KR101035364B1

KR101035364B1 - 핵산 전달용 세포내 환원성 폴리(올리고-아르기닌)

Info

Publication number: KR101035364B1
Application number: KR1020080047011A
Authority: KR
Inventors: 김용희; 원영욱
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2008-05-21
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2011-05-20
Also published as: KR20090120948A

Abstract

본 발명은 유전자 전달 및 치료 시스템에 대한 발명으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 산화된 형태에서는 고분자량으로 존재하여 유전자와의 안정한 복합체를 효율적으로 형성할 수 있고, 세포 내로 전달된 후에는 환원된 형태의 작은 단위체로 되어 유전자 방출이 용이한 환원성 폴리(올리고-아르기닌)을 포함하는 비바이러스성 유전자 전달 시스템에 대한 발명이다.

본 발명의 환원성 폴리(올리고-아르기닌)은 유전자 전달 벡터로 사용될 때, DNA 를 효율적으로 응축, 안정화 및 트랜스펙션시킨다.

핵산 전달, 환원성 폴리아르기닌, 단백질 전달 도메인(PTD), 이황화 결합, 트랜스펙션

Description

핵산 전달용 세포내 환원성 폴리(올리고-아르기닌){INTRACELLULAR REDUCIBLE POLY(OLIGO-ARGININE) FOR NUCLEIC ACID DELIVERY}

통상적인 단백질 치료의 대용으로서 다양한 유전자 치료 기법이 발달되어 왔으나, 이에는 여전히 해결되어야 할 중요한 과제들이 존재한다. 유전자 치료의 주요한 과제 중 하나는 최소 세포독성을 가진 플라즈마(plasma) 및 핵막을 통한 효율적인 유전자 유입(influx)을 달성하는 것이다.

유전자 치료 시스템은 크게 바이러스성 벡터-매개 시스템 및 비바이러스성 벡터-매개 시스템으로 분류될 수 있다. 레트로바이러스(retrovirus) 또는 아데노바이러스(adenovirus) 등을 이용하여 만든 바이러스성 벡터는 세포 내로의 높은 트랜세펙션 효율을 갖는다는 장점이 있으나, in vivo 에서 면역원성의 문제 및 유전 자 재조합과 같은 내재적 문제점 등을 갖는다. 이러한 바이러스성 벡터의 안정성 문제를 극복하기 위하여, 다양한 중합체성 유전자 전달 시스템이 전통적인 바이러스성 벡터-기재 유전자 전달 방법에 대한 대안으로서 발달되어 왔다. 그러나, 중합체성 벡터는 엔도좀 탈출(endosomal escape) 및 핵 편재화(nuclear localization)와 같은 세포내 트래피킹(trafficking) 장벽을 갖는다는 문제점이 있다.

한편, 합성 펩타이드에 기초한 유전자 전달 시스템은, 낮은 pH 에서 엔도좀 막 내에서의 누출을 야기시킴으로써 DNA 를 응축시키고, 또한 엔도좀 탈출을 촉진하므로 중합체성 유전자 전달 시스템과 관련된 상기 문제점들을 극복할 수 있다. 이러한 이유로, 다양한 합성 펩타이드가 in vitro 에서 여러 세포주에서의 유전자 전달을 촉진하는 것으로 개발되어 왔다. 그러나, 이 역시 in vivo 적용에 있어서 독성 및 혈청 불안정성 등의 문제점이 존재한다.

단백질 전달을 위한 PTDs(Protein transduction domain)가 세포내 흡수 및 핵 전위(translocation)를 강화할 수 있기 때문에, 중합체성 또는 합성 펩타이드-기재 유전자 전달 시스템의 대안으로서 제안되었다. 폴리(L-리신)(PLL) 및 폴리에틸렌이민(PEI) 기재 유전자 캐리어(carrier)는 비바이러스성 중합체성 유전자 캐리어의 전형적인 예이다. 양이온성 중합체 중에서, 분지화된 25kDa 의 PEI 는 가장 광범위하게 연구되는 화합물 중 하나이다. 분지화된 PEI 는 일차 및 이차 아민기를 함유함으로써 엔도좀의 산성 환경에서 용이하게 양성자화된다. 그 결과 양성자 스폰지(sponge) 활성은 엔도좀 팽창 및 막 파괴에 이은 DNA/PEI 의 엔도좀 탈출을 이끈다. 비록 PLL 이 낮은 세포독성의 측면에서 PEI 에 대하여 유리하다고 할지라도, PLL 의 트랜스펙션 효율은 PEI 의 트랜스펙션 효율보다 낮다는 단점이 있다. 오직 일차 아민기만을 갖는 PLL 은 복합체가 세포 내로 내재화(internalized)된 후에 PLL/DNA 복합체의 엔도좀 탈출을 촉진하는 양성자 완충 능력을 갖는다. PEI 및 PLL 양자 모두에 있어서, 분자량 및 아민/인산기의 비율이 증가함에 따라 트랜스펙션 효율 및 세포독성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 중합체성 벡터는 변형되어 표적-특이적 전달을 달성하고, 또한 세포간 유전자 전달 효율을 향상시킨다. 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG)는 컨쥬게이션되어, 중합체/DNA 복합체의 응집을 방지하고, 혈청에서의 복합체의 안정성을 증가시킨다. 또한 작은 리간드(ligand) 및 항체와 같은 특이적 표적부는 복합체로 컨쥬게이션되어 특이적 세포 또는 조직 내로의 세포 흡수를 강화하며, 또한 다른 위치에서의 부작용을 감소시킨다.

세포내 환경에 의한 절단(cleavage)이 DNA 의 엔도좀 탈출을 용이하게 하는 것과 같이, 가교 저분자량 폴리양이온(polycations)은 중합체성 캐리어의 세포독성을 감소시키면서 또한 생리학적 조건에서 안정성을 유지할 수 있다는 것이 전제되었다. 산화성 세포외 공간 및 환원성 세포내 공간 사이의 산화환원 전위의 차이(100 배 차이)는 세포생물학에서 독특한 이황화 결합을 만듦으로써 안정적이고 비독성인 유전자 전달에 이용될 수 있다.

