CN102517332A - Egf修饰的pamam自组装转基因组合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了EGF修饰的PAMAM自组装转基因组合物及其制备方法与应用。本发明所提供的用于转基因的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、表皮细胞生长因子和核酸复合制成。本发明具有以下优点：1)通过自组装的方法形成EGF修饰的PAMAM载体作为基因递送载体，利用EGF与肿瘤细胞EGFR介导的内吞作用，提高PAMAM载体对细胞的靶向性，最大限度地降低非靶细胞的摄入，可在提高有效性的同时降低毒副作用；2)通过EGF对PAMAM的修饰，可降低PAMAM载体过强的正电荷强度，有利于降低细胞毒性和溶血现象的发生；3)采用自组装方法制备EGF/PAMAM/DNA复合物，与化学合成相比，分子自组装方法可更方便、灵活的对体系进行修饰，并且保持配体的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及EGF修饰的PAMAM自组装转基因组合物及其制备方法与应用。
背景技术
新兴的基因治疗手段是通过将外源基因片段转入细胞内部，调控基因表达以纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，杀灭病变的细胞，或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治疗的目的。由于基因治疗可以跨越传统治疗手段的瓶颈，因此成为重大恶性疾病治疗领域(例如癌症、重大恶性传染病、遗传类疾病)的前沿和热点。
然而，由于基因治疗药物自身的特性使基因表达水平受限：1)基因治疗药物因携带负电荷无法跨越表面同样带负电荷的细胞膜；2)在体内递送的过程中不稳定极易被降解；3)易被非特异性免疫清除；4)体内递送的非靶向性等。由此可见，当前体内基因治疗能够成功并实现临床转化应用的关键是如何将基因治疗药物高效地在体内进行递送并实现其胞内功效，而解决这些问题的关键是设计构建合适的基因治疗药物载体系统。
利用纳米技术制备的药物载体颗粒具有比表面积大、尺寸小、表面易修饰等特点，因此，将纳米颗粒包载基因治疗药物后用于重大恶性疾病的治疗正成为基因治疗药物研究的新方向。以纳米颗粒作为基因递送载体，将DNA和RNA等治疗性基因片段包裹在纳米颗粒之中或者吸附在颗粒表面，同时利用颗粒表面偶联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，或纳米材料自身的特殊物理化学性质，如磁性、光学性能、被动靶向性等，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性基因治疗[Proc 28th Int Symp on Contr Rel of BioactMater，2001，7095]。
新型树枝状高分子聚酰胺-胺(PAMAM)，以其独特的分子结构和表面性质，成为了治疗性基因载体研究的热点。以末端为胺基的PAMAM树枝状大分子为例，它在生理pH条件下具有很好的溶解性；由于能够通过其所带的阳离子和DNA所带的阴离子的静电相互作用，不但可以实现更多数量基因的运载，提高转染效率；而且体系稳定，非常适合作为DNA的载体，能有效地在不同的细胞类型间转移遗传物质；可介导外源基因在宿主细胞染色体DNA中的整合，从而获得转基因的长期、稳定表达；能够保护目的基因不受体内血浆或组织细胞中各种酶的破坏，因而可以实现体内的有效转染[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：4897-4902]。
众多研究表明，PAMAM纳米基因递送系统在体外转染中表现良好的应用前景，但PAMAM作为纳米基因递送载体在体内应用尚存在以下几个问题需要解决：1)转染效率相对较低；2)在体内环境下，PAMAM可以非特异性的结合大量的负电大分子和红细胞，影响转染效率并且发生溶血现象；3)如何实现PAMAM纳米基因递送系统的靶向性。
为了解决上述问题，目前研究多直接在PAMAM分子上进行修饰，如在PAMAM表面修饰鸟氨酸等残基[Int J Pharm，2010，392：294-303]，增强PAMAM分子表面正电性以增强转染效率，但此方法在增强过多正电性的同时，也提高了细胞毒性；另一方面，对PAMAM表面修饰PEG[Nanotechnology，2009，20：105103]，以提高生物相容性，减少非特异性的结合血浆中的负电大分子和红细胞，另外，在PEG末端修饰特定蛋白如乳铁蛋白[Biomaterials，2008，29(2)：238-246]，以实现组织靶向性，但PEG的修饰增加了PAMAM分子和DNA分子结合的空间位阻，降低了转染效率。
