP5基因的双质粒载体，并将其结合至向脂肪细胞特异性递送的特定递送体中而提供基因递送复合物，从而，仅指向脂肪细胞，不存在细胞毒性的同时具有优秀的肥胖治疗效果。

Description

包括双质粒载体的靶向脂肪细胞的非病毒性基因递送复合物
技术领域
本发明涉及包括sh(FABP4+FABP5)双质粒载体的靶向脂肪细胞的非病毒性基因递送复合物以及利用其的肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗。
背景技术
为替代传统的蛋白质治疗方法，已经开发出许多基因治疗方法，然而仍然存在需要解决的问题，其中之一是需要实现在最小细胞毒性下的通过质膜(在动物细胞中)和核膜的有效的基因注入(influx)。
基因治疗体系大体能够分为病毒载体介导的体系和非病毒载体介导的体系。使用逆转录酶病毒(retrovirus)或腺病毒(adenovirus)等构建的病毒载体，其优点是能够高效地转染(transfection)到细胞中，然而，具有在体内(in vivo)的免疫原性问题及与基因重组相关的内在问题。为克服这种病毒载体的稳定性问题，已经开发多种等效异位基因递送系统作为传统基于病毒载体的基因递送方法的替代方案。然而，等效异位基因递送系统具有例如内体逃逸(endosomal escape)和核定位(nuclear localization)的细胞内转运(trafficking)障碍的问题。由此，病毒载体具有免疫应答、自我复制，体内稳定性等问题，而通常的等效异位高分子载体的生物相容性低，由此导致细胞及生物毒性大，核酸递送效率低的问题。
一方面，基于合成多肽的基因递送系统在低pH下，引发在内体膜中的基因泄漏，由此使得DNA缩合，并且通过促进内体逃逸，能够克服等效异位基因递送系统的上述问题。基于此，已经开发出多种合成肽以在体外(in vitro)促进在数种细胞系中的基因递送。然而，这些合成肽在体内(in vivo)应用中仍存在毒性和血清不稳定性的问题。
对此，正在进行有关利用短阳离子肽的载体的研究，然而，仍存在一些问题，例如DNA在细胞外空间不稳定，以及与DNA的复合物的稳定性差和基因表达水平不充分的问题。进一步地，需要开发一种特定细胞的特异性基因递送载体，具有靶向特定细胞的能力，从而有利于DNA到靶向细胞中的注入以及DNA从复合物的释放，由此，提高期望基因的表达水平。
一方面，当靶细胞是脂肪细胞、特别是成熟的肥胖脂肪细胞时，上述细胞是最终分化的细胞，因此具有难以转染的问题。在现有研究中已经使用电穿孔法来转染脂肪细胞，然而，所报道的转染效率仅为约10％。此外，上述方法还没有尝试在体内(in vivo)基因递送系统中选择性地将基因递送到目标脂肪组织。
与此相关，本发明人根据通过将靶向脂肪细胞的序列(adipocyte targe tingsequence，ATS)及特定肽序列的复合物与成熟脂肪细胞中表达的阻抑素(prohibitin)结合，能够有效地将基因递送至脂肪细胞，研发出了非病毒性的靶向脂肪细胞的基因递送系统(韩国授权专利公报第10-1447901号)。例如，在上述文献中说明了以下内容：对于ATS序列及R9序列的复合物，将对脂肪酸结合蛋白质(fatty acid binding protein,FABP)进行编码的FABP4基因结合为shRNA的形态的基因递送复合物。
与此相关，目前公开有九种的FABP基因，其中，FABP4在脂肪细胞内对脂肪酸的转运与储存起到核心的作用。由此，在前述专利文献1中进行了如下尝试，即在制备包括shFABP4基因的基因递送复合物之后，通过在脂肪细胞内抑制FABP4的表达而实现肥胖治疗效果，然而，并未观察到充分的体重减少效果。由此，需要开发出使用非病毒性的靶向脂肪细胞的基因递送系统，获得有效的肥胖治疗效果的技术。
发明内容
要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种包括双质粒载体的靶向脂肪细胞的非病毒性基因递送复合物，从而，使用靶向脂肪细胞的基因递送体对用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因进行递送，由此，在治疗肥胖相关疾病的过程中，不存在细胞毒性的同时能够发挥优秀的肥胖治疗效果。
解决问题的技术方案
本发明为解决上述问题：
提供一种基因递送复合物，所述基因递送复合物包括：
靶向脂肪细胞的序列；
九聚精氨酸(R9)肽；以及
包括肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因的双质粒载体，