유전자 발현을 추가적으로 증가시키기 위하여, 이황화 결합을 함유하는 환원성 PLL 및 폴리로탁산(polyrotaxane) 중합체 시스템을 조사하여 중합체/pDNA 복합 체의 커플링해제(uncoupling)를 촉진하였다. 문헌 [Lin et al.]은 다양한 치환 선형 폴리(아미도아민)이 트랜스펙션 효율 및 세포 생활성(viablity)을 현저히 증가시킴을 보여주었다. 또한, 근래에는, 문헌 [Lane et al.]에서 pDNA 응축 및 완충 능력과 같은 PEI 의 특성을 유지하면서 환원성 중합체의 최소 독성 및 핵산 분해에 대한 보호를 예증함으로써, 유전자 전달에 있어서의 잠재적인 캐리어로서 폴리(아미도 에틸렌이민)(SS-PAEIs)을 함유하는 이황화물을 보고하였다.

PTDs 는 거대분자를 세포내로 수송하는 것을 방해하는 생물학적 장벽의 하나인 세포막을 통하여, 약물, 단백질, 유전자 및 입자와 같은 생-활성(bio-active) 카르고(cargo)를 효율적으로, 그러나 비-특이적으로 전달하는 능력을 갖는다. HIV-1 TAT 단백질의 기본 도메인인 TAT (49-57, RKKRRQRRR)은 당업계에 널리 알려진 PTD 의 하나이다. 세포로 유입되는 알라닌-치환 TAT 의 불활성은 TAT 의 양이온성 잔기가 세포로의 흡수에 있어서 필수적인 영역임을 나타낸다. 그러나, 히스티딘, 리신 및 오르니틴과 같은 다양한 양이온성 아미노산은 TAT 펩타이드보다 더 낮은 세포 흡수 효율을 나타낸다. 미카엘리스-멘텐 운동 분석(Michaelis-Menten kinetic analysis)에 의하여 결정된 바에 의하면, TAT 펩타이드의 세포 흡수 효율과 비교하여, L-R9 의 세포 흡수 효율은 이보다 20 배 더 높으며, D-R9 는 이보다 100 배 더 높다. 아르기닌이 풍부한 펩타이드라는 점 등과 같이, TAT 펩타이드를 포함하는 대부분의 PTD 가 이와 유사한 특징을 나타낸다는 사실을 주목할 만 하다. 실제로 여섯개 이상의 아르기닌을 함유하는 올리고-아르기닌은 리신, 히스티딘, 오르니틴 또는 시트룰린으로 구성되는 동일한 길이의 펩타이드보다 더욱 신속하게 세포 내로 유입된다. 그러나, 짧은 양이온성 펩타이드를 갖는 응축된 DNA 는 더 낮은 협동 효과(cooperative effect)에 의하여 안정성이 낮다는 문제가 있으며, 그 결과로서 복합체는 혈류에서 불안정하고, in vitro 에서 DNA 를 대사로부터 보호하기에 불충분하게 된다. 반면 양이온성 펩타이드가 음성으로 하전된 유전자와 너무 강하게 결합하는 경우에는 유전자가 복합체로부터 유리되지 않을 수 있다.

즉, 상기 언급된 바와 같이 바이러스성 벡터의 경우 면역반응이나 자가복제와 같은 문제점이 있으며, 일반적인 중합체성 벡터의 경우 생체 적합성이 떨어지고 이로 인하여 세포 및 생체 독성이 크고 핵산 전달 효율이 낮다는 문제점이 있다.

이와 관련하여 짧은 양이온성 펩타이드를 이용한 벡터에 대한 연구가 진행되고 있으나, 이 경우 세포외 공간에서 DNA 가 불안정하다는 문제점이 있으며, 또한 DNA 와의 복합체의 안정성 및 유전자 발현의 수준 등이 불충분하다는 문제점이 존재한다.

따라서, 세포외 공간에서 DNA 를 안정화시키면서, DNA 의 세포 내로의 유입 및 복합체로부터의 DNA 의 유리를 원활히 하여 유전자 발현의 수준을 높일 수 있는 새로운 유형의 유전자 전달 벡터의 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 양이온성 펩타이드의 분자량이 증가함에 따라 유전자 발현의 수준도 증가하는 것에 착안하여, 짧은 양이온성 펩타이드로 구성된 환원성 폴리펩타이드가 세포외 공간에서 DNA 가 불안정해지는 단점을 극복할 수 있을 것임을 가정하고 연구를 거듭한 결과, 세포 산화환원 및 pH 구배에 민감한 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)을 이용하여, 독성이 적으면서도 더욱 효과적으로 유전자를 세포내로 전달할 수 있는 비바이러스성 유전자 전달 시스템을 발명하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 환원성 폴리(올리고-아르기닌)을 포함하는 비바이러스성 유전 자 전달 벡터에 대한 발명이다. 비바이러스성 유전자 전달 벡터는 바이러스를 이용하지 않고 유전자를 세포내로 운반하는 캐리어를 총칭하는 의미로서, 유전자를 구성하는 핵산이 음전하를 띠는 성질을 이용하여 양이온상의 양이온 부위와 핵산상의 음이온 부위의 전기적 상호작용을 이용하여 핵산을 코팅하는 형태의 벡터가 대표적인 예이다. 한편, 본 발명의 폴리(올리고-아르기닌)은 폴리(올리고-L-아르기닌)과 폴리(올리고-D-아르기닌)을 포함하며, 그 중에서도 폴리(올리고-D-아르기닌)인 것이 바람직하다.

