CN102010461A - 一种alpha螺旋状阳离子多肽分子及其制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种alpha螺旋状阳离子多肽分子及其制法和应用。本发明多肽分子由alpha螺旋性主链与侧链构成。主链由赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、组氨酸构成;侧链主要由组氨酸、赖氨酸、精氨酸和靶向基团构成。组氨酸有利于内涵体释放基因,增加基因表达效果;赖氨酸或精氨酸可提供正电荷,与DNA结合形成稳定复合体;靶向基团有利于提高基因表达效率。利用本发明alpha螺旋状阳离子多肽分子得到的多肽/DNA复合物粒径大小在100-500nm之间,表面带正电荷。本发明具有多肽分子量分布窄、多肽与基因复合方法简单、稳定性和基因表达效率高、毒性低等特点。
Description
技术领域
本发明主要涉及生物医用高分子材料及其应用领域,具体涉及一种alpha螺旋状阳离子多肽分子及其制法和应用。
背景技术
基因治疗自1989年首次进入临床试验,至今已有二十余年,它为很多疾病(尤其是癌症)提供了一种新的治疗方法。基因治疗必须要有一个能将目的基因导入机体细胞的载体系统。基因治疗在临床的成功应用与否,其技术瓶颈是能否开发出一个安全而高效的基因药物传递系统(International Journal of Pharmaceutics,2001,229:1-21;Nature Biotechnology,2000,18:33-37;Gene Therapy,2005,12:1734-1751)。目前,常用于基因传输的载体系统包括两类:病毒性载体和非病毒性载体。前者具有较高的基因表达效率,但存在安全性和免疫原性等风险,1999年,美国曾出现第一例采用病毒性载体基因治疗死亡的病例(Genetherapy,2003,10:1135-1141)。尽管非病毒性载体对基因的表达效率较病毒性载体低,但非病毒性基因载体具有毒性低、低免疫原性以及易于规模生产等优点,在基因治疗应用中备受瞩目。
近年来,关于非病毒性基因载体,报道了阳离子聚合物、接枝共聚物、脂质体以及阳离子多肽等作为基因的载体,也具有较高的基因表达效率(Journal of Controlled Release,2004,94:1-14;Nature Materials,2006,5:439-451)。如聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)中的伯胺可用来与DNA结合,而仲胺和叔胺可用于内涵体释放DNA,因此,其基因表达效率高,被认为是目前非病毒基因载体的标准。但PEI毒性大,因此,难以推广应用。多肽作为基因载体,由于其生物相容性高,近年来备受关注。如组氨酸(Biochimica EtBiophysica Acta-Biomembranes,2006,1758:301-307)、赖氨酸(Biochemical and BiophysicalResearch Communications,2007,357:511-516)和精氨酸(Bioconjugate Chemistry,2001,12:1005-1011;Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research,2003,1640:129-136)构成的多肽均可用作为基因的载体。在多肽作为基因载体的设计中,赖氨酸与组氨酸用来与DNA结合,而组氨酸可用来内涵体释放DNA。多肽序列中还可引入半胱氨酸,在多肽/DNA复合体中,半胱氨酸中的二硫键可发生发生交联反应,有效增加复合体稳定性。此外,Niidome等(Biomaterials,2000,21:1811-1819)设计了两亲性阳离子多肽KALA作基因载体,该多肽分子可以形成alpha螺旋结构,能有效穿过细胞膜提高基因表达效率。专利申请CN101235384A公布了一种新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法;专利申请CN1844170A公布了一种温敏聚异丙基丙烯酰胺-聚赖氨酸缀合物转基因载体的制备;专利申请CN1462763A公布了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒与制备方法及作为基因载体的应用;专利申请US7112442和US6387700公布了由色氨酸、半胱氨酸和赖氨酸组成的多肽作为基因的载体材料。尽管基因载体材料的研究备受关注,也取得一些进展,但仍有很多问题有待解决。迫切需要设计和开发出一种合成方法简单、基因表达效率高、毒性小的基因载体。
