JP2015500472A - 生体分子の濃度を測定するための方法 - Google Patents

生体分子の濃度を測定するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、対象における関心対象の生体分子の絶対濃度を測定するための方法を提供する。このような生体分子は１つ以上の神経性および神経変性の疾患または障害に関係し得る。また、中枢神経系に由来する生体分子のインビボ代謝に治療物質が影響を及ぼすかどうかを判定するための方法も提供する。また、本発明の方法を実施するためのキットも提供する。

Description

発明の分野
本発明は全体として、神経性および神経変性の疾患、障害、および関連する過程を診断および治療するための方法に関する。
背景情報
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の最も多い原因であり、公衆の健康問題を増加させている。それは、現在、米国では５００万人を悩ませていると推定され、２０５０年までに１３００万人に増加すると予測される（Ｈｅｒｂｅｒｔら、２００１、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓ．Ａｓｓｏｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．１５（４）：１６９-１７３（非特許文献１））。ＡＤは、その他の中枢神経系（ＣＮＳ）変性疾患のように、タンパク質の産生、蓄積、およびクリアランスの障害を特徴とする。ＡＤの場合、タンパク質であるアミロイド-β（Ａβ）の代謝の調節不全は、当該疾患を有する人々の脳におけるアミロイドプラークの形態でのこのタンパク質の大量の蓄積によって示される。さらに、タンパク質であるタウが、タウ濃縮体の形態で脳に蓄積する。ＡＤは記憶、認知機能、および最終的には自立の喪失、ならびに死をもたらす。この疾患は、患者、家族および社会に重い個人的および経済的犠牲を課す。当該疾患の重症度および人口における罹患率の増加により、より良い治療の開発が急務である。
現在、症状を緩和するいくつかの医薬があるが、疾患を緩和する治療はない。疾患を緩和する治療は、不可逆的な脳損傷が始まる前に施せば、最も効果的であると考えられる。しかしながら、ＡＤの臨床診断がなされるまでに、広範囲のニューロンの損失はすでに発生している（Ｐｒｉｃｅら ２００１、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８（９）：１３９５-１４０２（非特許文献２））。したがって、ＡＤを発病するリスクのある人々を識別するための方法が、ＡＤの発症を予防するのにまたは遅らせるのに最も役に立つと考えられる。現在、臨床症状の発症前にＡＤにおいて起こる病態生理学的変化を識別する手段も、発症を予防し得るもしくは疾患の進行を緩やかにし得る治療効果を効果的に測定する手段もない。
したがって、対象における生体分子を定量化するための、感度が高く、精確であり、かつ再現性のある方法が必要とされている。絶対定量に使用されるこれまでの科学技術として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これは抗体を使用して、捕捉しかつ濃度を測定する。しかしながら、ＥＬＩＳＡは、総濃度を定量化するかまたは、定量化のためのアイソフォーム特異的抗体に依存しており、大抵は、アッセイごとにたった１つの種の濃度を測定するためにしか使用できない。ＥＬＩＳＡアッセイ法に使用される抗体は、タンパク質種に極めて特異的でなければならず、それらが結合させるタンパク質の構造により、および関心対象のタンパク質に結合する２つの抗体に依存することにより、ＥＬＩＳＡアッセイ法から報告される濃度のアッセイ間およびアッセイ内の変動性は高くなる可能性がある。このように、インビボにおいて体液中および生物組織内の１つ以上の生体分子の濃度の絶対定量の測定を行うための方法が必要とされ、この生体分子は疾患の診断および／または進行に関連する。
Ｈｅｒｂｅｒｔら、２００１、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓ．Ａｓｓｏｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．１５（４）：１６９-１７３ Ｐｒｉｃｅら ２００１、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８（９）：１３９５-１４０２
本発明の様々の態様の中には、対象における１つ以上の生体分子の濃度を計算するための方法の提供がある。方法は、対象由来の試料を、標識された既知濃度の関心対象の生体分子である定量標準物質に接触させるステップを含む。定量標準物質は、試料から関心対象の生体分子を単離する前か、または試料から生体分子を単離した後のいずれかに、対象由来の試料に接触させることができる。方法は、試料から関心対象の生体分子を単離するステップ、および、試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を測定し、それによって、比を使用して試料中の非標識の生体分子の濃度を計算するステップをさらに含む。ある実施形態では、方法は、計算された濃度を標準曲線に正規化するステップを含み、標準曲線は、定量標準物質に対する非標識の生体分子の比を２つ以上測定することによって生成され、この場合、非標識の生体分子の濃度は既知である。
別の態様では、本発明は、対象における１つ以上の生体分子の濃度を定量化するインビボ方法を提供する。方法は、対象に１つ以上の標識されたアミノ酸を投与するステップを含み、標識されたアミノ酸は、対象において関心対象の生体分子に取り込まれる。方法は、対象から体液または生物組織の試料を得るステップをさらに含み、試料は標識された生体分子の画分および非標識の生体分子の画分を含む。その後、試料を定量標準物質に接触させ、定量標準物質は、対象に投与された１つ以上の標識されたアミノ酸とは異なる分子量を有する部分で標識された、既知濃度の生体分子を含む。その後、定量標準物質に対する標識された生体分子の比および定量標準物質に対する非標識の生体分子の比を使用して、標識された生体分子と非標識の生体分子の両方の濃度をそれぞれ計算することができる。ある実施形態では、非標識の生体分子の濃度を計算することは、定量標準物質の濃度に、定量標準物質に対する非標識の生体分子の測定された比を掛けることを含む。別の実施形態では、標識された生体分子の濃度を計算することは、定量標準物質の濃度に、定量標準物質に対する標識された生体分子の測定された比を掛けることを含む。さらに別の実施形態では、非標識の生体分子および標識された生体分子の計算された濃度をそれらの独立した標準曲線のそれぞれに正規化し、標準曲線は、定量標準物質に対する標識された生体分子および非標識の生体分子の比を２つ以上測定することによって生成され、標識された生体分子および非標識の生体分子の濃度は既知である。
別の態様では、本発明は、対象の中枢神経系において産生される１つ以上の生体分子のインビボ代謝を測定するための方法を提供する。方法は、標識された部分を対象に投与するステップを含み、標識された部分は、血液脳関門を通過すること、および、１つ以上の生体分子が対象の中枢神経系において産生されるときに、生体分子に取り込まれることができる。方法は、対象から中枢神経系の試料を得るステップをさらに含み、中枢神経系の試料は、中枢神経系の組織または液体である。中枢神経系の試料は、１つ以上の生体分子に標識された部分が取り込まれている、標識された生体分子の画分、および、１つ以上の生体分子に標識された部分が取り込まれていない、非標識の生体分子の画分を含む。この過程の最終ステップは、１つ以上の生体分子のそれぞれについての、標識された生体分子の量および非標識の生体分子の量を検出することを含み、各生体分子についての、非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比は、対象における当該生体分子の代謝に直接的に比例する。
別の態様では、本発明は、対象の中枢神経系において産生される生体分子の代謝に治療物質が影響を及ぼすかどうかを判定するための方法を提供する。方法は、対象に治療物質および標識された部分を投与するステップを含み、標識された部分は、血液脳関門を通過すること、および、生体分子が対象の中枢神経系において産生されている際に、生体分子に取り込まれることができる。方法は、対象から生体試料を得るステップをさらに含み、生体試料は、標識された部分が生体分子に取り込まれる、標識された生体分子の画分、および、標識された部分が生体分子に取り込まれていない、非標識の生体分子の画分を含む。この過程の次のステップは、標識された生体分子の量および非標識の生体分子の量を検出することを含み、非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比は、対象における生体分子の代謝に直接的に比例する。この過程の最終ステップは、対象における生体分子の代謝を適切な対照値と比較することを含み、対照値からの変化が、対象の中枢神経系における生体分子の代謝に治療物質が影響を及ぼすことを示す。
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。ある実施形態では、キットは対象における神経性疾患もしくは神経変性疾患の進行または治療を診断および／またはモニタリングするために提供される。キットは、１つ以上の標識された部分（例えば、標識されたアミノ酸）、および、対象に１つ以上のアミノ酸を投与するための手段を含む。キットはさらに、対象から一定の時間間隔で生体試料を得るための手段を含んでいてもよい。ある実施形態では、キットは、非標識の関心対象の生体分子に対する標識された関心対象の生体分子の比を経時的に検出および測定するため、ならびに非標識の生体分子の濃度を計算するための説明書も含む。ある実施形態では、説明書は、計算された濃度を、ある標準値および／または本明細書に開示される対照値と比較するための方法を開示する。