본 발명의 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 이황화물로 가교된 말단 시스테인을 포함하는 양이온성 올리고머로 구성된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시스테인은 인접하는 다른 시스테인 분자와 이황화 가교(cross-linking)를 형성하는 설프하이드릴기를 함유하는 유일한 아미노산으로서, 이황화물로 가교된 말단 시스테인 이외의 단백질 전달 도메인(PTD) 부분은 임의의 양이온성 펩타이드가 될 수 있다. 더욱, 바람직하게는 본 발명의 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 Cys-(D-R9)-Cys 반복 단위로 구성될 수 있다. 이러한 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 Cys-(D-R9)-Cys 반복 단위의 말단 시스테인-티올기의 DMSO 산화 과정에 의하여 제조될 수 있으며, 환원시약으로써 Cys-(D-R9)-Cys 로 단편화될 수 있다.

또한, 본 발명은 환원성 폴리(올리고-아르기닌)을 포함하는 벡터에 전달 유전자가 결합된 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체에서, 환원성 폴리(올리고-아르기닌)은 폴리(올리고-D-아르기닌)인 것이 바람직하며, Cys-(D-R9)-Cys 반복 단 위로 구성되는 것이 특히 바람직하다.

또한, 본 발명의 벡터를 사용하여 전달될 수 있는 유전자는 특별히 한정되지 않으며, 유전자 치료의 재료가 될 수 있는 어떠한 것이라도 무방하다. 유전자는 DNA, 안티센스 분자나 siRNA 를 포함하는 각종 형태의 RNA 등을 포함할 수 있다.

이하에서 보다 구체적으로 본 발명을 설명한다.

고분자량 폴리(올리고-D-아르기닌)은 DNA 의 응축을 효과적으로 촉진하여 안정한 복합체 및 DNA 의 세포 내로의 내재화를 형성하고, 내재화 후에는 복합체가 이황화결합의 환원에 의하여 엔도좀으로부터 세포질 공간으로 탈출하게 된다.

본 발명에서는 R9 단백질 전달 도메인 상에 기초하는 환원성 고분자량 폴리(올리고-D-아르기닌)을 발현시키고, 유전자 전달 벡터로 사용될 때 DNA 를 효율적으로 응축, 안정화 및 트랜스펙션시켰다. 고분자량 폴리(올리고-D-아르기닌)은 PLL 및 PEI 와 비교하여 더욱 효과적인 DNA 응축 능력을 나타내었고, 혈청에서 DNA 가 분해되지 않도록 보호하였다. 환원제를 사용한 환원성 시스템의 평가는 DNA 가 이황화 결합의 환원에 의하여 복합체로부터 유리될 수 있음을 확인하였는데, 이는 가역적인 이황화 결합이 다양한 세포 환경에서 상이한 메커니즘에 의하여 환원될 수 있으며, 복합체로부터의 DNA 의 유리를 촉진할 수 있음을 나타낸다. 비록 폴리(올리고-D-아르기닌)이 PEI 보다 분자량이 더 크기는 하나, 다양한 세포에 대하여 PEI 보다 독성이 낮거나 또는 전적으로 비독성이었을 뿐만 아니라, PEI 에 필적하거나 PEI 보다 더 높은 트랜스펙션 효율을 가졌다.

요컨대, R9 PTD 상에 기초한 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 낮은 세포독 성, 혈청에 대한 DNA 의 보호 및 유전자 전달에서의 사용을 위한 혈청 함유 배지에서의 효과적인 트랜스펙션의 측면에서 훌륭한 비바이러스성 유전자 전달 시스템으로 사용될 수 있다.

본 발명의 환원성 고분자량 중합체를 포함하는 유전자 전달 시스템은 세포외 공간에서 DNA 를 안정화시키고, DNA 의 세포 내로의 흡수를 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 이황화물의 환원에 의한 복합체로부터의 DNA 의 유리를 통하여 유전자 발현의 수준을 증가시킬 수 있다.

이하에서, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기의 실시예에 기재된 예만으로 국한되는 것은 결코 아니다. 또한, 하기의 실시예 뿐만 아니라, 당업자에 의해서 이로부터 용이하게 추론될 수 있는 범위까지도 본 발명의 보호범위에 속함은 자명하다.

따라서, 하기 실시예에서 사용된 폴리(올리고-D-아르기닌)은 본 발명의 최적의 효과를 달성하기 위하여 사용된 의도일 뿐이며, 폴리(올리고-D-아르기닌) 뿐만 아니라, 폴리(올리고-L-아르기닌)의 경우에도 전기된 바와 같이 그 세포 흡수 효율이 기존의 공지된 PTD 중 하나인 TAT 펩타이드의 세포 흡수 효율보다 20 배나 더 높은 점에 미루어(폴리(올리고-D-아르기닌)의 세포 흡수 효율은 TAT 펩타이드의 세포 흡수 효율보다 100 배 더 높음), 본 발명의 실시예에 기재된 예와 유사한 효과 를 달성할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 유전자 전달 시스템의 제조 및 평가를 위한 실험 재료 및 세포는 하기와 같이 준비하였다.

실험 재료 및 세포 배양

(1) 실험 재료

펩타이드 CR9C (CRRRRRRRRRC, Mr 1628) 및 D-R9 (RRRRRRRRR, Mr 1422) 를 Peptron(Daejoen, Korea)사로부터 입수하였다. 또한, PEI(분지형, 평균 분자량 25,000), PLL(분자량 15,000-30,000) 및 0.1% TFA 를 Sigma(St. Louis, MO)사로부터 입수하였다. 또한, 플라스미드 DNA (pGL3-Promoter, 5010bp) 및 루시퍼레이즈(luciferase) 분석 키트를 Promega(Madison, WI)사로부터 입수하였다. 다른 모든 시약은 분석 등급이었다.

(2) 세포 배양

인간 배아 신장 세포주 293 (HEK 293) 및 래트 심근 세포주 H9C2 을 ATCC 로부터 입수하였다. 래트 폐 세포주 L2 는 한양대학교(대한민국, 서울) 이민형 박사님으로부터 기증받았다. 이러한 세가지 세포주 모두를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), 10% FBS 및 페니실린(100 IU/㎖)/스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)에서 배양하였다. 상기 세포를 37℃에서 5% CO₂를 사용하여 80% 집합(confluency)으로 배양하였다.

