CN1930477A - 用于对结合进行定量的试剂及方法 - Google Patents

用于对结合进行定量的试剂及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1930477A
CN1930477A CNA2005800072530A CN200580007253A CN1930477A CN 1930477 A CN1930477 A CN 1930477A CN A2005800072530 A CNA2005800072530 A CN A2005800072530A CN 200580007253 A CN200580007253 A CN 200580007253A CN 1930477 A CN1930477 A CN 1930477A
Authority
CN
China
Prior art keywords
display systems
target part
domain
sample
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2005800072530A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1930477B (zh
Inventor
J·科利尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Badrilla Ltd
Original Assignee
Badrilla Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Badrilla Ltd filed Critical Badrilla Ltd
Publication of CN1930477A publication Critical patent/CN1930477A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1930477B publication Critical patent/CN1930477B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明提供了展示系统和用于在可能含有靶部分的样品中定量靶部分的方法，该方法包括采用特定浓度的展示系统或改变展示系统的量，以便产生比较点或校准曲线，该比较点或校准曲线提供了比较展示系统产生的信号和样品产生的信号的方法，其中所述展示系统包括所述靶部分或其局部的至少一个拷贝。

Description

用于对结合进行定量的试剂及方法
发明领域
本发明涉及对试剂与特异性结合伙伴的结合进行定量的试剂及方法，校准产品及其应用。本发明尤其但不专用于基于印迹的检测技术并涉及样品中试剂的定量。
发明背景
分离技术如基于印迹的技术可用于鉴别样品中特定靶分子的存在。一种基于印迹的技术，免疫印迹，可用于通过特定蛋白与特异于所述蛋白的抗体的相互作用而鉴别所述蛋白的存在。样品中的蛋白可通过电泳彼此分开，转移至适合的膜支撑物，然后用特异性抗体测定。抗体对蛋白的结合在膜上显现为“点”，提供关于蛋白存在和位置的信息。位置可以给出关于蛋白的物理状态的信息，例如糖基化、磷酸化或蛋白水解。
Western印迹和其它免疫技术的缺点在于产生的数据是定性的(无单位的)，其限制了从实验中获得的信息并且不能够提供包含单位的定量结果。而且，在灵敏度方面观察到相当大的日变化(day-to-dayvariation)，其阻碍了在分开的场合下进行的实验的快速比较，尤其是当该实验由不同研究者进行时。相应地，存在有相当大的实验间变化，其致使实验之间的比较变得困难和不精确。这些缺点限制了获得的信息的质量和技术的生产能力。
有多种其它的基于印迹的检测技术。Southern印迹是用于检测特定DNA序列存在的技术，而Northern印迹用于在混合物中定位特定RNA序列。ELISA技术具有高灵敏度，并由此能检测样品中非常少量的蛋白或其它抗原物质。本方法的基础是抗原被连接在板表面的抗体结合。通过采用结合到抗体的过氧化物酶检测免疫复合物的形成，其中过氧化物酶用于产生增强的显色反应。然而，尽管有ELISA的高灵敏度性质，其也不能定量样品中的蛋白或抗原。因此，与Western印迹有关的缺点也与其它的基于印迹的检测技术相关联。
