CN112047996A - 一种通过炔丙基型锍盐选择性修饰半胱氨酸的方法 - Google Patents

一种通过炔丙基型锍盐选择性修饰半胱氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种选择性修饰半胱氨酸的方法，采用炔丙基型锍盐，锍盐中心活化的炔丙基与硫醇进行加成反应，硫醇进攻炔丙基型锍盐中的联烯中间体β碳，选择性的修饰蛋白质半胱氨酸或无保护基多肽的半胱氨酸。本发明还提供了炔丙基型锍盐在制备探测生物体内半胱氨酸或硫醇的探针中的用途。将本发明的反应应用于临近甲硫氨酸和半胱氨酸的无保护基多肽中，可以方便地进行分子内加成反应，从而构建出稳定性更好、有利于细胞吸收的环状多肽。

Description

一种通过炔丙基型锍盐选择性修饰半胱氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及蛋白质翻译后修饰及稳定多肽的方法，具体来说是一种通过炔丙基型锍盐选择性修饰半胱氨酸的方法及一种新型稳定多肽的化学合成方法。
背景技术
蛋白质的翻译后修饰(PTM)对于蛋白质功能的多样化起着关键作用，这也引起了人们对设计各种合成方法来修饰蛋白质的兴趣。报道了各种蛋白质氨基酸的位点选择性和化学选择性修饰，包括半胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸等。由于巯基的高亲核性，半胱氨酸被广泛用于选择性修饰的各种应用，包括基于活性的蛋白质分析(ABPP)，细胞成像，共价抑制剂等。许多疾病的发生发展都与蛋白-蛋白相互作用的稳态失衡有关。因此靶向蛋白-蛋白相互作用被认为是一种非常有前景的治疗性策略。
多肽相对于小分子药物来说，具有更小的脱靶效应，同时保留了生物大分子药物对于靶点较高的亲和力和选择性，可以固相合成，容易修饰，可以有效拓展靶向分子的化学空间。但是由于多肽容易在体内降解，穿膜能力差，口服生物利用度低，极大地限制了其生物学应用。
炔-巯基耦合是一个新兴的“点击”反应,广泛应用于多肽和蛋白质修饰，但大多数的这种反应通过自由基分子,利用紫外线或光引发。或者通过末端炔丙基酰胺、环辛炔等形式与半胱氨酸进行共价结合，这些方法合成步骤较为繁琐或者应用场景有限。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种通过炔丙基型锍盐选择性修饰半胱氨酸的方法，所述的这种通过炔丙基型锍盐选择性修饰半胱氨酸的方法要解决现有技术中多肽和蛋白质修饰步骤较为繁琐的技术问题。
本发明提供了一种选择性修饰半胱氨酸的方法，采用炔丙基型锍盐，锍盐中心活化的炔丙基与硫醇进行加成反应，硫醇进攻炔丙基型锍盐中的联烯中间体β碳，选择性的修饰蛋白质半胱氨酸或无保护基多肽的半胱氨酸；
所述炔丙基型锍盐的结构通式如下所示：
Figure BDA0002680879670000021
R1、R2分别代表烷基、烯基、苯基、苄基或者氨基酸残基基团的任意一种。
进一步的，所述的炔丙基型锍盐B与物质A在微碱性环境下进行点击反应，得到炔丙基型锍盐修饰的半胱氨酸类化合物C；物质A为半胱氨酸及巯基类似物、含有半胱氨酸残基的多肽或蛋白质，炔丙基型锍盐B与物质A的化学反应式为：
Figure BDA0002680879670000022
其中：C代表炔丙基型锍盐修饰的半胱氨酸类化合物；R1、R2、R3分别代表具有烷基、烯基、苯基、苄基或者氨基酸残基基团的一种。
进一步的，所述碱性环境为pH＝8.0的碳酸铵溶液或PBS缓冲溶液。
本发明还提供了一种炔丙基型锍盐修饰的半胱氨酸类化合物的制备方法，炔丙基型锍盐B与物质A在微碱性环境下进行点击反应，得到烯丙基化合物；物质A为半胱氨酸及巯基类似物、含有半胱氨酸残基的多肽或蛋白质，炔丙基型锍盐B与物质A的化学反应式为：
Figure BDA0002680879670000023
其中：C代表炔丙基型锍盐修饰的半胱氨酸类化合物；R1、R2、R3分别代表具有烷基、烯基、苯基、苄基或者氨基酸残基基团的一种。
本发明还提供了炔丙基型锍盐在制备探测生物体内半胱氨酸或硫醇的探针
中的用途,所述炔丙基型锍盐的结构通式如下所示：
Figure BDA0002680879670000031
R1、R2分别代表烷基、烯基、苯基、苄基或者氨基酸残基基团中的任意一种。
