CN1891690A - 用于质谱法的电离修饰剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通式(I)的化合物,其中R、R’、R”、R”’、R””、X和n如说明书和权利要求书中所定义,本发明还涉及所述化合物作为电离修饰剂的用途。本发明进一步涉及对来自含有标记和未标记形式的所述多肽的来源的多肽或其片段进行定量的方法,其包括:(a)用电离修饰剂修饰分离的多肽,(b)通过质谱法分析制备的多肽或其片段,并且由此测定多肽或其片段的来源中存在的多肽或其片段的量。
Description
背景技术
在分析蛋白质生物化学中,质谱法已经发展成了一种多用途技术。选择的仪器类型为MALDI-TOF质谱仪,并且针对用胰蛋白酶或内蛋白酶(endoproteinase)-C形式的内肽酶裂解所产生的分子量为0.8-3kDa的肽类对分析窗进行优化。
然而,尽管裂解过程被设计用于产生可确保电离的基础残基(basicresidue)均质分布的肽这一事实,但是一些分子比其它分子更易于检测。这是由于可导致一些肽完全猝灭的电离竞争所致。一个突出的实例是阿尔茨海默病淀粉样肽(Alzheimer’s amyloid peptide)(Aβ)。已知用内肽酶Lys-C产生的Aβ的三个肽片段表现极为不同(Grüninger等2000,使用基于质谱法的检测系统鉴定β-分泌酶样活性(Identification of beta-secretase-likeactivity using a mass spectrometry-based assay system).NatureBiotechnology,18:66-70)。氨基末端片段和中间片段具有极佳的电离特性,但是使用优选的MALDI-TOF方法从未检测到羧基末端片段(Rüfenacht等2005,使用与质谱法组合的激光切割显微术对阿尔茨海默病斑块中的Aβ肽进行定量(Quantification of the Aβpeptide in Alzheimer’s plaques bylaser dissection microscopy combined with mass spectrometry).J.MassSpectrom.;40:193-201)。
但是羧基末端被认为是淀粉样肽的关键部分。Aβ以不同链长出现。大部分肽终止于残基40,而少量肽终止于残基42。较长的形式具有高得多的成纤维倾向并且因此被认为是产生问题的原因。
此外,具有意义的是区分通过修饰产生的不同Aβ种类,例如Aβ(11-16)和Aβ(pyroGlu11-16)片段(Huse等,2002,高尔基体外侧网络中的γ-分泌酶加工优先产生在阿尔茨海默病大脑中蓄积的截短的淀粉状蛋白种类(γ-Secretase processing in the trans-Golgi network preferentially generatestruncated amyloid species that accumulate in Alzheimer’s disease brain).J.Biol Chem.277:16278-16284)或除了天然形式的甲硫氨酸外还在35位上带有甲硫氨酸亚砜的Aβ。Hou等(甲硫氨酸-35氧化减少阿尔茨海默病的淀粉样Ab-(1-42)肽的原纤维装配(Methionine-35 oxidation reduces fibrilassembly of the amyloid Ab-(1-42)peptide of Alzheimer’disease).J.Biol.Chem.(2002)277:40172-40176)证实在生理pH下Met-35侧链氧化成甲硫氨酸亚砜(Met-35(ox))显著妨碍42-残基Aβ-(1-42)的原纤维形成速率。Met-35(ox)还改变特征性Aβ原纤维形态并且防止初原纤维形成,而它是β-淀粉样变和相关神经毒性的关键中间体。
因此,强烈需要一种用于检测这类以前用质谱法无法检测的分子的方法。
因此,本发明涉及修饰多肽并因此使得可用质谱法检测以前用该方法无法检测的多肽的新分子。
发明内容
本发明提供了以下通式的化合物:
n=0、1、2、3、4、5、6、7或8;
X=H、OH、F、Cl、Br、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R=无残基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R’=无残基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R”=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R””=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
或者R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””彼此键合与它们所连接的氮原子一起形成环,并且R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””一起为:
-CH2-(CH2)p-,
其中p为1、2或3;
