CN104926924B

CN104926924B - 一种利用手性锍盐侧链稳定多肽α-螺旋二级结构的方法

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Publication number: CN104926924B
Application number: CN201410099191.1A
Authority: CN
Inventors: 李子刚; 田原
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: CN104926924A

Abstract

本发明公开了一种利用手性锍盐侧链稳定多肽α‑螺旋二级结构的方法，尤其公开了一种含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物及其合成方法，该合成方法涉包括如下步骤：（1）含有非天然氨基酸的多肽固相合成；（2）通过巯基‑烯等反应获得硫醚侧链修饰的多肽化合物；（3）在固相或者液相条件下利用烷基化或苄基化试剂将硫醚烷基化生成锍盐；（4）将步骤（3）的产物经过分离纯化获得含R构型锍盐侧链修饰的多肽化合物并通过圆二色谱等表征方法证明了利用手性锍盐侧链对多肽α‑螺旋二级结构具有很好的稳定效果。本发明简单高效，对于多肽类药物修饰稳定有重要意义。

Description

一种利用手性锍盐侧链稳定多肽α-螺旋二级结构的方法

技术领域

本发明属于化学生物学稳定多肽技术领域，涉及一种通过构建含手性锍盐侧链稳定多肽α-螺旋二级结构的方法，尤其涉及一种含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物及其合成方法。

背景技术

多肽类药物由于其特殊的生理活性、特异性以及低毒性等特点在生物医药行业引起了广泛兴趣。但同时多肽类药物存在稳定性差，易降解，难以穿透细胞膜等缺点。

研究表明α-螺旋大约占蛋白质结构的近30％，很多跨膜蛋白跨膜区便采用α-螺旋构象。而传统的肽类药物由于氨基酸残基数目有限，无法有效形成复杂结构，在生理溶液中有很高自由度并呈无规则线性状态，不仅降低了其特异性同时容易被蛋白酶所降解。

自上世纪八九十年代以来，化学家期望通过各种化学修饰手段，来模拟蛋白多种相互作用以稳定多肽α螺旋。相关技术包括利用酰胺键侧链，二硫键侧链，三唑键等共价方式，或者通过静电相互作用如盐桥等方式稳定。侧链稳定简单讲就是通过侧链偶联氨基酸的位置，一般为i/i+3，i/i+4，i/i+7，i/i+11等共价连接形成位于α螺旋同一面上。其中应用较多的是i/i+4与i/i+7。

上述稳定方法在实际的生物学应用上均有不同的缺点，其中最大的问题便是侧链共价键的稳定性问题，如酰胺键在体内容易被蛋白酶水解，二硫键容易被还原而打开，均不利于多肽的生物学应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用手性锍盐侧链稳定多肽的α-螺旋二级结构的方法，尤其是提供一种含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物及其合成方法。本发明的手性硫盐侧链可以有效稳定多肽二级结构，提高多肽稳定性，同时该合成方法简便高效，具有侧链简单、序列耐受性好、能有效提高多肽溶解性等优点。

为了实现上述目的及其他目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明首先提供了一种含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物。

一种含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物，其结构通式如式(I)所示，该含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物，具有稳定的α-螺旋二级结构：

其中：R₁，R₅各自独立地为氢或甲基，R₂，R₃，R₄各自独立地为任意氨基酸残基，n为0～6的正整数，R₆为任意烷基、苄基及其衍生物，X^-代表任意抗衡阴离子，所述含手性锍盐侧链修饰的多肽化合物中手性锍盐的构型为R型。当n优选为3时，对螺旋结构有更显著的提升。

较佳的，R₆选自烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、苄基、杂环芳基、芳基衍生物、苄基衍生物、烷基衍生物中的任一种。

较佳的，X^-选自F^-、Cl^-、Br^-、I^-、TfO^-、BF₄ ^-、TsO^-、PF₆ ^-、AsF₆ ^-、SbF₆ ^-、ClO₄ ^-、TFA^-、SO₄ ^2-和HSO₄-中的任一种抗衡阴离子。