실시예 1 : 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)의 합성

통상적인 산화적 다중응축반응(polycondensation)을 통하여 DMSO 를 사용하여 폴리(올리고-D-아르기닌)을 제조하였다. 150 rpm 으로의 교반하면서 실온에서 6 일 동안 30% DMSO 를 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 에서 57 mM Cys-(D-R9)-Cys 농도로 응축반응을 수행하였다. 콘쥬게이션 정도에 의한 분자량의 증가가 고분해능 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-비행시간(MALDI-TOF) 에 의하여 24 시간 시차를 두고 관찰되었다. MALDI-TOF 에 의하여 분자량 분포의 어떠한 변화도 관찰되지 않은 후에, 상업적으로 시판중인 PLL 과의 보정(calibration)을 통하여 폴리(올리고-D-아르기닌)의 평균 분자량을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정하였다. 저분자량 펩타이드를 투석막을 사용하여 제거한 후, 정화된 펩타이드를 수집하고, 진공-동결 건조기로 동결건조시켰다. SEC 분석을 위하여, 펩타이드를 1 mg/ml 의 농도에서 0.2 M NaCl 을 함유하는 0.1% TFA 에 용해, 주입하였다. 펩타이드를 0.6 ml/분 의 유속에서 0.2 M NaCl 을 함유하는 0.1% TFA 로 용출시켰다.

상기 방법에 의하여 제조한 폴리(올리고-D-아르기닌)에 대하여 MALDI-TOF 에 의하여 측정되는 분자량 분포를 시간 내 상이한 지점에서 측정된 다른 데이터와 비교하였다. 반응을 6 일 동안 수행하였으며, 저분자량 불순물을 투석에 의하여 제거하고, 합성된 폴리(올리고-D-아르기닌)의 평균 분자량을 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 측정한 결과 합성된 펩타이드의 평균 분자량은 94 kDa 였으며, 원래 펩타이드의 분자량 1,628 Da 에 대하여 현저히 증가하였음을 알 수 있었다.

실시예 2 : 폴리(올리고-D-아르기닌)에 의한 DNA 의 응축시험

1. 아가로스 ( agarose ) 겔 전기영동 분석

다양한 양의 양이온성 펩타이드 및 PEI 를 1 ㎍ 의 DNA 에 첨가한 후, 샘플을 실온에서 3 분 동안 배양하고, 0.5% TBE 완충용액에서 100V, 30분 동안 에티디움 브로마이드(EtBr)로 염색된 0.8% (w/v) 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 아가로스 겔의 상(image)을 캡쳐하여 DNA 의 위치를 나타내었다. 모든 데이터에 대하여 상기 비율을 양이온성 펩타이드 또는 PEI/플라스미드 DNA 의 중량비(X)로서 나타내었다.

2. 에티디움 브로마이드 배제 분석

표준 EtBr 배제 분석에 의하여 DNA 를 응축시키는 능력을 시험하였다. DNA (15 ㎍) 및 EtBr (4 ㎍)을 3 ml 의 HEPES 완충액 (5 mM, pH 7.0) 에서 3 분 동안 배양하고, 그 결과 나타난 형광을 100% 인 것으로 고려하였다. 다양한 양의 양이온성 펩타이드 및 PEI 를 분리된 뱃치에 있는 DNA-EtBr 혼합물에 단계적으로 첨가하여 각각을 최종 부피 3 ml 로 하였다. 역전(inversion)에 의하여 상기 샘플을 혼합한 후 호일(foil)로 덥고, 형광의 측정에 앞서 3 분 동안 실온에서 배양하였다. 상기 혼합물의 상대적인 형광 강도를 DNA-EtBr 혼합물에 대한 형광 강도의 백분율로서 표시하였다. 각각 516 nm 및 598 nm 의 흥분 및 방출 파장에서 UV/형광 리더 (SpectraMax M2^e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 형광을 측정하였다.

3. 폴리(올리고-D-아르기닌)의 이황화 결합 환원

최종 부피 6 ㎕ 에서 폴리(올리고-D-아르기닌)/DNA 의 다양한 비율에서 복합체를 제조하고, 그 샘플을 실온에서 3 분 동안 배양하였다. 시스테인 간의 이황화 결합의 환원을 위하여 4 ㎕ 의 β-메르캅토에탄올을 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 30 분 동안 부드러운 교반 하에서 수행하였다. 상기 샘플을 상기 (1)과 동일한 조건으로 전기영동시켰다.

4. 혈청에서의 DNA 안정성

혈청-함유 배지에서 DNA 의 보호를 위하여, 양이온성 펩타이드 및 PEI/DNA 복합체를 DMEM 에서 2.0 의 비율로 제조하고, 실온에서 3 분 동안 배양하였다. 배양 후에, 10% (v/v) 의 최종 농도에서 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)을 복합체에 첨가하였다. 37℃ 에서의 가열과 함께 150 rpm 에서 교반하면서, 1 시간 및 2 시간 후 혈청에서의 DNA 의 안정성을 시험하였다. 혼합물을 상기 (1)과 동일한 조건으로 전기영동시켰다.

5. 응축된 DNA 의 특징 분석

복합체의 평균 직경 및 표면 제타 전위를 Zetasizer-Nano ZS(Malvern instruments, Worcestershire, UK)를 이용한 동적광산란법(Dynamic Light Scattering)을 사용하여 측정하였다. DNA 의 양이온성 펩타이드 및 PEI 와의 복합체를 5 mM HEPES 완충액(pH 7.0)에서 제조하였다. 2.0 의 비율에서 평균 직경의 시간-의존적 변화를 25 분 동안 관찰하였다. 제타 전위의 측정을 위하여, 양이온성 펩타이드 및 PEI/DNA 복합체를 1.0, 2.0, 3.0, 및 4.0 의 중량비에서 시험 하였다. 복합체의 평균 직경 및 제타 전위를 3 벌로 평가하였다.