すべての態様で、標識された部分は、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、および３６Ｓから成る群から選択される非放射性同位体を含む。ある実施形態では、標識された部分は、必須または非必須であってもよい標識されたアミノ酸である。例示的なアミノ酸として、限定されないがスレオニン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンが挙げられる。したがって、ある実施形態では、標識された部分は、ｘ＝１〜４である１３Ｃｘ-スレオニンである。別の実施形態では、標識された部分は１５Ｎで標識されたアミノ酸である。別の実施形態では、標識された部分は、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたロイシンである。別の実施形態では、標識された部分は、ｘ＝１〜５である１３Ｃｘで標識されたグルタミン酸である。別の実施形態では、標識された部分は、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたフェニルアラニンである。別の実施形態では、標識された部分は、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンである。別の実施形態では、標識された部分は、ｘ＝１〜６およびｙ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンおよび１３Ｃｙで標識されたフェニルアラニンである。
すべての態様で、生体分子はペプチド、脂質、核酸、または炭水化物であってもよい。ある実施形態では、生体分子は、タウ、アミロイド-β（Ａβ）、α-シヌクレイン、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α-２-マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、ＴＤＰ-４３、スーパーオキシドジスムターゼ１、ハンチンチン、インターロイキン、およびＴＮＦ等の中枢神経系（ＣＮＳ）で合成されるペプチドである。２つ以上の生体分子がアッセイされる本発明の態様では、生体分子は同じタンパク質のアイソフォームであってもよい。このように、ある実施形態では、生体分子は、タウ-４Ｒ２Ｎ、タウ-４Ｒ１Ｎ、タウ-４Ｒ０Ｎ、タウ-３Ｒ２Ｎ、タウ-３Ｒ１Ｎ、タウ-３Ｒ０Ｎの１つ以上であってもよい。
本発明のその他の態様および特徴は以下により詳細に記述する。
１３Ｃ６ロイシンを培地に加えた後に、細胞培地から単離したときの非標識タウに対する１３Ｃ６で標識されたタウの比を示す。これは、細胞によって産生されているときのタウへの１３Ｃ６ロイシンの代謝的取り込みを説明している。 ＳＩＳＡＱ-タウの標準曲線を示す。曲線は５ｎｇ／ｍＬ〜５１ｐｇ／ｍＬ（２．５倍の希釈液）の範囲で直線的である。この曲線を使用して２つのＣＳＦ試料（３つ組で行われる）の濃度を測定する。 ＬｙｓＮ消化に基づく７つのタウ由来のペプチドについてのクロマトグラムを示す。表は親イオンのｍ／ｚと共にペプチドを表す。 タウのＬｙｓＮ消化物由来のスペクトルを示す。ペプチドはトレオニン４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）でリン酸化される。
発明の詳細な説明
本発明は部分的に、生体分子の安定同位体標識が、生体分子の分子量に小さな差をもたらすが、生体分子の物理的または化学的特性を変化させないという発見に基づく。本明細書に提供される技術を使用して、生体分子を用いて神経性障害または神経変性障害を有するかまたは発病するリスクのある対象を診断および／または治療することができる。したがって、本発明は、対象における１つ以上の関心対象の生体分子の濃度を計算するために有用な方法およびキットを提供する。
本発明はまた、治療物質が対象における生体分子の産生率またはクリアランス速度に影響を及ぼすかどうかを評価するための方法も提供し、生体分子は神経性疾患または神経変性疾患に関連する。したがって、方法を使用して、治療物質の適切な用量および／または適切な投与レジメンを決定してもよい。さらに、方法を使用して、特定の治療物質にどの対象がより良好に反応するのかを判定してもよい。例えば、生体分子の産生が増加している対象は、より良好にある治療物質に反応し得る一方で、生体分子のクリアランスが減少している対象は、より良好に別の治療物質に反応し得る。あるいは、ある特定の遺伝子型を有する対象は、異なる遺伝子型を有する対象よりも良好に、ある特定の治療物質に反応し得る。最終的に、同位体特異的な定量化を可能にすることにより、方法を使用して、同じ生体分子のある同位体の産生を別の同位体の産生に切り替えることによって、治療物質が生体分子の産生を調節することができるかどうかを判定することができる。
単数形の"１つの（ａ）"、"１つの（ａｎ）"、および"その（ｔｈｅ）"は、当該明細書および添付の請求項に使用されるとき、明白な別段の記載がない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つ以上の方法、および／または、当該開示等を読めば当業者に明らかとなる本明細書に記述される種類のステップを含む。
別段の定義がない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。任意の方法および本明細書に記載のものと同様または同等の材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記述する。
用語「対象」は、本明細書に使用するとき、本主題の方法を実施する任意の対象または患者を意味する。一般的に、対象は、当業者に理解されるようにヒトであるが、動物であってもよい。したがって、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む家畜動物、および霊長動物（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）を対象の定義に含む。さらに、用語「対象」は、細胞の培地を意味してもよく、本発明の方法は、例えば、治療物質の有効性を評価するためにインビトロで実施してもよい。
用語「試料」および「生体試料」は、本明細書に使用するとき、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を意味する。本方法に使用される細胞の試料を、対象由来の組織試料もしくは体液から、または生検手順（例えば針生検）または外科手術によって得られた組織から得てもよい。ある実施形態では、本発明の生体試料は、体液、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿、唾液、および涙の試料である。
本明細書に開示されるように、生体分子の安定同位体標識は、生体分子の分子量に小さな差をもたらすが、生体分子の物理的または化学的特性を変化させない。したがって、生体分子は抗体に結合し、同一の様式で液体クロマトグラフィーカラムから外れて溶出する。質量分析計等の感度の高い装置は、標識された生体分子と非標識の生体分子の重量におけるわずかな差も測定する能力をもたらす。
したがって、ある態様では、本発明は対象における生体分子の濃度を計算する方法を提供する。ある実施形態では、方法は、対象由来の試料を定量標準物質に接触させるステップを含む。本明細書において使用するとき、「定量標準物質」は、標識された、既知濃度の生体分子を意味し、試料に存在し得るその他の標識された生体分子または非標識の生体分子とは別個の分子量を有する。したがって、質量分析計、タンデム質量分析計、またはその両方の組み合わせ等の感度の高い計測器を使用して非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を測定する。標識された生体分子および非標識の生体分子の物理的特性は同じであるので、質量分析計によって測定された比は、元の試料中の比と同一である。したがって、それぞれが特有の同位体標識で標識された、既知量の１つ以上の生体分子を加えることによって、本発明は異なる同位体組成を有する生体分子の量を定量化する能力を提供する。
用語「生体分子」は、本明細書に使用するとき、生存生物の任意の有機分子を意味する。例示的な生体分子として、限定されないがペプチド、脂質、核酸、および炭水化物が挙げられる。ある実施形態では、生体分子は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）で合成されるタンパク質等のペプチドである。本発明の方法によって測定することのできる例示的なタンパク質として、限定されないがタウ（アルツハイマー病に関連）、アミロイド-β（Ａβ）およびその変異体、可溶性アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（同位体２、３、または４）、アポリポタンパク質Ｊ（クラステリンとも呼ばれる）、ホスホタウ、グリア線維酸性タンパク質、α-２マクログロブリン、α-シヌクレイン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症に関係がある）、プリオン、インターロイキン、ＴＤＰ-４３、スーパーオキシドジスムターゼ１、ハンチンチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。標的となり得るさらなる生体分子として、ＧＡＢＡ作動性神経、ノルアドレナリン作動性神経、ヒスタミン作動性神経、セロトニン作動性神経、ドーパミン作動性神経、コリン作動性神経、およびグルタミン酸作動性神経の産生物またはそれらの神経と相互作用するタンパク質もしくはペプチドが挙げられる。ある実施形態では、インビボ濃度が測定されるタンパク質は、アポリポタンパク質Ｅタンパク質であってもよい。別の実施形態では、インビボ濃度が測定されるタンパク質は、α−シヌクレインであってもよい。別の実施形態では、インビボ濃度が測定されるタンパク質は、Ａβまたはその変異体もしくはアイソフォームであってもよい。別の実施形態では、インビボ濃度が測定されるタンパク質は、タウまたはその変異体もしくはアイソフォームであってもよい。濃度を測定することができるタウの例示的なアイソフォームは、限定されないがタウの以下のリン酸化または非リン酸化アイソフォームが挙げられる：タウ-４Ｒ２Ｎ、タウ-４Ｒ１Ｎ、タウ-４Ｒ０Ｎ、タウ-３Ｒ２Ｎ、タウ-３Ｒ１Ｎ、タウ-３Ｒ０Ｎ。
一例としてかつ非限定的に、タウの特有のいくつかのアイソフォームがＣＳＦに存在し、これらのアイソフォームは、リン酸化を含むいくつかの方法で翻訳後修飾することができる。タウのトリプシン消化によっていくつかのペプチド（表１参照）が生じる。したがって、これらのペプチドのいくつかを定量化することによって、元の体液中のこれらのアイソフォームの濃度を計算することができる。
（表１）質量分析計によって同定されたタウのトリプシンペプチド
Figure 2015500472
