一种蛋白质组分析方法
技术领域
本发明涉及用于功能性蛋白质组的方法学,技术以及装置,它们能够用来集合发现和集合定量膜蛋白及其配体,以及分析其功能(相互作用)。本发明也涉及使用膜蛋白及其配体作为指标对疾病进行药理蛋白质组分析的新方法,所述方法包括发现,分离,鉴别以及定量膜蛋白及其配体(所述膜蛋白及其配体参与具体疾病的发作、恶化以及治愈),阐明其功能并建立其类型和定量数值的数据库,本发明还涉及数据库本身。本发明进一步涉及每种生物体膜蛋白库的建立方法,并且还涉及膜蛋白的分离方法(所述方法能保持蛋白的结构和功能,并且是膜蛋白所必需的研究),鉴定方法,定量方法,以及阐明膜蛋白功能必须的其他基本方法。
背景技术
随着药物发现基础研究,包括分子生物学和基因组学(基因组科学)的发展,这些年的药物发现变化迅速,并且药物发现的新方法,以基因组药物发现为代表,正得到发展。
新药的发现取决于在某种(些)疾病中具有特殊生理活性物质的发现。这些具有生理活性的物质大部分是蛋白,并且阐明蛋白的结构和功能是医学发展中的基本问题。
对维持生命过程所必需的活动而言,从受精到发育、分化、生长,代谢直到死亡,包埋在膜中的蛋白执行重要的功能。这些膜蛋白作为膜受体执行将细胞外信息传递到细胞内的功能,作为生理物质的特定的膜运载蛋白从细胞内到细胞外,反之亦然,并且作为膜内层蛋白支持物动态的膜结构。纯化,分离以及功能分析的难度已经延误了膜相关蛋白的研究。
因为蛋白的功能(生理作用)不能从基因组测定的核酸序列预测出来,关联遗传信息与新药研究的方法建立是后基因组急待解决的问题。引起关注的一个方面是蛋白质组(蛋白质科学)。蛋白质组目标在于所有的超过100,000种蛋白的分离、鉴定以及功能分类。事实情况是,如何关联基因组信息与理解蛋白功能是21世纪药物发现的战略目标。
蛋白分子结构及其与生命活动有关的功能的高度多样性总体上与DNA分子的多样性无可比拟。从这种意义上讲,将通过只将DNA测序方法应用于结构上类似的24种人类染色体就取得成功基因组的策略,直接地应用于蛋白质组,来处理具有丰富多样性的研究对象是不切实际的。单凭DNA序列,预测生物活性是不可能的。因此,需要能阐明蛋白功能的蛋白质组。
分子结构与分子活性之间的关系是生物学的基本问题。结构-活性关系对理解任何生物学反应非常关键,例如酶功能,细胞间通讯的方法,以及细胞调节和反馈体系。
蛋白对生命现象非常重要,并通过与其他分子包括蛋白分子,DNA分子,合成的化合物或光子等等相互作用而发挥功能。对特定蛋白的理解超出了对该分子的物理或化学性质的单纯叙述。它包括通过鉴别出互相影响的分子并阐明相互作用(生理作用),来发现与何种分子发生怎样的相互作用。
已知的与其他分子相互作用和结合的某些种类大分子,具有高度特异性的三维分布和电子分布。具有所述特异性的任何大分子被认为是受体,无论它是催化代谢中间体水解的酶,介导离子膜转运的细胞表面蛋白,用于从相邻细胞的群体中鉴别特定细胞的糖蛋白,在血浆中循环的IgG抗体,核DNA的寡核苷酸序列或其他。与受体选择性结合的多种分子公知为配体。
约有一半的现有药品是通过细胞膜上受体发挥作用。因此,新膜蛋白及其生理配体的阐明为多种疾病的新治疗剂的开发提供了革命性的筛选体系。并且,建立疾病关联的新的和已知膜蛋白和配体的数据库能够阐明疾病中分子动力学,这是药理基因组学不能完成的,并且预期可以导致开发出新的诊断方法以及新治疗剂。
已有许多方法用来发现未知的受体与配体,但是从常规的思想,方法以及实验得到的受体或配体数目有时被其特征所限制。由多种肽组成的复合型受体的发现与多种仍然难以解决的问题相关。可以用新技术发现新受体与配体,例如X射线晶体衍射或基因重组技术。但是,这些新方法依赖于偶发巧合事件,并且需要较长时间的生物化学研究,或只适用于极为有限的分子种类。
考虑到上述的情况,对作为蛋白质组的目标的膜蛋白例如膜受体以及膜运载蛋白进行研究,以阐明部分生理功能(即鉴定生理配体)就非常重要。
常规的蛋白质组研究单纯依赖双向电泳方法作为分离蛋白的工具。但是,目前的方法当用来分析细胞总蛋白的时候,有下述5个方面的问题。
首先,当整个生物学样品在单块胶上进行电泳的时候,分析本身因为蛋白高分子量和不溶性膜蛋白保留在起点没有迁移而失败。因此,常规的双向电泳不能用来分析细胞中表达的总蛋白,但已经用来进行特定蛋白(主要是可溶的低分子量蛋白)的分析。20世纪的生物学由于分子生物学技术的发展取得了显著的进展,但大多数目标蛋白是水溶性蛋白。早期的蛋白质组研究揭示了血浆中检测到的蛋白总数约为200,细胞匀浆中的蛋白数为1400-4000。约30000种编码人蛋白的基因表达的总蛋白数,预计超过100,000种。这就意味着即使用最灵敏的蛋白质组技术,也只能检测到百分之几的总蛋白。
任何生命现象可以解释为蛋白的一种功能,其中生命是通过分裂自身和非自身以及膜而诞生。识别外界的非自身并使自身作出反应的任务是由膜蛋白来执行的。然而,许多用目前蛋白质组技术无法检测到的蛋白都是在生命活动中发挥重要作用的膜蛋白,它们通过与膜关联或包埋在膜中而表现出功能。
第二,由多种蛋白质组成并在细胞中发挥独特功能的蛋白复合物并不能够分析体内存在的结构(蛋白的四级结构)和实际功能,因为蛋白之间基于疏水相互作用的结合当在包含洗涤剂的缓冲液中进行电泳时,就会解离。
第三,还没有对包含在生物学样品中总蛋白进行分组的有效的思想、方法或技术。从约为30,000的人基因表达的总蛋白总数超过100,000。它们从同一基因转录后发生剪接,因此产生的蛋白与其他蛋白相比,具有稍短肽链的蛋白,也常在翻译后被糖、脂质、磷酸基等修饰。导致的结果是,蛋白(蛋白质组的目标),由远复杂于DNA聚合分子(基因组目标)的分子集合组成。基于这些事实,就建立了一种假设:基于唯一目的(测定核酸序列)的唯一方法学(核酸序列测定)不能阐明蛋白质组多样化的结构和功能。因此基于某种思想在蛋白质组分析之前将生物样品中的蛋白进行分组就显得非常重要,迄今为止,已经有一些在预处理方面的尝试。例如,Molly等[Eur.J.Biochem.267,2871-2881(2000)]和Santoni等[Electrophoresis,21,1054-1070(2000)]用强增溶剂预处理样品,但是未能溶解所有的蛋白。Herbert等[Electrophoresis21,3639-3648(2000)]和Zuo等[Anal.Biochem.284,266-278(2000)]通过依据其等电点进行分离来预处理样品,但是对目标蛋白而言,设置合适的等电点范围非常困难,并且要避免等电聚焦。应该注意的是这些尝试着眼于电泳方法的部分改良,并不是着眼于本发明实现的通过对总蛋白质组分组进行总蛋白质组分析。但是,迄今为止,由于没有提出有效的分组思想,从样品的制备到后续的分析使用的是同样的方法,没有对样品进行分组。这种情况也使得蛋白质组研究遭遇上述两个问题。
第四,在常规的蛋白质组研究中,在进行MS分析之前,需要将凝胶切割成小片段并使用特殊的溶液从每一段中提取蛋白的耗时、多步骤复杂操作。所述方法的复杂操作不能实现装置的微型化、检测时间的缩短、多样品的处理、或整套装置的自动化。
第5个问题是存在很多种类的所谓″低丰度蛋白″。仅100种基因就编码着占酵母中所有蛋白的50重量百分比的蛋白,这意味着数千种基因的产物占另外的50%的蛋白。许多最重要的蛋白,例如调节蛋白或信号转导相关蛋白包括受体都包括在″低丰度蛋白″之中,因此目前的基于电泳的蛋白质组分析方法不能用来分析它们。
为了解决电泳的这些制约性能力并阐明蛋白-蛋白相互作用,已经进行了很多尝试,例如ICAT(同位素编码的亲和性标记物)方法[Gygi等Nat.Biotech.10,994-999(1999)],酵母双杂交体系,BIA-MS-MS,蛋白阵列方法(溶液或芯片)[Zhou等TRENDS in Biotechnology 19,S34-S39]或LC-MS-MS的肽混合。但是,这些新方法和技术不能实现总蛋白质组的表达分析,相互作用分析以及网络分析,而这些是蛋白质组的最终目标。即使蛋白阵列方法,上述方法中最有希望的方法,包括固相蛋白阵列方法(芯片方法)[Fung等Curr.Opin.Biotechnol.12,65-69(2001)]和液相蛋白阵列方法(例如,荧光编码微珠[Fulton等Clin.Chem.43,1749-1756(1997)][Han等Nat.Bioptechnol.(in press)]也不能实现2种最重要的基本技术即,总蛋白质组纯化和分离以及总蛋白质组选择性固定到支持物上。
因此本发明目标是提供了一种用来解决目前蛋白质组研究面临的问题的思想、方法以及技术,因此第一次使膜蛋白的蛋白质组研究成为可能,所述膜蛋白的蛋白质组已经被认为是所有蛋白中对生物学功能和疾病的阐明至关重要的部分,但由于纯化和分离时保持其功能的极大难度使其在研究中远远落后。更特定地,本发明着眼于膜蛋白的蛋白质组研究并着眼于膜蛋白的完整分离,建立膜蛋白库,其中膜蛋白保持其天然的结构和功能,并以与其配体(即,发现和鉴别膜蛋白的天然的效应分子,或配体)相互作用的观点来解释膜蛋白功能,并为了这种目标,提供了一种进行任何膜蛋白分析的基本思想、方法、技术以及装置。更进一步,本发明着眼于汇集因此得到的膜蛋白及其生理配体的信息作为数据库,用来阐明其涉及的疾病机理,并进一步打开了建立所述疾病新诊断方法和开发新治疗剂的窗口。
发明概述
本发明提供了一种本领域不曾有人建议的基本思想,该思想提出将组成机体的总蛋白分组成膜蛋白和其他水溶性蛋白以进行膜蛋白的蛋白质组研究。本发明基于这种分组思想,注意了蛋白发挥其功能的天然局部位点。