所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因是抑制FABP4基因及FABP5基因的基因表达的碱基序列。
根据本发明的一优选实施例，所述碱基序列能够是DNA或者RNAi。
根据本发明的另一优选实施例，所述RNAi能够是siRNA或者shRNA。
根据本发明的另一优选实施例，所述双质粒载体能够具有SEQ ID NO:1的碱基序列。
根据本发明的另一优选实施例，所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因比上所述靶向脂肪细胞的序列及所述九聚精氨酸(R9)肽的重量比能够为1:1至1:4。
根据本发明的另一优选实施例，所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因比上所述靶向脂肪细胞的序列及所述九聚精氨酸(R9)肽的重量比能够为1:2。
根据本发明的另一优选实施例，所述靶向脂肪细胞的序列能够具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
根据本发明的另一优选实施例，所述九聚精氨酸(R9)肽能够具有Cys-(D-R)9-Cys结构。
根据本发明的另一优选实施例，所述脂肪细胞能够是已分化的成熟肥胖脂肪细胞。
发明的效果
本发明为治疗肥胖疾病，制备了能够同时抑制FABP4基因及FABP5基因的双质粒载体，并将其结合至向脂肪细胞特异性递送的特定递送体中而提供基因递送复合物，从而，仅指向脂肪细胞，不存在细胞毒性的同时具有优秀的肥胖治疗效果。
附图说明
图1a为显示根据sh(FABP4+FABP5)质粒与ATS-9R的重量比的凝胶阻滞分析结果的附图；
图1b为显示根据sh(FABP4+FABP5)质粒与ATS-9R的重量比的复合物的大小的附图；
图2a为显示通过RT-PCR测量的相对于GAPDH的FABP4mRNA水平的结果的图表；
图2b为显示通过RT-PCR测量的相对于GAPDH的FABP5mRNA水平的结果的图表；
图3a为显示分别施用shFABP4/ATS9R、shFABP5/ATS9R、shFABP4/ATS9R+shFABP5/ATS9R，以及sh(FABP4/FABP5)/ATS9R的各个给药组的随着时间的体重变化的图表；
图3b为显示分别施用shFABP4/ATS9R、shFABP5/ATS9R、shFABP4/ATS9R+shFABP5/ATS9R，以及sh(FABP4/FABP5)/ATS9R的各个给药组的随着时间的血糖变化的图表；
图3c为显示通过西方墨点法，对分别施用shFABP4/ATS9R、shFABP5/ATS9R、shFABP4/ATS9R+shFABP5/ATS9R，以及sh(FABP4/FABP5)/ATS9R的各个给药组的脂肪组织进行摘除，从而检查毒性及炎症反应的结果的附图；
图3d为显示在分别施用shFABP4/ATS9R、shFABP5/ATS9R、shFABP4/ATS9R+shFABP5/ATS9R，以及sh(FABP4/FABP5)/ATS9R的各个给药组的脂肪组织中确认的FABP4及FABP5基因表达率(％)结果的图表。
具体实施方式
本发明中使用的术语定义如下。
“基因”是指在蛋白质编码或转录时、或者在调节其他基因表达时具有功能作用的任何核酸序列或其部分。基因能够由负责编码功能性蛋白质的全部核酸或者负责编码或表达蛋白质的核酸的仅一部分组成。核酸序列能够包含在外显子、内含子、起始区域或终止区域、启动子序列、其他调节序列或基因的独特相邻区域内的基因异常。
术语“多核苷酸(polynucleotide)”或“核酸(nucleic acid)”是指任意长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构，因此包括双链和单链的DNA和RNA。其还包括已知的修饰类型，例如现有技术中已知的标记(label)、甲基化、“帽(caps)”、用类似物取代一种或更多种天然存在的核苷酸、脱连结(例如膦酸甲酯(methyl phosphonate)、磷酸三酯(phosphotriester)、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯(carbarnate)等)和连结(例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)等)的那些修饰、包括例如蛋白质的侧基团(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽(signal peptide)、多聚-L-赖氨酸(poly-Llysine)等)的、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素(Psolalen)等)的、含有螯合物(例如金属元素、放射性金属元素、硼、氧化性金属元素等)的、含有烷化剂的、利用修饰连接(例如α异头(alpha anomeric)核酸等)的，以及具有未修饰形式的多核苷酸的核苷酸间修饰。