このように、方法は、エンドプロテアーゼ（例えば、トリプシン、ＬｙｓＮ、またはＶ８プロテアーゼ）で消化された後に産生される断片等のタウの様々なアイソフォームの濃度を測定する能力を提供する。タウアイソフォームの例示的な断片として、限定されないが異なるアイソフォームとＮ-末端領域（２Ｎ／１Ｎ／０Ｎ）およびＣ-末端繰り返し領域（４Ｒ／３Ｒ）等のそれらの境界域との間で異なるタウの領域が挙げられる。
ＬｙｓＮ消化後のタウの例示的なペプチドとして、以下が挙げられる。
（表２）タウのＬｙｓＮペプチド
Figure 2015500472
用語「核酸」とは、本明細書に使用するとき、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖または三本鎖のもの、およびそれらの任意の化学修飾物を意味する。実質的には核酸のいかなる修飾物も考慮される。「核酸分子」は、長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００塩基長、またはさらにより長い塩基長から全長の染色体ＤＮＡ分子までのほとんどのすべての長さあってもよい。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書では交換可能に使用され、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸残基、すなわちペプチドアイソスターを意味する。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工的な化学模倣物である、アミノ酸ポリマーについて、ならびに、自然発生のアミノ酸ポリマー、修飾残基を含むもの、および自然発生ではないアミノ酸ポリマーについて適用する。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーとして通常言及される短鎖と、タンパク質として一般的に言及される長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは２０個の遺伝子コードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。このように、「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合しているアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む。タンパク質は、自然発生のアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣の構造から構成されていてもよい。したがって、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、本明細書に使用するとき、自然発生のアミノ酸と合成されたアミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモ-フェニルアラニン、シトルリン、およびノルロイシンが本発明の目的のために検討されたアミノ酸である。「アミノ酸」はプロリンおよびヒドロキシプロリン等のイミノ酸残基も含む。側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）構造のいずれかであってもよい。
いくつかの異なる部分は関心対象の生体分子を標識するために使用してもよい。一般的に、本発明の方法に使用される２種類の標識部分は、放射性同位体および非放射性（安定）同位体である。ある実施形態では、非放射性同位体は質量分析によって使用され、測定される。好ましい安定同位体として、重水素（２Ｈ）、１３Ｃ、１５Ｎ、１７または１８Ｏ、および３３、３４、または３６Ｓが挙げられるが、広く認められている天然型に見られるよりも多いまたは少ない中性子によって原子の質量を変化させる多くのその他の同位体も効果的であると考えられることを理解される。適切な標識は一般的に、質量分析計で検出することのできるように試験中の生体分子の質量を変化させる。ある実施形態では、測定される予定の生体分子はペプチドまたはタンパク質であってもよく、標識された部分は非放射性同位体（例えば１３Ｃ）を含むアミノ酸であってもよい。別の実施形態では、測定される予定の生体分子は核酸であってもよく、標識された部分は非放射性同位体（例えば１５Ｎ）を含むヌクレオシド３リン酸であってもよい。あるいは、放射性同位体を使用してもよく、標識された生体分子をシンチレーションカウンター（または核シンチグラフィーによって）および質量分析計によって測定してもよい。１つ以上の標識された部分を同時にまたは配列中に使用してもよい。
したがって、ある実施形態では、この方法を適用してタンパク質の濃度を測定するとき、標識された部分は典型的にアミノ酸である。当業者は、いくつかのアミノ酸を使用して生体分子の標識を供給してもよいと理解する。一般的に、アミノ酸の選択は、以下等の様々な要因に基づく。（１）アミノ酸は一般に、関心対象のタンパク質またはペプチドの残基の少なくとも１つに存在する。（２）アミノ酸は一般に、タンパク質の産生領域にたどり着き、組織または細胞の関門を急速に平衡化することができる。かつ、（３）所望のアミノ酸の商業的入手可能性（すなわち、いくつかのアミノ酸は高価であるかその他のアミノ酸より製造するのが大変である）。
ある実施形態では、アミノ酸は、必須アミノ酸（身体によって産生されない）であり、そのため、より高い割合の標識化を達成することができる。別の実施形態では、アミノ酸は非必須アミノ酸である。例示的なアミノ酸として、限定されないがスレオニン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンが挙げられる。このように、ある実施形態では、標識された部分は、ｘ＝１〜４である１３Ｃｘ-スレオニンである。別の実施形態では、標識されたアミノ酸は、１つ以上の１５Ｎで標識されたアミノ酸、ｘ＝１〜５である１３Ｃｘで標識されたグルタミン酸、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたロイシン、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたフェニルアラニン、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたイソロイシン、ｘ＝１〜６およびｙ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンおよび１３Ｃｙで標識されたフェニルアラニンである。例えば、６つの１３Ｃ原子を含む１３Ｃ６-フェニルアラニンを使用して、関心対象の生体分子を標識してもよい（例えば、ＣＮＳ由来タンパク質）。さらに別の実施形態では、１３Ｃ６-ロイシンを使用してＡβまたはタウを標識する。
非放射性同位体と放射性同位体の両方の標識されたアミノ酸の多くの商業的供給源がある。一般的に、標識されたアミノ酸は生物学的または合成的に産生されていてもよい。生物学的に産生されたアミノ酸は、生物がタンパク質を産生するときに、アミノ酸に取り込まれる１３Ｃ、１５Ｎ、または別の同位体の富化混合物内で成長した生物（例えば、ケルプ／海藻）から得られてもよい。そのアミノ酸は次に分離および精製される。あるいは、アミノ酸は既知の合成化学的過程で作製されてもよい。
標識された部分（例えば、標識されたアミノ酸）は、いくつかの方法によって、対象に投与されてもよい。投与に適した経路は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、または経口によるものを含む。ある実施形態では、標識された部分を静脈内注入によって投与しても良い。別の実施形態では、標識された部分は経口的に消化されてもよい。
標識された部分は、一定時間をかけて、選択される分析の種類（例えば、定常状態またはボーラス／チェイス）に依存した大量の単回用量としてゆっくりと投与されてもよいか、または、初回のボーラス投与の後に一定時間をかけてゆっくりと投与されてもよい。標識された生体分子が定常状態のレベルに達するために、標識時間は通常、標識された生体分子が確実に定量され得るように十分な持続時間のものであるべきである。ある実施形態では、標識された部分は単回経口用量として投与される。別の実施形態では、標識された部分は約１時間から約３６時間の範囲の時間、投与される。別の実施形態では、標識された部分は約６時間から約１２時間の範囲の時間、投与される。さらに別の実施形態では、標識された部分は約９時間から約１２時間の範囲の時間、投与される。さらに別の実施形態では、標識された部分は約９時間から約２４時間の範囲の時間、投与される。
標識された部分の投与速度は、約０．５ｍｇ／ｋｇ／時〜約５ｍｇ／ｋｇ／時にわたっていてもよい。ある実施形態では、標識されたロイシンの投与速度は、約１ｍｇ／ｋｇ／時〜約３ｍｇ／ｋｇ／時である。別の実施形態では、標識されたロイシンの投与速度は、１．８ｍｇ／ｋｇ／時〜約２．５ｍｇ／ｋｇ／時である。別の実施形態では、標識されたロイシンは、対象の体重１ｋｇあたり約５０から約５００ｍｇの間、対象の体重１ｋｇあたり約５０から約３００ｍｇの間、または対象の体重１ｋｇあたり約１００から３００ｍｇの間のボーラスとして投与されてもよい。さらに別の実施形態では、標識されたロイシンは対象の体重１ｋｇあたり約２００ｍｇのボーラスとして投与されてもよい。代わりの実施形態では、標識されたロイシンは、対象の体重１ｋｇあたり約０．５から約１０ｍｇの間、約１から約４ｍｇの間、または約２ｍｇの初回のボーラスの後に、上に詳述したように静脈内に投与されてもよい。
当業者は、標識された部分の量（または用量）が変動することができることおよび変動することを理解する。一般的に、その量は以下の要因に依存している（かつ以下の要因によって推定される）。（１）所望の分析の種類。例えば、血漿中の標識されたロイシンの定常状態が約１５％に達するために、１０分かけての２ｍｇ／ｋｇの初回ボーラスの後、約９時間かけて約２ｍｇ／ｋｇ／時が必要とされる。対照的に、定常状態が必要でない場合、標識された部分の大量のボーラス（例えば、１または５グラムの標識されたロイシン）を最初に投与してもよい。（２）分析中のタンパク質。例えば、タンパク質が急速に産生されている場合、必要な標識時間が少なくてもよく、かつ必要な標識が少なくてよく、おそらく１時間で０．５ｍｇ／ｋｇほどである。しかしながら、大部分のタンパク質の半減期は数時間から数日であり、もしかすると、０．５ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇで、４、９、または１２時間の持続注入を使用してもよい。かつ（３）標識の検出感度。例えば、標識の検出感度が増加すると、必要な標識の量を減少させてもよい。