所述的分组的领悟和采用[其中只有水溶性蛋白进行电泳而膜蛋白用新方法进行分析(即,膜蛋白包埋于人工脂质体,模拟细胞膜脂质双层并建立膜蛋白库)]解决了通过电泳分析膜蛋白的困难,并通过分析总蛋白(膜蛋白与水溶性蛋白)、利用分组后对水溶性蛋白的生物学亲和力建立了膜蛋白功能(与水溶性蛋白相互作用)分析的基本原理。这种基本技术也可以用于筛选分析膜蛋白-膜蛋白或水溶性蛋白-水溶性蛋白相互作用,为未来的蛋白质组研究提供了创新的理论。
更特定地,本发明提供了蛋白质组分析方法,以及多种装置,所述方法的特征在于将体内总蛋白分组成膜蛋白和水溶性蛋白,并且基于膜蛋白与配体之间的生物学亲和力集合地分析膜蛋白及其配体。所述方法包括下述步骤:
(1)从生物学样品中分离出水溶性蛋白级分,通过凝胶电泳分离该级分中的水溶性蛋白,将电泳后的凝胶与配体支持物接触,该配体支持物具有固定了保持生理功能的蛋白的表面,并将凝胶中水溶性蛋白转移到配体支持物上;
(2)从细胞样品中分离膜级分,并将膜级分与脂质体融合以制备膜蛋白库(一组包埋于脂质体的膜蛋白),其中所有的膜蛋白附加到或穿透进入脂质双层;
(3)将固定在配体支持物上的水溶性蛋白与膜蛋白库接触,以捕获对配体支持物上的水溶性蛋白有亲和力的膜蛋白;并且
(4)用能分析这些蛋白的至少一种物理或化学性质的方法来分析膜蛋白和/或具有亲和力的水溶性蛋白。
优选地,能分析蛋白至少一种物理或化学性质的所述方法为质谱分析,因此,合适的配体支持物为质谱板。
本发明具体地按照下述解决问题。
膜蛋白的二级,三级以及四级结构以及生理功能能够被保持,因为膜蛋白转移到人工脂质体膜中,该人工脂质体膜保持了疏水区和亲水区的生物学条件,没有使用蛋白变性剂,蛋白增溶剂或任何其他偏离膜蛋白生理条件的处理方法。至于受体,任何生物膜型受体,包括GPI型,GPCR型,以及寡聚型受体的任何结构和功能,都能够保留。因此,能够制备出每一种膜蛋白同时保持其结构和功能,从而解决了生物学领域包括医学和农业中膜蛋白研究的困难。
因为只有包含配体的水溶性蛋白用电泳进行分离,任何水溶性蛋白的分析可以不受水溶性蛋白中污染引起的多种干扰。
单向或双向电泳分离的水溶性蛋白可以直接地印迹在质谱板上,因此显著缩短操作时间,通过增加转移到质谱板上的蛋白量从而能够检测低丰度蛋白,使分析装置缩小和自动化,并且增加了待处理样品的数目。
将已经转移膜蛋白的脂质体与固定在支持物上的多种配体接触,以利用生物学亲和力进行纯化,可以分离出高度纯化的目标膜蛋白-配体复合物。
按照本发明,可以检测膜蛋白分子和配体(包含竞争剂)间的纯粹(pure)相互作用,不用考虑两种分子是否为高度纯化的或是否与许多其他物质共存,也没有细胞内信号递质或转录调节剂的影响。换言之,基于细胞应答的相互作用的检测方法遗漏了未经确正配体的生理作用部分,无论它是膜蛋白,细胞内信号递质或转录调节剂,或不同的作用点。相反,本发明能单独检测膜蛋白和配体间的相互作用。
在质谱分析板上纯化膜蛋白-配体复合物导致可以通过质谱仪进行这两者的综合检测。
膜蛋白-配体复合物的形成与检测可以阐明膜蛋白的功能(与配体相互作用)。
本发明也提供了一种鉴别在某种疾病中表现出数量或特定性质变化的膜蛋白和/或其配体的方法,所述方法包括利用取自患某种疾病的生物体(包括人,植物,动物以及所有其他的生物体)的样品用上述方法分析蛋白质组,并将得到的分析数据与健康的同种生物体数据进行比较。当这种方法用于多种疾病并将得到的数据汇集起来,就能建立用于诊断的数据库。如此一来,通过发现疾病-特异性膜蛋白及其配体,将定量数据输入数据库,并将数据与健康的同种生物体的数据进行比较,就可以产生基于二进位膜蛋白和配体的药理蛋白质组学的疾病诊断形式。
药理基因组学受到病人的遗传因素分析或静态病因学的限制。药理基因组学的分析结果通常与病人的疾病并不直接地相关,因此,不能提供发生了动态改变并且引起疾病的蛋白的信息。相反,药理蛋白质学组直接教导控制生物学反应的蛋白的动力学,并且通过蛋白的变化动态地显示病人的当前疾病状态。
药理基因组信息的收集与关于病人的遗传因素的个人信息相冲突,对个体、种族和民族而言有时候会成为难以解决的伦理问题。但是,由于药理蛋白质组信息涉及病人疾病原因的澄清,并以通常医院中进行的检测和诊断相同的方式收集,不存在涉及21世纪生物科学观点与伦理观点之间的斗争。
由于可以综合分析膜蛋白和配体的二进位数据,当疾病是由于经膜蛋白的信号转导缺陷引起时,如果疾病是由膜蛋白和/或配体的数量和特性的变化引起的,则可以立即诊断出疾病的原因。
一旦本发明的上述构成在全自动装置中实现,一个革命性的应用工业领域将会诞生。实例之一是一种全自动膜蛋白-配体蛋白质组分析体系,其组成示意性地显示在图1中。不用说,完全可以按照膜蛋白的研究目的,基于本发明组装出多种其他装置。
本发明可用于发现、鉴定以及分析所有其他类型的受体(GPI型,寡聚型)及其配体,它们几乎不能通过研究与从基因组序列通过同源性搜寻预测的G蛋白偶联受体(GPCR)有关的孤儿配体而发现,也不能使用计算机以及基于同源性的基因组序列预测到。
而且,本发明被认为有利于发现,鉴定和分析所有目前仍然极其困难的膜蛋白(除受体外的膜蛋白),从而能够发展所谓的″膜蛋白相关药物发现型″医学包括所谓的″受体相关药物发现型″医学,其目的在于疾病的分析,诊断试剂以及诊断方法的开发以及治疗剂的开发,其中涉及到所有的膜蛋白和配体。
本发明将划时代的方法学引进膜蛋白的研究(后者一直是生物学研究历史中最艰难的部分),其不仅将有利于医疗保健也将成为生物体新功能发现和应用以及其应用的新产业的推动力量,其目的在于解决最为关心的食品和环境问题,后者为21世纪初期的全球问题。
这些以及本发明的其他目标和优点,以及本发明的其他特征将随着本发明的下列描述而变得清楚。
附图说明
图1示意性地显示本发明的代表性蛋白质组分析体系实施方案以及其组成。
图2显示用于本发明的一种质谱板实施方案。
图3显示用于本发明的多种水溶性蛋白(配体)支持物的实施方案。
图4显示用于本发明的配体-受体(膜蛋白)矩阵表的一种实施方案。
图5显示在Bt2cAMP刺激之前(图5B)和之后(图5A),U937细胞膜上尿激酶受体(配体:FITC-UK),C5a受体(配体:FITC-C5a)和干扰素-γ受体(配体:FITC-INF-γ)的表达。
图6显示从U937细胞中分离出膜组分的照片,其中左边显示40%蔗糖密度梯度离心之前,右边显示40%蔗糖密度梯度离心之后。
图7显示分离包埋U937膜蛋白的脂质体的照片,其中A:脂质体(200μl)+膜组分;B:脂质体(50μl)+膜组分;C:膜组分;D:脂质体(200μl)。
图8显示FITC标记的膜组分(图8A),FITC标记的包埋膜蛋白的脂质体(图8B)以及简单的脂质体(图8C)的FACS分析结果。
图9显示尿激酶受体在U937细胞膜上表达的蛋白印迹分析结果。
图10为包埋尿激酶受体的脂质体的激光共聚焦显微照片:分别表示抗尿激酶受体的抗体存在(图10A)或缺失(图10B)时候的情况。
图11为包埋在脂质体中并已溶解的膜蛋白的蛋白印迹分析结果。
图12显示膜级分中尿激酶受体的配体(FITC标记的尿激酶)结合能力(图12A),其中FITC标记的HAS用来作为对照(图12B)。
图13显示包埋在脂质体中的尿激酶受体的配体(FITC标记的尿激酶)结合能力(图13A),其中FITC标记的HAS用来作为对照(图13B)。
图14显示标记的配体与U937细胞(图14A)和包埋于脂质体的尿激酶受体(图14B)结合的摩尔比率依存关系。
图15显示从PMA刺激(图15B)和未刺激(图15A)的U937细胞制备的包埋膜蛋白的脂质体的配体(FITC标记的尿激酶)结合能力。
图16显示随着减小脂质体微粒大小,包埋尿激酶受体的脂质体的表现。
图17的照片显示印迹了尿激酶的质谱板,以及印迹之前和之后的考马斯亮兰染色的聚丙烯酰胺凝胶。
图18显示印迹在质谱板上的尿激酶的质谱分析结果。
图19显示印迹在质谱板上的尿激酶的定量结果。
图20显示细菌视紫红质的质谱分析结果,其中图20A显示细菌视紫红质在多种浓度时的结果,图20B显示单独细菌视紫红质,细菌视紫红质与简单脂质体共存,和包埋在脂质体中的细菌视紫红质的结果。
图21显示在质谱板的尿激酶受体质谱分析结果,其中图21A是尿激酶受体进行电泳纯化后的照片,图21B为在质谱板上形成的复合物的示意图,图21C显示当抗尿激酶受体IgG(上)以及对照IgG(下)用来作为配体时的质谱分析结果。
图22显示加入IAA或DHB的牛视紫红质的质谱分析结果
条件:牛视紫红质:2.56pmol膜悬浮液(溶于20mM Tris-Hcl,10mMβ-巯基乙醇,100μM EDTA,pH 7.5)
基质:0.17mg/μL DHB(在乙醇中0.5μL)或IAA饱和溶液(在乙醇中1.0μL)。
图23显示用质谱选择性测定作为变性蛋白模型的尿激酶-受体(图23A)以及作为生理蛋白模型的尿激酶(图23B)。
图24显示包埋了不同受体的脂质体与相应受体的固定在Sepharose 4B凝胶上的配体的结合。
图25显示以尿激酶作为配体和以尿激酶-受体作为受体的集合质谱分析。
发明内容
1.本发明的术语以及一般性实施方案
下述术语用于本说明书的时候通常为下述含义。本发明一般性实施方案如下。
(i)术语″互补″指表面的拓扑兼容性或整合性,受体和配体通过其发生相互作用。换言之,受体及其配体是互补的,因此,其接触表面的性质彼此互补。
(ii)″配配体″为能被特定受体识别的分子。本发明中配体不限于生理配体,并且包括细胞膜受体的全部激动剂、部分激动剂、拮抗剂以及反激动剂、毒素、病毒表位、激素(例如、镇静剂、鸦片剂、类固醇等)、肽、酶、酶的底物、辅因子、药物、凝集素、糖、寡核苷酸、核酸、寡糖、蛋白以及单克隆抗体。配体可为天然分子或人工分子。天然配体的定位不作限制。其可为地球表面包括大气层存在的任何物质,生物体分泌的物质,细胞内物质,细胞器物质,细胞核物质以及其他物质。