EGFR是一种酪氨酸激酶受体，在细胞周期中起重要作用，与细胞生长、增殖、迁移有关。其编码基因是一种原癌基因，在生理状态下它不表达或只是有限制的表达，处于非激活状态，不具有致癌性。如果编码该受体的基因发生突变，将会导致多余的表面生长因子受体产生，增强了细胞信号的传导，便容易诱发肿瘤。EGFR的过度活化与肿瘤生长和分级(包括增殖、血管发生、浸润和转移)的关键过程有关。研究表明EGFR的过量表达和/或突变可以导致多种肿瘤发生，众多的人类实体瘤如头颈癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫及脑部肿瘤等，都存在EGFR过表达现象。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于转基因的组合物。
本发明所提供的用于转基因的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、表皮细胞生长因子和核酸复合制成。
所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的数均分子量为6909-28826。
所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的正电荷与所述核酸的负电荷的比值为1∶1-20∶1。
所述表皮细胞生长因子与所述核酸的质量比为2∶1-20∶1。
所述核酸为含有待转基因的重组质粒或待转基因。
所述表皮细胞生长因子(EGF)：购自Sigma公司，产品目录号为E4127。
所述组合物是按照下述的方法制备得到的。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述用于转基因的组合物的方法。
本发明所提供的制备所述用于转基因的组合物的方法，包括如下步骤：
将末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物的水溶液与核酸混合后，再加入opti-MEM培养基，孵育形成聚酰胺-胺树枝状聚合物与核酸的复合物；再向所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与核酸的复合物中加入表皮细胞生长因子，孵育形成聚酰胺-胺树枝状聚合物、表皮细胞生长因子和核酸的复合物，即得到所述用于转基因的组合物。
所述用于转基因的组合物在转基因中的应用或在制备基因治疗药物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明具有以下优点：
1)本发明的目的是利用表皮细胞生长因子受体(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)为靶点，采用表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)作为配体，通过自组装的方法形成EGF修饰的PAMAM载体作为基因递送载体，利用EGF与肿瘤细胞EGFR介导的内吞作用，提高PAMAM载体对细胞的靶向性，最大限度地降低非靶细胞的摄入，可在提高有效性的同时降低毒副作用；
2)通过EGF对PAMAM的修饰，可降低PAMAM载体过强的正电荷强度，有利于降低细胞毒性和溶血现象的发生；
3)采用自组装方法制备EGF/PAMAM/DNA复合物，与化学合成相比，分子自组装方法可以更方便、灵活的对体系进行修饰，并且保持配体的生物活性。
附图说明
图1为EGF修饰对EGF/PAMAM/DNA复合物Zeta电位的影响。
图2为EGF修饰对EGF/PAMAM/DNA复合物粒度的影响。
图3为制备的EGF/PAMAM/DNA复合物的透射电镜图(放大倍数150000X)。
图4为制备的EGF/PAMAM/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果。
图5为EGF修饰对PAMAM/DNA复合物体外转染效果的影响。
图6为EGF修饰对PAMAM/DNA复合物细胞毒性的影响。
图7为EGF/PAMAM/DNA复合物的跨膜转运研究结果。
图8为EGF修饰对MCF-7细胞增殖促进作用的安全性考察结果。
图9为用EGF/PAMAM/DNA复合物转染p53基因对细胞增殖抑制作用的考察结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)：末端带有氨基，以乙二胺为核，3.0代，(购自Sigma-Aldrich，产品目录号：412422，规格5g，数均分子量为6909)；采用旋转蒸发仪抽真空，去掉甲醇溶剂，获得PAMAM G3，再用PBS缓冲液(pH7.4)溶解，制备成10mg/mL储存液于4℃备用。
聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)：末端带有氨基，以乙二胺为核，4.0代，(购自Sigma-Aldrich，产品目录号：412449，规格10g，数均分子量为14215)；采用旋转蒸发仪抽真空，去掉甲醇溶剂，获得PAMAM G4，再用PBS缓冲液(pH7.4)溶解，制备成10mg/mL储存液于4℃备用。
聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)：末端带有氨基，以乙二胺为核，5.0代，(购自Sigma-Aldrich，产品目录号：536709，规格5g，数均分子量为28826)；采用旋转蒸发仪抽真空，去掉甲醇溶剂，获得PAMAM G5，再用PBS缓冲液(pH7.4)溶解，制备成10mg/mL储存液于4℃备用。
表皮细胞生长因子(EGF)：购自Sigma公司，产品目录号为E4127。
实施例1、制备EGF/PAMAM/DNA复合物
一、不同PAMAM代数和不同电荷比的筛选
1)先将上述制成的PAMAM G3、PAMAM G4和PAMAM G5(数均分子量分别为：6909、14215和28826)10mg/mL储存液溶解于消毒蒸馏水中，振荡混匀，配制成1mg/mL的工作溶液，4℃储存备用。转染前取1.0μg pGL-3.0质粒DNA(pGL-3.0质粒购自Promega公司，产品目录号为：E1771)置于EP管中，分别加入0.7μL、1.4μL、3.5μL、7μL浓度为1mg/mL的PAMAM G3、PAMAM G4和PAMAM G5工作溶液，再加入opti-MEM培养基(购自invitrogen，产品目录号为11058-021)500uL，混匀后置室温孵育10min形成PAMAM/DNA复合物。PAMAM/DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比分别为1∶1、2∶1、5∶1和10∶1。
2)按上述制备的不同代数、不同正负电荷比PAMAM/DNA复合物，按Promega荧光素酶检测系统(Promega，产品目录号为：E1500)说明书检测其体外转染效果，结果如表1所示，结果显示，不同代数的PAMAM对体外转染效果影响较大，随着代数的增加，PAMAM/DNA复合物的荧光素酶活性增加，PAMAM G5与DNA形成复合物的体外转染效果最好。电荷比的增加也会提高复合物的转染效果，PAMAM与DNA的正负电荷比为10∶1时，PAMAM/DNA复合物的荧光素酶活性最高。
表1不同代数和不同正负电荷比PAMAM/DNA复合物的荧光素酶活性检测结果
二、制备EGF/PAMAM/DNA复合物
EGF/PAMAM/DNA复合物按照如下步骤的方法制备而成：
1)首先将上述制成的PAMAM G5(数均分子量为28826)10mg/mL储存液溶解于消毒蒸馏水中，振荡混匀，配制成1mg/mL的工作溶液，4℃储存备用。转染前取1.0μg pEGFP-N1质粒DNA(pEGFP-N1质粒购自Clontech公司)置于EP管中，分别加入3.5μL、7μL、10.5μL、14μL和17.5μL浓度为1mg/mL的PAMAM G5工作溶液，再加入opti-MEM培养基(购自invitrogen，产品目录号为11058-021)500uL，混匀后置室温孵育10min形成PAMAM/DNA复合物。形成的PAMAM/DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1和20∶1。
2)将表皮细胞生长因子(EGF)用PBS缓冲液(pH7.4，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，NaH2PO4·H2O 1.56g，KH2PO40.20g，蒸馏水定容至1000ml)，配制成浓度为1mg/mL的EGF溶液，向500μL不同正负电荷比的PAMAM/DNA复合物加入2μL浓度为1mg/mL的EGF溶液，混匀后置室温孵育10min形成EGF/PAMAM/DNA复合物。形成EGF/PAMAM/DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1和20∶1；EGF与DNA的质量比为2∶1。将上述制备的复合物溶液放入激光粒度仪自动检测粒径和Zeta电位(英国Malvern公司，型号Zetasizer Nano ZS 90)。
结果表明，采用EGF修饰预先成型的PAMAM/DNA复合物，随着复合物中PAMAM与DNA的正负电荷比的增加，复合物的正电性增强(图1)，但平均粒径在300nm左右(图2)，无显著性差异。当PAMAM与DNA的正负电荷比为20∶1，EGF与DNA的质量比为2∶1时，制得的EGF/PAMAM/DNA复合物的透射电镜如图3所示，观测其粒度与激光粒度仪测定结果相似。
实施例2、EGF/PAMAM/DNA复合物的表征
一、EGF/PAMAM/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验
将实施例1制备的EGF/PAMAM/DNA复合物采用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验证明PAMAM与DNA的复合情况以及稳定性，所检测的EGF/PAMAM/DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比为20∶1，EGF与DNA的质量比为2∶1。具体方法如下：