複数の標識された部分を単一の対象に使用してもよいことを理解されたい。このことにより、同じ生体分子の複数の標識化が可能となり、様々な時間における生体分子の産生またはクリアランスについての情報が提供され得る。例えば、最初の期間に第一の標識を患者に与え、次に薬理学的物質（薬物）を与え、その後、第二の標識を投与してもよい。通常、対象から得られる試料の分析は、薬物投与の前後に、関心対象の生体分子の濃度を測定し、同じ対象における薬物の薬力学的効果を直接測定する。あるいは、複数の標識を同時に使用して、生体分子の標識化を増やす。
したがって、疾患が確立されかつ治療プロトコールが開始されると、本発明の方法は、対象における関心対象の生体分子の濃度のモニターを定期的に繰り返してもよい。継続的なアッセイ法から得られる結果を使用して、治療効果を数日から数ヶ月の期間にわたって示してもよい。したがって、本発明の別の態様は、神経性障害または神経変性障害を有する患者を治療するための治療レジメンをモニタリングするための方法に関する。治療前および治療中の関心対象の生体分子の濃度を比較することは、治療の効果を示す。そのため、当業者は、必要に応じて、治療のアプローチを認識し、調整することができる。
本発明の方法は、１つ以上の関心対象の生体分子のインビボ濃度を測定できるように、対象から得られる試料を提供する。ある実施形態では、試料は体液である。適した体液として、限定されないが脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液血漿、血清、尿、唾液、汗、および涙が挙げられる。体液は、典型的に複数の定量可能な生体分子を含むことを理解されたい。例えば、試料がＣＳＦの場合、定量可能な例示的な生体分子として、限定されないがタウ、タウの変異体、アミロイド-βタンパク質、アミロイド-βタンパク質（Ａβ）の変異体、アミロイド-βタンパク質の消化産物、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、α-シヌクレイン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、試料は、中枢神経系（ＣＮＳ）の組織等の組織試料である。試料は、当業者によく知られている標準的な手順を使用して収集される。
ある実施形態では、試料はＣＮＳ試料であり、限定されないが中枢神経系の組織であり、脳の組織および脊髄の組織を含む。本発明のある実施形態では、ＣＮＳ試料は脳の組織から採取してもよく、限定されないが前脳（例えば、大脳皮質、基底核、海馬）、間脳（例えば、視床、視床下部、視床腹部）、中脳（例えば、視蓋、被蓋）、または後脳（例えば、脳橋、小脳、延髄）が挙げられる。別の実施形態では、ＣＮＳ試料は脊髄の組織から採取してもよい。他の実施形態では、複数のＣＮＳ領域のＣＮＳ試料を採取してもよい。したがって、例えば、大脳皮質および海馬の様々なＣＮＳ試料において関心対象の生体分子の濃度を、同時に測定してもよい。
既知の技術によってＣＮＳ試料を得てもよい。例えば、脳の組織または脊髄の組織を解剖または切除によって得てもよい。あるいは、レーザー顕微解剖を使用してＣＮＳ試料を得てもよい。所望のＣＮＳ試料および使用する対象に依存して、対象は、屠殺されてもよいかまたは屠殺されなくてもよい。
通常、試験中の生体分子がペプチドまたはタンパク質であるとき、本発明は、標識された部分の投与を行う前に、第一の試料を採取し、ベースラインを設けてもよい。標識された部分（例えば、標識されたアミノ酸）の投与後に、１つ以上の試料を試料から得る。当業者に理解されるように、試料の数およびいつ試料が採取されるかは通常、分析の種類、投与の種類、関心対象のタンパク質、代謝速度、検出の種類、および対象の種類等の多くの因子に依存する。
ある実施形態では、単一の事前に定められた時点で、例えば、標識化の１時間以内に対象から試料を得る。通常、代謝が速いタンパク質について、標識された部分の投与の開始から最初の１２〜１８時間に採取した試料を使用して、関心対象の生体分子の産生速度を測定し、標識された部分の投与の開始から２４〜３６時間に採取した試料を使用して、関心対象の生体分子のクリアランス速度を測定する。別の実施形態では、０〜１２時間、０〜２４時間、もしくは０〜３６時間の間、１時間毎に対象から試料を得る。さらに別の実施形態では、関心対象の生体分子の産生およびクリアランス速度に依存して、１時間から数日または数週の間隔で試料を採取してもよい。
様々な時点における試料が望ましい場合、複数の対象を使用してもよいことを理解されたい。例えば、１つの対象はベースライン試料のために、別の対象は標識された部分の投与から１時間後の時点のために、また別の対象は標識された部分の投与から６時間後の時点のために使用されてもよい。
したがって、本発明は試料中の標識された生体分子の量および非標識の生体分子の量の検出を用いて、非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を測定してもよく、順番に対象における関心対象の生体分子の濃度を計算してもよい。ある実施形態では、非標識の生体分子に関して、標識された生体分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）の質量の変化を検出するための手段によって、比を測定する。標識された生体分子と非標識の生体分子の間の質量における差を検出する例示的な手段として、限定されないが液体クロマトグラフィー質量分析、ガスクロマトグラフィー質量分析、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析、およびタンデム質量分析が挙げられる。
しかしながら、非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を検出する前に、関心対象の生体分子を、試料中の他の生体分子から単離および／または分離することが望ましい場合もある。そのため、ある実施形態では、免疫沈降を用いて、関心対象の生体分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）を分析する前に、単離および精製してもよい。別の実施形態では、関心対象の生体分子をアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、単離または精製してもよい。あるいは、クロマトグラフィー機構を有する質量分析計を用いて、免疫沈降せずに生体分子を単離し、その後、関心対象の生体分子を直接測定してもよい。例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質を免疫沈降し、その後、エレクトロスプレーイオン化源（ＬＣ-ＥＳＩ-直列型ＭＳ）を備えたタンデムＭＳユニットとインターフェースで接続された液体クロマトグラフィーによって分析してもよい。
別の実施形態では、本発明は同じ試料中の複数の生体分子を同時に測定してもよい。つまり、複数の生体分子について、標識された生体分子と非標識の生体分子の両方の量を、別々にまたは同時に検出および測定してもよい。このように、本発明は、大規模（すなわち、プロテオミクス／メタボロミクス）で、１つ以上の生体分子の濃度、産生、およびクリアランスの変化をスクリーニングするために有用な方法を提供し、根底の病態生理学に関与する生体分子を検出し測定する感度の高い手段を提供する。態様では、本発明は複数の種類の生体分子を測定するための手段も提供する。この文脈では、例えば、タンパク質および脂質を同時にまたは経時的に測定してもよい。
標識されたおよび非標識の生体分子の量が試料において検出されると、非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比または割合を測定してもよい。その後、試料中の非標識の生体分子の濃度を測定することができる。言い換えると、既知量の標識された生体分子を未知量の生体分子に加え、非標識に対する標識の比を測定するため、非標識の生体分子の濃度を、以下のようにその比から計算することができる。
（ｉ）非標識の濃度＝（標識に対する非標識の比）×（標識の濃度）
この等式は以下のように単純化してもよい。
（ｉｉ）非標識の濃度＝（非標識：定量標準物質の比）×（定量標準物質の濃度）
逆に、既知量の非標識を、未知量の標識に加えた場合、標識された濃度を以下のように計算することができる。
（ｉｉｉ）標識の濃度＝（非標識に対する標識の比）×（非標識の濃度）
さらに、既知量の、標識１で標識された生体分子１を、未知量の、標識２で標識された生体分子２に加えた場合、生体分子２の濃度を以下のように計算することができる。
（ｉｖ）標識２の濃度＝（標識１に対する標識２の比）×（標識１の濃度）
同様に、既知量の、標識１で標識された生体分子１を、未知量の、標識２で標識された生体分子２および標識３で標識された生体分子３に加えた場合、生体分子２および生体分子３の濃度を以下のように計算することができる。
（ｖ）標識２の濃度＝（標識１に対する標識２の比）×（標識１の濃度）
（ｖｉ）標識３の濃度＝（標識１に対する標識３の比）×（標識１の濃度）
最後に、既知量の、標識１で標識された生体分子１を、未知量の、標識２で標識された生体分子２、および未知量の非標識の生体分子３に加えた場合、生体分子２および非標識の生体分子の濃度を以下のように計算することができる。
（ｖｉｉ）標識２の濃度＝（標識１に対する標識２の比）×（標識１の濃度）
（ｖｉｉｉ）非標識の濃度＝（標識１に対する非標識の比）×（標識１の濃度）
別の実施形態では、方法は、計算された濃度を、標準曲線によって生成された曲線近似等式に基づく標準曲線に正規化するステップをさらに含む。本明細書に使用される標準曲線は、個々の定量標準物質に対する非標識の生体分子の比を２つ以上測定することによって生成され、非標識の関心対象の生体分子の濃度は既知である。
別の実施形態では、本発明は、標識されたタンパク質および非標識のタンパク質を同時に測定することができ、非標識のタンパク質に対する標識されたタンパク質の比、およびその他の計算を行ってもよい。当業者は、本発明の方法で使用してもよい一次速度式モデルを熟知している。例えば、分画合成速度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒａｔｅ）（ＦＳＲ）を計算してもよい。ＦＳＲは、前駆体富化度（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）で割った非標識のタンパク質に対する標識されたタンパク質の増加の初期速度に等しい。同様に、分画クリアランス速度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅ）（ＦＣＲ）を計算してもよい。さらに、遅延時間および同位体トレーサー定常状態等のその他のパラメータを測定してタンパク質の代謝および生理学の測定値として使用してもよい。また、データに対してモデリングを実施し、複数のコンパートメントモデルを適合させ、コンパートメント間の移動を推定してもよい。勿論、選択された数理モデルは、個々のタンパク質合成およびクリアランスのパラメータに依存する（例えば、１プール、複数プール、定常状態、非定常状態、コンパートメントモデリング等）。「定常状態」は、本明細書に使用するとき、ある特定の時間にわたって、測定値に有意な変化がない間の状態を意味する。