存在有其它的基于分离的技术，如高效液相色谱(HPLC)和等电聚焦。等电聚焦技术为利用蛋白等电点的不同而分离蛋白的技术。蛋白等电点是蛋白无净电荷时的pH值。在该环境下蛋白在电场中不迁移。等电聚焦技术利用了在阴极和阳极之间建立的pH梯度，并且蛋白会向其等电点迁移。等电聚焦技术不提供真正的定量结果。
因此很久以来人们就期望简单的、可有效重现的校准技术，该技术可以克服所述缺点并提供在实验之间易于比较的定量数据。
发明陈述
本发明归于靶部分与支架物质中的至少一个或多个受控数目的位点或结构域的共价连接，该支架材料具有受控特性。以这种方式靶部分和支架材料构成展示系统，其可用作阳性对照、内标或可用于生成校准曲线。
本发明还提供了在可能含有靶部分的样品中定量靶部分的方法，该方法包括使用特定量的展示系统或改变展示系统的量，以便产生比较点或校准曲线，该比较点或校准曲线提供了比较展示系统产生的信号和样品产生的信号的手段，其中所述展示系统包括所述靶部分或其部分的至少一个拷贝。
贯串说明书和所附权利要求书，除非上下文所需，否则用语“包括”或不同形式应理解为包括陈述的整数或整数的组，并不排除任何其它整数或整数的组。
根据本发明的第一方面，提供了用于定量存在于样品中的靶部分的展示系统，该展示系统包括可由结合伙伴(binding partner)识别的靶部分或其局部的至少一个拷贝和共价连接到所述靶部分的支架的至少一个结构域，所述结构域对特异于所述靶部分(target moiety)或其局部(part)的结合伙伴无反应性。
在这里提及的靶部分或其局部包括但不限于DNA、RNA、蛋白或肽序列，抗原性结构或化学个体(chemical entity)或部分(moiety)。靶部分还可包括糖类、代谢物辅因子、半抗原或修饰基团。修饰基团可包括磷酸、亚硝酸基团、硫酸基团或糖基磷脂酰肌醇(GPI)基团。
展示系统的支架物质优选具有受控特性，该特性优选为相对分子质量(Mr)或重量(Mwt)或给定物质在溶液中等电点的pH值(pI)。
支架物质优选为蛋白。
支架物质优选包含具有至少一个或多个化学反应性基团的至少一个天然氨基酸或非天然氨基酸，该化学反应性基团优选位于残基侧链内。
支架优选包括一个或多个化学反应性基团，例如谷氨酸或天冬氨酸上的羰基，或酪氨酸上的羟基，以及更优选还包括至少一个半胱氨酸和/或赖氨酸基团。因此应理解支架物质可为硫醇或伯胺，或任何其中含有可用于与靶部分共价结合的合适反应性侧链基团如天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和/或赖氨酸基团的其它蛋白。希望靶部分与支架结构域的化学反应性基团的共价结合是受控的。
优选地，反应性半胱氨酸和/或赖氨酸基团的数量可通过从含有期望数量的反应性半胱氨酸和/或赖氨酸基团的天然来源中选择支架蛋白来控制。
支架蛋白优选选自包括以下成员的组：I27，来自含有两个半胱氨酸残基的肌联蛋白；I39结构域，剪接因子3b的亚基(亚基5)，含有1个半胱氨酸残基，含有1个半胱氨酸和1个赖氨酸残基的Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession Number Q8R448的Corti器蛋白(organ ofcorti protein)(Mus musculus)；热休克蛋白，线粒体的(Mus musculus)，Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession Number Q64433，其含有11个赖氨酸残基；剪接因子3B亚基5(Mus musculus)，Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession Number Q923D4，其含有1个半胱氨酸残基和5个赖氨酸残基；泛醇-细胞色素C还原酶复合物泛醌结合蛋白QP-C(Schizosaccharomyces pomme)，Swiss-Prot/TrEMBL PrimaryAccession Number P50523，其含有1个半胱氨酸残基和6个赖氨酸残基；E1B蛋白(人腺病毒11型)，Swiss-Prot/TrEMBL Primary AccessionNumber Q8B8U6，其含有1个半胱氨酸残基；伴侣蛋白(Arabidopsisthaliana)，Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession Number