或者X和R彼此键合与它们所分别连接的氮原子和碳原子一起形成环,并且X和R一起为:
-(CH2)k-,
其中k为1、2、3或4。
优选地,n=1,X=OH或H,R=H,R’=无残基,R”=H,R=H且R””=H。也优选其中n=4、X=H、R=H、R’=无残基、R”=H、R=H且R””=H的上述化合物。
X决定在分析物与电离修饰剂之间产生酰胺键的转化反应的反应性。当X为Cl或Br时,在复合峰型中鉴别出修饰的胺是可能的。电离修饰剂中含有的氯或溴以同位素混合物的形式存在并且产生不同的双带型。当用这类标记修饰分析物时,可通过峰型从其它峰中容易地鉴别出相应的加合物。
本发明进一步提供了上述化合物作为电离修饰剂的用途。
本文所用的术语“电离修饰剂”或“飞行修饰剂”指的是能够结合所关注的多肽并且通过结合改变所关注的多肽在质谱法中的行为的分子。电离修饰剂能够接受或提供至少一个电子。优选地,电离修饰剂对一种氨基酸(即赖氨酸)具有特异性。
本文所用的术语“多肽”或“所关注的多肽”指的是不同长度的氨基酸链。多肽可以是蛋白质或其片段或者肽或其片段。优选地,多肽是β-淀粉样肽Aβ1-40和Aβ1-42的C-末端片段,如例如Aβ(29-40)和Aβ(29-42)。
此外,本发明提供了对来自包含标记和未标记形式的所关注的多肽的来源的所述多肽进行定量的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)用电离修饰剂修饰分离的多肽;
(b)通过质谱法分析制备的多肽,并且由此测定多肽来源中存在的所关注的多肽的量。
本发明的一个实施方案涉及对所关注的多肽进行定量的方法,其包括:
(a)提供多肽来源;
(b)将确定量的用稳定同位素标记的多肽加入到(a)的来源中;
(c)分离未标记和标记的所关注的多肽;
(d)制备分离的所关注的多肽用于通过质谱法进行分析;
(e)用电离修饰剂修饰分离的多肽;
(f)通过质谱法分析制备的所关注的多肽;和
(g)测定多肽来源中存在的所关注的多肽的量。
所关注的多肽的来源可以是体液,例如血液,或者所关注的多肽可以获自组织样品(例如匀浆的脑样品)或细胞培养物。组织样品、体液或细胞培养物可以是哺乳动物组织样品、哺乳动物体液或哺乳动物细胞。优选的组织样品、细胞和体液来源于人或小鼠。
在所述的来源中,所关注的多肽可以以可溶性或聚集的形式存在。聚集的所关注的多肽可以形成斑块,由此本文所用的术语“斑块”指的是聚集的多肽的沉着物。可以通过包括一般生物化学多肽纯化方法的方法和包括激光切割显微术的用于从组织中特异性切下结构的方法从组织样品中获得含有聚集的多肽的所关注的多肽的来源(即含有聚集的β淀粉状蛋白的淀粉样沉着物)。
激光切割显微术方法包括低温消融(cold ablation)和激光压力弹射步骤(Schütze等(1998),通过激光介导的单细胞操作鉴定表达的基因(Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of singlecells),Nature Biotechnology 16:737-742;Simone等(1998),激光-俘获显微切割:开启用于分子分析的显微镜新领域(Laser-capture microdissection:opening the microscopic frontier to molecular analysis),TIG 14:272-276)。激光切割显微术可用于俘获任意特异性表型或可通过光学显微术鉴别的表型组织改变。例如,该技术可以有助于通过对分离的样本进行单独的显微切割和分析(例如通过微阵列)来检测正常细胞或组织与病理材料之间在基因表达上的差异。因此,与不使用激光切割所必须的整体组织分析相比,可以更容易地对重要改变进行定性和定量分析并且具有更大的准确度。在分析多肽组成之前通过激光切割分离所关注的结构的优点是有用的,其中不需要平均的多肽组成或浓度,但其中需要分析特异性生物结构。
含有聚集的所关注的多肽的切下的来源可能仅代表整个斑块的一部分。在Aβ的情况下,斑块为球形。为了测定整个斑块中所关注的多肽的量,所测定的斑块切下部分中所关注的多肽的量必须用校正因子进行平衡。校正因子取决于组织切片的厚度和平均斑块直径,将切下的小片的淀粉状蛋白含量外推至整个球体(Andreas Güntert“来自人和转基因小鼠的斑块比较中的激光切割显微术(laser dissection microscopy in the comparison ofplaques from human and transgenic mice)”Diploma thesis 2002,Biozentrum der Universitt Basel,瑞士)。
此外,在切下后,斑块可以通过静电效应被转移至容器中。
可以通过包括多肽生物化学、组织化学和免疫化学的方法测定组织样品、细胞培养物或体液中所关注的多肽的存在。可以优选通过包括用刚果红或硫磺素S染色的组织化学方法或通过免疫组织化学方法测定组织样品中聚集的所关注的多肽。更优选地,通过用组织化学和免疫组织化学方法双重染色测定组织样品中聚集的所关注的多肽的存在。这类方法是本领域技术人员众所周知的。最优选地,通过首先用刚果红染色、然后用免疫组织化学方法测定组织样品中聚集的所关注的多肽的存在。优选地,通过对体液样品进行蛋白质印迹实验测定体液中所关注的多肽的存在。