安定同位体動的標識化（ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ）（ＳＩＬＫ）方法は、生きている対象の脳脊髄液において、新たに合成されたタンパク質への安定（非放射性）同位体の代謝取り込みを検出することが示されている。ＳＩＬＫに関する詳細な情報については、米国特許出願公開第２００８／０１４５９４１号および同２００９／０１４２７６６号、ならびに、国際ＰＣＴ公報番号ＷＯ２００６／１０７８１４を参照し、それぞれの全体の内容は参照により本明細書に取り込まれる。ＳＩＬＫは、中枢神経系のタンパク質の産生およびクリアランスを測定することを可能にする。そのため、この方法は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関係するアミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生およびクリアランスを測定するのに使用されている。
しかしながら、これまで、ＳＩＬＫアッセイ法の現行バージョンは、Ａβの１７〜２８ペプチドへの、「標識」（すなわち、自然界で見出されているものと異なる同位体組成を有する原子を含むアミノ酸または生体分子）の取り込みを、アッセイ法が測定するため、全Ａβの代謝しか測定しない。当該アッセイ法はＡβ産生阻害物質の生物学的活性を測定することができるが、タウの代謝を調整するいずれの種類の薬物またはその他の化合物も測定することはできない。このように、Ａβはこの実施形態の一例として提供されるが、本明細書に提供される方法は任意のタンパク質（例えば、タウ）に適用してもよい。
したがって、ある態様では、タウを認識する抗体を使用する免疫沈降によって、タウを生体試料から単離する。この実施形態では、単離されたペプチドは、例えば、ギ酸を使用することによって抗体から溶離され、その後、トリプシンまたは別のプロテアーゼで消化される。Ａβの１７〜２８トリプシン分解断片の定量化に依拠するＳＩＬＫ-Ａβ（商標）アッセイ法の元々のバージョンとは反対に、本発明はアッセイ法に拡大し、タウの濃度を測定する。
用語「抗体」は、本明細書に使用するとき、ポリクロナールまたはモノクロナール抗体の無傷の分子、ならびに、それらの断片、例えば、エピトープ決定基を結合させることのできるＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２、Ｆｖ、およびＳＣＡ断片を含むことを意味する。用語「特異的に結合させる」または「特異的に相互作用する」は、抗体の言及に使用するとき、抗体および特定のエピトープの相互作用は、少なくとも約１×１０-６、一般的に少なくとも約１×１０-７、通常は少なくとも１×１０-８、かつ特に少なくとも約１×１０-９もしくは１×１０-１０またはそれ未満の解離定数を有することを意味する。
したがって、タンパク質の産生は典型的に、経時的な標識された／非標識のタンパク質の増加速度（すなわち、勾配、指数的近似曲線、またはコンパートメントモデルが、タンパク質の産生速度を画定する）に基づく。これらの計算について、タンパク質への標識の取り込みの精確な曲線（すなわち産生速度）を計算するために、最低１つの試料が典型的に必要とされ（ベースライン標識が推定され得る）、２つの試料が好ましく、複数の試料がもっとも好ましい。複数の試料が使用されるまたは好ましい場合、試料を同じ対象から採取する必要はない。例えば、ゼロの時点で５つの異なる対象においてタンパク質が標識され、その後、標識化後の異なる時点で各対象から１つの試料が採取される。
逆に、標識されたアミノ酸の投与を中断した後、非標識のタンパク質に対する標識されたタンパク質の比の減少速度は典型的に、そのタンパク質のクリアランス速度を反映する。これらの計算について、経時的にタンパク質からの標識の減少の精確な曲線を計算するために（すなわちクリアランス速度）、最低１つの試料が典型的に必要とされ（ベースライン標識が推定され得る）、２つの試料が好ましく、複数の試料がより好ましい。複数の試料が使用されるまたは好ましい場合、試料を同じ対象から採取する必要はない。例えば、ゼロの時点で５つの異なる対象においてタンパク質が標識され、その後、標識化後の異なる時点で各対象から１つの試料が採取される。所与の時間におけるＣＮＳ試料中の標識されたタンパク質の量は、産生速度またはクリアランス速度（すなわち除去または破壊）を反映し、通常、対象におけるタンパク質の１時間あたりの割合または質量／時間（例えばｍｇ／時）を表す。
標識された部分を用いた注入の後の様々な時点における標識された生体分子の比を計測するために、安定同位体標識化動態（ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）（ＳＩＬＫ）と組み合わせて、本明細書に示す方法は、新たに合成された生体分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）の絶対濃度および／またはその生体分子の各同位体の絶対濃度を計算することができる。
本発明の方法を使用して、対象における１つ以上の関心対象の生体分子のインビボ濃度を測定することによって、神経性疾患または神経変性疾患の進行を診断またはモニターしてもよい。さらに、本発明の方法を使用して、対象における関心対象の生体分子のインビボ濃度を測定することによって、神経性疾患または神経変性疾患の治療をモニターしてもよい。生体分子の濃度は、増加または減少が疾患の存在または進行を示し得るように、神経性疾患または神経変性疾患と関連していると考えられる。そのため、計算された１つ以上の関心対象の生体分子の濃度を、対応する正常な試料中の同じ生体分子の濃度と、既知の神経性疾患状態もしくは神経変性疾患状態にある対象における同じ生体分子の濃度と、以前の時点で測定された同じ対象由来の同じ生体分子の濃度と、またはそれらの任意の組み合わせと比較してもよい。
さらに、当該方法は、疾患の発病についての素因を有する個体を識別する助けになることができ、実際の臨床症状が現れる前に、疾患を検出するための手段を提供することができる。この種類のより多くの確定診断により、医療従事者がより早く予防対策または積極的治療を採用し、それによって疾患の発病またはさらなる進行を予防することができる。
「対応する正常な試料」とは、本明細書に使用するとき、検査される試料と同じ臓器由来のおよび／または該試料と同じ種類の試料を意味する。ある態様では、対応する正常な試料は、健康な個体から得られた細胞の試料を含む。このような対応する正常な試料は、検査される試料を提供する個体と年齢が適合するおよび／または同じ性別である個体由来であってもよいが、そうである必要はない。別の態様では、対応する正常な試料は、試験を受ける試料が得られる対象の組織の別の健康的な部分から得られる細胞の試料を含む。
既知の神経性疾患状態または神経変性疾患状態の対象における生体分子の濃度への言及は、神経性疾患または神経変性疾患と関連している生体分子の事前に測定された濃度を含む。そのため、この濃度は、単一の個体の試料から得られる生体分子の既知濃度と比較してもよいか、または対象の細胞系と同じ種類の確立された細胞系から得られる濃度と比較してもよい。ある態様では、確立された細胞系は、当該細胞系のパネルの１つであってもよく、パネルは、同じ種類の疾患の様々な細胞系および／または同じ生体分子に関連する異なる疾患の様々な細胞系を含むことができる。このような細胞系のパネルは、例えば、治療を受けている対象からわずかしか細胞を得ることができないときに、この方法を実施するために有用であり得、また、対象の細胞の代用試料を提供し、当該方法を実施する際の対照試料として含めるためにも有用であり得る。
関心対象の生体分子の濃度範囲と関連し得る例示的な神経性疾患または神経変性疾患として、限定されないがアルツハイマー病、ピック病、パーキンソン病、卒中、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、加齢が関連する障害および認知症、多発性硬化症、プリオン病（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症または狂牛病、およびスクレイピー）、レビー小体病、精神分裂病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）またはその他の運動ニューロン疾患、下肢静止不能症候群、てんかんまたは発作性疾患、振戦、抑うつ、躁病、不安障害、頭部外傷または損傷、ナルコレプシー、不眠症またはその他の睡眠障害、自閉症、正常圧水頭症、疼痛障害または症候群、片頭痛、群発性頭痛またはその他の形態の頭痛、脊髄小脳変性症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、網膜色素変性またはその他の形態の網膜変性が挙げられる。本発明の方法が、ＣＮＳの正常生理学、代謝、および機能を試験するために使用してもよいことも想起される。
別の態様では、本発明は、神経性疾患または神経変性疾患の治療に使用される治療物質が、対象における関心対象の生体分子の濃度に影響を及ぼすかどうかを評価するための方法を提供する。例えば、生体分子の濃度を測定して、所与の治療物質が生体分子の濃度を増加または低下させるのかを判定してもよい。ある実施形態では、方法は、本明細書に記述のように、インビボで実施される。別の実施形態では、方法は細胞培地を使用してインビトロで実施され、細胞の培地は本明細書に記載の方法における「対象」である。したがって、本明細書に提供される方法の使用により、当業者は関心対象の生体分子の濃度の変化の程度を精確に測定し、これらの測定値を疾患修飾治療の臨床転帰に相関させることができる。本発明のこの態様からの結果は、したがって、適切な用量および治療薬の投与頻度を決定する助けとなり得、臨床試験の設計に関する意思決定を補助することができ、最終的には、神経性疾患または神経変性疾患の治療のための効果的な治療物質の検証を促進させることができる。