对半胱氨酸进行修饰的技术，本发明通过炔丙基型锍盐实现了对半胱氨酸选择性修饰的目的。锍盐可以连接在小分子或者多肽上。本发明的方法包括烷基化硫原子以内的其他原子的炔丙基盐，如硒原子等。
本发明通过高效液相色谱，高分辨质谱，核磁共振技术等，证实了炔丙基型锍盐选择性修饰半胱氨酸这一方法的可行性和普适性。
本发明公开了一种选择性修饰半胱氨酸的方法。本发明在室温条件下，锍盐中心活化的炔丙基与硫醇进行加成反应，硫醇进攻联烯中间体β碳的机理。通过炔丙基型锍盐试剂，高化学选择性的与蛋白质半胱氨酸或无保护基多肽的半胱氨酸进行反应。将该反应应用于临近甲硫氨酸和半胱氨酸的无保护基多肽中，可以方便地进行分子内加成反应，从而构建出稳定性更好、有利于细胞吸收的环状多肽。同时，炔丙基型锍盐可作为以生物体内的半胱氨酸或其他硫醇为目标的多功能探针。
采用本发明的方法，分子内反应后多肽在体外条件下具有相对的稳定性。
本发明通过连接5-羧基荧光素多肽的流式细胞分析和激光共聚焦实验，证实该环状多肽显著的提高了其线性多肽的穿膜能力。本发明通过连接5-羧基荧光素多肽的荧光各向异性实验，证实该环状多肽增强了多肽与蛋白质的结合能力。本发明通过连接5-羧基荧光素的多肽，在PBS环境下，与多种蛋白质的共价结合实验，证实该结构可以同蛋白质共价结合。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的修饰方法在药物递送、荧光探针、蛋白质翻译后修饰、蛋白-蛋白相互用作用配体筛选、材料学等领域具有广泛的应用。
附图说明
图1A用来考察多肽稳定性及穿膜能力实验的模板多肽的化学结构示意图。
图1B为线性多肽2f和环状多肽3f的血清稳定性实验。
图1C为环状多肽3f在2-巯基吡啶、谷胱甘肽还原剂的条件下的稳定性实验。
图1D为线性多肽M(FAM-β Ala-MRRRM-NH2)和环状3f在HeLa细胞当中的激光共聚焦图。
图1E为线性多肽M(FAM-β Ala-MRRRM-NH2)和环状3f在HeLa细胞当中的流式细胞术实验。
图1F为线性多肽M(FAM-β Ala-MRRRM-NH2)和环状3f在HeLa细胞当中的定量穿膜实验。
图2A为用来考察蛋白质与多肽结合能力的线性多肽2g及其环状多肽3g的结构示意图。
图2B为线性多肽2g和环状多肽3g与PDZΔRGS3蛋白的荧光各向异性实验。
图3A显示了5-羧基荧光素标记的炔丙基型锍盐4的化学结构。
图3B为炔丙基型锍盐化合物4与四种蛋白质(SarA、PDZΔRGS3、BFL-1、MgrA)的共价结合实验。
图4为炔丙基型锍盐化合物4与蛋白质共价结合的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步说明，但这些实施例并非意味着限制本发明的保护范围。在下面的实施例中所涉及的实验材料无特别说明均可通过市场购得或通过本领域常规的制备方法获得。
实施例1
多肽固相合成及分离纯化：称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入二氯甲烷(DCM)，鼓氮气溶胀10分钟。加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30分钟，脱去Fmoc保护基团。用DMF和DCM交替洗涤树脂之后，将配好的Fmoc-AA-OH(5eq,0.4M,DMF)溶液，6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(5eq，0.38M，DMF)溶液，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气1小时。抽掉反应液，按上述方法洗树脂后继续脱保护，接氨基酸至多肽组装完毕。将多肽从树脂上切下：取20mg树脂与EP管中，加入0.5ml的TFA/TIPS/H2O/EDT(v:v:v:v＝94:1:2.5:2.5)剪切液震荡反应1小时,树脂过滤除去，用氮气把剪切液吹干，然后加入0.5ml冷的乙醚沉淀两分钟；离心弃去上清，沉淀的多肽于空气中挥干。
实施例2
Figure BDA0002680879670000051