한편, 공기중 클로스 접촉 모드(close contact mode)의 Nano-R^TM AFM (Pacific Nanotechnology, Santa Clara, CA)를 갖는 통상적인 원자력 현미경(AFM)으로 복합체의 형태학적 특성을 관찰하였다. 양이온성 펩타이드 및 PEI 의 DNA 와의 복합체를 2.5 ㎍/㎖ 농도, 2.0 의 비율에서 제조하였다. 네이키드 DNA 를 시각화하기 위하여, 3 mM NaCl 을 사용하여 DNA 를 2.5 ㎍/㎖ 농도로 제조하였다. 3 분 후, 10 ㎕ 의 복합체 및 네이키드 DNA 를 10 초 동안 와동시키고, 새롭게 절단된 마이카(mica) 상에 위치시켰다. 3 분 후, 잔존하는 용액을 소량의 물로 세척하고, 과잉의 물을 온화한 스트림의 질소로 건조시켰다.

6. 제조된 복합체의 물리화학적 특징

다양한 중량비에서 음이온성 DNA 의 양이온성 펩타이드 및 PEI 와의 결합친화성을 도 1a-d 에 제시하였다. 복합체 내에서의 양이온성 펩타이드 및 PEI 의 양이 증가함에 따라, DNA 이동(migration)이 현저하게 둔화되었으며, 이는 최적 비율 이상에서 양이온성 펩타이드 및 PEI 가 음이온성 DNA 와 복합체를 형성하였음을 나타낸다. PEI 와 응축된 DNA 는, PLL 및 D-R9 와의 복합체와 비교하여, DNA 이동이 조금 더 둔화되었다. 반면, 폴리(올리고-D-아르기닌)은 심지어 0.1 의 비율에서 겔 상 DNA 이동을 현저하게 둔화시켰다. PLL, D-R9, PEI 및 폴리(올리고-D-아르기닌)의 완벽한 둔화 비율은 각각 1.5, 1.0, 0.5 및 0.1 이상이었다. 추가적으로, 양이온성 펩타이드 및 PEI 에 의한 DNA 응축의 정량적인 분석은 EtBr 배제 분석을 사용하여 시험하였으며, EtBr 이 자유 이중가닥 DNA 와 개재되는(intercalated) 경우, 강한 형광 신호가 생성되었다. DNA 의 양이온성 펩타이드와의 상호작용에 의한 EtBr 전위는 형광 강도를 감소시켰는데, 이는 DNA 의 펩타이드와의 결합 정도와 관련된다. 도 2 에 제시된 바와 같이, PLL, D-R9, PEI 및 폴리(올리고-D-아르기닌)에 대한 형광 강도의 소광(quenching) 패턴은 각각 1.2, 0.6, 0.3 및 0.01 의 비율에서 명백해졌으며, 1.5, 1.0, 0.5 및 0.06 의 비율에서 항정 상태(steady-state)에 이르렀다. 이러한 결과는 폴리(올리고-D-아르기닌)의 결합 및 응축 능력이 PLL, D-R9 또는 PEI 의 결합 및 응축 능력보다 훨씬 강하다는 것을 나타낸다. 양이온성 펩타이드의 분자량은 DNA 응축물의 안정성에 큰 영향을 끼치며, 또한 유전자 전달의 수준에도 영향을 미칠 수 있다. PEI 의 분자량의 트랜스펙션 효율에 대한 효과가 이미 보고되었으며, 폴리(올리고-D-아르기닌)의 분자량은 PEI 의 분자량보다 높고, 낮은 중량비에서 DNA 의 펩타이드에 대한 결합을 치밀하게 할 수 있다.

이러한 환원성 고분자량 펩타이드는, 디티오트레이톨(DTT) 또는 β-메르캅토에탄올과 같은 이황화 결합을 환원시키는 환원제 존재 중, Cys-(D-R9)-Cys 로 단편화 될 수 있다. 또한, 가역적인 이황화 결합은 세포질 공간, 세포 표면, 엔도좀 및 라이소좀과 같은 다양한 세포 환경에서 상이한 메커니즘에 의하여 환원될 수 있다. 중합체/DNA 복합체의 환원성은 응축된 DNA 의 트랜스펙션 활성에 중요한 영향을 끼치는 바, 유전자 치료 기술 분야에서 중요한 고려 사항이 아닐 수 없다. 본 발명자들은, 환원성 고분자량 올리고-PTD-기재 중합체가 낮은 중합체/DNA 중량 비에서 DNA 와 안정한 복합체를 형성하여, 세포 내로 DNA 를 효과적으로 도입(transduce)한 후, 올리고머로 단편화됨으로써 DNA 를 세포내 유리시킬 수 있음을 밝혀냈으며, 또한 이 경우 트랜스펙션 효율이 높으면서 세포독성은 낮음을 밝혀내었다. β-메르캅토에탄올에 의한 두개의 시스테인 사이의 이황화 결합의 환원은 폴리(올리고-D-아르기닌)을 Cys-(D-R9)-Cys 로 단편화하였다. 이황화 결합의 환원은 양이온성 펩타이드의 분자량을 감소시켰으며, 복합체로부터의 DNA 의 유리를 촉진하였다(도 1e).