したがって、本発明の方法を使用して、特定の治療物質にどの対象が反応するのかを予測してもよい。例えば、ある特定の生体分子の濃度が高い対象は、特定の治療物質に対して、その生体分子の濃度が低い対象とは異なる応答をする場合がある。とりわけ、方法の結果を使用して、特定の対象についての適切な治療を選択してもよい（例えば、生体分子の産生を遮断する作用物質または生体分子のクリアランスを増加させる作用物質）。同様に、方法の結果を使用して、特定の遺伝子型を有する対象のための治療に適切な治療を選択してもよい。
特定の治療物質にどの対象が反応するかを予測するための方法は、対象に治療物質および標識された部分を投与するステップを含み、標識された部分は、対象において産生されるときの生体分子に取り込まれる。ある実施形態では、標識された部分の投与前に対象に治療物質を投与してもよい。別の実施形態では、治療物質の投与前に対象に標識された部分を投与してもよい。それぞれの投与の間隔は数分、１時間、数時間、または長時間でもあってよい。さらに別の実施形態では、治療物質および標識された部分を同時に投与してもよい。方法は、標識された生体分子および非標識の生体分子を含む少なくとも１つの生体試料を収集するステップ、試料中の標識された生体分子および非標識の生体分子の比を測定するステップ、ならびに、対象における非標識の生体分子の濃度を計算するステップをさらに含む。その後、計算された濃度と対照値の比較によって、（例えば、産生速度またはクリアランス速度を変化させることによって）治療物質が対象における生体分子の濃度を変化させるかどうかを判定されると考えられる。
当業者は、治療を受ける神経性もしくは神経変性の疾患もしくは障害に依存して、および／または代謝が分析される生体分子に依存して、治療物質が異なる可能性があるかまたは異なることを理解する。生体分子がタウである実施形態では、適切な治療物質の非限定的な例として、タウ代謝修飾因子、タウキナーゼ阻害物質、カテプシンＤ阻害物質、およびタウ凝集阻害物質が挙げられる。その他の適切なＡＤ治療物質として、ホルモン、神経保護物質、および細胞死阻害物質が挙げられる。上述の治療物質の多くは、また、神経変性障害に関係するその他のタンパク質のインビボ代謝に影響を及ぼし得る。さらに、シヌクレインのインビボ代謝に影響を及ぼし得る治療物質として、サーチュイン２阻害物質、シヌクレイン凝集阻害物質、プロテアソーム阻害物質が挙げられる。
既知の方法に従い対象に治療物質を投与してもよい。典型的に治療物質は、経口的に投与されるが、非経口または局所等のその他の投与経路も使用してよい。対象に投与される治療物質の量は、物質の種類、対象、および投与の特定の様式に依存して、変動する可能性がありかつ変動すると考えられる。当業者は、用量がＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｏｌｄｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩ、ｐｐ．４７５-４９３、およびｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ' Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅからの手引きで決定してもよいことを理解する。
本明細書に記述の本発明の方法は、高処理方式に適合し得て、したがって、独立して同じであってもまたは異なっていてもよい複数の（すなわち２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上の）試料および／または生体分子を同時に検査することを可能にし得ることが理解されたい。高処理方式は多くの利点をもたらす。例えば、高処理方式は、対象の、２つ、３つ、４つなどの異なる生体分子に関する、検査／定量化を、単独でまたは組み合わせて行うことができる。最終的に、高処理方式は、例えば対照試料（陽性対照およびまたは陰性対照）が試験試料と同時に行われることを可能にする。さらに、高処理方法は、複数の抗体を使用して同時に複数のタンパク質の免疫沈降を可能にし得る。
別の態様では、本発明は本発明の方法を実施するためのキットを提供する。ある実施形態では、キットは対象における神経性疾患または神経変性疾患の進行または治療を診断および／またはモニタリングするために提供される。キットは、１つ以上の標識された部分（例えば、標識されたアミノ酸）、および対象に１つ以上のアミノ酸を投与するための手段を含む。キットはさらに、対象から一定の時間間隔で生体試料を得るための手段を含む。ある実施形態では、キットは、経時的に、非標識の関心対象の生体分子に対する標識された関心対象の生体分子の比を検出および測定するため、および非標識の生体分子の濃度を計算するための説明書を含む。ある実施形態では、説明書は、計算された濃度を本明細書で開示される標準物質および／または対照と比較するための方法を開示する。
別の実施形態では、本発明のキットは、標識された部分を含む１つ以上の容器を含む区画化されたキャリアー、および本発明の方法を実施するための様々な手段を提供する。
以下の実施例は、本発明の利点および特徴をさらに説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。以下の実施例は、使用してもよい典型的なものであるが、当業者に公知であるその他の手順、方法、または技術が代替的に使用されてもよい。
実施例１
タウの代謝標識法
この実施例は、タウを産生する細胞が、安定同位体で標識したアミノ酸を、新たに合成されたタウに代謝的に取り込むことを説明する。
本発明者らは、細胞を正常な培地においてほぼコンフルエントになるまで増殖させた。本発明者らは、その後、新鮮な培地を加え、細胞を培地に２４時間慣らした。その後、本発明者らは、標識されたロイシンに対する非標識のロイシンの最終比が１：１になるまで培地に１３Ｃ６ロイシンをスパイクした。１３Ｃ６ロイシン添加後に、様々な時点で培地を収集し、タウを培地から単離し、標準的なＩＰ／ＭＳプロトコールを使用して分析した。非標識のタウに対する標識されたタウの比を時間に対してプロットした。
このことは１３Ｃ６ロイシンを使用してタウを代謝的に標識することができることを表している。ＳＩＬＫ-タウに実現可能性があることと、ＳＩＳＡＱ定量ペプチドを細胞において作製することができることとを示している。
実施例２
ＳＩＳＡＱによるタウの定量化
１３Ｃ６ロイシンで標識したタウを定量標準物質として使用し、５ｎｇ／ｍＬ〜５１ｐｇ／ｍＬの濃度のタウを含む、標準曲線の試料にスパイクした。その他に、定量標準物質を２つの別の個体由来のＣＳＦにスパイクした。タウを、免疫沈降を使用して試料から単離し、その後、トリプシンで消化し、質量分析によって分析した。定量標準物質に対する非標識のタウの比を全サンプルについて計算し、標準曲線を生成した。標準曲線は、試験した範囲内（５ｎｇ／ｍＬ〜５１ｐｇ／ｍＬ）では直線的であり、ＣＳＦ試料中のタウの濃度を計算するために使用した。ＣＳＦ試料中のタウの濃度は約１．２ｎｇ／ｍＬであり、タウ濃度の三つ組の測定値のＣＶは、１つのＣＳＦ試料では４％、他のＣＳＦ試料では７％であった。
このことは、安定同位体で標識したタウを定量標準物質として使用できることと、標識されたタウに対する非標識のタウの比が、未知試料におけるタウ濃度を測定できる標準曲線に関連していることとを示している。
本発明は上述の実施例を参照して記述しているが、修正例および変形例が本発明の精神および範囲に含まれることを理解されたい。したがって、本発明は添付の請求項によってしか限定されない。

Claims (92)

  1. 以下のステップを含む、対象における生体分子の濃度を計算する方法：
    （ａ）該対象由来の試料を、標識された既知濃度の関心対象の生体分子で構成される定量標準物質に接触させるステップ；
    （ｂ）該試料から該関心対象の生体分子を単離するステップであって、（ａ）および（ｂ）が逆順に行われてもよい、ステップ；
    （ｃ）該試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を測定するステップ；ならびに
    （ｄ）該試料中の該非標識の生体分子の濃度を計算するステップ。
  2. 前記非標識の生体分子の濃度を計算するステップが、前記定量標準物質の前記既知濃度に、前記試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を掛けることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 計算された前記濃度を標準曲線に正規化するステップをさらに含み、該標準曲線が、定量標準物質に対する非標識の比を２つ以上測定することによって生成され、前記非標識の生体分子の濃度が既知である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記定量標準物質が、１つ以上の標識された部分を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記１つ以上の標識された部分が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、および３６Ｓから成る群から選択される非放射性同位体を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記生体分子が、ペプチド、脂質、核酸、および炭水化物から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記生体分子が、中枢神経系（ＣＮＳ）で合成されるタンパク質である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ペプチドが、タウ、アミロイド-β（Ａβ）、α-シヌクレイン、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α-２-マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、ＴＤＰ-４３、スーパーオキシドジスムターゼ１、ハンチンチン、インターロイキン、およびＴＮＦから成る群から選択されるタンパク質である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記標識された部分が、標識されたアミノ酸である、請求項４に記載の方法。
  10. 前記アミノ酸が必須アミノ酸または非必須アミノ酸である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記必須アミノ酸または前記非必須アミノ酸が、スレオニン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記標識された部分が、ｘ＝１〜４である１３Ｃｘ-スレオニンである、請求項４に記載の方法。