在本发明的方法中,将用稳定同位素标记的所关注的多肽作为标准品加入到所关注的多肽来源中,然后开始溶解和/或分离操作。将该标准品、即用稳定同位素标记的所关注的多肽直接加入到匀浆的组织样品、切下的多肽沉着物、体液样品或细胞培养物中。
可以在开始时将标准品(用稳定同位素标记的所关注的多肽)掺入所关注的多肽来源中,例如掺入切下的多肽沉着物中或掺入体液样品中。由于待定量的未标记的所关注的多肽与标记的所关注的多肽标准品除了相同原子的质量不同之外在化学上是相同的,所以它们在聚集的所关注的多肽或可溶性的所关注的多肽(例如聚集的淀粉状蛋白或可溶性淀粉状蛋白)的所需的溶解和/或分离操作方面均表现相同,这些多肽可以被其它多肽结合,导致分析物与标准品的等量损耗。在所述操作之前和之后比较标记的标准品的量使得可以测定该来源中初始存在的未标记的所关注的多肽的量。
用至少一种选自包括2H、13C、15N和18O的组的稳定同位素标记所关注的多肽标准品。优选地,用15N或13C标记所关注的多肽标准品。更优选地,用15N标记所关注的多肽标准品。优选地,用质谱中同位素图分离所必须的种类的稳定同位素标记所关注的多肽标准品。
加入确定量的用稳定同位素标记的所关注的多肽标准品。优选地,以与所关注的多肽来源中存在的所关注的多肽的有效量处于相同范围内的量加入标记的所关注的多肽标准品。可以在预实验中、例如如Rüfenacht等(通过与质谱法组合的激光切割显微术对阿尔茨海默病斑块中的Aβ肽进行定量(Quantification of the Aβpeptide in Alzheimer’s plaques by laser dissectionmicroscopy combined with mass spectrometry).J.Mass Spectrom.;2005;40:193-201)所述来确定该量。
可以以重组方式生产在本发明的方法中用作标准品的用稳定同位素标记的所关注的多肽。用于制备表达构建体和用于重组生产多肽的方法以及多肽是本领域所公知的,并且在Ausubel,Current Protocols in MolecularBiology/Polypeptide science,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.(1994)中有概述。
可以通过化学合成生产在本发明的方法中用作标准品的用稳定同位素标记的所关注的多肽。用于合成生产多肽或其片段的方法是本领域所公知的,例如多肽的固相合成,并且在Ausubel,Current Protocols inPolypeptide science,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中有概述。固相肽合成是用于制备合成肽的最常用方法,并且已经使用用于α-氨基保护的Fmoc(9-芴基甲氧羰基)(Burdick,D等,J BiolChem 1992,267,546-554)和Boc(叔丁氧羰基)(Barrow,C.J.等,J Mol Biol1992,225,1075-1093)方法获得了成功合成。
加入所关注的多肽标准品后,可以通过包括免疫沉淀法和免疫亲和色谱法的多肽化学方法从体液、优选从血清或CSF中分离全部所关注的多肽,包括标记的和未标记的所关注的多肽。
因此,在另一个实施方案中,步骤(c)中所关注的多肽是通过包括肽化学和免疫化学的方法从体液中分离的。
为了测定含有聚集的所关注的多肽的所关注的多肽来源中所关注的多肽含量,必须将聚集的所关注的多肽溶解。在本发明的方法中,通过包括用增溶剂溶解和任选地在标记的所关注的多肽标准品存在下的机械增溶法的方法溶解聚集的所关注的多肽。本发明的增溶剂可以是具有溶解聚集的所关注多肽能力的所有试剂,例如六氟丙醇;酸如例如甲酸;脲-SDS。机械增溶法可以包括声波振荡。聚集的所关注的多肽的溶解操作在加入的标记的所关注的多肽标准品存在下进行,由此确保所关注的多肽标准品与待定量的所关注的多肽等量损耗。
因此,在另一个实施方案中,步骤(c)中的所关注的多肽是通过包括用增溶剂溶解和任选地声波振荡的方法从所关注的多肽沉着物中分离的。
随后制备分离的所关注的多肽用于通过质谱法进行分析。用于通过质谱法分析的制备物包括使待分析的Aβ电离得到改善的方法。导致电离改善的方法包括通过包括化学碎裂和酶消化的方法进行碎裂。
随后,用化学反应使任选地碎裂的多肽与飞行修饰剂结合。与飞行修饰剂的化学反应包括肽游离N-末端的电荷衍生化,以便提高敏感性并通过源衰变后MALDI质谱法促进片段离子的形成(J.Stults等(1993)Anal.Chem.65,1703-1708;B.Spengler等(1997)Int.J.Mass Spectrom.169-170,127-140;Z.Huang等(1999)Anal.Biochem.268,305-317;StaudenmannW.和James P.Proteome Research:Mass Spectrometry(P.James编辑)Springer Verlag,Berlin(2001)143-166)。可以使分离的多肽直接与飞行修饰剂反应以便制备用于质谱法分析的制备物。或者,可以使分离的多肽在碎裂后与飞行修饰剂反应。化学碎裂可以使用溴化氰进行。酶消化可以使用选自包括内多肽酶(endopolypeptidease)Lys-C、胰蛋白酶、内多肽酶Glu-C和胃蛋白酶的组的蛋白酶进行。在本发明的方法中,可以将分离的多肽进行干燥并重新溶于缓冲液,然后用蛋白酶消化。溶解的多肽的碎裂可使质谱分析中的检测限更好(Gruenigner等(2000),使用基于质谱法的检测系统鉴定β-分泌酶-样活性(Identification of β-secretase-like activity usinga mass spectrometry-based assay system).Nature biotechnology 18:66-70)。