(iii)″受体″是对特定配体具有亲和力的分子。受体可为天然分子或人工分子。其单独或以与其他类型的分子形成复合物的形式发挥功能。受体通过共价键或非共价键直接形成或通过特定结合物质形成复合受体(寡聚型受体)。本发明使用的受体包括,但不限于,抗体,细胞膜受体,单克隆抗体以及与特定表位(例如,病毒,细胞或其他物质上的表位)反应的抗血清,药物,聚核苷酸,核酸,肽,辅因子,凝集素,糖,多糖,细胞,细胞膜和细胞器。受体有时在有关的领域中称作″抗配体″。当在本说明书使用术语″受体″时,不考虑含义的差异。
在本发明中,而且,不考虑其结构和功能,任何膜受体,膜通道,膜泵,膜运载蛋白,膜内层蛋白以及与这些蛋白偶然结合的物质广泛地称作受体或膜蛋白。这是因为本领域普通技术人员很容易意识到本发明的方法可以分离并鉴定它们。
当两个分子通过分子识别作用而结合形成复合物时,就形成了″配体-受体复合物″。受体的定位不限于狭隘意义上的细胞膜(所谓的形成细胞外层的浆膜)。受体指与任何具有脂质双层常见组成的膜结合的分子。例如,与核膜结合的DNA聚合酶复合物对DNA复制和修复非常重要,RNA聚合酶对转录非常重要,与内质网膜结合的核糖体对蛋白的翻译非常重要。一组与线粒体膜结合的氧化还原酶在ATP产生中发挥重要作用,过氧物酶体膜上一组代谢相关酶参与过氧化物的代谢并产生热量,一组包含在溶酶体膜中的降解酶参与蛋白,核酸,糖和脂质的降解,高尔基体的膜蛋白在蛋白合成后糖基化以及合成的蛋白或脂质的膜转运中具有重要功能。进一步,有观点认为多种细胞膜表面可能作为与细胞内信号转导过程密切相关的一组磷酸化酶以及去磷酸化酶的根基来参与作用。上述实例并不将受体(膜蛋白)的重要功能局限于上述例证的范围。本发明新识别的膜蛋白及其功能,作为膜蛋白-相关的生命现象,显示出多样性,它们都包含在本发明中。
受体和脂质双层之间的位置关系是不同的。最常见的是跨膜型(G蛋白偶联受体),它折叠数次并通过蛋白的疏水区与脂质双层的疏水区的相互作用而稳定。这包括包埋在脂质双层的脂质外层中的GPI锚定型受体(糖基磷脂酰肌醇-锚定受体)。实例包括固定在细胞外表面层中的糖蛋白、糖脂以及寡糖,固定在细胞内的寡聚受体组分分子组(广义上包括GTP/GDP偶联蛋白质组),在膜形状的保持和变化中发挥重要作用的膜内层蛋白质组,与其结合的功能蛋白质组等。上述例证了受体(膜蛋白)与脂质双层之间的位置关系。例证是非限制性的,并且本发明包含有关的任何位置关系,因为本发明阐明了多种这类关系。
有许多成为本发明研究对象的受体,包括未知的。下述实例只引述了其中的一部分。
a)癌症特异性膜蛋白
通过鉴别在癌症细胞膜中表达并发挥作用的膜蛋白并分析其功能,预期可以开发出对癌症细胞具有生长抑制、细胞凋亡诱导、转移抑制的作用机理的药物。该膜蛋白特异的抗体本身可用作有效的药物并可用于将毒素等运输到目标癌症细胞进行靶向治疗。
b)通过鉴定在自身免疫性疾病中受自身抗体(配体)攻击的组织的细胞膜中或在器官移植中自身组织毒性淋巴细胞中表达的膜蛋白,可以开发出相关诊断剂或药物,用于阻滞与自身抗体或自身抗原特异组织毒性淋巴细胞的结合。
特定地,自身免疫性疾病中的疾病多样性被认为是基于组织特异性的,并且如果能够分离并鉴别出下列疾病中受自身抗体或自身组织毒性淋巴细胞攻击的抗原,就可以开发出对每种自体免疫疾病特异的副作用减轻的药物,所述疾病为Addison氏贫血症、肾小球性肾炎(原发、IgA)、Grave氏甲状腺机能亢进、胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化症、有害贫血症、类风湿性关节炎、Sjogren氏综合征、牛皮癣、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、白斑、Crohn氏病、先天性血小板生成性紫癜、以及其他疾病。
c)通过明确苯(并)二氮卓受体,大麻醇受体,Sigama受体1和Sigama受体2(它们已有其人工配体(竞争剂)但内源性配体还不清楚)的内源性配体,并明确与NMDA受体的苯环己哌啶结合位点结合的内源性配体,就可以开发出创新的中枢神经疾病治疗剂。
d)在微生物中表达的受体
结合到对微生物生存非常重要的膜运载蛋白的配体的测定可用来开发具有新作用机理的抗生素。特别地,对能抵抗现有抗生素的机会真菌,原生动物,以及细菌有作用的抗生素就非常有价值。
e)核酸作为配体时的受体
当合成出核酸序列并且对与DNA或RNA序列杂交的膜蛋白进行分离、鉴别、功能分析后,就可以阐明外源性核酸与细胞膜功能之间全新的相互作用,其又可导致有用的相关诊断剂或医药的开发。例如,可以开发出一种有效的转运体系,将基于DNA、RNA病毒的反义技术或新感染防御机理的医药转运至细胞内。
f)脂质或脂质代谢物为配体的受体
当合成出这些低分子量化合物并对与其交叉反应的膜蛋白进行分离、鉴别、功能分析后,可以开发出有用的相关诊断剂或药物。例如,找出与花生四烯酸级联中许多代谢物的平滑肌收缩以及放松作用有关的全新受体,以及与细胞的形态、再分布、生长以及附着有关的EDG(内皮分化基因)受体新亚型,就可以开发出在中枢神经系统疾病,循环系统疾病,癌症,消化系统或免疫系统疾病领域具有全新作用机理的药物。
g)膜蛋白朊病毒
为了阐明从正常朊病毒向致病性朊病毒转化的机理,使用一种重建系统,其中GPI型朊病毒膜蛋白以其完整结构被包埋在脂质体中,基于本发明研究其从脂质体膜释放的机理,分离出释放促进分子,分析膜蛋白型朊病毒和游离朊病毒转化为致病性朊病毒的速率。可以以此开发出致病性朊病毒的测量体系,致病性朊病毒的去除方法,致病性朊病毒感染的防御方法,CJD发作延迟方法,CJD病人治疗方法等。
(iv)″生物膜″指任何具有脂质双层作为成分的膜,包括细胞膜和构成细胞器的膜,例如,任何生物体的内质网膜、高尔基体膜、核膜等。
(v)″脂质体″指被脂质双层与外部分隔开的微粒。脂质体的脂质双层与生物膜在物理上、化学上以及生物学上具有相似性。优选地脂质体由膜成分例如提取自植物的脂质制成。
(vi)″膜相关物质″指任何穿入或结合到生物膜内部或外部的物质。膜相关物质包括将信号从细胞外部传导到内部的膜受体,构建细胞外部和内部之间生理物质转运膜通道的膜蛋白,保持动态膜结构的膜内层蛋白,蛋白翻译酶,核糖体以及任何通过共价或非共价键结合到生物膜上的其他物质。
(vii)″包埋膜蛋白的脂质体″指一种脂质体,其表面膜蛋白通过共价或非共价键结合。
(viii)″膜蛋白库″指一组由膜蛋白组成的膜蛋白包埋型脂质体,其中的膜蛋白含于一种细胞的一种生物膜、一种细胞的所有生物膜,一种组织的所有生物膜,一种器官的所有生物膜,一个个体的所有生物膜或任何其他可能的生物膜样品中。
(ix)″配体支持物″指一种载体,其与一般称为配体的可溶分子结合。所述载体由保持其形状和性质的基本结构以及用于优化配体的结合方式和结合量的配体吸附物质(表面)组成。
配体吸附材料可为共价键合或非共价键合吸附材料,取决于配体结合方式。后一种吸附方式通常包括正相、反相、疏水、阴离子、阳离子以及其他非共价键合的吸附材料。
吸附材料可包含间隔分子,以使配体与载体基本结构的表面之间形成距离(10-10000,优选地约100)。这种间隔分子的材料可为网状或有孔生物聚合物或合成聚合物。在任何一种情况下,其形成后可提供膜蛋白与配体的亲合力而不是亲和力,以使包埋在直径10nm-5000nm的脂质体中的膜蛋白与配体以大结合力结合。
在大多数的实施方案中,载体的形状基本上为平面的,但在一些实施方案中,其为磁性微粒、非磁性微粒、链、沉淀物、胶、薄片、管状、球体、容器、毛细管、小块、切片、膜、平板、载玻片以及其他多种表面结构的形式。基本上,在本发明中可使用任选便利的形式。
载体表面可为生物的,非生物的,有机的或无机的,或这些的组合,并且是在硬支持物的表面上形成,在这样的表面上可发生本说明书中描述的反应。
通过选择载体表面可以提供合适的蛋白吸附特性。其实例包括功能化的玻璃,Si,Ge,GaAs,GaP,SiO2,SiN4,重整硅树脂,大范围的凝胶和聚合物,例如(聚)四氟乙烯,(聚)亚乙烯基二氟化物,聚苯乙烯,聚碳酸酯,或其组合物等。具有多种单体或聚合物层序的载体表面实例包括核酸、多糖、脂质,具有α-、β-或ω-氨基酸的肽的线性或环形聚合物;用于色谱的凝胶表面载体(阴离子/阳离子化合物,由1到18碳链组成的疏水化合物,与亲水化合物交联的载体,例如二氧化硅,硝酸纤维素,纤维素乙酸酯,琼脂糖等);合成的同聚物例如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙二亚胺、聚丙炔硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯等;杂聚物,其为任何上述化合物和(共价或非共价键)结合到其上的已知药物或天然化合物的偶联物;以及从本公开的观点看其他适合的聚合物。
(vii)在对结合可溶性分子(通常被称为配体)的载体(配体支持物)进行质谱分析时所用的″质谱板″是指,在将配体用高精度分析方法(如单向和双向电泳,高效液相色谱等)分离、并直接转移到载体表面上以后,能自动地并立即地适应随后的高灵敏度质谱仪的一种载体。这种载体由保持其形状和性质的基本结构以及优化结合方式和配体结合量的配体吸附物质(载体表面)组成。
配体吸附物可为共价键合或非共价键合吸附物质,取决于配体的结合方式。后一种吸附方式典型地包括正相、反相、疏水、阴离子、阳离子以及其他O-共价键合吸附物质。
吸附物质可包含间隔分子以在配体和载体基本结构表面的之间形成距离(10-10000,优选地约100)。这种间隔分子物质可为网状或孔状生物聚合物或合成聚合物。在任何一种情况下,其形成后可提供膜蛋白与配体的亲合力而不是亲和力,以使包埋在具有10nm-5000nm直径的脂质体中的膜蛋白与配体以大结合力结合。