  13. 前記標識された部分が、ｘ＝１〜５である１３Ｃｘ-グルタミン酸である、請求項４に記載の方法。
  14. 前記標識された部分が、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘ-ロイシンである、請求項４に記載の方法。
  15. 前記標識された部分が１５Ｎで標識されたアミノ酸である、請求項４に記載の方法。
  16. 前記標識された部分が、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたフェニルアラニンである、請求項４に記載の方法。
  17. 前記標識された部分が、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンである、請求項４に記載の方法。
  18. 前記標識された部分が、ｘ＝１〜６およびｙ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンおよび１３Ｃｙで標識されたフェニルアラニンである、請求項４に記載の方法。
  19. 前記試料を２つ以上の定量標準物質に接触させ、かつ、非標識の２つ以上の前記生体分子の濃度を計算する、請求項１に記載の方法。
  20. 前記２つ以上の生体分子が、同じタンパク質のアイソフォームである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記生体分子が、タウ-４Ｒ２Ｎ、タウ-４Ｒ１Ｎ、タウ-４Ｒ０Ｎ、タウ-３Ｒ２Ｎ、タウ-３Ｒ１Ｎ、タウ-３Ｒ０Ｎから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  22. 前記生体分子が、翻訳後修飾されたタウから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  23. 前記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿、唾液、涙、および生物組織から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
  24. 前記試料が、ＣＳＦであり、かつ、アミロイド-βタンパク質、アミロイド-βタンパク質の変異体、アミロイド-βタンパク質の消化産物、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、タウ、α-シヌクレイン、α-２-マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、ＴＤＰ-４３、スーパーオキシドジスムターゼ１、ハンチンチン、インターロイキン、ＴＮＦ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 質量分析、タンデム質量分析、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される手段によって、前記試料中の前記非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を検出する、請求項１に記載の方法。
  26. 前記生体分子が、ペプチドであり、かつ、前記比を測定する前にエンドプロテアーゼで消化される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記エンドプロテアーゼがトリプシン、ＬｙｓＮ、またはＶ８プロテアーゼである、請求項２６に記載の方法。
  28. 消化された前記ペプチドが、前記比を測定する前にクロマトグラフィー分離によって分離される、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記クロマトグラフィー分離が液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記生体分子が免疫沈降によって単離される、請求項１に記載の方法。
  31. 非標識の前記関心対象の生体分子の濃度を、対応する正常な試料中の同じ生体分子の濃度と、既知の神経性疾患状態もしくは神経変性疾患状態の対象における同じ生体分子の濃度と、以前の時点で測定された同じ対象由来の同じ生体分子の濃度と、またはそれらの任意の組み合わせと比較するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  32. 前記神経性疾患または前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、加齢が関連する障害および認知症、多発性硬化症、プリオン病、レビー小体病、ならびに筋萎縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  33. 以下のステップを含む、対象における１つ以上の生体分子の濃度を定量化するインビボ方法：
    （ａ）該対象における関心対象の生体分子に取り込まれる１つ以上の標識されたアミノ酸を、該対象に投与するステップ；
    （ｂ）該対象から体液または生物組織の試料を得るステップであって、該試料が、標識された生体分子の画分および非標識の生体分子の画分を含む、ステップ；
    （ｃ）該試料を定量標準物質と接触させるステップであって、該対象に投与された該１つ以上の標識されたアミノ酸とは異なる分子量を有する部分で標識された、既知濃度の生体分子で、該定量標準物質が構成される、ステップ；
    （ｄ）該試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比、該定量標準物質に対する標識された生体分子の比、および該定量標準物質に対する非標識の生体分子の比を測定するステップ；ならびに
    （ｅ）該試料中の該非標識の生体分子の濃度および該標識された生体分子の濃度を計算するステップ。
  34. 前記非標識の生体分子の濃度を計算するステップが、前記定量標準物質の濃度に、該定量標準物質に対する非標識の生体分子の測定された前記比を掛けることを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記標識された生体分子の濃度を計算するステップが、前記定量標準物質の濃度に、該定量標準物質に対する標識された生体分子の測定された前記比を掛けることを含む、請求項３３に記載の方法。
  36. 非標識の生体分子の計算された前記濃度を非標識の標準曲線に正規化するステップ、および、標識された生体分子の計算された前記濃度を標識された標準曲線に正規化するステップをさらに含み、該標準曲線のそれぞれが、定量標準物質に対する非標識の生体分子または標識された生体分子の比を２つ以上測定することによって生成され、非標識の生体分子または標識された生体分子の該濃度が既知である、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記標識されたアミノ酸および前記定量標準物質が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、および３６Ｓから成る群から選択される非放射性同位体で独立して標識されている、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記標識されたアミノ酸が必須アミノ酸または非必須アミノ酸である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記必須アミノ酸または前記非必須アミノ酸が、スレオニン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンから成る群から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記標識されたアミノ酸または前記定量標準物質が、ｘ＝１〜４である１３Ｃｘ-スレオニンを含む、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記標識されたアミノ酸または前記定量標準物質が、ｘ＝１〜５である１３Ｃｘ-グルタミン酸を含む、請求項３７に記載の方法。
  42. 前記標識されたアミノ酸または前記定量標準物質が、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘ-ロイシンを含む、請求項３７に記載の方法。
  43. 前記標識されたアミノ酸または前記定量標準物質が、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘ-イソロイシンを含むか、または、ｘ＝１〜６およびｙ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンおよび１３Ｃｙで標識されたフェニルアラニンを含む、請求項３７に記載の方法。
  44. 前記標識されたアミノ酸または前記定量標準物質が、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘ-フェニルアラニンを含む、請求項３７に記載の方法。
  45. 前記定量標準物質が１５Ｎを含む、請求項３７に記載の方法。
  46. 前記標識されたアミノ酸が経口的、静脈内、筋肉内、または皮下に投与される、請求項３３に記載の方法。
  47. 前記標識されたアミノ酸が単回経口用量として投与される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記標識されたアミノ酸が６〜１２時間の間、１時間毎に投与される、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記標識されたアミノ酸が９〜１２時間の間、１時間毎に投与される、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記生体分子が、ペプチド、脂質、核酸、および炭水化物から成る群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  51. 前記生体分子が、中枢神経系（ＣＮＳ）で合成されるペプチドである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ペプチドが、アミロイド-β（Ａβ）、α-シヌクレイン、タウ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α-２-マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、ＴＤＰ-４３、スーパーオキシドジスムターゼ１、ハンチンチン、インターロイキン、およびＴＮＦから成る群から選択されるタンパク質である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ペプチドがタウであり、かつ、前記定量標準物質が１５Ｎで標識されたアミノ酸を含む、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記ペプチドがタウであり、かつ、前記定量標準物質が、ｘ＝１〜４である１３Ｃｘ-スレオニンを含む、請求項５０に記載の方法。
