CN105377305A - 靶向脂肪细胞的非病毒基因递送体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于靶向脂肪细胞的基因递送体系和使用该基因递送体系的用于肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗体系,更具体地,涉及直接靶向已分化的肥胖(成熟)脂肪细胞并含有靶向脂肪细胞的序列(ATS)-精氨酸(R9)肽的非病毒基因递送体系。
Description
技术领域
本发明涉及靶向脂肪细胞的非病毒基因递送体系和用于使用该基因递送体系来治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗体系。更具体地,本发明涉及包括靶向脂肪细胞的序列(ATS)和九聚精氨酸(R9)肽的非病毒基因递送体系,其中基因递送体系直接靶向已分化的肥胖(成熟)脂肪细胞。
背景技术
已经开发了各种基因治疗方法作为传统蛋白质治疗方法的替代。然而,在基因治疗中仍存在重要挑战。基因治疗的主要挑战之一是在最小细胞毒性下实现基因穿过质膜(在动物细胞中)和核膜的有效注入。
在广义上,基因治疗体系可以被分成病毒载体介导的体系和非病毒载体介导的体系。病毒载体是使用逆转录酶病毒或腺病毒构建的,并具有高转染到细胞中的效率的优势。然而,病毒载体具有与体内免疫原性相关的问题并且遭受与基因重组相关的固有问题。在克服这种病毒载体的稳定性问题的尝试中,已经开发多种等效异位基因递送体系作为传统基于病毒载体的基因递送策略的替代方案。为了有效的基因递送,等效异位载体需要克服细胞内的转运障碍,如内体逃逸和核定位。
另一方面,在低pH下在内体膜中从基于合成肽的基因递送体系发生基因泄漏,这导致DNA缩合和快速的内体逃逸。因此,基于合成肽的基因递送体系的使用可以克服等效异位基因递送体系遇到的问题。因此,已经开发多种合成肽以在数种细胞系中促进体外基因递送。然而,这些合成肽在体内应用中也遭受毒性和血清不稳定性的问题。
如上所述,病毒载体具有免疫应答、自我复制和体内稳定性的问题,而普通等效异位载体具有以下问题:高细胞毒性和生物毒性以及由于其差的生物相容性引起的低核酸递送效率。
关于这点,正在进行关于使用短阳离子肽的载体的研究。即使在这种情况下,也存在一些问题,如在细胞外空间不稳定的DNA。载体的其他问题是与DNA的复合物的稳定性差和基因表达水平低。
在这些环境下,存在开发一种特异性针对特定细胞的基因递送载体的需求,所述基因递送载体具有靶向特定细胞的能力,并有利于DNA到靶向细胞中的注入和DNA从复合物的释放,实现期望基因的高表达水平。
在这一点上,脂肪细胞、特别是成熟的肥胖脂肪细胞是最终分化的细胞并因此很难转染。在先前的研究中,已经使用电穿孔法来转染脂肪细胞,但是所报道的转染效率仅为约10%。此外,在体内基因递送体系中,该方法还没有尝试选择性地将基因递送到目标脂肪组织。
因此,本发明人研究了非病毒基因递送体系,结果首次发现以下机制:其中由特定肽和靶向脂肪细胞的序列(ATS)构成的肽复合物与成熟脂肪细胞中表达的阻抑素(prohibitin)结合,直接靶向肥胖脂肪细胞,将基因递送到脂肪细胞中,并促进基因的表达,因此适合于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征。基于该发现完成了本发明。
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的一个主要目的是提供一种靶向脂肪细胞的基因递送体系和其中将期望的基因与基因递送体系结合的复合物。
本发明的另一目的是使用基因递送体系来递送用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因。
本发明的又一目的是提供用于预防或治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的药物组合物。
用于解决问题的手段
本发明的一个方面提供含有靶向脂肪细胞的序列(ATS)和九聚精氨酸(R9)肽的靶向脂肪细胞的基因递送体系。
靶向脂肪细胞的序列和九聚精氨酸(R9)肽结合至阻抑素,并内化到脂肪细胞中。
特别地,九聚精氨酸(R9)肽优选具有Cys-(D-R)9-Cys结构,而靶向脂肪细胞的序列可以由SEQIDNO:1中所述的氨基酸序列构成。
脂肪细胞优选为已分化的成熟肥胖脂肪细胞,特别是在分化开始后第9至11天的成熟肥胖脂肪细胞。
本发明还提供含有靶向脂肪细胞的序列、九聚精氨酸(R9)肽、和用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的靶向脂肪细胞的治疗基因的复合物。
具体地,复合物具有其中用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因如DNA、siRNA或shRNA与基因递送体系结合的结构。基因递送体系的构成与以上所述的相同。用于肥胖治疗的治疗基因最优选为iRNA(RNA干扰基因),如siRNA或shRNA。
用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因的复合物具有200nm或更小的直径。特别地,纳米尺寸的复合物具有3:1至8:1的电荷比(+/-)。在该范围内,确保高转染效率。更优选地,复合物具有5:1至8:1的电荷比(+/-)。因为细胞膜带负电荷,所以当基因递送复合物作为整体带正电荷时获得高的递送效率。带正电荷的复合物可以通过电荷与电荷的相互作用容易地穿过细胞膜。如果复合物带负电荷,则其不容易地穿过细胞膜。复合物的电荷的量影响复合物穿过细胞膜的能力。越大量的电荷显示越好的穿过细胞膜的能力。
本发明还提供用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗组合物,其含有靶向脂肪细胞的序列、九聚精氨酸(R9)肽、和作为活性成分的用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的靶向脂肪细胞的治疗基因。用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因可以是DNA或iRNA,如siRNA或shRNA。
本发明的ATS-R9与脂肪组织脉管系统中的阻抑素结合,之后内化到脂肪细胞中。简言之,本发明的ATS-R9通过阻抑素靶向成熟脂肪组织脉管系统并与成熟脂肪组织脉管系统结合,穿过血管,并内化到脂肪细胞中。因此,本发明的ATS-R9特异性地靶向脂肪细胞,特别是其中大量表达阻抑素的已分化的成熟肥胖脂肪细胞,使得其可以将期望的基因递送至脂肪细胞。