중합전해질(polyelcetrolyte) 복합체의 생물물리학적 성질은 중합화 정도 및 펩타이드 내에 존재하는 양이온성 기와 같은 양이온성 펩타이드의 화학적 성질에 의하여 영향받는다. 또한, DNA 의 결합 친화성, 복합체의 표면 제타 전위 및 크기는 in vivo 에서 트랜스펙션 효율 및 생물학적 분포에 현저하게 영향을 끼친다. 각각의 펩타이드 및 PEI/DNA 복합체의 크기 및 제타 전위를 4.0 의 비율에서 비교하였다. 25 분에 걸쳐서 임의의 복합체에서의 평균 직경은 크게 다르지 않았는데(도 3a), 이는 DNA 의 펩타이드 및 PEI 와의 응축 복합체가 수초 내에 안정하며, 그 기간 내에서 형태가 유지되었음을 나타낸다. 폴리(올리고-D-아르기닌), PEI, PLL 및 D-R9 의 평균 직경은 각각 대략 150, 120, 80 및 70 nm 이었다. 폴리(올리고-D-아르기닌)이 가장 큰 복합체를 형성하고 D-R9 가 가장 작은 복합체를 형성하기 때문에, 펩타이드 및 PEI 의 분자량에서의 차이는 복합체의 크기 변화의 원인 중 하나일 수 있다. 복합체의 표면 제타 전위를 측정하여 동일한 양의 DNA 와 제타 전위의 차이를 비교하였다. 1.0 의 비율에서, 세가지 형태의 펩타이드는 음성 으로 하전된 반면, PEI/DNA 복합체는 양성으로 하전되었다(도 3b). 그러나, 펩타이드의 제타 전위는 2.0 이상의 비율에서 양성이었다. 상기의 비율 및 분자량이 증가함에 따라, 복합체의 크기 및 네트(net) 양성 하전이 증가하였는데, 이는 DNA 및 펩타이드 사이의 강력한 결합에 의하여 DNA 가 고분자량 펩타이드와 더욱 안정한 복합체를 형성하였음을 나타낸다. 유전자 전달을 위한 양이온성 펩타이드의 최소 사슬 길이는 6 내지 10 아미노산이다. 이 크기는 DNA 를 안정한 나노크기 입자로 응축하는데 적합하다. 펩타이드/DNA 복합체의 크기는 효율적인 세포내 전달을 위하여 필요하며, 연속적인 세포내 프로세싱(processing)은 400 nm 미만이다. DNA 의 폴리(올리고-D-아르기닌)과의 응축에 의하여 형성된 나노크기 입자가 400 nm 미만이므로, 폴리(올리고-D-아르기닌)/DNA 복합체의 세포내 흡수는 여전히 효과적일 수 있다. 복합체 및 미응축된 DNA 의 형태학적 특징을 도 4 에 나타내었다. 도 4a 는 DNA 단독의 형태학을 나타내는데, 이는 어떠한 구형 영역없이 사슬-유사 형태에 의하여 지시된다. 대조구와의 비교는 폴리(올리고-D-아르기닌), D-R9 및 PEI 에 의한 응축을 명백하게 보여준다(도 4b-d). 세가지 샘플은 음성으로 하전된 DNA 와 양성으로 하전된 펩타이드 및 PEI 와의 결합에 의하여 형성된 나노크기 입자를 나타내었으나, PLL 은 그러하지 않았다(데이터는 제시되어 있지 않음).

효소적 분해로부터의 DNA 보호는 in vivo 적용에 있어서 유전자 전달 캐리어로서의 필수요건 중 하나이다. 본 발명에서는, 효소적 분해로부터의 펩타이드 및 PEI 의 DNA 보호 능력을 혈청의 존재 중에서 비교하였다. 도 5 에 제시된 바와 같이, 네이키드(naked) DNA 및 복합체를 37℃ 에서 혈청-함유 DMEM 으로 1 시간 및 2 시간 동안 배양하였다. 2 시간의 배양 후에, 네이키드 DNA 의 현저한 분해가 관찰되었다. PLL 과 응축된 DNA 는 배양 1 시간 후에 약간의 분해가 관찰되었으며, 배양 2 시간 후에 현저한 분해가 관찰되었다. 폴리(올리고-D-아르기닌), D-R9 및 PEI 와 응축된 DNA 는 배양 1 시간 및 2 시간 후에 분해되지 않았는데, 이는 펩타이드 및 PEI 가 생리학적 조건 하에서 복합체화된 DNA 를 보호할 수 있음을 나타낸다.

실시예 3 : 세포독성 및 트랜스펙션 효율 시험

1. 세포독성 시험

세포독성의 측정을 위하여, HEK 293 세포를 1×10⁴ 세포/웰의 밀도에서 96-웰 플레이트 상에 접종하고, 48 시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 미리 결정된 중량비 또는 대조구에서, 모든 배양 배지를 양이온성 펩타이드 또는 PEI/DNA 복합체를 함유하는 200 ㎕ 의 신선한 배지로 대체하였다. 48 시간 후에, 20 ㎕ 의 세포 계산 키트-8 (CCK-8, Dojindo Laboratory, Tokyo, Japan) 용액으로 배지를 대체하였다. 2 시간의 배양 후에, 각각의 웰의 흡광도를 540 nm 에서 자외-가시선 분광광도계(UV-Vis Spectrophotometer)에 의하여 측정하였다.

[식 1]

상대적인 세포 생활성(%)을 상기 식 1 에 의하여 계산하였으며, 식 중, N 은 복합체를 가진 경우의 흡광도 값이고, C 는 복합체를 갖지 않는 경우의 흡광도 값이며, D 는 세포를 갖지 않는 블랭크(blanks)의 흡광도 값이다. 대조구 흡광도를 세포 생활성 100% 로 가정하였다. 생활성을 8 벌로 3 회 평가하였다.

2. in vitro 트랜스펙션 효율시험

HEK 293, H9C2 및 L2 세포를, 각각, 8.0×10⁴, 4.0×10⁴ 및 1.0×10⁴ 세포/웰의 밀도에서, 12-웰 플레이트 상에 접종하였다. 배양 1 일 후에, 미리결정된 비율 및 DNA 용량 또는 대조구에서, 배양 배지를 양이온성 펩타이드 또는 PEI/DNA 복합체를 함유하는 1 ㎖ 의 10% FBS-보충 DMEM 로 대체하였다. 트랜스펙션 효율에 대한 상기 비율의 효과의 결정을 위하여, DMEM 에서 2 ㎍ 의 DNA 및 다양한 양의 양이온성 펩타이드 또는 PEI 를 혼합하여 복합체를 제조하였다. DNA 용량에 있어서, DNA 의 양을 2.0 의 고정비율로 변화시켰다. 세포 배양 48 시간 후에, 정보제공 유전자(reporter gene) 발현의 분석에 앞서 PBS 로 세포를 두차례 세척하고, 150 ㎕ 의 1×용해완충시약으로 20 분 동안 처리하였다. 세포 용해물을 스크레이프 및 수집하고, 1.5 ㎖ 마이크로 튜브로 전달한 후, 13000 rpm 에서 3 분간 원심분리하였다. 세포 용해물의 루시퍼레이즈 발광정도(RLU)를 96-웰 플레이트 휘도계(Berthold Detection System, Pforzheim, Germany) 상에서 20초 적분(integration)으로 측정하고, 표준 우혈청 알부민((Bio-rad Laboratories, CA, USA)으로 구성된 보정 곡선을 사용하여, 그 결과를 DC 단백질 분석 키트에 의하여 결정된 세포 단백질의 RLU/mg 으로 나타내었다. 모든 경우에 대하여, 트랜스펙션 효율을 3 벌로 세차례 시험하였다.