一般地，本发明提供的核酸部分能够是包括基因组(genome)的片段和短的寡核苷酸连接子、或由一系列寡核苷酸、微生物或病毒操纵子(operon)、或真核基因的调控因子(regulatoryelement)的提供重组转录单元中表达的合成核酸的特有的核苷酸。
术语“载体(vector)”是指能够将另一种核酸输送到其已经连接的核酸的核酸分子。术语“表达载体(expression vector)”包括能够合成由载体携带的各个重组基因编码的蛋白质的质粒、黏粒(cosmid)或噬菌体(phage)。优选的载体是可以自我复制并表达与其结合的核酸的载体。
“转染(transfection)”是指通过将核酸(DNA或PNA等)直接引入动物培养细胞在细胞内表达其基因特性的方法。当目标是植物细胞时，在许多情况下去除细胞壁并将核酸引入到原生质体。通常，将期望的基因包含在运载体如质粒中并引入到核酸中。在许多情况下，引入的基因在细胞中得到稳定化时会插入到染色体中。将核酸引入到其中的细胞称为转导体。由于转导效率非常低，为提高效率开发出了许多方法，其中包括磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖处理、电穿孔和重分配(将称为脂质体的人工膜与制成DNA复合物的细胞进行融合的方法)等。
术语“氨基酸”和“氨基酸残基”是指天然氨基酸、非天然氨基酸和改性氨基酸。除非另有说明，通常或根据名称特别地，关于氨基酸的所有表述包括氨基酸的D-和L-立体异构体(当结构允许这种立体异构体形式)的全部两侧。天然氨基酸的实例包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯基丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、络氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括在N端氨基或侧链基团上化学改性的，或可逆地或不可逆地化学阻挡的改性氨基酸残基，例如，N-甲基化的D及L氨基酸或侧链官能团被化学改性成其他官能团的残基。
术语“支撑体或运载体(carrier)”是指生物体中的活性物质与其他物质结合存在的情况，或者负责穿过细胞膜实现物质移动的运载体运输的高分子物质的统称。载体的非限制性示例包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；其他糖类，如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇和山梨醇；形成盐的平衡离子(salt-forming counterion)，例如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。
术语“治疗”是为了获得包括临床结果在内的有益或所期望的结果的方法。疾病、失调或病症的“治疗”或“缓解”是指与未治疗病症、失调或疾病时相比，病症、失调或疾病和/或不期望的临床症状的程度减小，和/或病症、失调或疾病的进展受阻或延长。例如在肥胖的治疗中体重的减小，如重量减轻至少5％为优选的治疗结果。为实现本发明的目的，有益的或优选的临床结果不论是否能够验证，可以包括但不限于：一种或多种症状的减轻或改善、疾病程度减小、疾病的稳定(即没有恶化)状态、疾病进展的延迟或放慢、疾病状态的改善或缓解、和缓和(部分地或完全地)。“治疗”还可以指与未接受治疗时预期的存活相比其存活得到延长。并且“治疗”不一定受限于单次给药，能够通常通一系列给药来进行。因此，治疗上的有效量，缓解疾病的量，或者对疾病、失调或病症所需的量能够通过一次以上实施给药。
术语“失调”是指能够通过使用利用转基因动物模型识别的分子进行治疗并能够获益的任何状况。这其中有包括使哺乳动物易患疑难疾病的病理学条件的慢性和急性失调或疾病。本文中所涉及的疾病包括肥胖和代谢综合征，但并非限定于此。