称取适量琼脂糖，加入I×TAE溶液，加热溶解，配制0.7％琼脂糖凝胶溶液，室温冷却至约50℃，加入1μL溴化乙锭溶液(500μg/ml)插入DNA染色，灌胶，加样，100V电泳20min左右，紫外透射仪观察并拍照。新鲜配制所需转染复合物，0.7％琼脂糖凝胶电泳鉴定包封效果。
琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果如图4所示(图4中，泳道1为pEGFP-N1质粒DNA；泳道2为PAMAM/DNA复合物；泳道3为EGF/PAMAM/DNA复合物)，从图中可见，PAMAM/DNA复合物与EGF/PAMAM/DNA复合物都未能向正极迁移，表明EGF/PAMAM/DNA复合物可以有效包裹DNA。
二、EGF/PAMAM/DNA复合物的体外转染实验
对上述实施例1制备EGF/PAMAM/DNA复合物进行体外转染实验，EGF/PAMAM/DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比分别为5∶1、10∶1、15∶1和20∶1；EGF与DNA的质量比为2∶1。具体方法如下：
收集对数生长期的HepG2细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)接种于24孔细胞培养板，每孔105个，于37℃和5％CO2培养24h至细胞达到70％汇合度，弃培养基，用PBS洗涤三次。然后加入相应转染复合物：EGF/PAMAM/DNA复合物(EGF-Dendriplex)、PAMAM-DNA复合物(Plain-Dendriplex)，于37℃培养4h。转染结束后，细胞用PBS洗三次，并用新鲜含10％FBS的DMEM替换。转染48h后分别加入1mL细胞裂解液裂解细胞，4℃、12000g离心5min，然后取上清液，用荧光素酶试剂盒(购自Promega，产品目录号为E1500)检测基因表达情况。
结果如图5所示，EGF加入提高荧光素酶基因表达，高正负电荷比提高荧光素酶基因表达。此结果表明，采用EGF修饰的PAMAM/DNA复合物可以提高GFP在EGFR过表达的HepG2细胞中的表达。
三、EGF/PAMAM/DNA复合物的细胞毒性实验
对上述实施例1制备EGF/PAMAM/DNA复合物进行细胞毒性实验，EGF/PAMAM/DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比分别为5∶1、10∶1、15∶1和20∶1；EGF与DNA的质量比为2∶1。采用MTT法检测其细胞增殖情况，具体方法如下：
将HepG2细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)按每孔5×104个细胞接种96孔板，24h后按最佳质量比转染，将细胞随机分为正常对照组、PAMAM/DNA组以及EGF/PAMAM/DNA转染组(质粒浓度为0.5μg/mL，每组设6个复孔，重复3次，处理24h)。光镜下观察细胞的形态变化、生长特点，移行方式以及培养基的改变，用MTT法测定OD490值绘制生长曲线并计算各组HepG2细胞的相对存活率(％)。
HepG2细胞的相对存活率(％)＝(实验组OD490值/对照组OD490值)×100％。
实验结果如图6所示，从图中可见，EGF/PAMAM/DNA复合物对HepG2细胞的增殖抑制作用与PAMAM/DNA复合物相似，无显著性差异。
四、EGF/PAMAM/DNA复合物的跨膜转运机制研究
按实施例1制备EGF/PAMAM/DNA复合物，FITC标记PAMAM载体，研究其跨膜转运机制，具体方法如下：
将适量PAMAM溶于PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/L KH2PO4，pH＝7.4)中，缓慢滴加FITC的丙酮溶液[n(PAMAM)∶n(FITC)＝1∶1.2]，于室温下暗处搅拌24h。于透析袋中透析3d，除去部分游离的FITC，最后过葡聚糖凝胶G-25色谱柱，薄层板监控，完全除去游离的FITC，冻干得到纯品，即得到FITC标记PAMAM载体。
用上述得到的FITC标记PAMAM载体，按实施例1所述的方法制备EGF/PAMAM/DNA复合物。制备得到的EGF/PAMAM/DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比为20∶1，EGF与DNA的质量比为2∶1。
制备HepG2细胞爬片，具体方法如下：
将灭菌后的盖玻片置于6孔板中，接种对数期HepG2细胞，每孔106个细胞37℃，5％CO2培养24h。
将EGF/PAMAM/DNA复合物加入到HepG2细胞中37℃孵育1h，封片，激光共聚焦显微镜观察，激发波长为488nm。对照组为未修饰EGF的PAMAM/DNA复合物，正负电荷比比为20∶1。