  55. 前記ペプチドがタウであり、かつ、前記定量標準物質が、ｘ＝１〜５である１３Ｃｘ-グルタミン酸を含む、請求項５０に記載の方法。
  56. 前記ペプチドがタウであり、かつ、前記定量標準物質が、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘ-ロイシンを含む、請求項５０に記載の方法。
  57. 前記ペプチドがタウであり、かつ、前記定量標準物質が、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたフェニルアラニンを含む、請求項５０に記載の方法。
  58. 前記ペプチドがタウであり、かつ、前記定量標準物質が、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンを含む、請求項５０に記載の方法。
  59. 前記ペプチドがタウであり、かつ、前記定量標準物質が、ｘ＝１〜６およびｙ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンと１３Ｃｙで標識されたフェニルアラニンの両方を含む、請求項５０に記載の方法。
  60. 前記生体分子がタウであり、前記標識されたアミノ酸が１３Ｃ６ロイシンであり、かつ、前記定量標準物質が１３Ｃ６で標識されたイソロイシンと１３Ｃ６で標識されたフェニルアラニンの両方を含む、請求項５０に記載の方法。
  61. ２つ以上の標識されたアミノ酸の既知濃度を前記対象に投与し、かつ、１つ以上の生体分子の前記濃度を計算する、請求項３３に記載の方法。
  62. １つ以上の標識されたアミノ酸の既知濃度を前記対象に投与し、かつ、２つ以上の生体分子の前記濃度を計算する、請求項３３に記載の方法。
  63. 前記２つ以上の生体分子が、同じタンパク質のアイソフォームである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記生体分子が、タウ-４Ｒ２Ｎ、タウ-４Ｒ１Ｎ、タウ-４Ｒ０Ｎ、タウ-３Ｒ２Ｎ、タウ-３Ｒ１Ｎ、タウ-３Ｒ０Ｎから成る群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記生体分子が、翻訳後修飾されたタウから成る群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿、唾液、および涙から成る群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  67. 前記試料が、ＣＳＦであり、かつ、アミロイド-βタンパク質、アミロイド-βタンパク質の変異体、アミロイド-βタンパク質の消化産物、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、タウ、α-シヌクレイン、α-２-マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、ＴＤＰ-４３、スーパーオキシドジスムターゼ１、ハンチンチン、インターロイキン、ＴＮＦ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 単一の事前に決められた時点で前記試料を得る、請求項６６に記載の方法。
  69. ０〜１２時間、０〜２４時間、または０〜３６時間の間、１時間毎に前記対象から前記試料を得る、請求項６６に記載の方法。
  70. 質量分析、タンデム質量分析、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される手段によって、前記試料中の前記非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を検出する、請求項３３に記載の方法。
  71. 前記生体分子が、ペプチドであり、かつ、前記比を測定する前にエンドプロテアーゼで消化される、請求項３３に記載の方法。
  72. 前記エンドプロテアーゼがトリプシンまたはＶ８プロテアーゼである、請求項７１に記載の方法。
  73. 消化された前記ペプチドが、前記比を測定する前にクロマトグラフィー分離によって分離される、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記クロマトグラフィー分離が液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーを含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記試料から前記関心対象の生体分子を単離するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  76. 前記関心対象の生体分子を免疫沈降によって単離する、請求項７５に記載の方法。
  77. 非標識の前記関心対象の生体分子の濃度を、対応する正常な試料中の同じ生体分子の濃度と、既知の神経性疾患状態もしくは神経変性疾患状態の対象における同じ生体分子の濃度と、以前の時点で測定された同じ対象由来の同じ生体分子の濃度と、またはそれらの任意の組み合わせと比較するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  78. 前記神経性疾患または前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、加齢が関連する障害および認知症、多発性硬化症、プリオン病、レビー小体病、ならびに筋萎縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項７７に記載の方法。
  79. 対象における神経性疾患または神経変性疾患の進行または治療を診断またはモニタリングするためのキットであって、
    （ａ）１つ以上の標識されたアミノ酸；
    （ｂ）該１つ以上の標識されたアミノ酸を該対象に投与するための手段であって、それによって、該標識されたアミノ酸が、該対象における関心対象の生体分子に取り込まれ、かつ該生体分子を標識することができる、手段；
    （ｃ）一定の時間間隔で、該対象から生物試料を得るための手段であって、該試料が、標識された生体分子の画分および非標識の生体分子の画分を含む、手段；
    （ｄ）非標識の関心対象の生体分子に対する標識された生体分子の比を経時的に検出および測定するため、ならびに該試料中の該非標識の生体分子の濃度を計算するための説明書であって、それによって、該非標識の生体分子の濃度を、対応する正常な試料中の同じ生体分子の濃度と、既知の神経性疾患状態もしくは神経変性疾患状態の対象における同じ生体分子の濃度と、以前の時点で測定された同じ対象由来の同じ生体分子の濃度と、またはそれらの任意の組み合わせと比較することができる、説明書
    を含む、キット。
  80. 前記標識されたアミノ酸が必須アミノ酸または非必須アミノ酸である、請求項７９に記載のキット。
  81. 前記必須アミノ酸または前記非必須アミノ酸が、スレオニン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンから成る群から選択される、請求項８０に記載のキット。
  82. 前記標識されたアミノ酸が非放射性原子を含む、請求項７９に記載のキット。
  83. 前記非放射性原子が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、および３６Ｓから成る群から選択される、請求項８２に記載のキット。
  84. 前記生体分子が、ペプチド、脂質、核酸、および炭水化物から成る群から選択される、請求項７９に記載のキット。
  85. 前記生体分子が、中枢神経系（ＣＮＳ）で合成されるペプチドである、請求項８４に記載のキット。
  86. 前記ペプチドが、アミロイド-β（Ａβ）、α-シヌクレイン、タウ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α-２-マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、ＴＤＰ-４３、スーパーオキシドジスムターゼ１、ハンチンチン、インターロイキン、およびＴＮＦから成る群から選択されるタンパク質である、請求項８５に記載のキット。
  87. １つ以上の追加の標識されたアミノ酸を前記対象に投与するための手段、ならびに、１つ以上の追加の生体分子の比および１つ以上の追加の生体分子の濃度を測定するための説明書をさらに含む、請求項７９に記載のキット。
  88. 前記１つ以上の追加の生体分子が、同じタンパク質のアイソフォームである、請求項８７に記載のキット。
  89. 前記試料中の前記非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比を、質量分析、タンデム質量分析、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される手段によって検出される標識および非標識の生体分子の量から測定する、請求項７９に記載のキット。
  90. 前記神経性疾患または前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、加齢が関連する障害および認知症、多発性硬化症、プリオン病、レビー小体病、ならびに筋萎縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項７９に記載のキット。
  91. 前記タウタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１から成る群から選択される、請求項８６に記載のキット。
  92. 前記タウタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１から成る群から選択される、請求項８、２４、５２、および６７のいずれか一項に記載の方法。
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