发明内容
理想的基因传输系统应需满足以下条件:能有效与DNA结合,形成稳定的载体/DNA复合体;能有效与细胞膜相互作用,高效地穿透细胞膜,将基因传送到细胞内;内涵体中能高效地将DNA释放;载体材料对人体无毒或毒性很小。为达到上述目的,本发明提出一种新型alpha螺旋状阳离子多肽分子及其用于基因传输。
本发明采用的技术方案是设计一种具有alpha螺旋状阳离子多肽分子作为基因载体材料。alpha螺旋结构的穿透细胞能力,组氨酸有利于内涵体释放基因,赖氨酸或精氨酸提供正电荷与DNA结合形成复合体,靶向基团则向肿瘤部位定向传输基因。
一种alpha螺旋状阳离子多肽分子,结构通式为:
其中,n1=3~5,x=1~7,y=1~12,z=1~5,n2为1~4;
所述靶向基团为Arg-Gly-Asp;所述B1是Ala或His;B2为Lys或Arg。
所述的alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法,包括以下步骤:
(1)合成单体多肽分子,提纯;
(2)将单体多肽分子溶于水中,浓度为10~200mg/mL;
(3)将偶氮二甲酰胺溶于二甲基亚砜中,偶氮二甲酰胺的浓度为0.1~2mg/μL;
(4)将多肽的水溶液与偶氮二甲酰胺的二甲基亚砜溶液混合,其中多肽与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶10~1∶100,搅拌1~10天,得到溶液;
(5)将步骤(4)得到的溶液用去离子水透析1~5天后,收集透析袋中的产物并冷冻干燥,得到alpha螺旋状阳离子多肽分子粗产物;
(6)提纯粗产物。
所述透析袋的截断分子量为500~10000。
所述单体多肽分子的结构式为:
其中n1=3~5,x=1~7,y=1~12,z=1~5;所述B1是Ala或His;B2为Lys或Arg。
所述的alpha螺旋状阳离子多肽分子,结构通式还可以为:
其中,n1=3~5,x=1~7,y=1~12,n2为1~4;所述B1是Ala或His;B2为Lys或Arg。
所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法,包括以下步骤:
(1)合成单体多肽分子,提纯;
(2)将单体多肽分子溶于水中,浓度为10~200mg/mL;
(3)将偶氮二甲酰胺溶于二甲基亚砜中,偶氮二甲酰胺的浓度为0.1~2mg/μL;
(4)将多肽的水溶液与偶氮二甲酰胺的二甲基亚砜溶液混合,其中多肽与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶10~1∶100,搅拌1~10天,得到溶液;
(5)将步骤(4)得到的溶液用去离子水透析1~5天后,收集透析袋中的产物并冷冻干燥,得到alpha螺旋状阳离子多肽分子粗产物;
(6)提纯粗产物。
所述单体多肽分子的结构式为:
其中n1=3~5,x=1~7,y=1~12;所述B1是Ala或His;B2为Lys或Arg。
所述透析袋的截断分子量为500~10000。
所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子在基因传输中的应用。
本发明所述的单体多肽分子可以运用现有技术中已有的固相合成法,在多肽合成仪中合成单体多肽分子,再用制备液相色谱进行提纯,即可制得单体多肽分子。
所述透析袋的截断分子量为500~10000。
本发明所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子在基因传输中的应用。
再将步骤1所制得的单体多肽分子进行交联,制备主链较长的大分子多肽,交联度为1~8。
多肽/DNA复合体的制备方:首先,将一定量的多肽溶解于20mM的PBS缓冲液中(pH5.0),配置多肽浓度为1mg/mL的溶液。按照一定的氮磷比(N/P)将一定量的多肽溶液与DNA混合,N/P值取0、1、5、10、20、30、40和50。将混合液室温下放置30min,使多肽与DNA充分结合,形成稳定的多肽/DNA复合体。最后,用该复合体对细胞进行表达实验。运用扫描电镜或原子力显微镜观察复合体的外观形貌;动态光散射法测量胶束/DNA复合体的平均粒径;微电泳仪测定胶束/DNA复合体的zeta电位;四唑盐比色法(MTT)对多肽载体材料和多肽/DNA复合体进行细胞毒性评价。