因此,在另一个实施方案中,步骤(d)中的分离的所关注的多肽是通过包括化学碎裂和酶消化的方法制备的以用于通过质谱法进行分析。
在进行质谱分析前,可以使溶解的和任选地碎裂的所关注的多肽脱盐。当存在作为电离竞争者的离子化合物时(例如由缓冲液引入的),建议将样品脱盐(例如,通过ZipTip)。
然后,通过质谱法分析分离的和任选地碎裂的所关注的多肽。目前用于生物材料的电离技术包括ESI(电喷雾-电离)和MALDI(基质辅助激光解吸附电离)。优选地,所用的质谱分析是MALDI-TOF(飞行时间)质谱分析。MALDI-TOF-MS分析的光谱主要由完整的单电荷的分子离子组成。较大的分子如多肽还可以产生多电荷离子以及单电荷多聚体,这取决于它们的浓度。
就作为所关注的多肽的Aβ而言,天然14N Aβ的峰型与质谱法中其人工15N同系物基线分离,由此使得可辨别质谱中天然的所关注的多肽和标准所关注的多肽。
可以通过用于质谱分析的不同手段来测定聚集的所关注的多肽来源中存在的所关注的多肽例如Aβ的量:a)通过比较标记的标准品(就Aβ而言:15N-标记的淀粉状蛋白标准品)与来自所关注的多肽来源的所关注的多肽的两个主峰的峰高;b)通过比较分离的峰型的所有峰的峰高;c)通过比较两个主峰下的面积;或d)通过比较两种不同峰型的所有峰下的面积之和。然后使用操作开始时加入的标记的所关注的多肽标准品的确定量和已知量可以计算多肽来源中存在的多肽量。在必须测定三维淀粉样沉着物例如斑块中存在的多肽例如Aβ的量的情况下,计算中必须包括校正因子。
阿尔茨海默病的特征在于患者脑中的淀粉样原纤维的胞外沉着物。已知许多不同的Aβ变体随氨基-以及羧基-末端上的异质性而出现。特别有意义的是羧基-末端的异质性,因为带有42个氨基酸的较长形式(Aβ1-42)比含有40个氨基酸的较短形式(Aβ1-40)发生聚集的倾向大得多。因此,重要的是在两种长度变体之间进行区分。因此决定性的部分是C-末端。然而,在使用内肽酶Lys-D产生的三个部分中,使用质谱法检测不到C-末端肽片段。需要对死亡前淀粉样沉着进行定量的方法作为轻度或临床上易混淆情况下的诊断工具以及用于监测以防止Aβ沉着为目的的疗法的有效性。
因此,本发明进一步提供了对AβX-40和/或AβX-42进行检测和定量的方法,其包括:
(a)提供淀粉样肽AβX-40和/或AβX-42的来源;
(b)加入确定量的用稳定同位素标记的β淀粉样肽AβX-40和/或AβX-42;
(c)在标记的β淀粉状蛋白存在下分离β淀粉状蛋白AβX-40和/或AβX-42;
(d)用蛋白酶消化分离的β淀粉状蛋白AβX-40和/或AβX-42;
(e)用电离修饰剂修饰β淀粉状蛋白AβX-40和/或AβX-42的片段;
(f)通过质谱法分析消化的β淀粉样肽片段;和
(g)通过测定C-末端片段的长度变体的量测定该来源中存在的β-淀粉样肽AβX-40和/或AβX-42的量。
优选地,X为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11(Aβ1-40、Aβ2-40、Aβ3-40、Aβ4-40、Aβ5-40、Aβ6-40、Aβ7-40、Aβ8-40、Aβ9-40、Aβ10-40、Aβ11-40、Aβ1-42、Aβ2-42、Aβ3-42、Aβ4-42、Aβ5-42、Aβ6-42、Aβ7-42、Aβ8-42、Aβ9-42、Aβ10-42和Aβ11-42)。更优选地,X为1。
优选的(g)的C-末端片段的长度变体为Aβ29-40和Aβ29-42。还优选的(g)的C-末端片段的长度变体为Aβ11-40和Aβ11-42。
上述这些方法使得可以在C-末端片段(AβX-40和AβX-42)的两种变体之间进行区分,并且可以对样品、即获自组织样品的淀粉样沉着物中各个变体的量进行定量。
本发明的另一个实施方案为对修饰的淀粉样肽进行定量的方法,其包括:
(a)提供修饰的淀粉样肽Aβ的来源;
(b)加入确定量的用稳定同位素标记的修饰的β淀粉样肽Aβ;
(c)在标记的β淀粉状蛋白存在下分离修饰的β淀粉状蛋白Aβ;
(d)用蛋白酶消化分离的修饰的β淀粉状蛋白Aβ;
(e)用电离修饰剂修饰修饰的β淀粉状蛋白Aβ的片段;
(f)通过质谱法分析消化的修饰的β淀粉样肽片段;和
(g)测定该来源中存在的修饰的β淀粉样肽Aβ的量。
Aβ肽的修饰可以是Aβ(11-16)谷氨酸11的环化,由此产生N-末端N-焦谷氨酸种类Aβ(pyroGlu11-16)。优选地,淀粉样肽的修饰是甲硫氨酸35的侧链氧化成甲硫氨酸亚砜(Met-35(ox))。甲硫氨酸35指的是β-淀粉样肽的氨基酸链35位上的氨基酸甲硫氨酸。优选的淀粉样肽的来源是脑中的淀粉状蛋白斑块。脑可以来源于哺乳动物。优选的脑为人脑或小鼠脑。