本发明的靶向脂肪细胞的非病毒基因递送体系具有期望基因的高转染效率、低细胞毒性和高表达效率。由于这些优势,本发明的基因递送体系在期望基因的递送中是有效的。
本发明的效果
本发明的ATS-R9肽结构能够通过阻抑素在分化后的脂肪细胞中的过表达的机制直接靶向成熟肥胖脂肪细胞,以将基因递送到脂肪细胞。因为该特异性功能和效果,本发明的ATS-R9肽结构在用于肥胖的基因治疗中会非常有用。
附图说明
图1是示出通过本发明的ATS-R9寡肽复合物将靶向基因递送至脂肪细胞的机制的示意图。
图2示出根据脂肪细胞分化程度的关于3T3-L1脂肪细胞的定量分析和油红O染色的结果。
图3和4示出ATS-R9的时间依赖的细胞内分布(内化)以证明ATS-R9对脂肪细胞的特异性结合亲和力。
图5示出根据3T3-L1脂肪细胞分化程度的阻抑素的分布。
图6将通过蛋白质印迹确定的非肥胖小鼠中阻抑素和肌细胞的表达与肥胖小鼠中阻抑素和肌细胞的表达进行比较。
图7示出ATS-R9浓缩和保护DNA的能力的凝胶阻滞分析和小鼠血清中DNA降解的测试的结果。
图8示出ATS-R9/DNA寡肽复合物的ζ电势和平均直径。
图9示出细胞活性分析的结果以评价ATS-R9/DNA寡肽复合物的毒性。
图10示出寡肽复合物的转染效率。
图11示出使用食源性肥胖(DIO)小鼠的情况下ATS-R9对脂肪组织的靶向效果。
图12和13将ATS-R9的体内归巢能力与R9的体内归巢能力进行比较。
图14示出ATS-R9的体内基因表达效果。
图15示出ATS-R9在体外和体内递送sh-RNA和沉默基因的能力。
图16示出在用sh-FABP4-ATS-R9寡肽复合物处理后体重的减少。
图17和18示出在用sh-FABP4-ATS-R9寡肽复合物处理后胰岛素和葡萄糖耐受性的改变。
图19示出比较ATS-R9递送基因的能力与作为对照的PEI和lipofectamine递送基因的能力的图。
图20是比较在脂肪细胞分化之前和之后ATS-R9的基因递送效力的图。
实施发明的最佳方式
本文中所使用的术语的定义如下。
“基因”意思是在编码或转录蛋白质、或者调节其他基因表达中具有功能作用的任何核酸序列或其部分。基因可以由负责编码功能性蛋白质的全部核酸或者负责编码或表达蛋白质的核酸的仅一部分组成。核酸序列可以包含在外显子、内含子、起始区域或终止区域、启动子序列、其他调节序列或基因的独特相邻区域内的基因异常。
术语“多核苷酸”或“核酸”是指任意长度的核苷酸的聚合形式,如脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构,因此包括双链和单链的DNA和RNA。其还包括已知的修饰类型,例如现有技术中已知的标记、甲基化、“帽”、用类似物取代一种或更多种天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰如利用不带电荷的连结(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和利用带电荷的连结(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修饰、含侧基团例如蛋白质(包括例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)的那些、利用嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合物(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷化剂的那些、利用修饰连接(例如α异头核酸等)的那些,以及未修饰形式的多核苷酸。一般地,本发明提供的核酸片段可以由基因组的片段和短的寡核苷酸连接子、或由一系列寡核苷酸、或由单个核苷酸组成,以提供能够在包括来源于微生物或病毒操纵子、或真核基因的调控因子的重组转录单元中表达的合成核酸。
术语“载体”是指能够将另一种核酸输送到其已经连接的核酸的核酸分子。术语“表达载体”意在包括质粒、黏粒或噬菌体,其可以合成由载体携带的重组基因编码的神经突蛋白(Neuritin,CPG15)。优选的载体是可以自我复制并表达与其结合的核酸的载体。
“转染”意思是以下这种方法:通过该方法,将核酸(例如DNA或RNA)直接引入到动物培养细胞以表达其基因特性。当目标是植物细胞时,在许多情况下将细胞壁去除并将核酸引入到原生质体。该方法使得能够研究医学科学和生物学中的许多问题,例如在细胞水平上的致癌机制、感染、免疫、生成和信息递送。一般地,将期望的基因包含在运载体如质粒中,并引入到核酸中。在许多情况下,当在细胞中稳定化时将引入的基因插入到染色体中。已经将核酸引入到其中的细胞被称为“转导体”。已经开发数个方法来克服低转导效率的问题。这种方法的实例包括磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖处理、电穿孔和重分配(称作脂质体的人工膜与细胞的融合以用于DNA络合)。
“ζ电势”意思是由在结合至带电颗粒表面的固定水与可从颗粒容易地分开的可移动水的扩散双层中正电荷的密度梯度引起的电动电势。ζ电势也表示为细胞表面与周围培养流体之间的电势差。
在用作基因递送体系的复合物中术语“电荷比”意思是当带负电的DNA与带正电的支撑体或运载体通过静电引力结合时支撑体或运载体的电荷量与DNA的电荷量的比。当复合物作为整体带正电时,获得良好的递送效率,细胞膜带负电的事实解释了这一点。
术语“氨基酸”和“氨基酸残基”意在包括天然氨基酸、非天然氨基酸和改性氨基酸。除非另有说明,关于氨基酸的所有陈述都包括氨基酸的一般陈述和根据其名称的氨基酸的D-和L-立体异构体(只要其结构允许这种立体异构体形式)的特殊陈述。天然氨基酸的实例包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯基丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、络氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括在它们的N端氨基或它们的侧链基团上可逆地或不可逆地化学改性的、或化学地阻挡的改性氨基酸残基,例如,其侧链官能团被化学地改性成其他官能团的N甲基化的D和L氨基酸或残基。
术语“祖细胞”是指具有自我更新能力和分化潜力的未分化细胞,但是是最终会分化成预定类型的细胞的细胞。祖细胞专用于分化途径,并且一般不表达标志物或用作成熟的完全分化的细胞。因此,祖细胞分化成相关细胞类型,但是在正常状态下可以形成多种细胞类型。在本发明中,使用会分化成脂肪细胞的前脂肪细胞。