“治疗上的有效量”是指使病症减轻的，研究者、兽医师、医师或其他临床医生所寻求的引发组织、系统、对象或人的生物或医学反应的组合物中的活性化合物的量。
“预防上的有效量”是指使具有肥胖或肥胖诱导的失调、病症或疾病的风险的对象防止肥胖或肥胖诱导的失调、病症或疾病的，研究者、兽医师、医师或其他临床医生所寻求的引发组织、系统、对象或人的生物或医学反应的组合物中的活性化合物的量。
术语“基因治疗(gene therapy)”是指通过修饰突变基因来治疗基因疾病或者通过使用基因或RNAi调节蛋白质表达来治疗疾病的方法。即，基因治疗是将外源正常基因移植到患者细胞中以改变细胞的表型来治疗疾病的方法。基因治疗中，必须进行对于实现体内基因转染的基因载体和体系的研究。
“约”是指相对于所参考的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度以30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％变化的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度。
整个说明书中，除非上下文需要，否则“包括”及“包含”是指包括所表述的步骤、或元素、或步骤或元素的组，但不排除任何其他步骤或元素、或步骤或元素的组。
下面，对本发明进行更详细的描述。
如前所述，本发明的目的在于，改善现有的治疗肥胖相关疾病的治疗剂的治疗效果，尤其，改善包括ATS序列、R9序列以及shFABP4基因的靶向脂肪细胞的递送系统所具有的问题。
即，即使是通过所述靶向脂肪细胞的递送系统，在靶向脂肪细胞中减少FABP4的表达时，也未能观察到满意的治疗效果，对此，本发明的发明人推断，上述结果是源于靶向脂肪细胞的补偿效果(compensation effect)。
具体地，当通过所述基因递送系统向靶向脂肪细胞递送shFABP4基因，靶向脂肪细胞内的FABP4基因的表达减少，由此，细胞内FABP4蛋白质的量减少。基于此，将脂肪酸转运并储存至脂肪细胞内的起到核心作用的FABP4蛋白质减少，由此，能够期待实现肥胖治疗效果，然而，实际观察到并未获得所预期的满意的肥胖治疗效果。这是由于与FABP4一起对肥胖诱导起到核心作用的FABP5基因的表达量作为对FABP4基因表达量减少的补偿而得到增加，由此，本发明的发明人表明，为获得有效的肥胖治疗效果，需要同时减少FABP4基因及FABP5基因的表达量。
一方面，由于现有的基因递送系统是只递送一种基因的基因递送系统，为了同时抑制两种基因，原则上各个基因需要两倍的基因递送体。然而，为了递送特定基因而增加基因递送体的量时，会引发细胞毒性的问题，本发明为解决上述问题，使用双质粒载体(dualplasmid vector)。即，本发明种将作为抑制对象的两种基因插入一种质粒内，当将相应质粒递送至对象细胞时，能够同时对两种基因进行抑制。
为此，本发明提供一种基因递送复合物，包括：
靶向脂肪细胞的序列；
九聚精氨酸(R9)肽；以及
包括肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因的双质粒载体，
所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因是抑制FABP4基因及FABP5基因的表达的碱基序列。
能够从下列实施例的结果中看到，通过使用本发明的基因递送复合物同时抑制FABP4基因及FABP5基因，相比对单一基因进行抑制具有更优秀的肥胖治疗效果，同时还能够实现减少肥胖组织内的炎症的效果。
对于本发明的基因递送复合物，所述靶向脂肪细胞的序列(adipocyte targetingsequence,ATS)及九聚精氨(R9)肽起到将治疗基因特异性地递送至脂肪细胞的作用。即，本发明的基因递送复合物是ATS及聚(寡精氨酸)，尤其是包括九聚精氨(R9)肽的非病毒性基因递送复合物，所述ATS-R9序列与脂肪细胞内的阻抑素(prohibitin)结合，能够向脂肪细胞内特异性地递送治疗基因。
本发明的基因递送复合物的构成成分中，对于所述ATS及九聚精氨(R9)肽的详细内容，在本发明人的在先技术韩国专利申请号第10-2013-0041402号中对其内容进行详细描述，相应内容全文引入此处。