3. 실험 결과

세포내 흡수를 가능케 하는 PTDs 의 구조 성분은 아르기닌의 구아니디니움 머릿기와 연관된다. 비록 PTDs 의 내재화 메커니즘이 불명확하나, 작은 카르고의 구아니디움-풍부 펩타이드로의 부착 및 연속적인 세포 내로의 수송을 암시하는 가설이 보고되었다. 자발적으로 발생하는 수송 메커니즘의 제 1 단계는 음성으로 하전된 세포막 및 극성이면서, 양성으로 하전된 수용성 아르기닌 올리고머와 사이의 수소 결합을 수반한다. 이러한 전달 메커니즘은 음성으로 하전된 카르고에 결합된 아르기닌 올리고머가 자유 아르기닌 올리고머보다 덜 용이하게 세포 내로 유입되는 이유를 설명한다. 그러나, 몇몇의 아르기닌을 세포막과의 상호작용에 대하여 개방하면서, 오직 4 내지 5 개의 아르기닌이 옥타아르기닌 PTD 와 카르고와의 복합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 7 내지 9 개의 자유 아르기닌을 함유하는 카르고/PTD 복합체는 1 내지 5 개의 자유 아르기닌 잔기로 구성된 복합체보다 상당히 더 높은 흡수를 나타낸다.

헤파란 설페이트(HS) 매개 내재화 및 R9 의 엔도좀 탈출이 보고되었다. HS 를 갖지 않는 경우의 세포 내로의 R9 내재화는 불충분한데, 이는 HS 가 R9 세포 엔트리(entry)에 필요함을 나타낸다. 세포 내로의 R9-매개 카르고 전달은 세포 표면 상에서 R9 의 HS 에 대한 결합, 세포내이입(endocytosis)에 의한 흡수, HS 분해에 의한 유리, 세포내이입 소포(endocytic vesicles)로부터의 누출을 수반한다. HS 는 산성 엔도좀에서 헤파라네이즈(heparanase)에 의해서 분해되는데, 이는 R9 에 대한 친화성을 감소시킨다. PTD 농도 및 펩타이드/지질 비율에 의존하여, R9 는 리포좀의 지질 이중층을 파괴시키고 세포내이입 소포를 누축시키며, 따라서 산성 분해 이전에 잠재적으로 엔도좀으로부터 탈출하게 된다. 트랜스펙션 능력을 증가시키기 위하여, R9 를 고농도로 사용할 경우 세포독성이 증가할 수 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 합성 펩타이드의 in vivo 적용을 위하여서는, 혈청의 존재 중 트랜스펙션 활성을 평가하는 것이 필수적이다. 따라서, 본 발명에서는 폴리(올리고-D-아르기닌)의 트랜스펙션 효율을 혈청-함유 배지에서 시험하였다. 세가지 형태의 세포주 HEK293, H9C2 및 L2 에서 PLL, D-R9, 폴리(올리고-D-아르기닌) 및 PEI 의 트랜스펙션 효율을 다양한 중량비에서 평가하였다(도 6). 혈청의 존재 중 1.0 내지 4.0 의 상이한 비율에서 웰 당 2.0 ㎍ 의 불변 DNA 용량을 사용하여 트랜스펙션 연구를 수행하였다. 세가지 세포주 모두에서, PLL 및 D-R9 은 폴리(올리고-D-아르기닌)보다 유전자 발현이 더 낮았다. PLL 의 불충분한 DNA 보호 능력 때문에, 트랜스펙션 이전에 DNA 가 분해될 수 있다. D-R9 는 낮은 트랜스펙션 효율을 나타내었다. PEI 는 1.0 의 비율에서 가장 높은 트랜스펙션 효율을 나타냈으며, 최대 4.0 까지의 비율에서의 증가는 트랜스펙션 효율을 감소시켰다. 감소된 유전자 발현은 더 높은 중량비에서 PEI 의 세포독성 때문일 수 있다. 이와 대조적으로, 폴리(올리고-D-아르기닌)의 트랜스펙션 효율은 중량비가 1.0 에서 2.0 으로 증가함에 따라 현저하게 증가하였으며, HEK 293 및 L2 에서 2.0 의 비율에서 항정 상태에 이르렀다. 1.0 의 비율에서의 PEI 와 비교하여 4.0 이 상의 비율에서 폴리(올리고-D-아르기닌)의 유전자 발현의 거의 동일한 수준이 H9C2 에 제시되었다. 도 7 에 제시된 바와 같이, 혈청의 존재 중 0.1 ㎍ 내지 2.0 ㎍ 의 상이한 DNA 용량에서 동일한 비율의 펩타이드 또는 PEI 를 사용하여, 세가지 세포주에서의 용량-의존적 트랜스펙션 효율을 평가하였다. PLL 및 D-R9 에 대한 유전자 발현의 수준은 폴리(올리고-D-아르기닌) 또는 PEI 와 비교하여 낮았다. 폴리(올리고-D-아르기닌)이 2.0 ㎍ 의 DNA 용량까지의 트랜스 펙션 효율의 용량-의존적 증가 패턴을 나타내었기 때문에, DNA 용량의 증가는 유전자 발현을 포화시킬 수 있을 것으로 기대되었다.