较佳的，所述多肽的长度大于或等于5个氨基酸。

本发明还提供了上述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法。

一种含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法，包括如下步骤：

将i/i+4硫醚侧链修饰的多肽化合物烷烃化、芳基化或者苄基化，获得R型或者S型手性锍盐侧链修饰的多肽化合物，其中的R型手性锍盐侧链修饰的多肽化合物即为所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物。

进一步的，所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法，具体包括如下步骤：

将i/i+4硫醚侧链修饰的多肽化合物在酸性条件下，加入烷基化试剂或苄基化试剂，并室温下搅拌48h，所得的反应液冻干后用高效液相色谱分离纯化，获得所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物；其中的酸性条件如在三氟乙酸或者0.2M甲酸水溶液中。

上述的i/i+4硫醚侧链修饰的多肽化合物，其结构通式如式(II)所示：

其中：R₁，R₅各自独立地为氢或甲基，R₂，R₃，R₄各自独立地为任意氨基酸残基，n为0～6的正整数。

优选的，所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成路线如路线1或路线2所示。

路线1：

路线2：

其中，R₆选自烷基、苄基及其衍生物，X^-代表任意抗衡阴离子。

所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法，还具体包括如下步骤：

(1)含有非天然氨基酸的多肽固相合成；

(2)通过巯基-烯等反应获得i/i+4硫醚侧链修饰的多肽化合物(II)；

(3)在固相或者液相条件下利用烷基化试剂或苄基化试剂将硫醚烷基化生成锍盐；

(4)将步骤(3)的锍盐产物经分离纯化获得含R构型锍盐侧链修饰的多肽化合物(I)，并通过圆二色谱等表征方法证明了利用手性锍盐侧链修饰对多肽α-螺旋二级结构具有很好的稳定效果，该合成方法简单高效，对于多肽类药物修饰稳定有重要意义。

本发明的含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法可用作稳定多肽α-螺旋二级结构的方法。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

本发明的含有手性硫盐侧链修饰的多肽化合物，本发明的手性硫盐侧链可以有效稳定多肽二级结构，提高了多肽的α-螺旋含量，提高多肽稳定性，同时该合成方法简便高效，而且锍盐的形成可有效改善多肽的溶解性，这种利用手性锍盐侧链稳定多肽二级结构的方法，其具有侧链简单、序列耐受性好、能有效提高多肽溶解性等优点，对于多肽类药物修饰稳定有重要意义。

附图说明

图1为n＝3时Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂与碘甲烷反应生成锍盐的HPLC图。

图2为Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium甲基锍盐异构体A与异构体B在PBS溶液里的CD图

图3为Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium甲基锍盐异构体B在PBS和50％TFE溶液里的CD图。

图4为Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium甲基锍盐异构体B在不同温度下在PBS溶液里的CD图。

图5为Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium对叔丁基苄基锍盐异构体B在PBS和50％TFE溶液里的圆二色谱图。

图6为Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium 3,5-三氟甲基-苄基锍盐异构体B在PBS和50％TFE溶液里的圆二色谱图。

图7为Ac-cyclo(1,5)-monoS₅ARAC-NH₂sulfonium甲基锍盐异构体B在PBS溶液里的CD图。

上述的图2-7的横坐标代表波长(nm)，纵坐标代表椭圆率(mdeg。

图8为多肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium甲基锍盐异构体B的LC色谱图。

图9为多肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium甲基锍盐异构体B的质谱图。

图10为多肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium对叔丁基苄基锍盐异构体B的LC色谱图。

图11为多肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium对叔丁基苄基锍盐异构体B的质谱图。

图12为多肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium 3,5-三氟甲基-苄基锍盐异构体B的LC色谱图。

图13为多肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium 3,5-三氟甲基-苄基锍盐异构体B的质谱图。

图14为多肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅ARAC-NH₂sulfonium甲基锍盐异构体B的LC色谱图。