通过本发明的复合物递送的用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因能够插入优选在目标脂肪细胞中表达的任何基因，包括DNA、RNA和它们的合成类似物。例如对多肽(酶、激素、生长因子、细胞因子、受体、结构蛋白等)、反义RNA、核酶、诱饵，和引起RNA干扰的RNA进行编码的基因。其具体实例包括gDNA、cDNA、pDNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、和拮抗剂等。它们能够是天然存在的或人工合成的，并且可以具有从寡核苷酸至染色体的各种大小。这些基因能够来源于人类、动物、植物、细菌、病毒等。并且，能够通过现有技术已知的方法获得。
由基因编码的所述多肽能够包括各种激素、组织相容的抗原、细胞黏附蛋白、细胞因子、各种抗体、细胞受体、胞内酶、胞外酶和其片段。并且，能够包括用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的基因表达调节因子，例如转录启动子、增强子、沉默子、操纵子、终止子、弱化子和其他表达调节因子。
优选地，用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因包括编码与肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗或诊断有关的多肽的基因。用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因特别优选为在肥胖疾病的基因治疗中有效的RNAi。
RNA干扰(RNAi)是自然机制，其通过双链的短干扰RNA(siRNA)特异性下调期望基因的表达。已知各种类型的RNAi介导剂，其实例包括短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和小发夹RNA(shRNA)。具体地，所述shRNA，能够使用同时抑制FABP4基因及FABP5基因的表达的sh(FABP4+FABP5)。用于施用RNAi的有效剂量和用药方案可以由本领域技术人员试验确认。RNAi可以以单次或多次进行给药。
一方面，构成所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因，以及本发明的基因递送复合物的其他成分，即所述靶向脂肪细胞的序列及所述R9肽的重量比也会对肥胖治疗效率产生影响，所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因:所述靶向脂肪细胞的序列及所述R9肽的重量比为1:1至1:4，更优选为1:2。所述靶向脂肪细胞的序列及所述R9肽的重量含量未达到所述范围时，存在无法与所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因相结合的问题，当超过所述范围时，复合物过大而具有无法注入细胞内的问题。
如前所述，本发明的基因递送复合物包括ATS及R9肽，这是九聚精氨酸(R9)肽与靶向脂肪细胞的序列(ATS)结合的结构(ATS-R9)。靶向脂肪细胞的序列(adipocytetargeting sequence,ATS)能够是现有技术中已知的ATS序列[Nature Medicine,2004June]。优选地，由下列SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列构成，但并非限定于此。
SEQ ID NO:2CKGGRAKDC
如本发明的发明人的在先技术，韩国专利申请号第10-2013-0041402号中的公开，所述ATS-R与脂肪细胞中的阻抑素(prohibitin)结合，阻抑素是在支撑脂肪细胞的血管内皮细胞中过表达的受体，并且是在成熟脂肪细胞和前脂肪细胞中都存在的ATS受体。特别地，阻抑素在肥胖中起重要作用，其在脂肪组织血管中高度表达，以及与分化之前相比在分化后倾向于从脂肪细胞的细胞核和线粒体迁移到质膜的特征，表明阻抑素是肥胖的潜在生物标志物。所述阻抑素较少在前脂肪细胞的质膜中分布，而更多地位于其细胞核与线粒体中，然而，位于已分化脂肪细胞的细胞核与线粒体中的阻抑素迁移至质膜，并在质膜中高度表达。也就是说，阻抑素随着脂肪细胞分化的进行而过表达。本发明的ATS-R9通过阻抑素介导的机制内化到脂肪细胞中。换言之，ATS在脂肪细胞靶向中起重要作用，并且所期望的基因的表达水平依赖于脂肪细胞中阻抑素的表达水平。
特别地，所述阻抑素在分化后的成熟脂肪细胞中比在分化前的脂肪细胞中更加过表达，因此，本发明的ATS-R9具有直接靶向已分化的成熟肥胖脂肪细胞的作用。具体地，靶向分化开始后9至11天的肥胖脂肪细胞的能力最为优秀，本发明中，术语“成熟脂肪细胞”和“肥胖脂肪细胞”具有相同的含义并且可交换使用。