두개의 상이한 중량비에서 양이온성 펩타이드 또는 PEI 를 사용하여 세포를 2 일 동안 배양한 후에, CCK-8 분석 방법을 사용하여 HEK 293 세포의 생활성을 측정하였다(도 8). 양이온성 펩타이드는 PEI 보다 독성이 낮은 것으로 밝혀졌으며, 폴리(올리고-D-아르기닌)은 양이온성 펩타이드 중에서 독성이 가장 낮았다. 상기 비율이 증가함에 따라, 양이온성 펩타이드의 경우 세포 생황성이 약간 감소된 반면, PEI 의 경우 세포독성이 현저하게 증가하였다. 비록 폴리(올리고-D-아르기닌)의 분자량이 PEI 및 PLL 의 분자량보다 높기는 하나, 폴리(올리고-D-아르기닌)이 세포독성이 더 낮으면서, 그 트랜스펙션 효율은 PEI 에 필적하거나 그 이상이라는 사실이 흥미로웠다. 이는 강화된 세포 형질도입(transduction) 및 폴리(올리고-D-아르기닌)의 세포내 가역적 특징 때문일 수 있다.

5 - 10% 정도의 저혈청에서 양이온성 벡터 시스템이 불활성화되기 때문에, in vitro 에서의 높은 유전자 전달 효율은 in vivo 에서 높은 전달 효율을 담보해 주지 못한다. 10% 혈청으로 수행된 트랜스펙션 결과는, 본 연구에서 시험된 세가지 세포주 모두에서 폴리(올리고-D-아르기닌)을 사용한 복합체 형성에 의하여, DNA 가 적절하게 보호되고, 효율적으로 발현되었음을 보여주었다. 융합생성(fusogenic) 펩타이드 또는 핵 위치 신호(NLS)를 사용한 양이온성 펩타이드의 컨쥬케이션은 엔도좀 탈출 또는 핵 전위를 촉진하는 데에 효과적이다. 그러나, 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)-기재 유전자 전달 시스템은, 엔도좀 탈출 또는 효율적인 유전자 발현을 위하여 융합생성 펩타이드 또는 신호 서열과의 추가적인 컨쥬게이션을 요구하지 않는다.

본 발명의 유전자 전달 시스템은, 치료용 유전자의 표적 특이적 전달, 표적에서 치료 유전자의 발현을 이용한 질병의 치료, siRNA 를 이용한 특정 질병 유발 유전자의 발현 억제를 통한 질병의 치료 및 사멸 유전자의 전달을 통한 질병 세포의 사멸 유도 등에 이용될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 천식 치료 단백질 유전자를 폐에 전달하는 방법에 의한 천식의 치료, 치매 유발 유전자의 발현을 siRNA 를 이용하여 억제하는 방법에 의한 치매의 예방 및 심근경색 치료 단백질의 유전자를 심근에 전달하는 방법에 의한 심근경색의 치료 등에 이용될 수 있다.

도 1 는 겔 둔화 분석 결과를 나타낸 것으로서, (a) PLL, (b) D-R9, (c) 폴리(올리고-D-아르기닌) 및 (d) PEI 에 의하여 DNA 이동이 둔화되었으며, (e) 이황화 결합의 환원을 β-메르캅토에탄올의 존재 중 도 1c 에서와 동일한 조건으로 수행하였다.

도 2 는 EtBr 배제 분석 결과를 나타낸 것으로서, 0.01 내지 3.0 의 중량비로 양이온성 펩타이드 및 PEI 를 단계적으로 첨가하였으며, 형광 광도를 초기 형광 강도에 대한 백분율로서 표현하였다.

도 3 은 (양이온성 펩타이드 또는 PEI)/DNA 복합체의 특징화를 나타낸 결과로서, (a) 입자 크기 및 (b) 제타 전위의 변화를 나타내었다.

도 4 는 양이온성 펩타이드 또는 PEI 와 응축된 DNA 의 형태학적 분석을 나타낸 결과로서, (a) 어떠한 양이온성 펩타이드 또는 PEI 를 갖지않는 DNA, (b) 폴리(올리고-D-아르기닌)/DNA 복합체, (c) PEI/DNA 복합체 및 (d) D-R9/DNA 복합체의 원자력 현미경에 시각화 결과를 나타내었다.

도 5 는 혈청에서의 DNA 안정성을 나타낸 결과이다.

도 6 은 다양한 (펩타이드 또는 PEI)/DNA 비율로 상이한 세포주 (a) HEK 293, (b) H9C2 및 (c) L2 에서 복합체의 트랜스펙션 효율을 나타낸 결과이다.

도 7 은 세가지 세포주 (a) HEK 293, (b) H9C2 및 (c) L2 에서 복합체의 DNA 용량-의존적 트랜스펙션 효율을 나타낸 결과이다.

도 8 은 2.0 및 4.0 의 (펩타이드 또는 PEI)/DNA 비율에서 HEK 293 세포 생 활성에 대한 양이온성 펩타이드 또는 PEI 의 영향을 나타낸 결과이다.

Claims

다음을 포함하는 유전자 전달 복합체의 제조방법:

(a) Cys-[R(arginine)9]-Cys의 양 말단 -SH를 이용하여 이황화결합을 형성하여 선(liner) 형의 환원성 폴리(올리고-아르기닌)을 합성하는 단계;

(b) 상기 합성된 환원성 폴리(올리고 아르기닌)과 유전자의 복합체를 형성하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 환원성 폴리(올리고-아르기닌)은 말단 시스테인-티올기의 DMSO 산화 과정에 의하여 형성된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 Cys-[R(arginine)9]-Cys는 Cys-(D-R)9-Cys인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유전자는 DNA 또는 siRNA로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법으로 제조되고,

Cys-[R(arginine)9]-Cys 반복 단위로 이루어지고 상기 말단 시스테인(Cys)이 이황화결합을 형성하고 있는 환원성 폴리(올리고-아르기닌)에 유전자가 결합되어 있는 유전자 전달 복합체.
제 5 항에 있어서, 상기 Cys-[R(arginine)9]-Cys는 Cys-(D-R)9-Cys인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 5 항에 있어서, 상기 유전자는 DNA 또는 siRNA로 이루어진 것을 특징으로 하는 복합체.
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