图15为多肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅ARAC-NH₂sulfonium甲基锍盐异构体B的质谱图。

图16为实施例1中的具体路线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

研究表明，一般氨基酸个数少于20的短肽在生物体内极易被蛋白酶水解，通常半衰期只有几分钟，这与它们无法有效形成复杂结构，在生理溶液中有很高自由度并呈无规则线性状态关系密切，这种存在形式不仅降低了其对于靶点的亲和力和特异性，更重要的是降低了其稳定性。

因此无论是多肽化学还是药剂学领域的研究热点便是通过各种不同的方法提高多肽的稳定性，而利用化学共价修饰的手段从分子水平上稳定多肽的二级结构引起了学术界乃至工业界的广泛关注，这其中又以稳定α-螺旋最为重要。

研究表明α-螺旋大约占蛋白质结构的近30％，很多跨膜蛋白跨膜区便采用α-螺旋构象，与此同时，在细胞内，很多重要的调控生理过程的蛋白-蛋白相互作用的界面便是一段α-螺旋，然而蛋白质可以通过疏水相互作用、氢键、二硫键、盐桥等相互作用形成复杂的三级、四级结构参与调控，而短肽本身由于缺少这种复杂作用因而无法形成复杂结构。

因此，通过化学手段来稳定短肽二级结构，使其采取α-螺旋构象，进而模拟乃至发挥蛋白质的功能十分重要，这将丰富相关研究人员的工具库，同时这类稳定构象的多肽可以进一步发展为潜在的多肽药物先导化合物，这将进一步推进多肽类药物的研发。

本发明以五肽为模型，构建了含有手性锍盐侧链的多肽化合物，该策略显著提高了五肽的α-螺旋含量，同时探索了该策略对于不同序列的多肽均有很广的适用性。

本发明将含有硫醚侧链的多肽烷基化或者苄基化，使之形成手性锍盐。再通过高效液相色谱进行分离纯化得到单个异构体，通过圆二色谱等表征方法证明了手性锍盐侧链对于五肽α-螺旋含量的提高，同时显著改善多肽的溶解性。

所述含手性锍盐侧链的多肽化合物有如下结构通式(I)所示：

通式中：R₁，R₅各自独立地为氢或甲基，R₂，R₃，R₄各自独立地为任意氨基酸残基，n为0～6的正整数，R₆为任意烷基、苄基及其衍生物，X^-代表任意抗衡阴离子，所述含手性锍盐侧链修饰的多肽化合物中手性锍盐的构型为R型。而R₆表示选自烷基，环烷基，杂环烷基，芳基，苄基，杂环芳基，芳基衍生物，苄基衍生物，烷基衍生物中的任何一种；X^-表示选自F^-，Cl^-，Br^-，I^-，TfO^-，BF₄ ^-，TsO^-，PF₆ ^-，AsF₆ ^-，SbF₆ ^-，ClO₄ ^-，TFA^-,SO₄ ^2-,HSO₄-中的任何一种。

制备上述侧链稳定的多肽化合物的核心反应步骤如下：

上述化合物2(即为式(I)所示化合物)，是由化合物1(即为式(II)所示化合物)与烷烃化试剂或苄基化试剂及其衍生物进行反应而得。反应条件设定为：取化合物10.5mmol，溶解于三氟乙酸或者0.2M甲酸水溶液2mL，加入10eq烷烃化试剂，室温下搅拌48h。

将化合物2反应液冻干后溶于5ml水中，高效液相色谱纯化得化合物2，即含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物。其中化合物2含有两个异构体，其中保留时间稍短的异构体称为化合物2A，保留时间稍长的异构体称为化合物2B(具有螺旋结构的多肽，其侧链手性锍盐构型为R构型，该异构体有更长的保留时间)。