炔丙基型锍盐的合成：取10mL玻璃瓶，称取N-乙酰-L-甲硫氨酸(0.2mmol，38.25mg)置于瓶内，加入0.2mL的乙腈/水(1：1)溶液，加入2μL的甲酸酸化(pH等于3左右)，室温加入溴丙炔(1.0mmol，86.2μL)，并且在室温搅拌12小时。反应后直接旋干溶剂得到粗产物，用乙腈和水的混合溶液溶解粗产物，然后通过HPLC纯化，得到白色固体产物1a，1HNMR(400MHz,D2O)δ4.64-4.55(m,1H),4.40(t,2H),3.53-3.43(m,2H),3.25(td,1H),2.99(s,3H),2.54-2.41(m,1H),2.35-2.20(m,1H),2.08(s,3H).13C{1H}NMR(101MHz,D2O)δ174.5,173.5,80.8,51.2,37.2,25.6,25.5,22.1,22.0.HRMS(ESI-TOF):m/zcalc ulatedfor C10H16NO3S+[M]+,230.0845,found 230.0848。
我们实验涉及的硫醇结构及产物结构如表1和表2所示。我们通过多肽3f和3g完成了多肽穿膜能力及多肽与蛋白质结合实验的研究。
Figure BDA0002680879670000052
表1.反应条件筛选
Figure BDA0002680879670000061
实施例3
Figure BDA0002680879670000062
炔丙基型锍盐与巯基加成反应条件：如上表所述，模板炔丙基型锍盐在实验条件下采用不同巯基试剂的反应条件及产物结构。取10mL玻璃瓶，称取N-乙酰基-L-半胱氨酸(0.2mmol，32.64mg)加入0.5mL碳酸铵溶液(pH8.0)，加入化合物1a(0.2mmol，46.06mg)。在室温下反应1小时，直接旋干溶剂得到粗产物，加入乙腈和水的混合溶液溶解粗产物，通过HPLC纯化得到产物3c。1H NMR(400MHz,D2O)δ5.24(s,1H),4.98(s,1H),4.28-4.23(m,1H),4.18-4.14(m,1H),3.33-3.08(m,4H),2.95-2.84(m,1H),2.81-2.74(m,2H),2.71-2.62(m,1H),1.92-1.83(m,9H).13C{1H}NMR(101MHz,D2O)δ177.0,176.7,173.6,173.6,173.5,171.0,160.3,113.1,54.4,53.9,38.1,33.2,32.9,22.1,22.1.HRMS(ESI-TOF):m/zcalculated for C15H25N2O6S2 +[M]+,393.1149,found 393.1143。
Figure BDA0002680879670000063
表2.涉及的多肽序列及实验条件
Figure BDA0002680879670000071
实施例4
Figure BDA0002680879670000072
环状多肽的合成：如上表所述，不同链长的炔丙基型锍盐多肽的分子内反应条件及产物结构。取1.5mL离心管，将线性多肽2d溶在0.5mL乙腈/水(1：1)中，加入5μL的三乙胺。在室温摇床内振荡反应12小时，反应后直接通过冻干机将溶剂去除得到粗产物，用乙腈和水的混合溶液溶解粗产物，通过HPLC纯化得到产物3d。1H NMR(400MHz,D2O)δ5.84(s,1H),5.62(s,1H),4.72-4.56(m,2H),4.48-4.34(m,2H),3.53-3.44(m,2H),3.32-3.19(m,1H),3.05-2.95(m,3H),2.80-2.77(m,1H),2.51-2.40(m,1H),2.37-2.24(m,1H),2.12(s,3H).13C{1H}NMR(101MHz,DMSO-d6)δ158.8,158.3,132.8,118.8,116.3,51.7,47.9,38.6,33.6,27.0,23.2,22.3,15.2.HRMS(ESI-TOF):m/z calculated for C13H22N3O3S2 +[M]+,332.1097,found 332.1098。
实施例5
如图1A所述，参照实施例1，合成三种结构的模板多肽(2f、3f、M)，该环状多肽3f的体外稳定性考察：如图1B所述，将多肽2f和3f加入到100μL25％含有老鼠血清的PBS溶液中，在37℃下孵育，在0小时，1小时，2小时，4小时，8小时和24小时取10μL溶液。加入12％三氯乙酸溶液(水/乙腈＝1：3)放入4℃静置30分钟，再用14000rpm离心15分钟。通过HPLC峰面积得到多肽降解过程。
实验结果表明，多肽3f在老鼠血清条件下比多肽2f稳定，多肽3f在24小时仍有60％未降解，多肽2f在8小时已经完全降解。