用本发明的方法定量的β淀粉状蛋白的其它形式包括交联肽,例如Aβ(X-38)、Aβ(X-39)、Aβ(X-40)、Aβ(X-41)、Aβ(X-42)、Aβ(X-43),其中X为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11,并且所述的肽在3和/或11位上被焦谷氨酸化(pyroglutinated)。这些交联的肽可以任选地被蛋白酶阵列碎裂,以便适合所述方法的分析窗。术语β淀粉状蛋白和Aβ在本发明中等同使用。
优选的β淀粉状蛋白或其片段的来源是获自组织样品、血清和CSF的淀粉样沉着物。获自组织样品的淀粉样沉着物包括致密斑块(神经斑或老年斑)、弥漫性斑块以及导致微血管病变的小动脉和小静脉中的淀粉样沉着物。淀粉样沉着物主要包括聚集的β淀粉状蛋白,还有少量其它成分。最优选的是获自脑组织的淀粉状蛋白斑块。
优选地,淀粉样沉着物是通过激光切割显微术从组织样品中切下的。优选地,淀粉样沉着物是从组织切片中切下的,更优选地,它们是从脑切片中切下的。
β淀粉状蛋白可以以聚集的或可溶性形式存在于β淀粉状蛋白来源中。尽管已知斑块中的Aβ掺入了淀粉样原纤维,但是Aβ的可溶性非原纤维形式确实在体内存在。Teller等(Teller,J.K.等,Nat Med 1996,2,93-95)在来自唐氏综合征受试者和正常老年对照组的脑的水提取物中检测到了可溶性Aβ种类;在尸体解剖时由胎儿和年龄为4天-61岁的受试者获得样品。在唐氏综合征受试者中,可溶性Aβ的量高出数倍,并且它随着年龄而增加。此外,在神经斑形成之前很长时间就出现可溶性Aβ的升高。Kuo等(Kuo,Y.M.等,J Biol Chem 1996,271,4077-4081)检查了来自8位AD受试者和4位正常对照受试者的脑的水提取物,发现可溶性Aβ的量增加了6倍。对可溶性Aβ进行的超滤实验证实了Aβ寡聚体的存在。
聚集的β淀粉状蛋白可以是折叠成″β-折叠″结构(beta-pleated sheet)原纤维的淀粉样原纤维,其中淀粉样原纤维根据包括以下的标准分类:(1)刚果红结合证实并且在交叉的起偏振器之间观察时显示绿色双折射;(2)直径为6-10nm的精细无分支纤维的电子显微镜证实;(3)存在特征-结构;和(4)与在丝心蛋白中观察到的交叉图谱类似的x-射线纤维衍射图谱。
可以通过包括蛋白质生物化学、组织化学和免疫化学的方法测定组织样品或体液中β淀粉状蛋白的存在。优选地,通过包括用刚果红或硫磺素S染色的组织化学方法或通过免疫组织化学方法测定组织样品中聚集的β淀粉状蛋白的存在。更优选地,通过用组织化学和免疫组织化学方法双重染色测定组织样品中聚集的β淀粉状蛋白的存在。最优选地,通过首先用刚果红染色、然后使用免疫组织化学方法测定组织样品中聚集的β淀粉状蛋白的存在。优选地,通过对体液样品进行蛋白质印迹实验测定体液中β淀粉状蛋白的存在。
用稳定同位素标记并且被作为标准品加入的Aβ代表了与Aβ来源中待定量的Aβ相同的Aβ形式。因此,用稳定同位素标记的Aβ可以选自包括Aβ1-40、Aβ2-40、Aβ3-40、Aβ4-40、Aβ5-40、Aβ6-40、Aβ7-40、Aβ8-40、Aβ9-40、Aβ10-40、Aβ11-40、Aβ1-42、Aβ2-42、Aβ3-42、Aβ4-42、Aβ5-42、Aβ6-42、Aβ7-42、Aβ8-42、Aβ9-42、Aβ10-42、Aβ11-42和Aβ29-X的组,其中X为37、38、39、40、41、42或43。用至少一种选自包括2H、13C、15N和18O的组的稳定同位素标记Aβ标准品。优选地,用15N或13C标记Aβ标准品。更优选地,用15N标记Aβ标准品。优选地,用质谱中同位素图分离所必须的种类的稳定同位素标记所关注的多肽标准品。
加入确定量的用稳定同位素标记的Aβ标准品。优选地,以与所关注的多肽来源中存在的Aβ的有效量处于相同范围内的量加入标记的Aβ标准品。可以在预实验中确定该量。
可以通过化学合成生产在本发明的方法中用作标准品的用稳定同位素标记的Aβ标准品。用于合成生产多肽的方法是本领域所公知的,例如多肽的固相合成,并且在Ausubel,Current Protocols in Polypeptide science,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中有概述。使用合成Aβ肽在体外形成的淀粉样原纤维与分离自老年斑的那些淀粉样原纤维相同这一现象的证实(Kirschner,D.A.;Inouye,H.;Duffy,L.K.;Sinclair,A.;Lind,M.;Selkoe,D.J.Proc Natl Acad Sci USA 1987,84,6953-6957)已经验证了合成肽在不同研究中的用途。固相肽合成是用于制备合成肽的最常用方法,并且已经使用用于α-氨基保护的Fmoc(9-芴基甲氧羰基)(Burdick,D等,J Biol Chem 1992,267,546-554)和Boc(叔丁氧羰基)(Barrow,C.J.等,J Mol Biol 1992,225,1075-1093)方法获得了成功合成。尽管Aβ肽合成存在中等难度,但是已经证实标准偶联方法和侧链保护策略足以成功进行合成。为了将稳定同位素引入Aβ标准品,在合成方法中使用稳定同位素标记的氨基酸。