载体表面可为生物学的、非生物学的、有机的或无机的、或其组合,并且是在坚硬支持物表面形成,在其上可发生本说明书中描述的反应。
通过选择载体表面可以提供合适的蛋白吸附特性。其实例包括功能化的玻璃,Si,Ge,GaAs,GaP,SiO2,SiN4,重整硅树脂,大范围的凝胶和聚合物,例如(聚)四氟乙烯,(聚)亚乙烯基二氟化物,聚苯乙烯,聚碳酸酯,或其组合物等。具有多种单体或聚合物层序的载体表面实例包括核酸、聚糖、脂质,具有α-、β-或ω-氨基酸的肽的线性或环形聚合物;用于色谱的凝胶表面载体(阴离子/阳离子化合物,由1到18碳链组成的疏水化合物,与亲水化合物交联的载体,例如二氧化硅,硝酸纤维素,纤维素乙酸酯,琼脂糖等);合成的同聚物例如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙二亚胺、聚丙炔硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯等;杂聚物,其为任何上述化合物和(共价或非共价键)结合到其上的已知药物或天然化合物的偶联物;以及从本公开的观点看适合的其他聚合物。
(viii)″质谱仪″指测量和检测物质分子量的装置,它使气态样品离子化,将离子化的分子及其分子碎片抛入电磁场,基于迁移状况按照质量数/电荷数进行分离,并测定该物质的光谱。有可以优选使用的数种型号,但其他型号也可以使用。
在典型的实施方案中(图1),本发明蛋白质组分析方法包括用凝胶电泳只分离水溶性蛋白并将分离的水溶性蛋白从凝胶上直接印迹到质谱板上的步骤(步骤A),将膜蛋白吸附到或穿入人工脂质体膜的步骤(步骤B),将包埋在脂质体中的膜蛋白与印迹有水溶性蛋白的质谱板接触,并利用生物亲和力(亲合力)形成配体-受体复合物的步骤(步骤C),以及利用质谱术综合检测该复合物,收集得到的数据并建立数据库的步骤(步骤D)。
下面将详细说明步骤A到D的具体实施方案、操作这些步骤的每一种装置以及衍生自组成部分的本发明的其他方面。
2.快速蛋白印迹装置(装置A)
该装置由电泳装置、蛋白印迹装置和质谱板作为主要组成部件而组成。电泳装置可为市售或专门设计的。按照目的,单向凝胶电泳和双向凝胶电泳都可以使用。在双向凝胶电泳中,第一次迁移基于利用蛋白等电点进行的分离,第二次迁移基于按照蛋白分子量进行的分离。用于电泳的凝胶大小没有任何特别限制。尽管通常使用10cm×10cm的,但当需要的时候也可以使用20cm×20cm或其他大小的凝胶。凝胶的基本材料为聚丙烯酰胺,根据不同的目的,也可使用不同载体例如琼脂糖凝胶,纤维素乙酸酯膜等。凝胶浓度可为恒定或呈梯度。
进行电泳的水溶性蛋白可从生物样品用任何已知方法制备。样品的实例包括,但不限于,任选生物体例如植物,动物,微生物体等的细胞,组织或细胞外液(例如血、血浆、尿液、骨髓液、腹水等)。例如,可溶级分可按下列方式得到,得到目标细胞后,在合适的缓冲液中在多种蛋白酶抑制剂存在的条件下进行匀浆处理,或用细胞匀浆仪例如Polytron等进行悬浮处理,或用低渗透冲击破裂细胞,或用超声破裂细胞膜,然后离心得到上清液。
第二个步骤包括电泳后将蛋白从凝胶转移到质谱板上。在本发明优选的实施方案中,质谱板的形状设计成与随后使用的质谱仪样品入口完全匹配。例如,这里提到″集束质谱板″,其具有预先制好的分离条,使得将蛋白转移到与电泳凝胶尺寸相称的集束质谱板后,集束样品可以容易地分离进入每个条型板中,后者与质谱仪的样品入口吻合。图2显示一种本发明优选质谱板的实施方案。
在常规的质谱仪中,样品是一个接一个检测的,或同一时间只能检测有限的样品,因为质谱板是单向转移,类似前述条型质谱板。与此大不相同的是,本发明的全自动蛋白质组分析能够对电泳后双向展开的所有蛋白进行分析,其通过激光管口或运载质谱板的工作台在双向方向移动以连续进行整体扫描(间歇扫描将遗漏不被激光照射的蛋白,即未分析的蛋白)来实现。该方法与间歇扫描联用,将有可能与质谱板一起对分散到96-孔板中的96种样品进行分析(96种样品以相同的间隔排布在矩形芯片上),并直接地将芯片用质谱仪进行分析。
在优选的实施方案中,质谱板材料由作为基座的铝板和作为吸附材料的二氧化硅组成。铝板用于通过电作用力而实现印迹,也可使用另一种导体,如不锈钢。对通过扩散进行的印迹,可以使用绝缘体(陶瓷,塑料等)。作为吸附材料,可以使用二氧化硅,任何蛋白都可以转移到其上,但依据目的,也可使用上述的其他物质。
迁移后展开在凝胶上的蛋白可用多种方法转移到质谱板上(扩散,电动等)。该步骤通常称作印迹。印迹的效率是与随后的质谱分析局限性相关的一个重要因素。并且,在迁移和印迹中应尽可能地避免蛋白变性。这是因为当水溶性蛋白结合到膜蛋白上的时候,如果其中之一为变性的或其天然的三维结构没有得到保持,结合将不能完成。对广泛用于蛋白质组研究的该装置而言,覆盖质谱板表面的分子的组成非常重要。为了提高印迹的效率,需要较大的蛋白吸附容量以及吸附任何蛋白的能力(而不是对特定蛋白的吸附力)以及对任何蛋白一致的吸附速率,为了实现与膜蛋白的结合,印迹和吸附到质谱板后,必需保持蛋白的三维结构。根据表面材料的不同,可以用MASS分析法对膜蛋白和配体的综合,或单独的膜蛋白,或单独的配体进行检测、鉴定和定量。
本发明中当膜蛋白用质谱进行分析的时候,优选在配体和支持物之间插入由蛋白或其他生物聚合物或合成的聚合物形成的间隔,以便使膜蛋白与其配体基于它们的生物学亲和力(亲合力)而有效结合,因为膜蛋白固定在脂质体上并且配体也被固定在支持物上。如在″本发明的术语和一般性实施方案″中所述,需要提高亲合力。实施例中使用的生物聚合物为蛋白G,抗体和生物素。配体与载体基本结构表面间的距离为10-10000,优选地约100。间隔物的形状可为网状或孔状。
支持物与间隔物之间,以及间隔物与配体之间的结合方式下文将详细描述,但是根据蛋白质组分析的目的,可以应用共价键或非共价键的形式。相应地,膜蛋白和水溶性蛋白都能够集合地或分别地用质谱术进行高灵敏度检测。
按照本发明的方法,凝胶上迁移的蛋白经过一步处理而印迹在质谱板上。因此,常规蛋白质组分析需要的电泳后以及质谱分析开始前的所有复杂步骤都可以省略,这显著缩短了操作时间。结果是,可以按照蛋白质组分析的需要对大量样品进行处理。
此外,在本发明中,不需要电泳后切割凝胶的步骤。结果是,解决了在切割点(线)和丢失级分中未被MASS测定的蛋白的问题。这就使得将凝胶上所有的蛋白加到质谱板上成为可能。而且,不用从凝胶中提取蛋白的步骤(提取效率小于10%),通过电作用力或扩散力直接印迹,其可以实现100%印迹效率,并且印迹在质谱板上的蛋白的量是常规的提取蛋白量的数倍或数十倍。
在本发明典型的实施方案中,膜蛋白包埋型脂质体及配体按照如下叙述形成复合物后,可以综合检测和分析膜蛋白和配体,在另一实施方案中,本发明提供了一种配体分析方法,其只对配体(水溶性蛋白)印迹在其上的质谱板进行质谱分析。
也就是,质谱板上的蛋白通过将质谱板进行质谱分析而得到分析。本发明固定在质谱板上的配体的分析可使用任何型号的商业化的质谱仪进行,但更优选使用利用了以下方法的质谱仪进行:MALDI-TOFMS方法,由基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)组成,其中样品与吸收激光的基质混合并干燥结晶,然后通过从基质转移能量以及通过高强度激光脉冲,使结晶的样品离子化并将其导入真空中,在飞行时间质谱分析术(TOFMS)中,基于由初始阶段加速引起的样品分子离子飞行时间的差异进行质量数分析;一种方法,其中将蛋白放入液滴中并直接从该液体离子化并带电;纳电喷雾质谱(纳ESMS)方法,其中样品溶液以带电的形式喷雾到空气中,使每一个未折叠蛋白多价离子进入气态等。
通过将最适于蛋白质组分析标靶和目的的支持物和超高灵敏度检测体系组合,可获得本发明配体支持物的多种实施方案。详细内容见下文(例如,表1和图3),非磁性微粒和磁性微粒都举例说明,质谱板也是如此。
本发明的检测体系也有多种实施方案与最适于蛋白质组分析标靶和目的的支持物联用。下文将讨论细节内容,除质谱外,也举例说明了荧光测定,放射活性测定等方法。当配体支持物为微粒时,应用预先荧光标记的脂质体可以高灵敏地检测、分离和定量膜蛋白-配体复合物。
该步骤(步骤A)不仅可以用于水溶性蛋白,也可以用于肽、糖,DNA、RNA等,其存在于细胞外液(例如,多种体液例如血、血浆、尿、骨髓液、腹水等),细胞内液或细胞器内液,不用吸附到或穿透构成细胞的脂质双层例如细胞膜、核膜、内质网膜等;也可以用于来自机体的任何其他可溶的分子、任何人工合成的化合物、气体物质(例如,氧气分子,氮氧化物等)等。也就是说,利用其性质,将每一种分析目标物质高度纯化,转移到最佳的支持物上并分析其与包含膜蛋白等的脂质体相互作用。
3.制备膜蛋白-包埋的脂质体的装置(装置B)
该装置包括用于从细胞分离出膜级分、制备脂质体、使膜级分与脂质体融合、调整融合脂质体(膜-蛋白-包埋的脂质体)微粒大小、以及当需要的时候,保存融合脂质体的各种装置。
可以用常规的方法从细胞提取出膜级分。例如,得到目标细胞,在合适的缓冲液中在多种蛋白酶抑制剂存在的条件下进行匀浆处理,或用细胞破坏装置例如Polytron等进行悬浮处理,或用低渗透压破裂细胞,或用超声破裂细胞膜。然后,细胞膜级分以及细胞器膜级分通过使用多种溶媒进行密度梯度离心来制备。
可以使用多种已知方法制备脂质体。典型的但不限于,将选定的脂质的混合物均匀地溶在有机溶剂中,该溶剂在氩气中完全蒸发并且在缓冲溶液中被水合从而产生脂质体。脂质体的组成很重要。通常,细胞膜包含丰富的胆固醇,但是脂质双层构成的细胞器例如内质网等包含很少或无胆固醇。因此,接受膜蛋白的脂质体的组成在决定将哪种细胞膜蛋白转移到脂质体中成为一个非常重要的因素。本领域普通技术人员依照膜蛋白来源能够决定适当的脂质组成脂质体。