将得到的化合物溶于10mM pH＝7.4的PBS磷酸盐缓冲液中，用圆二色谱测定其构象。化合物2B在PBS磷酸盐缓冲液中呈现稳定的α-螺旋。

综上所述，本发明提供了一种通过利用手性锍盐侧链稳定多肽α-螺旋的方法，该方法新颖合成方法高效简洁，同时锍盐的形成可有效改善多肽的溶解性，这种利用锍盐侧链稳定多肽二级结构的方法侧链简单、序列耐受性好、有效提高多肽溶解性等优点，是目前本领域其他手段或者策略无法达到的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

n＝3时手性甲基锍盐侧链五肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂(CH₃)的合成，即结构式(III)的合成：

具体路线如图16

具体操作步骤为：

1.多肽固相合成：称取1.0g Rink amide MBHA树脂于50ml接肽管中，加入10ml N-甲基吡咯烷酮(NMP)，鼓氮气溶胀树脂30min，加入50％(v/v)吗啡啉的NMP溶液(v代表体积)，鼓氮气30min，NMP×5，DCM×5洗涤树脂(其中DCM为二氯甲烷)。将配制好的Fmoc-Cys-OH(0.4M在NMP中)溶液、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(0.38M inNMP)、DIEA(N，N-二异丙基乙胺)按7.5ml/7.5ml/1ml混匀加入树脂中鼓氮气1h；抽掉反应液，按上述洗涤方法洗涤树脂后进行下一步操作。

2.第二个，第三个，第四个丙氨酸与第一个半胱氨酸连接方法相同，即：将配制好的Fmoc-Ala-OH(0.4M in NMP)溶液、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(0.38M在NMP中)、DIEA按7.5ml/7.5ml/1ml混匀加入树脂中鼓氮气1h；抽掉反应液，按上述洗涤方法洗涤树脂后进行下一步操作。

3.非天然氨基酸monoS₅：50％(v/v)吗啡啉NMP溶液脱保护，将Fmoc-monoS₅-OH(0.4M在NMP中)溶液、HCUT(0.38M在NMP中)、DIEA按5.0ml/5.0ml/0.71ml混匀加入树脂中鼓氮气2-3h，抽掉反应液进行下一步反应。

4.N-端乙酰化：50％(v/v)吗啡啉NMP溶液脱保护，洗涤，抽掉NMP，加入10ml的Ac₂O、DIEA和NMP(三者体积比1：3：16)的混合液，鼓氮气1h，必要时可进行两次乙酰化，获得N-端乙酰化的五肽树脂。

5.侧链构建：首先构建含硫醚侧链的五肽，具体地，将上述N-端乙酰化的五肽树脂溶胀于10mL二氯甲烷DCM中20min，抽去DCM，加入配置好的3％(v/v)三氟乙酸TFA的DCM溶液，5％(v/v)三异丙基硅烷TIPS的DCM溶液(v/v代表体积百分比)，脱去半胱氨酸三苯甲基Trt保护基，10min×4。洗涤后将树脂抽干，溶胀于50mL除水DMF中，加入一当量光引发剂安息香二甲醚DMPA以及一当量光敏剂对甲氧基苯乙酮MAP，置换氮气后置于365nm光反应器中光照2h。

6.抽掉反应液，将树脂依次用氮甲基吡咯烷酮(NMP)(10ml)，二氯甲烷(DCM)(10ml)，甲醇(MeOH)(10ml)交替洗涤，抽干保存或用于下一步反应。

7.将多肽从树脂上剪切下：取100mg树脂于2ml EP管中，加入0.5ml的TFA、TIPS和H₂O(体积比9.5：0.25：0.25)震荡反应1h，树脂过滤除去，用氮气把剪切液吹干，然后加入冷的1ml的乙醚和正己烷(二者体积比4：1)的混合液；离心去上清，沉淀于空气中挥干残余溶剂。

8.多肽纯化：将上述沉淀加入10％(v/v)(体积百分比)的乙腈水溶液后用高效液相色谱进行纯化，250*10mm C18反相色谱，A液：0.1％体积百分比的TFA的H₂O溶液，B液：0.1％体积百分比的TFA的乙腈溶液；溶剂梯度：0-31min内2-30％体积百分比的B液的梯度洗脱。