可以以重组方式生产在本发明的方法中用作标准品的用稳定同位素标记的Aβ淀粉样肽。用于重组生产天然Aβ的方法在本领域中有描述,例如在EP0641861中。优选地,可通过用15N氯化铵饲喂重组大肠杆菌来生产标记的Aβ。稳定同位素的其它来源包括13C-标记的葡萄糖和生长在15N-标记的底物上的藻类提取物。
尽管已经一般性地描述了本发明,但是参照具体实施例可以更好地理解本发明,本文包括这些实施例的目的仅仅在于结合下列附图用于解释本发明,而并非旨在限制本发明,另有说明的除外。
附图说明
图1以图解方式表示本发明方法的原理,以Aβ淀粉状蛋白的C-末端片段的鉴别为例。用内肽酶Lys-D消化Aβ产生三个片段(步骤1)。用飞行修饰剂
处理三个片段(步骤2),在此情况下,飞行修饰剂与游离氨基●特异性结合。结合的飞行修饰剂改变了所述片段的飞行行为并且使得能够检测C-末端片段和在Aβ(1-40)与Aβ(1-42)之间进行区分。
图2表示用25个人致密斑块、但不使用电离修饰剂(IM)获得的MALDI-TOF质谱图(MS)。无法对β-淀粉样肽的C-末端片段进行鉴别或定量。不能在Aβ1-40与Aβ1-42之间进行区分。
图3表示用35个人致密斑块与电离修饰剂(IM)获得的MALDI-TOF质谱图。因IM而可检测Aβ的C-末端片段,并且能在Aβ1-40与Aβ1-42之间进行区分。
图4表示使用电离修饰剂(IM)的45只PS2APP转基因小鼠(Richards等(2003)共表达hAPPswe和hPS2mut的PS2APP转基因小鼠表现出与年龄相关的离散性脑淀粉样沉着和与认知缺陷相关的炎症(PS2APPtransgenic mice,coexpressing hAPPswe and tPS2mut,show age-relateddiscrete brain amyloid deposition and inflammation associated with cognitivedeficits).J Neurosci.23,8989)的致密斑块的MALDI-TOF-质谱图。IM使得可以在Aβ1-40与Aβ1-42之间进行区分。此外,可以通过本发明的方法检测35位上甲硫氨酸磺化氧化形式的小修饰。
图5表示来自氨和34种小胺(用电离修饰剂(IM)衍生的乙醇胺、甘氨酸和半胱胺)的离子喷雾质谱图。
图6表示电离修饰剂的实例。
具体实施方式
除非另有说明,否则按照生产商的说明使用实施例中涉及的商购试剂。
实施例1:精氨酸-NHS加合物及其在检测阿尔茨海默病斑块中的Aβ的羧基-末端中的应用
L-精氨酸向其HBF4盐的转化
将350mg L-精氨酸(2mMoles)溶于8ml H2O。用约0.25ml 8M的四氟硼酸滴定该溶液,直到pH表现出从pH 6降至pH 2-3。冷冻干燥后,加入1ml二甲基甲酰胺(DMF),在第二次冷冻干燥后,得到澄明的、非常粘稠的油状物。
L-精氨酸N-羟基琥珀酰亚胺的合成
将25.5mg O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐溶于0.32ml DMF。向该溶液中加入70.6mg L-精氨酸HBF4盐制备物和60μl吡啶。将该混合物在20℃下温育并通过电喷雾质谱法(类型:API 150MCA)监测反应。L-精氨酸N-羟基琥珀酰亚胺极具反应性并且在稀释该样品和进样所需的几秒钟过程中大量已经被转化回游离酸或酰胺(因用于质谱法的缓冲系统中包含的铵离子所致)。5小时后所需产物的比例最佳。该制备物称作电离修饰剂粗品。
与获自脑切片的碎裂的Aβ肽的反应
该操作是已经描述的操作的扩展(专利申请EP 03024739.9和Rüfenacht等2005)。根据该描述,从脑薄切片上切下斑块,用抗-Aβ抗体或用刚果红染色,在显微镜下通过激光切割切下并且通过激光压力弹射收集在微量离心管内。接下来,用70%甲酸溶解斑块中包含的聚集的Aβ,在真空中干燥并且用内蛋白酶Lys-C消化。
通常,消化物的体积为10μl,用10mM NaHCO3缓冲。向该消化物中加入5μl电离修饰剂粗品溶液并且在20℃下温育1小时。
在该衍生化过程后,操作步骤与(Rüfenacht等2005)中所述的相同,包括首先用ZipTip脱盐,与基质混合以便进行MALDI-TOF MS。
任选地,可以在用70%甲酸溶解纤维前即刻加入已知量的15N-标记的Aβ。这使得可对斑块中包含的Aβ量进行定量。天然14N Aβ和重组生产的15N Aβ在化学上是相同的,因此在因吸附造成的损耗方面以及在蛋白酶裂解和电离方面表现相同。但当通过质谱法进行分析时,来源于15N Aβ的峰移位至较高质量。通过测定相应的14N与15N峰的比例,可以确定内源性Aβ的量。当重点集中在羧基-末端时,必须选择足够的Aβ掺入量(spike)。在到目前为止所分析的组织样品中,我们以不同比例检测到了4种不同的羧基-末端(因脑样品的来源而异):Aβ(29-40)WT、Aβ(29-40)M35Mox、Aβ(29-42)WT和Aβ(29-42)M35Mox。WT代表在35位具有甲硫氨酸残基的野生型,而M35Mox代表氧化形式。