多肽基因表达效率的检测:首先,将HepG2细胞接种于24孔板(8×104细胞/孔),放入培养箱,待细胞汇合度为70%,移去培养基,PBS缓冲液冲洗细胞两次后,加入无血清培养基。分别取步骤3中不同N/P值下的多肽/DNA复合体加入各孔细胞中,继续培养4h,然后换上含10%血清培养基,继续培养68h之后,移去培养基,用PBS缓冲液冲洗两次,然后每个孔加入1倍报告基因裂解缓冲液(1×reporter lysis buffer),并放置在-80℃冰箱中30min。最后通过超敏感管式发光仪检测基因表达效率。
本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果:
(1)本发明所用的原材料为各种氨基酸,为天然的生物材料,毒性低,无副作用,是一种新型的基因载体材料。
(2)制备方法简单,合成条件温和,合成技术要求不高,易于操作。
(3)本方法制备的交联多肽分子,电荷密度高,与DNA结合力强,形成多肽/DNA复合体粒径小(100~500nm),zeta电位较高(10~60mV),基因表达效率高(1.0×107~9.2×108RLU/mg蛋白质)。
附图说明
图1为实施例4中制备的多肽(简称RC29)的HPLC谱图。
图2为di-RC29(RC29二聚体)和tri-RC29(RC29三聚体)的MALDI-TOF检测图。
图3为di-RC29/DNA复合体的SEM照片。
图4为di-RC29和tri-RC29在水中的圆二色谱图。
图5di-RC29/DNA与tri-RC29/DNA复合体在不同N/P值下的电子迁移凝胶色谱图。
图6为HepG2细胞中di-RC29与tri-RC29多肽对荧光素酶基因的表达效率。
图7为di-RC29/DNA与tri-RC29/DNA复合体在HepG2细胞中的毒性测试。
具体实施方式
实施例1
权利要求1中多肽分子通式,取n1=3,n2=1,x=1,y=1,z=0,B1是Ala,B2是Lys。该多肽分子的结构为:
简称RC16。本实施例是阐述RC16的合成及其用于基因传输。运用多肽合成仪合成RC16,并用HPLC提纯。
将10mg的RC16溶解于20mM的PBS缓冲液中(pH 5.0),按照一定的氮磷比(N/P)将的RC16溶液与DNA混合,N/P值取0、1、5、10、20、30、40和50。将混合液室温下放置30min,使RC16与DNA充分结合,形成稳定的RC16/DNA复合物。该复合体的平均粒径为540nm,zeta电位为22mV。
将HepG2细胞接种于24孔板(8×104细胞/孔),放入培养箱,待细胞汇合度为70%,移去培养基,PBS缓冲液冲洗细胞两次后,加入无血清培养基。分别取不同N/P值下的RC16/DNA复合体加入各孔细胞中,继续培养4h,然后换上含10%血清培养基,继续培养68h之后,移去培养基,用PBS缓冲液冲洗两次,然后每个孔加入1倍报告基因裂解缓冲液(1×reporter lysis buffer),并放置在-80℃冰箱中30min。最后检测基因表达效率,RC16对基因的最高表达效率为2.2×105(N/P 40)。
实施例2
权利要求1中多肽分子通式,取n1=5,n2=4,x=7,y=12,z=5,B1是His,B2是Arg。n2=4表示该分子为四交联多肽,简称为tetra-RC49,相应的单体分子简称RC49。
其结构式为:
本实施例是阐述tetra-RC49的合成及其用于基因传输。其中tetra-RC49的结构式为:
首先,运用多肽合成仪合成RC49,用制备液相色谱进行提纯,制得单体多肽分子。
将10mg提纯后的RC49溶解于去离子水中,浓度为10mg/ml;将400mg的偶氮二甲酰胺(N,N,N’,N’-tetramethylazodicarboxamide)溶于DMSO中,配成浓度为0.1mg/μL。然后将两溶液混合,使RC49与偶氮二甲酰胺的摩尔比约为1∶100,室温下搅拌3天后,用去离子水透析(MWCO=10000Da)除去副产物,1天后收集产物并真空冷冻干燥,得到交联的RC49,产物经HPLC提纯,得到四交联RC49(tetra-RC26),其纯度在95%以上。
运用与实施例1中相同的方法制备N/P值分别为0、1、5、10、20、30、40和50的tetra-RC49/DNA复合体,平均粒径为456nm,zeta电位分别为72mV。