术语“分化”是指这样一种现象:其中细胞的结构或功能在其分裂、增殖和生长期间特异化,即器官的细胞或组织的特征或功能改变以执行给予细胞或组织的工作。在本发明中,该术语用于描述已分化的成熟脂肪细胞。
“萤光素酶”是催化萤光素的氧化以将化学能转换成光能从而实现光发射的酶。萤光素酶起类似报告基因的作用,其体内表达被实时连续地测量并且可以证实其对目标物质的作用。萤光素酶可从昆虫如萤火虫的身体直接获得。或者,萤光素酶可以通过在包含编码该酶的重组DNA片段的微生物中的表达来获得。
术语“支撑体或运载体”共同指当活性物质以与生物体中其他物质结合的形式存在或物质移动穿过细胞膜时负责运载体运输的聚合物材料。适合在本发明中使用的支撑体的非限制性实例包括:缓冲剂,如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸;抗氧化剂,如抗坏血酸;低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;其他糖类,如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖和糊精;螯合剂,如EDTA;糖醇,如甘露醇和山梨醇;形成盐的平衡离子,例如钠;和/或非离子表面活性剂,如聚乙二醇(PEG)和
术语“治疗”是获得有益的或期望的结果、包括临床结果的方法。疾病、失调或病症的“治疗”或“缓解”意思是与未治疗病症、失调或疾病时相比,病症、失调或疾病和/或不期望的临床症状的程度减小,和/或病症、失调或疾病的进展受阻或延长。在肥胖的治疗中,例如,期望的结果可以是体重的减小,例如至少5%的重量减轻。为了本发明的目的,有益的或期望的结果可以包括但不限于:一种或多种症状的减轻或改善、疾病程度减小、疾病的稳定(即没有恶化)状态、延迟或放慢疾病进展、疾病状态的改善或缓解、和缓和(不论部分的或全部的),不论可检测的或不可检测的。“治疗”还可以指与未接受治疗时预期的存活相比延长的存活。“治疗”不一定受限于施用单次给药,而通常通过施用一系列给药来进行。因此,治疗上有效的量,即足以缓解疾病、失调或病症的量或足以治疗疾病、失调或病症的量可以施用一次或更多次。
术语“失调”是会从使用利用转基因动物模型识别的分子的治疗获益的任何状况。这包括慢性和急性疾病或病,其包括使哺乳动物易患所讨论疾病的病理学情况。本文中待治疗疾病的非限制性实例包括肥胖和代谢综合征。
“治疗上有效的量”是指会引起研究者、兽医、医师或其他临床医生所寻求的对其有需要的组织、系统、对象或人的生物或医学反应(包括待治疗的失调的症状的减轻)的组合物中活性化合物的量。
“预防上有效的量”是指会引起研究者、兽医、医师或其他临床医生所寻求的对其有需要的组织、系统、对象或人的生物或医学反应(包括待治疗的失调的症状的减轻),以防止有肥胖或肥胖诱导的失调、病症或疾病的风险的对象中肥胖或肥胖诱导的失调、病症或疾病发作的组合物中活性化合物的量。
术语“基因治疗”指的是通过修饰突变基因来治疗基因疾病或者通过使用基因或RNAi调节蛋白质表达来治疗疾病。换言之,基因治疗是用于通过将外源正常基因移植到患者细胞中以改变细胞的表型来治疗疾病的方法。用于人类精子、卵细胞和胚胎的基因治疗的伦理问题在世界各地目前是有争议的。自从1993年制定“基因治疗临床研究指南(GuidelinesforGeneTherapyClinicalResearch)”以来,基因治疗的时代已经开始。用于体内基因转染的基因载体和体系的研究对于基因治疗是重要的。
“约”意思是相对于参考的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度以多至30%、25%、20%、25%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%变化的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度。
整个说明书中,除非上下文需要,否则单词“包括(包含)”及其变体应被理解为意味着包括所陈述的步骤、或元素、或步骤的组、或元素的组,但不排除任何其他步骤、或元素、或步骤的组、或元素的组。
以下会更详细地描述本发明。
本发明涉及核酸的细胞内递送(转染),并特别地涉及靶向脂肪细胞的治疗基因如DNA、siRNA和shRNA的递送,以使用递送体系直接靶向脂肪细胞来治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征。
在一个方面,本发明提供包含靶向脂肪细胞的序列(ATS)和聚(寡精氨酸)、特别是九聚精氨酸(R9)肽的靶向脂肪细胞的基因递送体系。特别地,本发明提供包含靶向脂肪细胞的序列(ATS)和可还原的聚(寡精氨酸)的非病毒基因递送载体。
非病毒基因递送载体共同指在不使用病毒的情况下将基因转移到细胞中的运载体。这种非病毒基因递送载体的代表性实例是基于载体上的阳离子位点与带负电荷的核酸构成的基因上的阴离子位点之间的电相互作用包覆核酸的载体。
聚(寡精氨酸)包括聚(寡-L-精氨酸)和聚(寡-D-精氨酸),最优选聚(寡-D-精氨酸)。高分子量的聚(寡-D-精氨酸)有效地促进DNA的缩合以形成稳定的复合物并使DNA内化到细胞中。在内化后,复合物通过二硫键的还原从核内体逃逸到细胞质空间。
可还原的聚(寡-D-精氨酸)优选由阳离子寡聚体构成,其每一个都包括在末端位置由二硫键交联的半胱氨酸残基,但不限于此。半胱氨酸是含有能够与相邻半胱氨酸交联以形成二硫化物的巯基的唯一氨基酸。除了由二硫键交联的半胱氨酸残基外蛋白质转导结构域(PTD)部分可以变成任何阳离子肽。例如,可还原的聚(寡-D-精氨酸)可以由Cys-(D-R)9-Cys重复单元构成。可还原的聚(寡-D-精氨酸)可以通过Cys-(D-R)9-Cys重复单元的末端半胱氨酸硫醇基的DMSO氧化来制备。通过利用还原剂的处理可以将可还原的聚(寡-D-精氨酸)裂解成Cys-(D-R)9-Cys片段。
换言之,可还原的聚(寡-D-精氨酸)可以由9个精氨酸残基构成。优选地,可还原的聚(寡-D-精氨酸)具有Cys-(D-R)9-Cys结构。在两个末端位置Cys残基的存在使得寡肽复合物(肽复合物)能够有效缩合,并允许得到的复合物具有中性电荷特征。
本发明的基因递送体系包括九聚精氨酸(R9)肽和靶向脂肪细胞的序列(ATS)。具体地,本发明的基因递送体系包括其中九聚精氨酸(R9)肽与靶向脂肪细胞的序列(ATS)结合的结构。
靶向脂肪细胞的序列(ATS)可以是现有技术中已知的那些中的任一种。例如,靶向脂肪细胞的序列(ATS)可以在NatureMedicine(2004年6月)中找到。优选地,靶向脂肪细胞的序列(ATS)由SEQIDNO:1中所述的氨基酸序列构成:
SEQIDNO:1:CKGGRAKDC