为了对M35Mox形式进行定量,可以使用15N Aβ(1-40)或15N Aβ(1-42)或任意其它15N Aβ(X-Y)形式(Riek等在水溶液中的NMR研究无法鉴定两种具有广泛不同的斑块-感受态的阿尔茨海默病肽的单体形式Aβ(1-40)ox和Aβ(1-42)ox之间的显著构象差异(NMR studies in aqueous solution fail to identify significant conformationaldifferences between the monomeric forms of two Alzheimer peptides withwidely different plaque-competence,Aβ(1-40)ox and Aβ(1-42)ox);Eur.J.Biochem.268,5930-5936(2001))。CNBr裂解操作产生甲硫氨酸亚砜(Dbeli等.生物技术方法提供了聚集感受态单体阿尔茨海默病1-42残基淀粉样肽的手段(A biotechnological method provides access to aggregationcompetent monomeric Alzheimer’s 1-42 residue amyloid peptide);BioTechnology 13,988-993(1995))。为了对WT形式进行定量,可以使用重组融合蛋白。用内蛋白酶Lys-C消化产生真正片段(authentic fragment)Aβ(17-28)和Aβ(29-X)。实例在图1、2和3中给出。
实施例2:6-胍基己酸-NHS加合物的合成和分析物峰向质谱仪分析窗的位移
6-胍基己酸向其HBF4盐的转化
6-胍基己酸在有机溶剂中具有较差的溶解度,但是当转化成其HBF4盐时,它可溶于甲醇。将346mg 6-胍基己酸(2mMoles)溶于0.25ml H2O,然后用约250μl 8M的四氟硼酸中和。冷冻干燥后,得到463mg白色粉末。理论产率:466mg。
6-胍基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺加合物的合成
将6.3mg 6-胍基己酸HBF4盐溶于120μl甲醇(200mM)并且将溶于120μl(200mM)二甲基甲酰胺的2.8mg N-羟基琥珀酰亚胺加入到70mgN-环己基碳二亚胺、N’-甲基聚苯乙烯珠粒(Novo Biochem,Lufelfingen,瑞士)中。将该浆液于20℃下在旋转振荡器上缓慢搅拌并通过电喷雾质谱法监测反应。8小时后,反应几乎完成,然后可以将其引入所需测定达不超过48小时。
用6-胍基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺加合物对小伯胺进行衍生化以便将m/z值移入电喷雾质谱仪的分析窗。
在20℃下,将10μl含有氯化铵、乙醇胺、甘氨酸和半胱胺(各20mM)的混合物用10μl 6-胍基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺加合物(大约浓度为100mM)处理1小时。在MS分析之前,加入30μl水,然后取5μl用500μl MS缓冲液(50%乙腈和50%10mM乙酸铵)稀释,将其中的2μl进样至电喷雾质谱仪(类型:API 150MCA)。未衍生的胺的m/z值为18(NH4离子)、62(乙醇胺离子)、76(甘氨酸离子)和77(半胱胺离子),因此在质谱仪的分析窗之外。如图5中所示,当与电离修饰剂轭合时,修饰的胺的所有预期的峰均是可见的。
Claims (38)
1.以下通式的化合物:
其中:
n=0、1、2、3、4、5、6、7或8;
X=H、OH、F、Cl、Br、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R=无残基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R’=无残基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R”=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R””=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
或者R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””彼此键合与它们所连接的氮原子一起形成环,并且R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””一起为:
-CH2-(CH2)p-,
其中p为1、2或3;
或者X和R彼此键合与它们所分别连接的氮原子和碳原子一起形成环,并且X和R一起为:
-(CH2)s-,
其中s为1、2、3或4。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中
n=1
X=OH或H
R=H
R’=无残基
R”=H
R=H
R””=H
3.根据权利要求1所述的化合物,其中
n=4
X=H
R=H
R’=无残基
R”=H
R=H
R””=H