结果如图7所示，结果显示，EGF/PAMAM/DNA复合物的细胞摄取明显多于未修饰的PAMAM/DNA复合物。
五、EGF/PAMAM/DNA复合物转染体系的安全性考察
按实施例1制备EGF/PAMAM/DNA复合物，PAMAM与DNA的正负电荷比为20∶1，EGF与DNA的质量比为2∶1和20∶1。采用MTT法检测复合物中EGF对细胞增殖的影响，具体方法如下：
将MCF-7(EGFR+)细胞(购自中国医学科学院血液学研究所)按每孔5×104个细胞接种96孔板，24h后进行转染，将细胞随机分为阴性对照组、PAMAM/DNA组、EGF/PAMAM/DNA转染组(EGF/DNA质量比分别为2∶1和20∶1，pEGFP-N1质粒DNA浓度为0.5μg/mL)以及EGF/DNA组(EGF及DNA加入量与对应的EGF/PAMAM/DNA组相当)，每组设6个复孔，重复3次，分别处理4h及72h进行对照。光镜下观察细胞的形态变化、生长特点，移行方式以及培养基的改变，用MTT法测定OD490值绘制生长曲线并计算各组细胞的相对存活率。
MCF-7细胞的相对存活率(％)＝(实验组OD490值/对照组OD490值)×100％。
结果如图8所示，EGF/PAMAM/DNA转染体系中的EGF不会对细胞增殖产生额外的促进作用；而所选工作浓度的游离EGF对细胞增殖的促进作用也仅限于短期(4h)，长期并无显著促进作用(72h)。
六、EGF/PAMAM/DNA复合物转染p53基因的有效性考察
按实施例1所述的方法制备EGF/PAMAM/DNA复合物，不同的是将pEGFP-N1质粒DNA替换为pCMV-flag-P53质粒DNA(pCMV-flag-P53质粒购自碧云天生物技术研究所)。制备的EGF/PAMAM/DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比为20∶1，EGF与DNA的质量比为2∶1和20∶1。采用MTT法检测复合物转染p53基因对MCF-7细胞的增殖抑制作用，具体方法如下：
将MCF-7细胞按每孔5×104个细胞接种96孔板，24h后按最佳质量比转染，将细胞分为正常对照组，PAMAM/pCMV-flag-P53质粒组、EGF/PAMAM/普通DNA组和EGF/PAMAM/pCMV-flag-P53质粒组，其中pCMV-flag-p53能够表达p53蛋白，而普通DNA所用质粒为pCMV空载体(购自碧云天生物技术研究所)，不表达对细胞周期产生影响的蛋白。每组设6个复孔，重复3次，转染72h后进行对照。用MTT法测定OD490值绘制生长曲线并计算各组细胞的相对存活率。
MCF-7细胞的相对存活率(％)＝(实验组OD490值/对照组OD490值)×100％。
结果如图9所示，EGF/PAMAM/普通DNA组的细胞存活率最高，而EGF/PAMAM/pCMV-flag-p53质粒组与不加入EGF 的实验组(即PAMAM/pCMV-flag-P53质粒组)相比表现出更加显著的抑制作用。
Claims (7)
1.一种用于转基因的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、表皮细胞生长因子和核酸复合制成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的数均分子量为6909-28826。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的正电荷与所述核酸的负电荷的比值为1∶1-20∶1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的组合物，其特征在于：所述表皮细胞生长因子与所述核酸的质量比为2∶1-20∶1。
5.根据权利要求1-4中任一所述的组合物，其特征在于：所述组合物是按照权利要求6所述的方法制备得到的。
6.一种制备权利要求1-5中任一所述用于转基因的组合物的方法，包括如下步骤：
将末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物的水溶液与核酸混合后，孵育形成聚酰胺-胺树枝状聚合物与核酸的复合物；再向所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与核酸的复合物中加入表皮细胞生长因子，孵育形成聚酰胺-胺树枝状聚合物、表皮细胞生长因子和核酸的复合物，即得到所述用于转基因的组合物。
7.权利要求1-5中任一所述用于转基因的组合物在转基因中的应用或在制备基因治疗药物中的应用。
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| CN102517332B (zh) | 2014-04-16 |
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