本发明的ATS-R9特异性地与脂肪细胞中的阻抑素结合。
阻抑素是在支撑脂肪细胞的血管内皮细胞中过表达且在成熟脂肪细胞和前脂肪细胞中都存在的ATS受体。因此,可以通过确定阻抑素与ATS而非其抗体的结合的能力来确认阻抑素的表达位置和水平。
特别地,阻抑素在肥胖中起重要作用。阻抑素在脂肪组织血管中高度表达,且与分化之前相比在分化后倾向于从脂肪细胞的细胞核和线粒体迁移到质膜。该特征表明阻抑素可以是肥胖的潜在生物标志物。阻抑素在前脂肪细胞的质膜中较少分布,而更大量地位于其细胞核与线粒体中。然而,位于已分化脂肪细胞的细胞核与线粒体中的阻抑素迁移至质膜,并在质膜中高度表达。也就是说,阻抑素随着脂肪细胞分化的进行而过表达。
本发明的ATS-R9通过阻抑素介导的机制内化到脂肪细胞中。换言之,ATS在脂肪细胞靶向中起重要作用,并且所期望的基因的表达水平依赖于脂肪细胞中阻抑素的表达水平。
特别地,阻抑素在分化后的成熟脂肪细胞中比在分化前的脂肪细胞中更加过表达。因此,本发明的ATS-R9具有直接靶向已分化的成熟肥胖脂肪细胞的作用,这可以在实验实施例1中得到证实。本发明的ATS-R9具有靶向成熟肥胖脂肪细胞、特别是分化开始后9至11天的那些的最佳能力。术语“成熟脂肪细胞”和“肥胖脂肪细胞”在本文中具有相同的含义并且可交换地使用。
因此,本发明涉及用于通过使用靶向肥胖脂肪细胞的基因递送体系将特异性基因有效地递送至脂肪细胞的方法和相关体系。靶向肥胖脂肪细胞的特异性基因可以是用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的已知治疗基因。
在另一方面,本发明提供含有以下的复合物:靶向脂肪细胞的序列(ATS)、九聚精氨酸(R9)肽、和用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的靶向脂肪细胞的治疗基因,其中期望的基因与基因递送体系结合。
目标细胞也可以是与能够分化成脂肪细胞的前脂肪细胞相对应的细胞,但最优选是成熟脂肪细胞(例如肥胖脂肪细胞、白脂肪细胞和棕脂肪细胞)。
前脂肪细胞包括间充质干细胞和基质细胞以及能够直接分化成脂肪细胞的细胞,所述间充质干细胞和基质细胞保持分化成各种细胞、包括脂肪细胞的潜力。这些细胞也可以是来自人类或非人类哺乳动物的脂肪组织的原代培养细胞。细胞也可以是已确立的培养细胞系。
脂肪组织的合适来源的实例包括皮下脂肪和内脏脂肪,但不限于此。在收集后导致损害个体功能的风险较小的脂肪组织非常适于作为目标细胞的来源。间充质干细胞和基质细胞可以从骨髓和其他组织收集。
通过本发明的复合物递送的用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因可以是在目标脂肪细胞中表达的任何合适的基因,其实例包括DNA、RNA和它们的合成类似物。合适的基因包括编码多肽(酶、激素、生长因子、细胞因子、受体、结构蛋白等)的基因、反义RNA、核酶、诱饵和引起RNA干扰的RNA,其具体实例包括gDNA、cDNA、pDNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、和拮抗剂。它们可以是天然存在的或人工合成的,并且可以具有寡核苷酸至染色体的各种大小。这些基因可以来源于人来、动物、植物、细菌、病毒等,且可以通过现有技术已知的方法获得。
由基因编码的多肽可以包括各种激素、组织相容的抗原、细胞黏附蛋白、细胞因子、各种抗体、细胞受体、胞内酶、胞外酶和其片段。本发明的复合物可以包括用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的基因表达调节因子,例如转录启动子、增强子、沉默子、操纵子、终止子、弱化子和其他表达调节因子。
优选地,用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因包括编码与肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗或诊断有关的多肽的基因。用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因特别优选为在肥胖疾病的基因治疗中有效的RNAi。
RNA干扰是自然机制,其包括通过双链的短干扰RNA(siRNA)特异性下调期望基因的表达。已知各种类型的RNAi介导剂,其实例包括短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和小发夹RNA(shRNA)。
因此,在另一方面,本发明提供用于治疗肥胖或肥胖诱导的代谢综合征的组合物,其包含含有靶向脂肪细胞的序列(ATS)、九聚精氨酸(R9)肽、和用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的靶向脂肪细胞的治疗基因的复合物。
如先前所述,用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因优选为在肥胖疾病的基因治疗中有效的基因,例如RNAi。
用于施用RNAi的有效剂量和用药方案可以由本领域技术人员试验确认。RNAi可以以单次给药或多次给药施用。
另一方面,本文中使用的术语“肥胖和肥胖诱导的代谢综合征”一般被定义为具有超过30的身体质量指数(BMI)。为了本发明的目的,需要或希望防止进一步体重增加的所有目标,包括具有小于30的BMI的那些落入“肥胖”的范畴。
基因以带负电荷的大聚合物链的形式存在。因此,当基因单独存在时,其采取相对大体积的无规卷曲的形式。该形式使得基因难以递送至细胞。因此,有必要使基因减小为更小的纳米颗粒。在本发明中,基于ATAS-R9与基因的静电相互作用使复合物的大小减小至纳米范围。本文中使用的术语“生物可降解的键”指的是通过溶解水解或通过酶、生物体等的作用裂解以使物质转变成较小的复合中间体或最终产物的键。特别地,当本发明的二硫键合的ATS-R9进入脂肪细胞时,其裂解成较低分子量的分子,因此,可以从复合物释放期望的基因。
根据本发明的用于将物质递送至脂肪细胞的递送体系和复合物具有以下优势。
(1)本发明的ATS-R9中的ATS在脂肪细胞靶向中起重要作用。
本发明的ATS-R9递送体系通过与在脂肪细胞中表达的阻抑素结合来靶向脂肪组织内皮细胞。换言之,ATS靶向脂肪细胞,并通过阻抑素介导的机制内化到脂肪细胞中。特别地,目标细胞最优选为其中阻抑素过表达的已分化的成熟肥胖细胞。
在下文的实施例部分中,证实用游离ATS的预处理减少萤光素酶基因表达。这表明ATS-R9寡肽复合物通过结合至阻抑素进入细胞。本发明的ATS-R9显示比PEI和R9更高的转染效率和基因表达效率。