并且，本发明的基因递送复合物，所述九聚精氨酸(R9)肽能够具有Cys-(D-R)9-Cys结构，该ATS-R9复合物，1)通过与在脂肪细胞中的阻抑素相互作用，显示优秀的转染及基因表达效率；2)提高递送后的转基因表达效率(transgene expression efficiency)，3)与DNA结合以形成纳米大小的复合物并具有正的ZETA电位值，容易通过细胞膜；4)具有极低的细胞毒性。
下面，通过实施例对本发明进行更详细的说明，然而，下列实施例仅作为帮助理解本发明，并非用于限定本发明。
细胞培养、肽制备、细胞染色、共聚焦显微镜观察、竞争分析、凝胶阻滞分析、ZETA电位和大小测量、体外(in vitro)转染效率测量、体外(invitro)细胞毒性分析、小鼠模型中的肥胖诱导、体内(in vivo)脂肪归巢、前脂肪细胞的分化、内化到脂肪细胞中的能力评价、确认根据分化程度靶向脂肪细胞的能力、确认在多种细胞中的阻抑素表达、测量寡肽复合物的物理和生物表征等以在韩国专利申请号第10-2013-0041402号中记载的相同的方法执行，所述专利申请内容全文引入本说明书。
实施例1.制备sh(FABP4+FABP5)双质粒载体
为制备sh(FABP4+FABP5)双质粒载体，使用为实现两种shRNA的表达的作为双RNAPolIII盒式载体的psiRNA-DUO(InvivoGen，美国)，具体过程如下。
旋转含有冻结的质粒的试管从而沉淀DNA，为获得1μg/μl的质粒溶液，将所述获得的DNA在20μl的灭菌水中再次悬浊，将再次悬浊后质粒在-20℃进行保存。为提高产出率，转染至所述再次悬浊E.coli(大肠杆菌)，执行质粒扩增过程。
接下来，使用作为限制酶的Bbs I(NEB,2单位酶/μg质粒DNA)对psiRNA-DUO质粒进行处理，使用0.7％低熔点琼脂糖凝胶洗脱大的片段(3180bp)后，稀释提纯的DNA片段获得0.1μg/μl的溶液(Gus盒)。并且，使用Acc 65I及Hind III(与NEB酶，NEBuffer 2+BSA使用)处理psiRNA-DUO质粒，使用0.7％低熔点琼脂糖凝胶洗脱大的片段(3150bp)后，稀释提纯的DNA片段获得0.1μg/μl的溶液(LacZ盒)。
为将sh(FABP4+FABP5)克隆至psiRNA-DUO内，同时使用Acc65I、Hind III，及Bbs I处理psiRNA-DUO，使用将两种psiRNA-DUO切片(Hind III/Bbs I及Bbs I/Acc65I)与两种插入shRNA同时连接的一步过程，或者，使用克隆第一种插入shRNA之后，克隆剩余的第二种插入shRNA的两步过程。克隆的详细过程可参考InvivoGen公司的psiRNA-DUO使用手册(Catalog#ksirna4-gz3)。
实施例2.sh(FABP4+FABP5)质粒与ATS-9R的含量比最优化
为最优化sh(FABP4+FABP5)质粒与ATS-9R的含量比，使用凝胶阻滞分析方法(gelretardation assay)，将1μg的DNA、去离子水，以及ATS-9R按照不同的重量比在室温下培养30分钟，以制备寡肽复合物(oligo-peptoplex)。使用Zetasizer-Nano ZS(MalvenInstruments，英国)DLS测量寡肽复合物的平均直径和表面ZETA电位。图1a及1b中，显示了根据sh(FABP4+FABP5)质粒与ATS-9R的重量比的凝胶阻滞分析结果及复合物的大小，参照图1b，sh(FABP4+FABP5)质粒:ATS-9R的重量比为1:2时能够导出最优的大小。
实施例3.确认根据本发明的转染基因递送复合物的脂肪细胞的FABP4及FABP5表 达量
将作为小鼠来源的脂肪细胞的3T3-L1细胞分化为脂肪细胞，之后，对分化的脂肪细胞中进行加扰(scrambled)shFABP4+ATS9R、shFABP4+ATS9R、shFABP5+ATS9R、sh(FABP4/FABP5)+ATS9R处理，在48小时后利用RNeasy Lipid tissue Mini试剂盒(Qiagen)只将RNA从细胞中进行分离，并合成cDNA。之后，使用Cyber premix EX taq RT-PCR试剂盒，通过RT-PCR测量对相对于作为内源对照组(endogenous control)的GAPDH的FABP4、FABP5mRNA水平进行测量。图2a及2b显示了测量结果，参照图2a及2b，在通过体外实验的成熟脂肪细胞中，实际处理作为双质粒载体的sh(FABP4/FABP5)+ATS9R时，确认FABP4、FABP5的mRNA量减少。并且，当减少FABP4时，能够确认(shFABP4+ATS9R)组中的FABP5mRNA的量得到增加，由此能够得出，为获得最佳的肥胖抑制治疗效果，需要同时抑制FABP4及FABP5。