9.锍盐制备：将已纯化环肽Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂ 1mg溶于1ml三氟乙酸(TFA)中，加入10eq碘甲烷，室温下搅拌48h，然后用氮气吹干三氟乙酸后，加入1mL水溶解反应物后用高效液相色谱HPLC纯化，得到含有手性锍盐侧链的环肽非对应异构体：Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium CH₃A和Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium CH₃B。

10.圆二色谱表征：将Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂CH₃两种异构体CH₃A和CH₃B溶于10mM PBS溶液中测定CD图谱：取0.1-0.5mg样品分别溶于0.5ml 10mmol PBS中测CD波长为190nm-250nm处的色谱图，然后根据以下公式计算螺旋含量；

alpha螺旋计算公式：

f_H＝([θ]_obs215-[θ]_C)/([θ]_∞215-[θ]_C)

[θ]_∞215＝(-44000+250T)(1-к/N_p)

[θ]_C＝2220-53T＝1054

T＝22℃,к＝4.0,N_p＝6(对于五肽),C为样品摩尔浓度M，f_H为平均螺旋含量，[θ]_obs215为215nm下实际摩尔椭圆率，[θ]_∞215为215nm下极大摩尔椭圆率，[θ]_C为无规卷曲摩尔椭圆率，θ为椭圆率。

其结果是，圆二色谱结果表明锍盐B异构体在50％TFE下并未显著提高，说明这一侧链稳定方法已经将该五肽α螺旋提高到了最佳值，即化合物2B呈现稳定的α-螺旋，如图1、图2、图3、图4所示。

图1的具体结果如表1所示

表1 Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂Sulfonium A和B的HPLC分析结果

峰名称	保留时间(min)	峰开始时间(min)	峰结束时间(min)
				A	15.1	14.5	15.8
B	21.4	21.0	22.1

含手性锍盐侧链的五肽在HPLC上可分离到两个不同保留时间的异构体A和B，其中分别对这两种异构体进行圆二色谱表征二级结构发现异构体A在10mM的磷酸盐缓冲液PBS中呈现无规卷曲构象，而异构体B在相同条件下呈现特征的α螺旋吸收(请参见表2和图2)，同时异构体B在50％(v/v)TFE下其螺旋并未显著提高(请参见图3)。

表2多肽III在pH＝7.4，22℃，10mM PBS中圆二色谱数据

多肽	[θ]<sub>215</sub>	[θ]<sub>207</sub>	[θ]<sub>190</sub>	[θ]<sub>215</sub>/[θ]<sub>207</sub>
					III A	-8.79797	-15.1152	-7.42947	-
III B	-19.27045	-25.21615	29.69965	0.76

多肽α螺旋二级结构用圆二色谱表征，其特征为190nm处正峰，同时[θ]₂₁₅、[θ]₂₀₇为负峰且[θ]₂₁₅/[θ]₂₀₇比例越接近1其螺旋含量越高，而上述结果说明含有手性锍盐侧链的五肽的构象与手性锍盐的手性密切相关，其中R构型可以显著稳定多肽的α螺旋二级结构。

图4为在不同温度下含手性锍盐侧链的稳定多肽的构象变化情况，说明在一定温度范围内，含有手性锍盐侧链稳定的多肽均保持螺旋的构象。

图8、图9为该多肽化合物LC-MS结果，可找到对应分子量m/z 515。

实施例2

苄基化手性锍盐侧链稳定多肽α-螺旋分别为Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfoniumtBu-B以及Ac-cyclo(1,5)-monoS₅AAAC-NH₂sulfonium CF₃-B的合成，即结构式(IV)和(V)的合成：

将甲基锍盐替换为苄基锍盐，实验步骤与实施例1的甲基锍盐相同，终产物经过高效液相色谱纯化亦可以得到保留时间不同的两个异构体，且保留时间稍长的异构体(化合物2B)在PBS磷酸盐缓冲溶液中有稳定的α-螺旋二级结构。