为了基因递送体系的高效率,支撑体应当能够穿过核膜,并且应当将基因运载递送到细胞核。因为阻抑素在成熟脂肪细胞的细胞核中高度表达,所以ATS-R9应快速穿过细胞核。这有力地表明ATS(一种靶向阻抑素的部分)在有效靶向脂肪细胞和在脂肪细胞中的选择性基因表达中非常重要。换言之,阻抑素成为用于选择性转染成熟脂肪细胞的潜在目标。
(2)本发明的ATS-R9在递送后提高用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因的转基因表达效率。
基因在本发明的ATS-R9中以≥3:1、优选3:1至8:1、更优选5:1至8:1的电荷比(+/-)缩合,实现ATS-R9的高转染效率。特别地,在下文的实施例部分中,本发明的递送体系在5:1的电荷比下显示最高的基因转染效率。
电荷比是指构成递送体系的带正电荷的精氨酸与构成基因的带负电荷的磷酸基团的比。在本发明中,使带负电荷的基因与3至8倍过量的递送体系反应。换言之,3:1至8:1的电荷比表明递送体系的量为期望基因的量的3至8倍。
因为细胞膜带负电荷,所以在基因递送复合物作为整体带正电荷时,获得高的递送效率。带正电荷的复合物可以通过电荷与电荷的相互作用容易地穿过细胞膜。如果复合物带负电荷,则其不容易穿过细胞膜。复合物的电荷的量影响复合物穿过细胞膜的能力。更大量的电荷显示更好的穿过细胞膜的能力。
另一方面,脂肪细胞分化的程度会影响ATS-R9的转染效率。ATS-R9的转染效率逐渐增加直到分化的第10天。随着分化的程度和已分化脂肪细胞的数量增加,阻抑素被上调,这增加了ATS-R9的转染效率。在下文的实施例部分中,证实ATS-R9在分化开始后第9至11天具有对成熟肥胖脂肪细胞的最高转染效率。
如上所述,本发明的复合物使得能够根据脂肪细胞中阻抑素的表达水平来表达期望的基因。
特别地,本发明的ATS-R9具有比现有技术中通常使用的阳离子聚乙烯亚胺(PEI)支撑体具有高得多的基因表达效率。换言之,在上述最佳电荷比下ATS-R9表现出更有效地缩合DNA并防止DNA在血清中降解的能力。
(3)本发明的ATS-R9与DNA结合以形成纳米大小的复合物并具有正的ζ电势值。
当ATS-R9与DNA结合时,其通过静电相互作用以较低的聚合物氮(+)/pDNA磷酸盐(-)(N/P)比例有效地缩合DNA。换言之,ATS-R9在中性条件下带有正电荷,使得能够将DNA有效地浓缩成纳米大小(大约≤200nm)并使得ATS-R9在≥1的电荷比下能够具有正的ζ电势。这是因为寡肽在两个末端位置处都包括Cys残基。
如上文说明的,带正电荷的复合物可以通过电荷与电荷的相互作用而容易地穿过细胞膜。如果复合物带负电荷,则其不容易穿过带负电荷的细胞膜。因此,复合物的正ζ电势值表明复合物的高基因递送效率。
(4)本发明的ATS-R9具有低细胞毒性。
与作为常用阳离子聚合物支撑体的PEI支撑体相比,本发明的ATS-R9具有低细胞毒性。在下文的实施例部分中,ATS-R9在最高9的电荷比下显示无毒性,和在所有电荷比下显示至少90%的细胞存活率,而PEI支撑体显示毒性。
综上所述,本发明的ATS-R9与脂肪组织血管中的阻抑素结合,然后有效地内化到脂肪细胞、特别是已分化的成熟肥胖脂肪细胞中。换言之,ATS-R9的体内定位可以通过以下三个步骤简单地解释:通过阻抑素靶向并结合至脂肪组织血管;穿过血管;和内化到脂肪细胞中。
此外,本发明的基因递送体系具有高的转染效率、低毒性和期望基因的高表达效率,因此适合于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征。
用于实施本发明的方式
会参考以下实施例更具体地说明本发明。然而,这些实施例仅提供以用于举例说明的目的而不应被视为限制本发明的范围,这对于本领域技术人员会是明显的。
细胞培养
从WelGENE(韩国)购买达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、葡萄糖和FBS,从Wako(日本)购买胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),并从Sigma-Aldrich(美国)购买地塞米松和油红O。从韩国细胞系库购买3T3-L1前脂肪细胞。诱导前脂肪细胞分化。
在5%CO2的气氛中在37℃下在补充有葡萄糖、10%FBS、1%青霉素和链霉素的完全培养基中培养前脂肪细胞。细胞每周传代三次。
为了脂肪细胞分化,在接种后4天,用含有完全培养基、10μg/ml胰岛素、1μM地塞米松和0.5mMIBMX的分化诱导培养基处理细胞72小时。用含有完全培养基和10μg/ml胰岛素的脂肪细胞维持培养基代替分化培养基。每两天更换培养基。
肽制备
从Peptron(大田,韩国)购买若丹明B缀合的ATS(CKGGRAKDC)肽、FITC缀合的ATS-R9(CKGGRAKDRRRRRRRRRC)、和R9(CRRRRRRRRRC)肽。将肽冻干、溶解于去离子水中、并在使用前储存于-20℃。
肽的分子量如下:ATS:937,若丹明BATS:1361,ATS-R9:2341,FITC-ATS-R9:2844,R9:1628。
油红O染色
通过油红染色确认脂肪细胞分化。
为了制备油红O溶液,将0.7g油红O粉末溶解于200ml异丙醇、搅拌整夜、并通过0.22μm注射器过滤器过滤。将油红O溶液与去离子水按6:4的比例混合以制备油红O工作溶液,将其通过0.22μm注射器过滤器过滤。
为了进行细胞染色,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞,并用含有3.7%甲醛的PBS在室温下固定1小时。固定之后,用60%异丙醇清洗细胞,并在洁净工作台下干燥。在完全干燥后,用油红O工作溶液对细胞进行染色,并孵育15分钟。
用去离子水清洗细胞4次,并通过显微镜捕获图像。
为了定量分析脂肪细胞分化,用100%异丙醇将积累的油红O从细胞洗脱,并在520nm下获取吸光度。
用于共聚焦显微镜的样品制备
从Invitrogen购买CellmaskDeepRed,并从SouthernBiotech购买DAPI-Fluoromount-G。使3T3-L1前脂肪细胞、H9c2和HEK293细胞在放置在6孔板中的盖玻片上生长并分化。
在接种24小时后,用FITC缀合的ATS-R9(25μg/ml)处理细胞,并以15分钟至72小时的时间依赖方式孵育。
孵育之后,替换培养基,用PBS清洗细胞三次,并将其固定在3.7%甲醛中。用CellmaskDeepRed对细胞的质膜进行染色。再用PBS清洗细胞,并在DAPI存在下装载细胞以使细胞核染色。用CarlZeiss共聚焦显微镜捕获图像。
竞争分析