多种已知方法可以作为膜级分和脂质体融合的方法。例如,一种方法包括将两者以合适的比例混合然后反复冻融;一种方法包括将包含膜级分的水性溶液放到由选定的脂质的混合物制备的膜上,然后通过水化作用将膜蛋白转移到脂质双层上;或可以使用能实现目的的另一种方法。优选冻融方法,使用这种方法,膜蛋白相对脂质体的包埋比率(转移率)可以达到100%。
或者,当在脂质体形成后,实现与膜蛋白融合的时候,脂质体和膜蛋白部分的融合可通过将微粒大小调节到10nm-5000nm,优选地10nm-500nm而得到促进。
制备的膜蛋白-包埋的人工脂质体可通过超声、均匀化处理或其他方法来调节微粒大小。在本发明中,优选使用过滤(挤压机方法)使膜蛋白的变性降低到最低并调节微粒大小为10nm-5000nm,优选10nm-500nm。
通过小心调节膜级分和脂质体的混合比例,可以控制包埋入脂质体的膜蛋白的需要的类型和数量。该技术对促进分析绝对重要,因为它减少膜蛋白和配体二者的分子量测量和测定中的噪音蛋白(噪音峰),所述的膜蛋白和配体利用下文将提到的装置C形成本发明复合物。
开发出一种方法,用于稳定保存因此得到的包含附加或透入脂质双层的目标膜蛋白的脂质体(膜-蛋白-包埋的脂质体),对任何地方任何时间以及在没有质谱仪等的机构进行蛋白质组研究非常重要。开发用于简单脂质体保存的几种添加剂可用于这种目的。
本发明的方法可用于任何种类的膜蛋白。因此,其可用于发现、鉴定和分析通过基于基因组序列同源性用计算机预测很难发现的所有其他类型的受体(GPI型,寡聚型)及其配体,以及可用于搜寻从基因组序列用同源性搜寻预测的G蛋白偶联受体(GPCR)的孤儿配体,从而使以所有类型受体为靶标并基于受体的药物发现而实施的药物开发成为可能。此外,本发明极为有利于除受体以外的膜蛋白的发现、鉴定和分析。因此,就可以通过旨在分析与所有膜蛋白和配体有关的疾病的基于膜蛋白的药物发现进行药物开发、也可实现诊断剂和诊断方法的开发、以及治疗剂的开发。
本发明的方法可用于通常不出现在细胞膜表层的细胞内膜蛋白的发现、鉴定以及分析,例如通过其组成脂质成分固定(渗透入)在脂质双层的内层的膜蛋白,以及固定在脂质双层内层通常称为生物膜的内层蛋白。
进一步,本发明极为有利于基于抗体的药物发现(包括抗体药物)的研究,目的在于将抗体用于疾病的分析、诊断和治疗。作为有效用于疾病的分析、诊断和治疗的抗原,并有效用于相应抗体的制备的膜蛋白而言,保持结构和功能的膜抗原(膜蛋白)是不可缺少的。只有本发明的方法,其中膜抗原包埋在脂质体中并保持结构和功能,能够满足上述基于抗体的药物发现的基本条件。明显地,抗体相关药物发现方法是一种在一般方法中用抗体取代配体特殊的方法,其目的在于涉及所有膜蛋白和配体疾病的分析、诊断剂和诊断方法开发,以及治疗剂的开发,这都是本发明的范围。因此,本发明提供抗体药物发现型医药的开发以及受体药物发现型医药的开发。
本发明使得对膜蛋白及其配体的蛋白质组分析能对膜蛋白及其配体二者进行集合的发现和集合的定量,以及功能(相互作用)分析,或发现和定量其中之一并分析两者的相互作用。在这种情况下,膜蛋白及其配体是否已知不予考虑。配体包括固有的内源性配体,竞争剂(完整激动剂,部分激动剂,拮抗剂,反激动剂),医药,试剂,抗体以及任何其他经人工修饰能与膜蛋白结合的物质。
在该步骤(步骤B)得到的膜蛋白包埋型人工脂质体,可直接地对患有由膜蛋白的缺失、变异以及其他异常引起的疾病的病人施用,方式是以正常膜蛋白作为新剂型的膜蛋白包埋型人工脂质体药物。当脂质双层的组成成分来自除动物以外的生物学物种,就可以避免病原体对人类的感染。
该步骤得到的包埋膜蛋白的人工脂质体与内源性配体的复合物,或包埋膜蛋白的人工脂质体与竞争性试剂(无论是完整激动剂,部分激动剂,拮抗剂或反激动剂)的复合物,作为一种具有新作用机理的新剂型的包埋膜蛋白的人工脂质体药物,可以直接地对患有膜蛋白以及配体两者或其中之一异常引起的疾病的病人。
本发明也通过单独或联合使用下列方法提供了检测新和极高度灵敏膜蛋白-配体(包括竞争性剂)相互作用的原理、方法以及装置:荧光物质和其他标记物质通过共价键或非共价键交联到人工脂质体的脂质双层的方法,通过疏水相互作用的嵌入方法以及将可溶性标记物质包封进人工脂质体的水相的方法。通过应用亲和素-生物素体系、镍-组氨酸或其他交联体系也可能将产生二级信号(例如,酶例如碱性磷酸酶)的物质交联、嵌入或包封到或入人工脂质体,以替代荧光物质或其他标记物质,并放大检测灵敏度。
如下面实施例中所示,当人工脂质体包埋于标记的膜蛋白时候,其中用遗传工程或其他可能的方法,在DNA水平、RNA水平或蛋白水平导入荧光分子和其他FACS标记识别分子,通过挤压机方法或其他方法将其大小调节为10nm-5000nm,优选地500nm或以下,FACS分析清楚地显示出在相应大小区域的包埋标记的膜蛋白的脂质体的总量。因此,例如,当从基因序列中制备出编码膜蛋白的cDNA,宿主细胞用包含所述cDNA的表达载体转化,就表达出膜蛋白(其中导入荧光分子或其他FACS识别标记分子),将从表达宿主细胞膜级分制备出的包埋标记的膜蛋白的标记的脂质体调节到所述大小,并用FACS分析进行的检测膜蛋白表达的存在或其他方面,以及其表达量。与现存的其他方法不一样,在没有除膜蛋白或试剂的DNA序列以外信息的(抗体、配体、竞争性剂、细胞应答或膜蛋白的其他检测试剂)条件下的检测也可能进行。在膜蛋白检测试剂例如抗体等存在的存在下,在蛋白水平的标记成为可能,并同样地,用FACS分析表达也成为可能。更不用说相似的原理可用于配体的研究。
该步骤可用于使膜蛋白以及吸附于或透入细胞构成脂质双层,例如细胞膜,核膜,内质膜等,以及附着或透入具有预定脂质组成和形状的人工脂质体的脂质双层的一种或多种生物学聚合物包括糖、DNA、RNA发生吸附或穿透。
4.膜蛋白和水溶性蛋白结合的装置(装置C)
该装置包括用于印迹在质谱板上的配体与包埋膜蛋白的脂质体的结合反应的装置,清洗和除去非特异结合在质谱板上的脂质体的装置以及溶解和除去脂质体以在质谱板上形成只有配体和膜蛋白的复合物的装置。例如,这些装置可以是一种反应容器,其底部面积足够将质谱板浸入反应混合物,洗涤溶液等中,需要的时候可以装配摇动装置。根据实验目的,可在单个装置中执行这些多步骤,或可省略某种装置。
在结合反应装置中,用合适的物质包被(封闭)质谱板的吸附表面以预防在质谱板上除生理配体-膜蛋白相互作用以外的非特异吸附反应的步骤,可作为结合反应的预处理步骤。封闭剂的要求是其能预防脂质双层亲水头的非特异性吸附,可以预防除已经转移到脂质体中的目标膜蛋白以外的膜蛋白的非特异性吸附,其不是使随后的质谱分析无法进行的多组分体系,而是其中组分为已知的且其分子量一致的体系,其由不吸收电离能量的分子组成,等。
作为反应方法,可以应用简单的浸没、摇动等。增加质谱板附近的包埋膜-蛋白脂质体浓度的方法,推荐使用电力进行脂质体的富集。因为脂质体整体上带负电,脂质体转移到质谱板表面并在配体附近的浓度增加,一旦阴极固定在质谱板的底部而阳极固定在反应容器的上部。
非特异性结合到质谱板上的脂质体可通过用具有适当的盐浓度和成分的洗涤缓冲液清洗除去。尽管在清洗过程中温度条件非常重要,必要的时候本领域普通技术人员可以确定合适的条件。
通过裂解除去脂质体的方法可用下列方法例举说明:包括用缓冲液将其浓度调节至合适值后,将合适的有机溶剂(甘油,乙腈,乙醇,二氧六环,DMSO,DMF等)与质谱板接触。使用温和洗涤剂(例如,辛基葡萄糖等)也有效。
上述内容是图1中所示的全自动膜蛋白-配体蛋白质组分析装置的说明和解释,假定质谱分析为检测体系。考虑到与本发明多种目的的兼容性,水溶性蛋白支持物的实施方案自然地如中图3和表1所示的多种多样,但超出图3和表1中例举的范围。
表1水溶性蛋白(配体)支持物的类型和应用
类型 |
配体 |
结合目标 | 应用范围 |
支持物 |
结合方式 |
配体 |
受体 |
柱板板芯片芯片 |
磁性微粒磁性微粒(直接)磁性微粒(直接)非磁性微粒 |
共价共价共价共价/非共价共价/非共价共价 | ○○○○○ |
○○○○ |
LC-MS-MS[全自动]HTS(竞争剂筛选)HTS(竞争剂筛选)配体(非共价)的检测/鉴定利用SELDI,等离子体、荧光、RI等进行检测利用荧光、RI等进行检测/发现 |
在如图3所示的实例中,用传导的磁性金属作为支持物基本的结构以进行电泳后的印迹,用本发明开发的带有旨在提高亲合力的间隔臂的结合型磁性微粒作为支持物的表面物质。磁性微粒与双向电泳分离的水溶性蛋白以共价或非共价键的形式结合,在使用柱的实例中,分开成625间隔后,用磁力保留在分开的625微纤维内腔中。包埋膜蛋白的脂质体通过后,依次洗脱并用LC-MS-MS分别检测。在不同的应用中,使用板、通过磁力将磁性微粒保留在分开的625腔中,分开成625间隔后。在HTS方式中,可以实现包埋膜蛋白脂质体和竞争性试剂的加入,反应,清洗以及检测。芯片应用是用于的稍早例举的质谱板产品的实例。在表1中,本发明应用范围中的实施方案取决于支持物的种类,其中最后例证明显示了水溶性蛋白通过本发明的间隔分子共价结合到非磁性微粒(聚糖凝胶,合成聚合物凝胶等)后,水溶性蛋白与包埋膜蛋白的脂质体的结合。除质谱以外的荧光、放射活性、二级信号扩增体系等检测体系,可按照蛋白质组分析的目的灵活应用,从而为未知配体,特别地孤儿配体等的搜寻提供了最佳体系。
5.质谱分析装置
本发明中使用的生理活性物质检测不限于质谱仪。不过,质谱仪仍然是本发明中重要检测装置,由于分子量是物质的固有物理量之一,可被直接地检测,检测限接近皮克水平,并且氨基酸序列可用MS-MS方法分析。用上述装置C对固定在本发明质谱板上的配体膜蛋白复合物的分析可使用任何类型的商业销售的质谱仪。例如,优选地只用于通过上述装置A固定在质谱板上配体的分析的质谱仪可类似地被应用。
在本发明中,当膜蛋白和水溶性蛋白在质谱板上共存的时候,取决于加入样品中溶剂的选择,可以用质谱分析同时进行二者或二者之一的高灵敏检测。