4.作为电离修饰剂的权利要求1至3中任意一项所述的化合物。
5.对来自包含标记和未标记形式的所关注的多肽的来源的所述所关注的多肽进行定量的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)用电离修饰剂修饰分离的多肽;
(b)通过质谱法分析制备的多肽,并且由此测定该多肽来源中存在的所关注的多肽的量。
6.根据权利要求5所述的方法,其中电离修饰剂是权利要求1至3中任意一项所述的化合物。
7.根据权利要求5至6中任意一项所述的方法,其中多肽是β淀粉样肽的C-末端片段Aβ(29-40)、Aβ(29-42)。
8.根据权利要求5至7中任意一项所述的方法,其中标记的多肽是用至少一种稳定同位素标记的。
9.根据权利要求8所述的方法,其中标记的多肽是用选自包括15N、13C、18O和2H的组的稳定同位素标记的。
10.根据权利要求5至9中任意一项所述的方法,其中步骤(e)中制备的多肽在通过质谱法进行分析之前被脱盐。
11.根据权利要求5至10中任意一项所述的方法,其中通过MALDI-TOF质谱法对步骤(e)中制备的多肽进行分析。
12.对所关注的多肽进行检测和定量的方法,其包括:
(a)提供多肽来源;
(b)将确定量的用稳定同位素标记的所述多肽加入到(a)的来源中;
(c)分离未标记和标记的多肽;
(d)制备分离的多肽用于通过质谱法进行分析;
(e)用电离修饰剂修饰分离的多肽;
(f)通过质谱法分析制备的多肽;和
(g)测定该多肽来源中存在的多肽的量。
13.根据权利要求12所述的方法,其中电离修饰剂是权利要求1至3中任意一项所述的化合物。
14.根据权利要求12至13中任意一项所述的方法,其中步骤(a)中的多肽来源是从组织样品获得的。
15.根据权利要求12至14中任意一项所述的方法,其中步骤(a)中的多肽来源是从组织样品获得的淀粉样沉着物。
16.根据权利要求15所述的方法,其中淀粉样沉着物是通过用激光切割显微术切下而从组织样品获得的。
17.根据权利要求15或16所述的方法,其中组织样品是从脑获得的。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述的脑是人或啮齿动物的脑。
19.根据权利要求12至14中任意一项所述的方法,其中步骤(a)中的多肽来源是体液。
20.根据权利要求12至19中任意一项所述的方法,其中步骤(b)中加入的标记的多肽是以重组方式生产的并且用至少一种稳定同位素标记的多肽。
21.根据权利要求12至19中任意一项所述的方法,其中步骤(b)中加入的标记的多肽是以合成方式生产的并且用至少一种稳定同位素标记的多肽。
22.根据权利要求12至21中任意一项所述的方法,其中步骤(b)中加入的多肽是用选自包括15N、13C、18O和2H的组的稳定同位素标记的。
23.根据权利要求12至13、19至22中任意一项所述的方法,其中步骤(c)中的多肽是通过包括多肽化学和免疫化学的方法从体液中分离的。
24.根据权利要求12至18、20至22中任意一项所述的方法,其中步骤(c)中的多肽是通过包括用增溶剂溶解的方法从沉着物中分离的。
25.根据权利要求12至24中任意一项所述的方法,其中步骤(d)中的分离的多肽是通过包括化学碎裂和酶消化的方法制备的以用于通过质谱法进行分析。
26.根据权利要求25所述的方法,其中步骤(d)中的分离的多肽是通过用蛋白酶进行酶消化制备的以用于通过质谱法进行分析,所述的蛋白酶选自包括内多肽酶Lys-C、胰蛋白酶和内多肽酶Glu-C的组。
27.根据权利要求12至26中任意一项所述的方法,其中步骤(f)中的制备的多肽在通过质谱法进行分析之前被脱盐。
28.根据权利要求12至27中任意一项所述的方法,其中通过MALDI-TOF质谱法对步骤(f)中的制备的多肽进行分析。
29.根据权利要求12至28中任意一项所述的方法,其中所关注的多肽是长度变体AβX-40和/或AβX-42,其中X为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。
30.根据权利要求29所述的方法,其中测定步骤(g)的来源中存在的β-淀粉样肽AβX-40和/或AβX-42的量是通过测定C-末端片段的长度变体的量来进行的。
31.根据权利要求30所述的方法,其中步骤(g)中测定的C-末端片段的长度变体是Aβ29-40和/或Aβ29-42。
32.根据权利要求30所述的方法,其中步骤(g)中测定的C-末端片段的长度变体是Aβ11-40和/或Aβ11-42。
33.根据权利要求29所述的方法,其中X为1。
34.根据权利要求12至28中任意一项所述的方法,其中所关注的多肽是β淀粉样肽的C-末端片段Aβ(29-40)或Aβ(29-42)。
35.根据权利要求12至28中任意一项所述的方法,其中所关注的多肽是修饰的淀粉样肽Aβ。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述的修饰是淀粉样肽的35位甲硫氨酸的氧化。
37.根据权利要求35所述的方法,其中所述的修饰是淀粉样肽的11位谷氨酸的环化。
38.基本如本文以上所述的方法,尤其参照上述实施例的方法。
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