为了进行竞争分析,用游离ATS(100μg/ml)处理3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞(在第10天)。培养6小时后,用FITC-ATS-R9寡肽复合物处理细胞并孵育24小时。使用H9c2和HEK293细胞系作为对照。用FITC缀合的ATS-R9(25μg/ml)寡肽复合物处理H9c2和HEK293细胞并孵育24小时。
凝胶阻滞分析
将1μg萤光素酶质粒DNA(p-β-Luci,Promega(美国))、去离子水和ATS-R9(电荷比:0.25、0.5、1、3、5、7和9)在室温下孵育30分钟以构建寡肽复合物。在0.5%TBE缓冲液下在0.8%琼脂糖凝胶中使寡肽复合物进行电泳25分钟(100V)。
使用裸DNA作为对照。将ATS-R9的DNA缩合效率与支化PEI(25KDa,Sigma,美国)的缩合效率进行比较。
ζ电势和大小测量
将5μg萤光素酶质粒DNA(p-β-Luci)、去离子水和ATS-R9(电荷比:0.5、1、3、5、7和9)在室温下孵育30分钟以构建寡肽复合物。使用装配有Zetasizer-NanoZS的DLS(MalvernInstruments,英国)测量寡肽复合物的平均直径和表面ζ电势。
体外转染效率
从Promega(美国)购买萤光素酶分析试剂盒。从Bio-RadLaboratories(美国)购买DC蛋白质分析试剂盒和牛血清白蛋白标准物。在24孔板中接种3T3-L1前脂肪细胞和已分化的脂肪细胞。
通过将ATS-R9与2μg萤光素酶质粒DNA以5的电荷比混合来制备寡肽复合物。使用R9和PEI多复合物作为对照并以5的电荷比制备。在接种24小时后转染细胞。
孵育72小时后,用PBS清洗细胞,并用150μl的1x细胞裂解缓冲试剂处理20分钟。然后刮取、收获细胞裂解物,并将其转移到1.5ml微管,并以13000转每分钟离心3分钟。
利用20秒整合在96孔板光度计(BertholdDetectionSystems,德国)上测量细胞裂解物的发光,并将其表示为细胞蛋白质的相对发光单位(RLU)/mg。利用牛血清白蛋白标准物通过DC蛋白质分析试剂盒来确定蛋白质浓度。
体外细胞毒性分析
通过MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物]分析来测量细胞存活率。
在24孔板中孵育3T3-L1已分化的脂肪细胞。用通过萤光素酶质粒DNA、普通DMEM培养基和ATS-9R以预定的电荷比制备的寡肽复合物处理脂肪细胞(在第10天)。使用PEI多复合物作为对照。
转染48小时后,将50μlMTT试剂添加至每个孔中的500μl培养基,并在37℃孵育3小时。移除培养基,将500μl二甲亚砜(DMSO)添加至每个孔,并在室温下孵育20分钟。在570nm下测量吸光度。
在小鼠模型中的肥胖诱导
从CentralLabAnimalInc.(韩国)购买3周大的C57BL/6J小鼠。在最初两周,用50%正常饲料和50%具有来自脂肪的60千卡%的鼠饲料喂养小鼠。喂给小鼠的高脂肪饲料的比例逐渐增加,并且在第7周开始仅喂小鼠具有来自脂肪的60千卡%的高脂肪饲料。在第14周后小鼠变得肥胖(体重>45g)。
体内脂肪归巢
将FITC缀合的ATS-9R(10mg/ml)和FITC-9R(10mg/ml)在PBS中稀释至1.5mg/ml的最终浓度,并通过尾静脉注射将100μl的肽注射到肥胖小鼠中。
注射后立即通过Cellvizio(MaunaKeaTechnologies,法国)观察不同器官的脉管系统中的肽定位。
实施例1:3T3-L1前脂肪细胞的分化
3T3-L1脂肪细胞分化的阶段示于图2中。
当将3T3-L1前脂肪细胞在用于脂肪细胞分化的培养基中培养时,细胞形态逐渐变成细胞质中圆形的和大的脂滴。约90%的细胞区域填充有脂滴(图2b)
由于油红O染色,95%的细胞培养群体分化成成熟脂肪细胞(图2c)。油红O染色由于其选择性地染色中性脂质的能力而成为确认脂肪细胞分化的常用技术。更高的油红O积累代表更高的脂肪细胞分化。
为了定量分析,用油红O将已分化的脂肪细胞染色5至14天。洗脱积累的油红O并在520nm下通过分光光度法进行定量。结果示于图2d中。油红O积累随着增加的细胞分化时间而增加。油红O时间依赖的量增加表明前脂肪细胞随着时间连续地分化成为成熟脂肪细胞。
实施例2:ATS-R9内化到脂肪细胞中
为了监测ATS-R9内化到细胞中的程度,用FITC标记的ATS-R9(FITC-ATS-R9)处理成熟脂肪细胞和前脂肪细胞,并研究支撑体到细胞的递送。
用FITC缀合的ATS-R9(25μg/ml)处理3T3-L1已分化的脂肪细胞(在第10天)并孵育预定的时间段。用CellmaskDeepRed对细胞的质膜进行染色,并用DAPI将细胞核进行复染色。蓝色通道(对于DAPI)显示为白色以示出ATS-R9的细胞核定位。用共聚焦激光扫描显微镜捕获图像。比例尺:10μm。
结果,ATS-R9非常快速地内化到3T3-L1脂肪细胞中。ATS-R9在15分钟和1小时内分别到达细胞质和细胞核,且保持强荧光信号直至48小时。
这归因于ATS-R9通过阻抑素靶向脂肪细胞的能力,如已经说明过的。在内化到3T3-L1成熟脂肪细胞中后,融合的肽快速穿过核膜。换言之,ATS-R9被非常快速地递送至细胞。ATS-R9的时间依赖的细胞内分布示于图3中。
在成熟脂肪细胞中ATS-R9分别在15分钟和1小时内到达细胞质和细胞核,并保持其稳定状态48小时。相反地,ATS-R9在前脂肪细胞中在48小时后保持其稳定状态,并在48小时后观察到其迁移至细胞核。
根据这些结果,可以得到的结论是在成熟脂肪细胞和前脂肪细胞中ATS-R9的不同摄取方式和分布与不同阻抑素水平和位置有关。
实施例3:竞争分析
进行竞争分析来研究ATS对ATS-R9靶向脂肪细胞的影响。
在第10天用游离ATS处理3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞,并将受体阻断6小时。
在游离ATS存在或不存在下孵育细胞。用FITC-ATS-R9/pLuc复合物[也称为“寡肽复合物(寡肽/DNA复合物)”]处理所有细胞。
为了证明ATS-R9对脂肪细胞的特异性结合亲和力,使用其中阻抑素在质膜上不表达的HEK293和H9c2细胞作为对照。用FITC缀合的ATS-R9寡肽复合物处理细胞,并将细胞孵育24小时。
结果示于图4中。用游离ATS的预处理抑制ATS-R9寡肽复合物的内化。这表明ATS-R9寡肽复合物是通过阻抑素内化到细胞中的。