6.用于数据库建立和分析的装置(装置D)
从本发明上述装置A、B和C得到的上述膜蛋白-配体复合物的测量结果,输入预设的″配体-受体(膜蛋白)矩阵表″(图4),并在任何时候可添加新的数据以建立诊断判断用数据库。
行数字(1-25)和列标志(A-Y)分配来代替上述示范性引入的质谱板的整个区域,从而用数字(A1-Y25)分派给总625(25*25)区间的每一个区间(4mm*4mm),形成一一对应(图2)。结果是,电泳后转移到质谱板上的全部配体用配体-受体(膜蛋白)矩阵区间号整理出来。不必说,因此与包埋于脂质体中的受体反应得到的相应受体可用同样的区间号整理出来,聚集在某一个区间号下的物质组被认为相互地且生理性地结合。
在特定实施方案中,目标体液(认为包含可溶的配体)例如健康人体的血清等以及患特定疾病病人的同类目标体液首先进行双向凝胶电泳并,印迹到质谱板后,用质谱等进行测量。这样,由于疾病原因导致的配体的增加或减少就很清楚并可输入数据库中。
然后,目标体液,例如对健康人体的血清等进行电泳并转移到两块凝胶上以制备两块质谱板,这样就制备出转移了健康人体的配体质谱板。分别地,从健康人体和病人获得同类的细胞,并使用上述提及的装置B(膜蛋白分离和转移脂质体装置)将各自的膜蛋白转移到脂质体中,进行包埋膜-蛋白的脂质体的制备。来自健康人体和病人的包埋膜-蛋白的脂质体分别与各自的质谱板接触,在其上已经使用装置C(结合水溶性蛋白和膜蛋白的装置)转移到健康人体的配体,并发生配体-受体结合反应,随之进行清洗等,得到在质谱板上高度纯化的配体-受体复合物。利用质谱分析,由于疾病原因导致的受体的增加或减少就很清楚并可输入数据库中。
数据库项目为疾病名,配体来源的体液名称,膜蛋白来源的细胞名称,以及配体-受体(膜蛋白)矩阵区间号,质谱结果的分子量或量化数值(或从分析装置输出的信号强度例如峰高,峰面积等)等。
质谱分析的结果按照自动程序输入数据库,结果如图4中所示的差异显示的方式显示,其中,在″配体/受体(膜蛋白)矩阵表″的三角形右半部分中,配体增加用红色、下降用兰色、缺失变化用黄色显示,同样地在三角形左半部分中,受体增加用红色、下降用兰色、缺失变化用黄色显示。在图4中,使用模式的方式。
上述操作时间约为:用整夜时间(约12小时)同时进行4块胶的电泳,用约6小时同时进行2种膜级分制备,用约2小时同时进行将2种样品转移到脂质体,用约1小时同时进行2种配体-受体结合反应(上述步骤总耗时约21小时),用约52小时用商品化的TOF-质谱仪分析625区间。当使用1台质谱仪时,总步骤需要21+52×4=229小时,当使用4台质谱仪时,需要21+52×1=73小时。限速步骤为电泳、膜级分制备以及质谱分析。当这些步骤得到改善并实现自动化后,操作时间可以显著缩短。例如,电泳装置可以在5小时内处理100份样品,膜级分的制备、转移脂质体以及配体/受体结合反应都可自动化并集合成1个装置,这样在3小时内就可以同时处理20个样品。进一步,质谱仪分析时间可以缩短五倍。
经过上述的时间缩短后,可以粗略计算出建立测定疾病的数据库需要的近似时间,用上述方法来分析100种疾病、每种疾病100例,用10组本发明的上述装置和100套质谱仪,使用血清和一种疾病的一种目标细胞作为样品,需要100×100×3×5/99/10(152)小时进行电泳,100×100×2/19/10(105)小时进行质谱分析质谱板的制备,以及100×100×10.4×3/100(3120)来进行质谱分析,因此速率限定质谱分析的3120小时(130天)。因此,测定预定100种疾病的数据库可在半年内建立起来,这之后,在1天内联合诊断100种疾病就可以实现。从上述可以了解,该装置和该数据库对医学领域的影响无法估量。
用来实现该目的的配体样品为体液例如血、血清、尿、脑-骨髓液、精液、唾液、汗、泪液等,所有的细胞内液,所有的细胞内细胞器液等。膜蛋白样品可为任何构成机体的细胞以及包含在细胞中的所有细胞器。疾病分类表ICD-10,显示了约10,000种疾病。当所有的生物体作为目标的时候,使用该装置建立的数据库中的记录数会达到无法估计的数字。但是,信息工程领域包括计算机硬件和软件的快速发展容许这种详尽数据库的建立。
本发明也为配体/膜相关蛋白相关疾病的治疗剂的开发提供了有用的工具。配体/膜-相关-蛋白的功能分析占据了21世纪生物学(包括医学和农业)中的重要领域,并且分子生物学进行的生物学功能的阐明中很大一部分是阐明与一些膜相关蛋白关系。除了可以从上述诊断数据库(到现在为止数据用于诊断判断)阐明涉及特定疾病中配体的增加和下降和受体的增加和下降,本发明的其他优点在于同时测配体和膜蛋白二者的反分子,即生理性结合的特定配体和特定膜蛋白。该领域的新物质通常是通过下列途径被发现:由于偶然或因为其他目的发现其中之一(例如,配体)然后使用标记的配体发现相应的受体,或由其他方式发现了一对配体和受体。这样,需要偶然的巧合和长期的耐心。有许多具有未知功能的配体和膜蛋白,以及与人工物质(药物)结合但其生理配体未鉴定出来的受体。当多种分子(至少2种分子包括1种配体和1种相应的受体)在输入本方法的测量结果得到的配体-受体(膜蛋白)矩阵区间号中某个位置得到确认,以及存在量疾病-特异性地增加或下降,位于同一区间号的所有分子提供来作为疾病-相关配体/膜蛋白,以及药物发现成功研究的高度有前途(希望)候选研究对象。为实现这种目的,可使用串联质谱仪。其能够实现归于特定区间号的所有分子种类的氨基酸序列的测定。
因为本方法可以分析一种具体的细胞膜的任何膜蛋白,相关疾病,目标细胞膜蛋白可用一轮操作进行系统地分析,而不是依赖偶然巧合一一发现涉及疾病的每个单独膜蛋白。
而且,如表2中所示,当细胞器膜,例如线粒体膜的膜蛋白,成为研究对象时,迄今为止无人能够想象的药物发现策略,例如疾病的分类、疾病间关系的阐明、或开发组特异的治疗剂,可以基于ATP产生能力的变化而得以实现。
表2各种膜中有吸引力的药物发现靶标
膜 |
靶标 |
细胞膜核膜线粒体膜过氧物酶体膜溶酶体膜高尔基体膜内质网膜X膜 |
细胞外效应分子的细胞内信号转导DNA复制,RNA转录/剪接氧化还原,ATP产生过氧化物代谢蛋白、核酸、糖和脂质的降解转糖基作用和膜转运蛋白/脂质合成和膜转运,MHC信号转导分子的反应场所? |
7.其他优选实施方案
本发明也为在水性溶液中观察和分析不溶于水性溶液的分子与其他可溶的或不溶的分子的相互作用的提供了检测原理和方法。因此,本发明范围不限于来自机体的膜蛋白-配体复合物的发现、定量和分析,也包括与膜蛋白相互作用的人工制造的物质发现、定量和分析,对两种或多种能相互作用膜蛋白发现、定量以及相互作用分析,对来自机体除膜蛋白以外不溶物质与不溶的或可溶的物质之间相互作用的分析,以及对不是来自机体的物质(目标)发现、定量和分析。
包括糖链和脂质为构成成分的蛋白MS分析的常规方法,需要用蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶等进行预处理,与常规方法形成鲜明对比的是,通过仅改变加入到质谱板样品中的溶剂的成分,在本发明中就可以得到无糖链或脂质的简单蛋白全部(或部分地取决于测试条件)的谱图。细节说明见下文实施例8。
本发明进一步提供了一种超高灵敏方法,用于检测变性的非水溶性蛋白例如致病性朊病毒蛋白等。在下面的实施例9中将详细说明。
本发明的重要性和目标不限于进行膜蛋白和配体分析的全自动蛋白质组分析装置的完成,而是在于对膜蛋白科学的繁荣技术贡献,膜蛋白科学担负着生命现象中的重要功能,但由于方法学和技术障碍在研究方面却远远落后。如上所述,本发明提供了将蛋白质组分组成膜蛋白和水溶性蛋白并将膜蛋白包埋于脂质体的原理、方法和结果,从而使膜蛋白的处理方式与水溶性蛋白的处理方式类似。
所述原理和方法将汇入基因组药物发现方法学所探究的药物发现的潮流,并在不久的将来被公认为膜蛋白药物发现,与受体相关药物发现、抗体相关药物发现、HTS相关药物发现、蛋白空间结构分析、基因表达分析、其他蛋白质组分析等紧密相关。
本发明下面将参考只作为范例、不以任何方式限制本发明的实施例进行详细的说明。
实施例
下面将显示特定实施方案以及结果以证实本发明的方法和装置可以有效用于膜蛋白及其配体以及二者相互作用分析的同时筛选,以及其为蛋白质组分析的新方法和装置。
受体基于结构分为三类:GPI锚定型,GPCR型和寡聚型。为了证实本发明可用于进行膜蛋白的蛋白质组分析,应该分析所有这些型受体作为靶标与每种特定配体的相互作用。U937细胞来自人单核细胞的细胞株,许多受体表达在其膜表面上。其中,尿激酶受体选来作为GPI锚定型受体,血清补体成分C5a受体选来作为GPCR型受体,干扰素-γ受体选来作为寡聚型受体。
参考实施例1:三种受体表达的证实
Bt2cAMP刺激前后,U937细胞分别与三种FITC预标记的配体反应,并用FACS分析观察受体表达的存在。结果,观察到的所有三种受体表达如图5中所示。
实施例1
包埋尿激酶受体的脂质体的制备
(1)膜级分的制备
由于U937是来自人单核细胞的细胞株,并且经佛波醇酯(PMA)刺激后表达出高浓度的尿激酶受体,因此将其作为分离膜级分的样品。清洗后,通过用Polytron在冰冷却的条件下以1分钟的间隔处理3次,每次2-5秒,使细胞破碎,而膜级分通过40%蔗糖密度梯度离心(95,000g×60分钟)富集在界面上(图6)。
(2)包埋膜蛋白的脂质体的制备