运用与实例1中相同的方法对tetra-RC49/DNA复合体在HEpG2细胞中进行基因表达测试,其最高表达效率为1.1×107(N/P 30)。
实施例3
权利要求1中多肽分子通式,取n1=4,n2=2,x=2,y=4,z=3,B1是His,B2是Lys。n2=2表示该分子为二交联多肽,简称为di-RC30,相应的单体分子简称为RC30,其结构式为:
本实施例是阐述di-RC30的合成及其用于基因传输。其中di-RC30的结构式为:
首先,运用多肽合成仪合成RC30,并用HPLC提纯。
将10mg提纯后的RC30溶解于去离子水中,浓度为50mg/ml;将24mg的偶氮二甲酰胺(N,N,N’,N’-tetramethylazodicarboxamide)溶于DMSO中,浓度为2mg/μL。然后将两溶液混合,使RC30与偶氮二甲酰胺的摩尔比约为1∶52,室温下搅拌3天后,用去离子水透析(MWCO=500Da)除去副产物,1天后收集产物并真空冷冻干燥,得到交联的RC30,产物经HPLC提纯,得到二交联RC30(di-RC30),其纯度在95%以上。
运用与实施例1中相同的方法制备N/P值分别为0、1、5、10、20、30、40和50的di-RC30/DNA复合体,平均粒径为230nm,zeta电位分别为43mV。
运用与实例1中相同的方法对di-RC30/DNA复合体在HEpG2细胞中进行基因表达测试,其最高表达效率为2.2×107(N/P 30)。
实施例4
根据权利要求1中多肽分子通式,取n1=3,n2=3,x=3,y=6,z=3,B1选择His,B2选择Lys,该多肽分子简称为tri-RC29,相应的单体分子简称RC29,
其结构式为:
tri-RC29的结构式为:
首先,运用多肽合成仪合成RC29,并用HPLC提纯。
将10mg提纯后的RC29溶解于去离子水中,浓度为50mg/ml;将20mg的偶氮二甲酰胺(N,N,N’,N’-tetramethylazodicarboxamide)溶于70μL的DMSO中,浓度为0.3mg/μL。然后将两溶液混合,使RC29与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶40,室温下搅拌5天后,用去离子水透析(MWCO=1000Da)除去副产物,1天后将收集产物并冷冻干燥,制得交联的RC29。产物用HPLC提纯分离出三交联RC29(tri-RC29),并用MADI-TOF检测其纯度,tri-RC29的纯度在95%以上。
运用与实施例1中相同的方法制备N/P值分别为0、1、5、10、20、30、40和50的tri-RC29/DNA复合体,平均粒径为147nm,zeta电位为58mV。
运用与实例1中相同的方法对tri-RC29/DNA复合体在HEpG2细胞中进行基因表达测试,tri-RC29对基因的最高表达效率为5.3×108(N/P 30)。
实施例5
根据权利要求1中多肽分子通式,取n1=2,n2=4,x=3,y=6,z=3,B1选择Ala,B2选择Arg,该多肽分子简称为tetra-RC25,相应的单体分子简称RC25。
其结构式为
tetra-RC25的结构式为
首先,运用多肽合成仪合成RC25,并用HPLC提纯。
将10mg提纯后的RC25溶解于去离子水中,浓度为50mg/ml;将20mg的偶氮二甲酰胺(N,N,N’,N’-tetramethylazodicarboxamide)溶于DMSO中,浓度为浓度为0.3mg/μL。然后将两溶液混合,使RC25与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶35,室温下搅拌10天后,用去离子水透析(MWCO=1000Da)除去副产物,1天后将收集产物并冷冻干燥,制得交联的RC25。产物用HPLC提纯分离出四交联RC25(tetra-RC25),并用MADI-TOF检测其纯度在95%以上。
运用与实施例1中相同的方法制备N/P值分别为0、1、5、10、20、30、40和50的tetra-RC25/DNA复合体,平均粒径为221nm,zeta电位为61mV。
运用与实例1中相同的方法对tertra-RC25/DNA复合体在HEpG2细胞中进行基因表达测试,tertra-RC25对基因的最高表达效率为和2.3×107(N/P 40)。
实施例6
多肽分子螺旋性检测。