与没有游离ATS孵育的组相比,在3T3-L1前脂肪细胞或成熟脂肪细胞中用游离ATS孵育的组显示出明显低水平的FITC强度(图4a和4c)。这是因为少量的FITC-ATS-R9可以透过细胞膜,并可以内化到细胞中。两组之间FITC强度的差异是因为通过利用游离ATS预培养而阻断阻抑素。与游离ATS结合的阻抑素不与ATS-R9/pLuc寡肽复合物自由地相互作用,这导致寡肽复合物的内化降低。在前脂肪细胞中观察到相似的结果。然而,荧光强度的差异比在成熟脂肪细胞中观察到的差异小。这种结果是由于在成熟脂肪细胞和前脂肪细胞中观察到的不同阻抑素水平引起的。
与在脂肪细胞中用相同量的肽处理相同的孵育时间相比,少量肽位于其中阻抑素不表达的HEK293和H9c2细胞(图4b)。因为在每个细胞系中都观察到弱的FITC强度,所以看起来在这些细胞中内化了很少量的ATS-R9/DNA寡肽复合物。
此外,该结果表明ATS-R9靶向并识别脂肪细胞,而不依赖于分化状态,并且通过阻抑素介导的机制内化到细胞中。换言之,这些结果证明ATS-R9对脂肪细胞的特异性结合亲和力。
实验实施例1:确认根据分化程度靶向脂肪细胞的能力
为了研究根据脂肪细胞分化的程度所表达的阻抑素的位置和量,用若丹明B标记的ATS(RhoB-ATS)处理两种类型的脂肪细胞。ATS会被用来确定阻抑素而不是抗体的存在,因为ATS结合阻抑素的能力高。
通过该实验,观察到存在成熟脂肪细胞和前脂肪细胞中的阻抑素即ATS受体根据分化程度的不同而以不同的特征分布。
结果详细地示于图5中。换言之,能够确认ATS靶向分化前的脂肪细胞(前脂肪细胞)和分化后的细胞(肥胖脂肪细胞)的能力。
通过免疫沉淀分析确定ATS与阻抑素的结合(图5a),并通过染色结果确认3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中阻抑素的分布(图5b和5c)。图5b揭示ATS被有效地递送至已分化的肥胖脂肪细胞,而图5c揭示阻抑素即ATS配体的表达的差异。
如以上证明的,阻抑素在成熟脂肪细胞的质膜、细胞质和细胞核中高度表达,而在前脂肪细胞的细胞质中主要表现出低的表达水平。阻抑素分布的差异表明在成熟脂肪细胞和前脂肪细胞中不同的细胞内ATS-R9递送和分布机制。
总之,ATS对分化前的脂肪细胞的靶向效率不是明显地高,但是ATS对分化后的肥胖细胞的靶向效率非常高。
比较例1:确认在非肥胖(成熟)脂肪细胞和肌细胞中的阻抑素表达
为了更清楚地证明本发明的融合的寡肽复合物对肥胖脂肪细胞具有特异性,对非肥胖小鼠和肌细胞中阻抑素的表达模式进行比较和分析。使用蛋白质印迹来分析。结果示于图6中。
特别地,非肥胖小鼠和肥胖小鼠之间阻抑素的表达模式有显著差异,如图6a中所示的,而在肌细胞中阻抑素的表达模式明显有大的差异,如图6b中所示的。换言之,在非肥胖脂肪细胞中阻抑素的表达比在肥胖脂肪细胞中的表达高。还确认了阻抑素在肥胖脂肪细胞中对细胞膜特异性地表达,这与肌细胞中不同。这些结果证明阻抑素对细胞膜的特异性表达的增加导致ATS对脂肪细胞的靶向效率的增加。
实施例5:寡肽复合物的物理和生物表征
阳离子聚合物/DNA复合物的生化性质是影响其细胞摄取、运载稳定性、细胞毒性和转基因表达的主要因素。通过凝胶阻滞分析来确认ATS-R9缩合和保护DNA的能力,并测试小鼠血清中DNA的降解。
5-1.凝胶阻滞分析和血清保护分析
将ATS-R9的缩合效率与支化PEI(25KDa)的缩合效率进行比较。
利用萤光素酶质粒DNA(p-β-Luci)、去离子水和ATS-R9或PEI以预定的电荷比制备寡肽复合物,并在室温下孵育30分钟。
以预定的电荷比制备寡肽复合物,将小鼠血清以50%(体积/体积)的最终浓度添加至多复合物,在37℃孵育样品2小时。
为了在血清孵育后使DNA从多复合物解络,将在磷酸盐缓冲液中的肝素(pH7.4,0.5摩尔/升NaCl)在0.01摩尔/升EDTA存在下添加到样品,并孵育1小时。将样品装载在0.8%琼脂糖凝胶中。
结果,在≥3的电荷比下在ATS-R9或PEI中都没有观察到DNA迁移,这表明完全的DNA缩合(图7a)。ATS-R9在最佳电荷比下保护DNA以免在血清中降解,而裸DNA在测试条件下完全降解(图7b)。
换言之,ATS-R9能够有效地缩合质粒DNA,并保护DNA以免在血清中降解。由DNA复合物形成带正电荷的更小的复合物使得能够有效地内化到细胞中。
5-2.ζ电势和大小测量
使用动态光散射(DLS)来测量ATS-R9/DNA寡肽复合物的ζ电势和平均直径。
结果,寡肽复合物在≥3的电荷比下具有正的ζ电势,并且在≥1的电荷比下具有小于200nm的平均直径,如图8中所示的。
5-3.细胞存活率分析
测试ATS-R9/DNA寡肽复合物的毒性。用寡肽复合物转染第10天的3T3-L1已分化脂肪细胞。转染48小时后,通过MTT分析(n=6)来分析细胞存活率。
结果,已分化的脂肪细胞在最高9的电荷比下显示至少90%的细胞存活率,如图9中所示的。这表明与毒性PEI相比寡肽复合物对已分化的脂肪细胞是无毒性的。
实施例6:转染效率
6-1.电荷比的最佳化
研究用于转染效率最佳化的电荷比。以5的电荷比通过ATS-R9、R9和PEI用p-β-Luci转染分化第10天的成熟脂肪细胞。通过萤光素酶分析试剂盒在72小时后测量萤光素酶基因表达。
结果,发现电荷比为5时ATS-R9寡肽复合物的转染效率比R9和PEI的转染效率高(图10a)。换言之,在相同的电荷比下ATS-R9具有比R9和PEI高的转染效率。转染效率和基因表达效率随着增加脂肪细胞分化时间而增加。
6-2.最佳时间点
为了确定最佳转染时间点,在不同的分化天数时以5的电荷比通过ATS-R9和PEI利用萤光素酶质粒DNA(p-β-Luci)转染3T3-L1已分化的脂肪细胞。通过萤光素酶分析试剂盒在72小时后测量萤光素酶基因表达。
结果,在分化第9天和第10天获得更高的基因表达,这表明寡肽复合物适合用于转染成熟脂肪细胞(图10b)。
实施例7:体内脂肪归巢实验
在该实施例中,使用食源性肥胖(DIO)小鼠进行体内实验。通过尾静脉注射将FITC-ATS-R9施用到肥胖小鼠来观察ATS-R9对脂肪组织的靶向。使用基于探针的共聚焦激光显微内镜(pCLE,Cellvizio)使追踪可视化。
观察每个小鼠的肝、肾和其他脂肪垫脉管系统。结果,ATS-R9在脂肪垫脉管系统中聚集。在其他器官中,ATS-R9沿着血管散布,并且没有观察到聚集(图11)。
将FITC缀合的ATS-R9在脂肪垫脉管系统中的脂肪归巢与FITC缀合的R9的脂肪归巢进行比较。结果,ATS-R9在脂肪垫脉管系统中聚集,与R9不同。换言之,在施用R9之后,没有在脂肪脉管系统中观察到聚集,但是在内皮中观察到聚集(图12)。
水平切割脂肪垫微脉管并对其进行分析。在探针到脉管系统的固定距离下获得脂肪垫微血管的图像。ATS-R9处理在内皮边缘产生高度聚集的荧光强度,而R9处理在脉管系统的整个区域产生荧光强度(图13)。换言之,作为将在脂肪垫脉管系统中FITC缀合的ATS-R9的脂肪归巢与R9的脂肪归巢进行比较的结果,发现ATS-R9与脂肪垫微脉管结合,但没有观察到R9与脂肪垫微脉管结合。