将纯化的卵黄卵磷脂(1.25g)和胆固醇(0.125g)悬浮在25mL生理盐水中,在冰冷却的条件下用探头型超声装置处理15分钟。得到的脂质体的平均粒径为80nm。将预先制备的U937膜级分加入到该脂质体溶液中,在-80℃和室温反复冻融3次。混合物变浑浊。当只包含脂质体的溶液按照同样的方式处理时,脂质体溶液变浑浊。与此形成对比的是,U937膜级分即使反复冻融后仍然保持半透明。将氯化铯加入到这些样品中,并将终浓度调节到40%,在该溶液之上依次添加含30%和15%浓度的氯化铯的溶液和生理盐水,进行密度梯度离心(95,000g×1小时)。结果是,U937膜级分在氯化铯的30%和15%浓度界面上形成条带,浑浊的脂质体在15%氯化铯与生理盐水的界面上形成条带。在脂质体和U-937膜级分的混合物中,在与浑浊的脂质体相似的位置观察到条带,但在U-937膜级分的位置没有观察到条带。从结果可以判断,U-937膜级分已经与脂质体融合并形成了包埋膜蛋白的脂质体(图7)。
(3)包埋膜蛋白的脂质体的证实
分离和制备膜级分后,膜蛋白用荧光(FITC)标记。该膜级分依照上述方法(2)与脂质体反应形成包埋膜蛋白的脂质体。膜级分、包埋膜蛋白的脂质体以及简单的脂质体中的每个样品用FACS进行分析。结果如图8中所示,其中膜级分的荧光强度(y轴)/微粒最高,简单脂质体的最低(没有蛋白存在,只能检测到很弱的除FITC荧光以外的散射光),包埋膜蛋白的脂质体介于二者之间。由于包埋膜蛋白的脂质体样品几乎不包含在简单脂质体中检测到的发射弱散射光的微粒,因此可以认为膜级分和简单的脂质体部分几乎100%地融合。即,膜级分和简单的脂质体融合形成了多层脂质体,并且膜蛋白也转移到多层脂质体中内部脂质体的表面。因此,在外膜表面的膜蛋白数量下降,进而降低包埋膜蛋白脂质体的荧光强度。从上述可知,表明制备出的与细胞和细胞膜级分结合的膜蛋白通过这种制备方法转移到脂质体的脂质双层。
(4)尿激酶受体(U937细胞)的鉴定
使在PMA存在或缺失条件下培养的U937细胞溶解,用羊抗人尿激酶受体抗体进行免疫沉淀。电泳后,进行Western印迹分析,确证U937细胞膜上尿激酶受体的存在。Western印迹的初级反应是稀释250倍的生物素标记的羊抗人尿激酶受体抗体进行2小时的反应,二级反应是稀释100倍的碱性磷酸酶标记的链亲和素进行1小时的反应。反应后,用PBS/0.1%Tween20洗3次并用BCIP/NBT检测。结果如图9中所示,可以观察到分子量为50kDa的用抗人尿激酶受体抗体染色的宽带。因此,在U937细胞表面可以发现有带有不同的糖链结构的尿激酶受体的存在。
(5)包埋尿激酶受体的脂质体的证实
用上述方法(3)得到的包埋膜蛋白的脂质体与作为一抗的羊抗人尿激酶受体抗体在4℃反应1小时,与作为二抗的FITC-标记的兔抗山羊IgG抗体在4℃反应1小时。一抗和二抗在10倍稀释的条件下反应,并且反应后,用0.1%BSA-PBS(包含蛋白酶抑制剂)洗涤四次。然后,用320倍的共聚焦扫描激光显微镜(LSM410,CarlZeiss)观察(图10)。在加入了抗尿激酶受体特异抗体的融合脂质体中,可以观察到荧光(图10A);但没有加入了抗尿激酶受体特异抗体的融合脂质体中,不能观察到荧光(图10B)。从前述可知,表明尿激酶受体转移到脂质体的脂质双层中。按照同样的方式,将得到的包埋膜蛋白脂质体进行溶解处理,用羊抗人尿激酶受体抗体进行免疫沉淀并进行Western印迹。Western印迹的初级反应是与稀释250倍的生物素标记的羊抗人尿激酶受体抗体进行2小时的反应,二级反应是与稀释100倍的碱性磷酸酶标记的链亲和素进行1小时的反应。反应后,用PBS/0.1%Tween20洗3次并用BCIP/NBT检测。结果如图11中所示,可以观察到分子量为50kDa的用抗人尿激酶受体抗体染色的宽带。结果与前述用U937细胞证实的结果显示出同样的分子量分布。因此,表明转移到包埋膜蛋白的脂质体的脂质双层的尿激酶受体保持了在天然细胞中存在的糖链结构等。
(6)尿激酶受体的配体结合能力
既然从U937细胞制备的膜级分显示出在脂质双层中保持有尿激酶受体,就进行了尿激酶受体的尿激酶(配体)结合能力的研究。尿激酶用FITC进行荧光标记,与膜级分反应并考察了受体与配体的结合。作为对照,使用了用FITC进行荧光标记的人血清白蛋白(HSA)。结果如图12中所表示。从图中可以清楚地看出,用这种方法制备的膜级分与内源性配体尿激酶结合(图12A),而不与HAS结合(图12B)。这意味着保留在用这种膜蛋白制备方法得到的膜级分中的尿激酶受体保持了三维结构和生理功能(配体结合能力)。接着,考察了包埋膜蛋白的脂质体的尿激酶结合能力。尿激酶用FITC进行荧光标记,与用稍早方法得到的包埋膜蛋白的脂质体(包括包埋尿激酶受体的脂质体)反应,并考察了受体和配体的结合。作为对照,使用FITC荧光标记的人血清白蛋白(HSA)。结果如图13中所示。从图中可以清楚地看出,用这种方法制备的包埋尿激酶受体的脂质体与内源性配体尿激酶结合(图13A)而不与HAS结合(图13B)。为了证实包埋尿激酶受体的脂质体和尿激酶之间的结合特异性,制备出1∶1-1∶10000之间多种摩尔比的RI-标记的尿激酶和未标记的尿激酶混合物,分别与U937细胞和包埋尿激酶受体的脂质体反应,测定与细胞和包埋尿激酶受体的脂质体结合的放射活性。如图14中所示,随着未标记的配体增加,在与受体结合的放射活性中,二者都显示出下降。因此,可以认为包埋尿激酶受体的脂质体与尿激酶的结合是特异的。
此外,用PMA刺激导致的尿激酶受体表达量的变化,基于尿激酶与包埋膜蛋白的脂质体的结合量进行了研究。如图15中所示,从PMA刺激U937细胞制备的包埋膜蛋白的脂质体与那些从未处理的细胞相比,清楚地显示出与荧光标记的尿激酶结合的脂质体微粒数量的增加。
上述结果表明包埋在脂质体中的膜蛋白的结构和功能,与那些在活细胞膜上表达的膜蛋白一样。因此,表明本发明方法可用来评价在疾病进程中受体和配体数量和特性的变化,而不用活细胞。
实施例2:微粒直径减小后受体包埋型脂质体的外观
用挤压机方法改变包埋膜蛋白脂质体的微粒大小,并用荧光(FITC)-标记型尿激酶考察包埋尿激酶受体的脂质体的外观。结果是,当通过的滤器的滤孔大小不超过0.6μm的时候,脂质体溶液中包埋目标受体的脂质体数量明显上升,如图16中所示。据推测是由下列事实引起:融合后绝大部分目标受体立即被包封在多层脂质体中的大脂质体中,荧光不能检测出,而且更重要的是,体积较小的脂质体导致包埋在一个脂质体中的受体数量减少,因此造成包埋目标受体的脂质体与没有包埋目标受体脂质体之间显著的不同,并且包埋的脂质体数目上升。当用挤压机方法或其他方法将脂质体调节为大小10nm-5,000nm的微粒,优选地不超过500nm时,通过FACS分析发现,包埋标记型膜蛋白的脂质体群体清楚地显示在对应的大小区间。
因此,当,例如,从膜蛋白基因序列制备出cDNA,并用包含所述cDNA的表达载体转化宿主细胞以表达膜蛋白(其中导入荧光分子或其他可用FACS识别的标记分子)时,以及当具有依照本发明从表达宿主的细胞膜级分制备出的包埋并标记的膜蛋白的未标记脂质体调节到所述大小,并用FACS分析时,很明显可以进行膜蛋白的存在或其表达和表达量的检测。从这种角度上讲,与现存的其他方法不一样,在不具有除膜蛋白DNA序列以外的信息或试剂(抗体、配体、竞争性剂、细胞应答或膜蛋白的其他检测试剂)的条件下也可进行检测。并且,如果膜蛋白的检测试剂例如抗体等存在,在蛋白水平的标记成为可能,并同样地,用FACS分析表达也成为可能。更不要说相似的原理可用于配体的研究。
实施例3:尿激酶印迹到质谱板上
以恒定的时间间隔将尿激酶(10,13,16,20,33μg)加样到聚丙烯酰胺凝胶的同一孔中并进行电泳。迁移完成后,凝胶从玻璃板剥离,用印迹缓冲液(5%乙腈/125mM NaCl/PBS)替换凝胶中的溶液5分钟后,将其热印迹(扩散印迹)到铝板上,该铝板表面用具有16碳原子的疏水物质处理过。印迹缓冲液使用包含5%乙腈和125mM NaCl的磷酸盐缓冲液,在35℃印迹4小时。图17显示的是印迹后质谱板以及凝胶印迹前后用考马斯亮兰染色后的照片。裸眼无法看见质谱板上的尿激酶带,但是既然印迹后凝胶上的尿激酶带变弱,就暗示一定量的尿激酶已经转移到质谱板上。
实施例4:用质谱分析鉴定质谱板上的尿激酶
聚丙烯酰胺凝胶电泳后,用热印迹(扩散印迹)转移到质谱板上的尿激酶直接地用质谱仪检测,其结果见图18。质谱条件如下,芥子酸(溶解在50%乙腈/0.5%三氟乙酸中的饱和溶液)作为能量吸收物质,其按0.5μl/点加入并空气干燥,然后加入同等量并空气干燥。检测用SELDI Protein Chip体系(Ciphergen Biosystems Inc制造)完成。质量校准使用β-乳球蛋白A(牛的),辣根过氧化物酶以及伴清蛋白(鸡)进行外部校准。SELDI Protein Chip体系的测量参数是:检测电压2200V,检测灵敏度10,激光强度285。结果是,在分子量为49461.2的位置观察到一个峰。由于用于检测的尿激酶是前体分子,从氨基酸序列预测的分子量为48,525,暗示着加入了糖链分子。
实施例5:尿激酶向质谱板上的转移率
转移到质谱板上的尿激酶通过质谱分析进行定量。使用25、12.5、6.25ng的标准尿激酶,绘制用质谱得到的峰高对浓度的标准曲线。此后,将尿激酶(2,500ng)上样到聚丙烯酰胺凝胶并进行电泳。通过热印迹(扩散印迹)将尿激酶转移到质谱板上并直接地用质谱仪检测。结果是,检测出相应于25ng的峰高,如图19中所示。从结果中可以看出,通过热印迹方法从凝胶向质谱板的转移率估计约为1%。
实施例6:质谱板上包埋细菌视紫红质的脂质体的质谱分析
图20显示的是使用质谱仪测量细菌视紫红质(Sigma,B3636)得到的结果。样品放置在芯片上,空气干燥,加入0.5μL/点的2,5-二羟基苯甲酸(170mg/mL的乙醇溶液)并空气干燥后,用SELDI Protein Chip体系(Ciphergen)检测。质量校准使用β-乳球蛋白A(牛的),辣根过氧化物酶以及伴清蛋白(鸡)进行外部校准。SELDI Protein Chip体系的测量参数是:检测电压2100V,检测灵敏度10,激光强度285。结果是,在每种情况下在27027.3和28120.2位置观察到2个峰。由于细菌视紫红质的理论分子量为27068.0,前者为细菌视紫红质后者暗示为细菌视紫红质类蛋白,因为其对有机溶剂处理显示出视黄醛去除。