运用圆二色谱(Circular dichroism,CD)检测tri-RC29(结构式见实施例4)的二级结构。首先,室温下配置1mg/mL的多肽水溶液,在190-250nm远紫外区域进行扫描,扫描光程0.2cm,步长0.2nm,扫描速率为100nm·min-1。采用连续扫描方式,得到椭圆率,然后根据以下公式转换为摩尔椭圆率θM:
其中,θM为摩尔椭圆率,θobs为测出的椭圆率值,MRW为氨基酸残基分子量,c为多肽的浓度(mg/mL),1为广程长度(cm)。
tri-RC29在208nm和222nm处有负峰出现,表明其二级结构具有alpha螺旋性。在222nm处,tri-RC29的平均残基椭圆率为37425deg.cm2.dmol-1。
实施例7
tri-RC29(结构式见实施例4)与基因的结合强度检测。
通过琼脂糖电泳来考察多肽与基因的结合效率或结合强度。首先,将10mg tri-RC29溶于20mM的10mL醋酸缓冲液,然后按照氮磷比分别为0、1、5、10、20、30、40和50配置一系列的多肽/DNA复合体,室温下放置30min使多肽与DNA有效地结合,配置浓度为1%的琼脂糖凝胶缓冲液(0.5×TBE缓冲液),制作凝胶凝胶电泳(含溴化乙锭0.5μg/mL),电泳电压为80mV,60min后取出凝胶,在凝胶成像仪(Chem Genius,Evolve,Singapore)下观察并拍照。tri-RC29与DNA完全有效结合的最小N/P值为2。
实施例6
多肽/DNA复合体的毒性检测。
应用四唑盐比色法(MTT)对tri-RC29(结构式见实施例4)和tri-RC29/DNA复合体进行细胞毒性评价。首先,将细胞接种于96孔板(1×104细胞/孔),常规培养,至60-70%汇合度。细胞用PBS冲洗两次,加入无血清培养基,并将多肽、载药胶束或多肽/DNA复合体加入各孔。同时设空白对照组,除了不加入样品,其余操作均相同。继续培养4h后,移去培养基,换上含10%血清培养基,继续培养48h后,再用100μL新鲜培养基与20μL的MTT混合物替换,培养4h后小心吸弃孔内培养基,每孔加入150μL的DMSO,摇床震荡15min,在酶标仪上,测量550nm和690nm处的吸光度。按以下公式计算细胞存活率:
式中,A550和A690分别为在550nm和690nm处所测样品的吸光度。所有多肽或多肽/DNA复合体体系的细胞存活率均为80%以上,毒性不大。
Claims (9)
3.权利要求1所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)合成单体多肽分子,提纯;
(2)将单体多肽分子溶于水中,浓度为10~200mg/mL;
(3)将偶氮二甲酰胺溶于二甲基亚砜中,偶氮二甲酰胺的浓度为0.1~2mg/μL;
(4)将多肽的水溶液与偶氮二甲酰胺的二甲基亚砜溶液混合,其中多肽与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶10~1∶100,搅拌1~10天,得到溶液;
(5)将步骤(4)得到的溶液用去离子水透析1~5天后,收集透析袋中的产物并冷冻干燥,得到alpha螺旋状阳离子多肽分子粗产物;
(6)提纯粗产物。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述透析袋的截断分子量为500~10000。
6.权利要求2所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)合成单体多肽分子,提纯;
(2)将单体多肽分子溶于水中,浓度为10~200mg/mL;
(3)将偶氮二甲酰胺溶于二甲基亚砜中,偶氮二甲酰胺的浓度为0.1~2mg/μL;
(4)将多肽的水溶液与偶氮二甲酰胺的二甲基亚砜溶液混合,其中多肽与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶10~1∶100,搅拌1~10天,得到溶液;
(5)将步骤(4)得到的溶液用去离子水透析1~5天后,收集透析袋中的产物并冷冻干燥,得到alpha螺旋状阳离子多肽分子粗产物;
(6)提纯粗产物。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述透析袋的截断分子量为500~10000。
9.权利要求1或2所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子在基因传输中的应用。
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