这是因为ATS-R9与脂肪脉管系统结合以在血管内皮中形成聚集体。相比之下,ATS-R9沿着血管连续地迁移而没有结合或聚集,这是肝和肾中典型的ATS-R9-内皮相互作用。
如从以上结果可看出的,ATS-R9可以选择性地与脂肪组织脉管系统结合,仅在血管和脂肪组织微脉管中聚集,但在其他器官如肝或肾中不聚集。ATS-R9在脂肪组织中的结合方式与简单的精氨酸结合结构的结合方式完全不同。
实施例8:体内基因表达
首先,研究ATS-R9内化到体内脂肪组织。
通过尾静脉注射将FITC缀合的ATS-R9施用至C57B/6J肥胖小鼠。注射若丹明缀合的凝集素来使血管染色。
使用多光子共聚焦激光扫描显微镜对固定的脂肪组织进行成像和观察。结果,ATS-R9透过血管,并逐渐内化到脂肪细胞中(图14a)。白色箭头指示内化到脂肪细胞中的FITC-ATS-R9(比例尺:50μm)。
然后,通过免疫荧光分析来确认将FITC-ATS-R9诱导进入脂肪组织的能力(靶向脂肪组织的能力或归巢)。
将FITC缀合的ATS-R9注射到C57B/6J肥胖小鼠中,并将固定的脂肪组织切片与生物素缀合的抗FITC抗体一起孵育。将Cy3缀合的ExtrAvidin用于其信号放大。使用多光子共聚焦激光扫描显微镜观察图像。图14b确认了FITC-ATS-R9进入脂肪组织的诱导(脂肪组织归巢)。
最后,确认体内基因表达。为此,用FITC-ATS-R9浓缩红色荧光蛋白(RFP)表达质粒,并将寡肽复合物注射到C57BL/6J肥胖小鼠中。使用未处理的小鼠作为对照。使用多光子共聚焦激光扫描显微镜观察图像。结果,清楚地确认RFP基因表达。
实施例9:递送sh-RNA和沉默基因的能力
进行关于本发明的ATS-R9在体外和体内将sh-RNA和沉默基因递送至脂肪细胞方面是否有效的确定。
首先,通过ATS-R9、PEI和脂质体用2μg的fabp4sh-RNA转染3T3-L1成熟脂肪细胞,并通过RT-PCR测量基因沉默效率。使用GAPDH作为内源对照。结果,Fabp4基因沉默效率为70%或更大(图15)。
9-1.减重效果
在sh-FABP4处理后,还确认了体重减小(图16)。
用30μg的sh-FABP4连同ATS-R9处理C57BL/6J小鼠每周两次,持续8周,并将寡肽复合物皮下注射到其中。使用sh-Luci作为对照。
8周后,用sh-FABP4-ATS-R9寡肽复合物处理的组减少其最初重量的约20%。
9-2.胰岛素和葡萄糖耐受测试
观察胰岛素和葡萄糖耐受测试。
用sh-FABP4-ATS-R9寡肽复合物处理C57BL/6J小鼠每周两次,持续8周。皮下施用寡肽复合物。使用sh-Luci作为对照。
8周后,确认用sh-FABP4-ATS-R9寡肽复合物处理的组对胰岛素和葡萄糖更敏感(图17和18)。
换言之,本发明的ATS-R9在体外和体内将shRNA和沉默基因递送至脂肪细胞方面有效,当递送用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因时导致重量减小,并有助于胰岛素和葡萄糖敏感度的提高。
比较例2:基因递送能力的比较
(1)其他递送体系对脂肪细胞的基因递送能力
评价ATS-R9将萤光素酶基因递送至肥胖脂肪细胞的能力。使用PEI和脂质体作为对照。结果示于图19中。
结果,确认ATS-R9对肥胖脂肪细胞的基因递送效率比其他递送体系PEI和脂质体的基因递送效率高。
(2)脂肪细胞分化之前和之后的基因递送能力
将脂肪细胞分化之前和之后的基因递送效率进行比较。结果示于图20中。
这些结果确认,随着脂肪细胞分化成肥胖脂肪细胞的进行,本发明的ATS-R9的基因递送效率增加。
(3)根据序列特异性的基因递送能力
使用萤光素酶作为待递送的基因,并使用无序ATS作为靶向脂肪的序列。将(无序ATS)-R9将基因递送至肥胖脂肪细胞的能力与ATS-R9的能力进行比较。
结果,无序ATS的使用大大降低了递送基因的能力,如在图21中所示的。
工业实用性
如根据上文明显的,本发明的ATS-R9肽结构能够通过阻抑素在分化后的脂肪细胞中的过表达的机制直接靶向成熟肥胖脂肪细胞,以将基因递送到脂肪细胞。因为该特异性功能和效果,本发明的ATS-R9肽结构在用于肥胖的基因治疗中会非常有用。
Claims (17)
1.一种靶向脂肪细胞的基因递送体系,其含有靶向脂肪细胞的序列(ATS)和九聚精氨酸(R9)肽。
2.根据权利要求1所述的靶向脂肪细胞的基因递送体系,其中所述靶向脂肪细胞的序列和所述九聚精氨酸(R9)肽结合至阻抑素。
3.根据权利要求1所述的靶向脂肪细胞的基因递送体系,其中所述九聚精氨酸(R9)肽具有Cys-(D-R)9-Cys结构。
4.根据权利要求1所述的靶向脂肪细胞的基因递送体系,其中所述靶向脂肪细胞的序列由SEQIDNO:1中所述的氨基酸序列构成。
5.根据权利要求1所述的靶向脂肪细胞的基因递送体系,其中所述脂肪细胞是已分化的成熟肥胖脂肪细胞。
6.根据权利要求5所述的靶向脂肪细胞的基因递送体系,其中所述脂肪细胞是分化开始后第9至11天的成熟肥胖脂肪细胞。
7.一种复合物,其包含靶向脂肪细胞的序列(ATS)、九聚精氨酸(R9)肽、和用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的靶向脂肪细胞的治疗基因。
8.根据权利要求7所述的复合物,其中所述靶向脂肪细胞的序列和所述九聚精氨酸(R9)肽结合至阻抑素。
9.根据权利要求7所述的复合物,其中所述九聚精氨酸(R9)肽具有Cys-(D-R)9-Cys结构。
10.根据权利要求7所述的复合物,其中所述靶向脂肪细胞的序列由SEQIDNO:1中所述的氨基酸序列构成。
11.根据权利要求7所述的复合物,其中用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因是DNA或RNAi。
12.根据权利要求11所述的复合物,其中所述RNAi是siRNA或shRNA。
13.根据权利要求7所述的复合物,其中所述复合物具有200nm或更小的直径。
14.根据权利要求7所述的复合物,其中所述复合物具有3:1至8:1的电荷比(+/-)。
15.根据权利要求7所述的复合物,其中所述脂肪细胞是已分化的成熟肥胖脂肪细胞。
16.根据权利要求15所述的复合物,其中所述脂肪细胞是分化开始后第9至11天的成熟肥胖脂肪细胞。
17.一种用于治疗肥胖或肥胖诱导的代谢综合征的组合物,其包含根据权利要求7所述的复合物作为活性成分。
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