图20A显示当单独检测细菌视紫红质时,蛋白浓度与峰强度之间的相关性,从比例关系可以知道,检测限为20fmol。图20B显示单独细菌视紫红质、与简单脂质体共存条件下的细菌视紫红质以及包埋于脂质体中的细菌视紫红质的检测结果。在同样的溶剂条件下,在同样的浓度条件下,三种模式下细菌视紫红质显示出不同的MS信号强度,表明细菌视紫红质的质谱分析甚至可以在与简单脂质体共存和以及将细菌视紫红质包埋在脂质体中的条件下进行。
实施例7:质谱板上尿激酶受体的质谱分析
蛋白G通过共价键交联到质谱板上,抗尿激酶受体抗体以非共价的形式进行结合以制备质谱板。图21中所示的尿激酶受体纯化产物(图21A)应用到该板上并用常规的方法进行质谱分析(图21B)。结果是,尿激酶受体峰位置在分子量为49978.1的位置出现(图21C上),并且被认为是尿激酶受体配体的抗尿激酶受体IgG抗体也在理论分子量的区域出现。当非特异的IgG用来作为对照的时候,没有观察到尿激酶受体的质量峰(图21C下)。然后,将U937细胞膜级分进行质谱分析。结果是,在近似的位置发现尿激酶受体峰,推测来自U937细胞膜级分的尿激酶受体也能与抗尿激酶受体IgG特异地结合。此外,蛋白G共价地结合到质谱分析板上,以结合抗尿激酶受体IgG(山羊),其中蛋白G/抗体复合物作为板上的间隔。当尿激酶纯化产物应用到板上后,用常规的方法从U937细胞制备的蛋白脂质体溶液在4℃在板上反应过夜。使用包含辛基葡糖苷的缓冲液除去脂质体后进行质谱分析。结果是,尿激酶受体和尿激酶的组合峰在50,000Da左右出现(图25上)。尽管使用没有蛋白的简单脂质体代替蛋白脂质体的情况下在该位置也出现峰(图25中),但峰强度明显下降。即,两峰之间的差异源自尿激酶-受体有或无,表明了包埋尿激酶-受体的蛋白脂质体能与结合在板上尿激酶结合的事实。两峰的出现归因于尿激酶受体(的存在)并且在使用不能结合尿激酶的牛IgG代替抗尿激酶IgG的情况下,没有观察到尿激酶(图25下)。
这里需要特别引起注意的是下列事实:包埋在的脂质双层中的尿激酶受体可通过质谱用配体(尿激酶)集合地检测和鉴别,从而证实了本发明的基本原理。
实施例8:质谱板上糖成分的去除
带糖链的膜蛋白(尿激酶受体,牛视紫红质)以及可溶蛋白(尿激酶,辣根过氧(化)物酶),以及不带糖链的膜蛋白(细菌视紫红质)和可溶蛋白(β-乳球蛋白,细胞色素c)捕获在质谱板上,空气干燥,以0.5μl/点的方式加入溶解在50%乙腈-0.5%三氟乙酸中的饱和的芥子酸(SPA),饱和的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)或吲哚丙烯酸(IAA)并空气干燥。用SELDI Protein Chip体系(Ciphergen)进行检测。质量校准使用泛素(牛),肌红蛋白(马)和血清白蛋白(牛)进行外部校准。结果如表3和图22中所示。
表3质谱板上糖链的去除
蛋白 |
糖链 |
减少的分子量 |
膜 UKR蛋白 细菌视紫红质牛视紫红质ProUK可溶 HRP蛋白 β-乳球蛋白细胞色素c |
有无有有有无无 |
约3,000Da0约3,000Da约1,000Da约1,400Da约45Da约45Da |
不管是膜蛋白还是可溶的蛋白,使用SPA或IAA得到的分子量与从氨基酸序列得到的理论值很相近,但使用DHB得到的分子量值取决于是否存在蛋白糖链。例如,无糖链的细胞色素c蛋白在两种情况下几乎显示出同一分子量(SPA:12,251,DHB:12,297),但有糖链的尿激酶受体蛋白在使用DHB和SPA的情况中出现约3,000Da的差异(SPA:47,466,DHB:50,465)。对有糖链的其他蛋白而言,使用DHB得到的分子量比使用SPA或IAA得到的分子量高1000~3000Da。
对包含糖链或脂质组分的蛋白进行质谱分析时候,仅通过改变加入到质谱板上样品中的溶剂的组成去除所有的(或部分,取决于所用的条件)糖链或脂质,本发明方法能够得到简单蛋白的谱图,与需要用蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶等预处理的常规的方法形成鲜明对比。
本发明可应用于任何蛋白,无论是膜蛋白或水溶性蛋白,溶剂可包含除在组分中包含蛋白(即,限于为酶)的物质的催化剂以外的任何物质,其中浓度,加入顺序以及这些物质和测定原理等,质谱仪种类等都没有限制。
实施例9:变性蛋白的质谱检测
在质谱分析中,当水溶性蛋白例如细胞色素c,β-乳球蛋白,辣根过氧化物酶,尿激酶等使用芥子酸(SPA)作为溶剂进行检测时候,出现正常的MASS信号强度。但当用2,5-二羟基苯甲酸(DHB)作为溶剂的时候,MASS蜂变得特别弱(图23右)。对膜蛋白(细菌视紫红质,尿激酶受体)而言,这种溶剂效应刚好相反(图23左)。从这点可以知道,高度灵敏地只检测膜蛋白质组或高度灵敏地只检测水溶性蛋白质组成为可能。本发明一个重要的方面是提供了一种测定方法,可以提供水溶性蛋白和非水溶性蛋白的选择性检测,当某一蛋白,在天然的生理条件下是可溶的,由于某些原因变性成水不溶蛋白(本身肽段释放,遗传变异,具有相同序列的异结构分子相互改变成热力学更稳定结构等)。这用现有技术是无法实现的。
因此,本发明对致病性朊病毒(无论其为人、绵羊、牛、酵母等生物学物种)提供了超高灵敏检测和定量。该测定原理不但可以应用到其他神经退行性疾病,例如受变性的(不溶)淀粉样β-蛋白(Aβ)影响的Alzheimer氏疾病,受变性的(不溶)甲状腺素运载蛋白影响的家族性淀粉样多神经病等,也可以应用于由变性的(不溶的)蛋白引起的任何疾病的检测,动物检疫,肉类检查等。本发明可以广泛用做对可溶的分子的变性条件(不溶的)和生理条件(可溶的)进行分类的测定方法,例如对试管中的蛋白的复性程度进行测量等。
实施例10:结合到支持物上的配体与包埋在脂质体中的膜蛋白之间的结合
利用脂质体、生物膜(膜级分)或生物膜(细胞)作为膜蛋白支持物,质谱板、Sepharose 4B凝胶或磁性铁微粒作为配体支持物,以及蛋白G或生物素联合作为间隔臂,如表4中所示,来形成膜蛋白-配体复合物。
表4包埋在脂质体中的膜蛋白与结合到支持物上的配体之间的结合
配体 |
受体 | 检测方法 |
名称 |
支持物 |
间隔分子 |
名称 |
支持物 |
UK,IF,C5aUKPoAbPoAbUKUK,IF,C5aUK |
无板板S4B凝胶S4B凝胶S4B凝胶磁性铁粒 |
无PoAb/蛋白G蛋白G无无生物素生物素 |
UKR,IFR,C5aRUKRUKRUKRUKRUKR,IFR,C5aRUKR |
脂质体脂质体无无脂质体脂质体生物膜 |
荧光质谱质谱Western印迹荧光荧光荧光 |
结果是,发现支持物和配体之间存在间隔分子是优选的。根据配体的种类,当没有间隔时,包埋膜蛋白的脂质体根本不能结合或结合力很弱。这是因为由于两种分子固定在不同的固体表面上,亲合力(avidity)效果的相互作用需要多点结合,而不是亲和力(affinity)效果的单点结合。为了提供多点结合,需要合适的间隔分子介入,其减小了立体位阻并增加了两种分子结合过程中的碰撞频率。间隔分子存在配体和支持物之间,由生物学聚合物(蛋白等),合成聚合物,金属等组成,取决于分析目的可通过共价键或非共价键结合,并且可为具有三维空间的微小的网状,孔状等。
实施例11:固定在Sepharose 4B凝胶上的配体和脂质体包埋受体之间的结合
生物素标记的三种配体(尿激酶,干扰素-γ,补体C5a)与亲和素标记的Sepharose 4B凝胶结合。这种情况下的配体支持物为Sepharose 4B凝胶,间隔为亲和素(蛋白)。包埋膜蛋白的脂质体按照上述实施例1(2)的方法从FITC标记的荧光脂质体和U937膜级分进行制备,与固定在Sepharose 4B凝胶上的三种配体反应,用PBS洗涤三次,并用可见光和荧光进行观察。结果如图24中所示,所有的凝胶在可见光下观察呈白色(B)。在暗视野荧光下(A),只有Sepharose 4B凝胶没有观察到颜色,在使用了合并结合三种配体的其他凝胶中,却发射出荧光。该结果说明,本发明原理可适用于任何配体支持物/任何检测体系的组合,例如微粒/荧光,微粒/放射活性,微粒/二级信号产生试剂等,包括前述的质谱板/质谱。
在上述实施例中,尿激酶受体(GPI锚定型)、激活补体C5a受体(GPCR型)以及干扰素-γ受体(寡聚型)及其配体(尿激酶,C5a,IFNγ)之间相互作用(功能)的检测结果表明本发明可适用于任何型的受体。基于这些结果,本领域普通技术人员很容易理解下列事实:按照本发明的原理和方法,可以用配体分离和鉴别出任何膜相关受体,膜相关通道,膜相关泵,膜相关运载蛋白以及与这些蛋白伴随结合的物质,而不用考虑分子结构和功能。
尽管对进行膜蛋白和配体分析的全自动蛋白质组分析装置各个组分在质谱作为检测方法的情况下,进行了基本说明并显示了考察结果,本领域普通技术人员很容易理解:本发明适用于广泛的应用领域,如采用荧光分析的使用荧光标记的脂质体和配体-微粒偶联物的实例所示。
尽管本发明对优选的实施方案进行了重点描述,本领域普通技术人员很容易理解:可以使用优选的实施方案任何变化并且只是用来说明本发明可以实行而不是作为详细的描述。因此,本发明包括包含在本发明的精神和范围中如下述权利要求中定义的所有改变。
本申请基于美国临时专利申请60/260,433(2001年1月9日提交),以及60/272,981(2001年3月2提交),其内容这里引入作为参考。
这里引用所有的参考,包括专利、专利申请、以及公开,这里整体引入作为参考。