实施例4.通过动物实验，确认本发明的基因递送复合物的肥胖治疗效果
向C57BL6/6N小鼠喂养60kcal高脂肪减肥饲料2至3个月后，选择体重为45g以上的小鼠，按照一周两次的频率通过IP注射法施用shFABP4/ATS9R、shFABP5/ATS9R、shFABP4/ATS9R+shFABP5/ATS9R，以及本发明的作为基因递送复合物的sh(FABP4/FABP5)/ATS9R。
首先，按照各给药组观察了随着时间的体重变化。图3a中显示了各给药组的随着时间的体重变化的图表，参照图3a，其余组体重减轻效果不明显，然而根据本发明的基因递送复合物的给药组，在8周后显示出体重减少20％的效果。
之后，通过ITT分析，观察各给药组的随着时间的血糖(Blood glucose)变化。图3b中显示了各给药组的随着时间的血糖变化的图表，参照图3b，能够确认根据本发明的基因递送复合物给药组，显示出明显的血糖降低效果。
之后，摘除小鼠的脂肪组织，通过西方墨点法检查了毒性及炎症反应，具体地，在包括pH 8.0的10mM Tris-HCl、1mM EDTA、140mM NaCl、0.1％SDS、0.1％脱氧胆酸钠、1％Triton X-100，以及蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA缓冲液进行溶菌，之后在4℃培养15分钟，之后在4℃，以14000g的速度进行15分钟的离心分离，之后将上层液作为样品进行使用。使用SDS-PAGE对样品进行电泳，之后移至聚偏氟乙烯(PVDF)进行西方墨点法。图3c显示了西方墨点法结果，参照图3c，相比其他组，在进行sh(FABP4/FABP5)+ATS9R处理的组中，作为炎症标志物的TNF-α得到减少。
之后，在小鼠脂肪组织中，观察了各给药组的FABP4及FABP5基因表达率(％)。图3d显示了各基因表达率(％)的结果，参照图3d，相比其他组，处理sh(FABP4/FABP5)+ATS9R的组中，FABP4及FABP5基因的表达旅显著减少。
工业实用性
本发明的基因递送复合物，将作为肥胖相关治疗基因的FABP4基因及FABP5基因特异性地递送至脂肪细胞，同时，实现对两种基因的抑制，由此，不存在细胞毒性并且具有良好的肥胖治疗效果，能够有效适用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的基因治疗方法中。

Claims (9)

1.一种基因递送复合物，所述基因递送复合物包括：
靶向脂肪细胞的序列；
九聚精氨酸肽；以及
包括肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因的双质粒载体，
所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因是抑制FABP4基因及FABP5基因的基因表达的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的基因递送复合物，
所述碱基序列是DNA或者RNAi。
3.根据权利要求2所述的基因递送复合物，
所述RNAi是siRNA或者shRNA。
4.根据权利要求1所述的基因递送复合物，
所述双质粒载体具有SEQ ID NO:1的碱基序列。
5.根据权利要求1所述的基因递送复合物，
所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因:所述靶向脂肪细胞的序列及所述九聚精氨酸肽的重量比为1:1至1:4。
6.根据权利要求1所述的基因递送复合物，
所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因:所述靶向脂肪细胞的序列及所述九聚精氨酸肽的重量比为1:2。
7.根据权利要求1所述的基因递送复合物，
所述靶向脂肪细胞的序列具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的基因递送复合物，
所述九聚精氨酸肽具有Cys-(D-R)9-Cys结构。
9.根据权利要求1所述的基因递送复合物，
所述脂肪细胞是已分化的成熟肥胖脂肪细胞。
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