含手性锍盐侧链的五肽在HPLC上可分离到两个不同保留时间的异构体A和B，其中分别对这两种异构体进行圆二色谱表征二级结构发现异构体A在10mM的磷酸盐缓冲液PBS中呈现无规卷曲构象，而异构体B在相同条件下呈现特征的α螺旋吸收，同时异构体B在50％(v/v)TFE下其螺旋并未显著提高(结构式(IV)的圆二色谱图请参见图5、结构式(V)的圆二色谱图请参见图6)。

表3多肽在IV、V在pH＝7.4，22℃，10mM PBS中圆二色谱数据

多肽	[θ]<sub>215</sub>	[θ]<sub>207</sub>	[θ]<sub>190</sub>	[θ]<sub>215</sub>/[θ]<sub>207</sub>
					IV B	-6.35611	-7.3373	11.85826	0.87
V B	-5.03363	-6.44584	9.95072	0.78

图10、图11为多肽化合物IV的LC-MS结果，可找到对应分子量m/z 647。

图12、图13为多肽化合物V的LC-MS结果，可找到对应分子量m/z 727。

实施例3

手性甲基锍盐侧链稳定多肽α-螺旋Ac-cyclo(1,5)-monoS₅ARAC-NH₂sulfoniumCH3的合成，即结构式(VI)的合成：

实验步骤与实施例1的甲基锍盐相同，终产物经过高效液相色谱纯化亦可以得到保留时间不同的两个异构体，且保留时间稍长的异构体(化合物2B)在PBS磷酸盐缓冲溶液中有稳定的α-螺旋二级结构。

含手性锍盐侧链的五肽在HPLC上可分离到两个不同保留时间的异构体A和B，其中对异构体B进行圆二色谱表征二级结构发现异构体B在10mM的磷酸盐缓冲液PBS中呈现特征的α螺旋吸收。

表4多肽在VI在pH＝7.4，22℃，10mM PBS中圆二色谱数据

多肽	[θ]<sub>215</sub>	[θ]<sub>207</sub>	[θ]<sub>190</sub>	[θ]<sub>215</sub>/[θ]<sub>207</sub>
					VI B	-16.3375	-23.1209	21.3906	0.71

图14、图15为多肽化合物VI的LC-MS结果，可找到对应分子量m/z 584。

实施例4

将甲基锍盐替换为环烷基锍盐，该环烷基具体为碘代环己烷基团，R1和R5为甲基，X^-为I^-，n＝3，R₂为丙氨酸残基、R₃为苯丙氨酸残基，R₄为丙氨酸残基，其实验步骤与实施例1的甲基锍盐相同，终产物经过高效液相色谱纯化亦可以得到保留时间不同的两个异构体，且保留时间稍长的异构体(化合物2B)在PBS磷酸盐缓冲溶液中有稳定的α-螺旋二级结构。

实施例5

将甲基锍盐替换为杂环烷基锍盐，该杂环烷基具体为2-(碘甲基)-氧杂环己烷基团，R1为氢，R5为甲基，X^-为TFA^-，n＝1，R₂为丝氨酸残基、R₃为赖氨基残基，R₄为苯丙氨酸残基，实验步骤与实施例1的甲基锍盐相同，终产物经过高效液相色谱纯化亦可以得到保留时间不同的两个异构体，且保留时间稍长的异构体(化合物2B)在PBS磷酸盐缓冲溶液中有稳定的α-螺旋二级结构。

实施例6

将甲基锍盐替换为杂环芳基锍盐，该杂环芳基具体为2-溴甲基吡啶基团，R1为甲基，R5为氢，X^-为Br^-，n＝6，R₂为缬氨酸残基、R₃为组氨酸残基，R₄为色氨酸残基，实验步骤与实施例1的甲基锍盐相同，终产物经过高效液相色谱纯化亦可以得到保留时间不同的两个异构体，且保留时间稍长的异构体(化合物2B)在PBS磷酸盐缓冲溶液中有稳定的α-螺旋二级结构。