实施例6
该环状多肽3f的体外还原性考察：如图1C所述，将多肽3f(1mmol/L)溶于PBS溶液，分别加入10倍当量的2-巯基吡啶和谷胱甘肽还原剂，在0小时，6小时，12小时，24小时和48小时的时间点，通过HPLC峰面积得到多肽被还原过程。实验结果表明，多肽3f在2-巯基吡啶和谷胱甘肽还原剂的条件下均能稳定存在，多肽3f在24小时后仍能稳定存在90％以上。
实施例7
该环状多肽3f的穿膜能力考察：如图1D、1E和1F所述，激光共聚焦、流式细胞术实验和定量穿膜实验所示，环状多肽3f(5μmol,4h)的在HeLa细胞里表现出不同程度的较线性多肽M提高的穿膜能力。实验结果表明，从定性数据荧光强度上比较环状多肽3f的荧光强度比线性肽M亮。从定量数据细胞流式及荧光强度上比较环状多肽3f也比线性肽M穿膜能力强。
实施例8
该环状多肽3g与蛋白质的结合能力的考察：如图2(A、B)所述，在通过锍盐环化后的多肽没有影响多肽与蛋白的结合能力，通过荧光各向异性实验得到的结果环状多肽3g(KD＝117.9±4.833)较线性多肽2g(KD＝124.6±9.727)结合能力强，说明此方法没有破坏多肽与蛋白质的结合能力。实验结果表明，环状多肽3g与蛋白质结合更好，说明该方法是对原有线性肽的优化方法，综合实施例5-8的结果，这种环化方法有很强的蛋白-蛋白相互作用调节的潜力。
实施例9
该炔丙基型锍盐化合物4与蛋白质共价结合能力考察：如图3(A、B)所述，通过5-羧基荧光素化合物4为蛋白质结合的底物。以SarA、PDZΔRGS3、BFL-1、MgrA四种蛋白质为模板蛋白质完成蛋白质与炔丙基型锍盐的共价结合实验。在20μL的PBS(pH8.0)溶液内，蛋白质浓度为10μmol/L，化合物4浓度为20μmol/L，反应体系在37℃下反应24小时，然后通过15％聚丙烯酰胺凝胶分析共价结合能力。
实验结果表明，从荧光观察该锍盐化合物4与多种蛋白质均有共价结合，这些蛋白质序列均有半胱氨酸，如图4所示，该方法是选择性与蛋白质上半胱氨酸共价结合的方法。我们通过引入荧光基团的方式在蛋白质表面点亮蛋白质，是一个新颖的点击化学方法学。

Claims (5)

1.一种选择性修饰半胱氨酸的方法，其特征在于：采用炔丙基型锍盐，锍盐中心活化的炔丙基与硫醇进行加成反应，硫醇进攻炔丙基型锍盐中的联烯中间体β碳，选择性的修饰蛋白质半胱氨酸或无保护基多肽的半胱氨酸；
所述炔丙基型锍盐的结构通式如下所示：
Figure FDA0002680879660000011
R1、R2分别代表烷基、烯基、苯基、苄基或者氨基酸残基基团中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的一种选择性修饰半胱氨酸的方法，其特征在于：所述的炔丙基型锍盐B与物质A在微碱性环境下进行点击反应，得到炔丙基型锍盐修饰的半胱氨酸类化合物；物质A为半胱氨酸及巯基类似物、含有半胱氨酸残基的多肽或蛋白质，炔丙基型锍盐B与物质A的化学反应式为：
Figure FDA0002680879660000012
其中：C代表炔丙基型锍盐修饰的半胱氨酸类化合物；R1、R2、R3分别代表具有烷基、烯基、苯基、苄基或者氨基酸残基基团中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种选择性修饰半胱氨酸的方法，其特征在于：所述碱性环境为pH＝8.0的碳酸铵溶液或PBS缓冲溶液。
4.一种炔丙基型锍盐修饰的半胱氨酸类化合物的制备方法，其特征在于：炔丙基型锍盐B与物质A在微碱性环境下进行点击反应，得到烯丙基化合物；物质A为半胱氨酸及巯基类似物、含有半胱氨酸残基的多肽或蛋白质，炔丙基型锍盐B与物质A的化学反应式为：
Figure FDA0002680879660000021
其中：C代表炔丙基型锍盐修饰的半胱氨酸类化合物；R1、R2、R3分别代表具有烷基、烯基、苯基、苄基或者氨基酸残基基团的一种。
5.炔丙基型锍盐在制备探测生物体内半胱氨酸或硫醇的探针中的用途，所述炔丙基型锍盐的结构通式如下所示：
Figure FDA0002680879660000022
R1、R2分别代表烷基、烯基、苯基、苄基或者氨基酸残基基团中的任意一种。
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