实施例7

将甲基锍盐替换为烷基衍生物锍盐，该烷基衍生物具体为基团三氟甲磺酸2-溴-乙酯，X^-为TfO^-，n＝2，R₂为精氨酸残基、R₃为谷氨酸残基，R₄为亮氨酸残基，实验步骤与实施例1的甲基锍盐相同，终产物经过高效液相色谱纯化亦可以得到保留时间不同的两个异构体，且保留时间稍长的异构体(化合物2B)在PBS磷酸盐缓冲溶液中有稳定的α-螺旋二级结构。

实施例8

除了n＝0不同外，实验步骤与实施例1的甲基锍盐相同，终产物经过高效液相色谱纯化亦可以得到保留时间不同的两个异构体，且保留时间稍长的异构体(化合物2B)在PBS磷酸盐缓冲溶液中有稳定的α-螺旋二级结构。

实施例9

除了n＝5外，实验步骤与实施例1的甲基锍盐相同，终产物经过高效液相色谱纯化亦可以得到保留时间不同的两个异构体，且保留时间稍长的异构体(化合物2B)在PBS磷酸盐缓冲溶液中有稳定的α-螺旋二级结构。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物，其结构通式如式(I)所示，该含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物，具有稳定的α-螺旋二级结构：

其中：R₁，R₅各自独立地为氢或甲基，R₂为丙氨酸或精氨酸的R基团，R₃为丙氨酸或精氨酸的R基团，R₄为丙氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸的R基团，n为0～6的正整数，R₆选自甲基基团、4-叔丁基苄基基团或3,5-双(三氟甲基)苄基基团中的一种，X^-选自Br^-、I^-、TfO^-、TFA^-中的一种，所述含手性锍盐侧链修饰的多肽化合物中手性锍盐的构型为R型。

2.如权利要求1所述的含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法，包括如下步骤：

将i/i+4硫醚侧链修饰的多肽化合物烷烃化或者苄基化，获得R型或者S型手性锍盐侧链修饰的多肽化合物，其中的R型手性锍盐侧链修饰的多肽化合物即为所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物。

3.如权利要求2所述的含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

将i/i+4硫醚侧链修饰的多肽化合物在酸性条件下，加入烷基化试剂或苄基化试剂，并室温下搅拌48h，所得的反应液冻干后用高效液相色谱分离纯化，获得所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物；

其中所述i/i+4硫醚侧链修饰的多肽化合物，其结构通式如式(II)所示：

其中：R₁，R₅各自独立地为氢或甲基，R₂为丙氨酸或精氨酸的R基团，R₃为丙氨酸或精氨酸的R基团，R₄为丙氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸的R基团，n为0～6的正整数。

4.如权利要求3所述的含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法，其特征在于，所述的酸性条件为在三氟乙酸中或者在浓度为0.2M的甲酸水溶液中。

5.如权利要求2-4任一所述的含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法，其特征在于，所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成路线如路线1或路线2所示：

路线1：

路线2：

其中，R₆选自甲基基团、4-叔丁基苄基基团或3,5-双(三氟甲基)苄基基团中的一种，X^-选自Br^-、I^-、TfO^-、TFA^-中的一种。

6.如权利要求2-4任一所述的含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法，其特征在于，还具体包括如下步骤：

(1)含有非天然氨基酸的多肽固相合成；

(2)通过巯基-烯反应获得i/i+4硫醚侧链修饰的多肽化合物(II)；

(4)将步骤(3)获得的锍盐产物经分离纯化获得含R构型锍盐侧链修饰的多肽化合物，即为通式(I)的所述含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物，并通过圆二色谱表征方法证明了利用手性锍盐侧链修饰对多肽α-螺旋二级结构的稳定性。

7.如权利要求2-4任一所述的含有手性锍盐侧链修饰的多肽化合物的合成方法用作稳定多肽α-螺旋二级结构的方法。