P34893，其含有9个赖氨酸残基；光系统II反应中心H蛋白(Arabidopsisthaliana)，Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession Number P56780，其含有3个赖氨酸残基；线粒体[前体](Homo sapiens)NADH-泛醌氧化还原酶亚基，Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession NumberP56181，其含有1个半胱氨酸和9个赖氨酸残基；信号识别颗粒蛋白(Mus musculus)，Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession NumberP49962，其含有2个半胱氨酸和8个赖氨酸残基；DNA聚合酶δ亚基4(Mus musculus)，Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession NumberQ9CWP8，其含有2个半胱氨酸和6个赖氨酸残基。
因此，应理解本发明的展示系统可提供多个与靶部分共价结合的位点，并且可根据使用者的需要选择支架。例如，线粒体[前体](Homosapiens)Swiss-Prot/TrEMBL Primary Accession Number Q56181，含有1个半胱氨酸和9个赖氨酸残基，可被选为连接靶部分的拷贝与单一半胱氨酸残基，或者含有1个半胱氨酸和1个赖氨酸残基的Corti器蛋白(Mus musculus)，Swiss-Prot/TrEMBL Primary AccessionNumber Q8R448，可选为连接靶部分的拷贝与半胱氨酸或赖氨酸残基，在这方面，本发明的展示系统灵活的减少至支架蛋白中的典型反应性残基。进一步的修饰反应性残基的方法将在以下描述。
在特定的实施方案中，展示系统可包括一个或多个结构域，如来自肌联蛋白的I27。肌联蛋白包括大量的属于Ig家族的β-夹心结构域。该I27结构域通常包含2个半胱氨酸残基并折叠形成10kDa的稳定结构。自然界中，I27结构域包含2个半胱氨酸残基(肽的共价结合位点)，然而，这些半胱氨酸残基的突变，例如突变为丝氨酸，与结构域折叠不相矛盾。因此可形成I27展示系统，其中分子量步长为方便的单位(10kDa步级)，并且其中一个单位(或更多，如果需要)可设计成拥有单一半胱氨酸残基用于肽连接，而所有其它I27单位没有半胱氨酸残基。在另外的实施方案中，I27单位可以没有其它反应性残基。这些残基可包括但不限于赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。I27拷贝可含有一个或多个这些反应性残基，为靶部分的共价结合提供受控数量的位点。
优选地，可通过修饰任何前述的支架蛋白控制反应性半胱氨酸和/或赖氨酸基团的数量，所述修饰采用添加或去除任一或多个反应性半胱氨酸和/或赖氨酸残基或使任一或多个反应性半胱氨酸和/或赖氨酸残基无作用的选择性突变来实现。
或者，一个或多个肌联蛋白结构域可突变为具有一个半胱氨酸残基或无半胱氨酸残基。在一个实施方案中，展示系统包括一个或多个I27结构域，以及靶部分的拷贝，其中I27结构域之一含有单一半胱氨酸残基而其它I27结构域无半胱氨酸残基。在优选实施方案中，展示系统包括5个I27结构域。
在另一实施方案中，展示系统的结构域可包括I39结构域，其是剪接因子3b的亚基(亚基5)。I39结构域为10kDa的结构域。
如前所述，在一个实施方案中，展示系统可以包括不同的结构域。例如，除了靶部分或其局部的至少一个拷贝外，展示系统可包括至少一个I39结构域以及至少一个I27结构域或任何一个或多个前述支架蛋白结构域。在一实施方案中，展示系统可包括4个I27结构域和1个I39结构域或其任何其它组合，该组合包括选自此前描述的支架蛋白的前述结构域的任何一个。
优选地，本发明的结构域或支架蛋白具有适宜的分子量并且出于方便典型地选择为10kDa。
优选地，展示系统可包括不同类型的单位或结构域的混合或多个相同结构域。单位或结构域可为已知分子量和/或pI，并且对特异于靶部分或其局部的结合伙伴无知觉(blind)，即无反应性，因此展示系统的单位或结构域可被认为是能够区分的，以至于它们为绝对或相对的“免疫无知觉”或“反应性上惰化”或基本上如此。在优选实施方案中，所述至少一个结构域源自与靶部分或其局部不同的分子，或为不同种类。
这里提到的展示系统旨在包括但不限于包含一个或多个串联连接的线性单元或结构域的分子。
在另一实施方案中，展示系统可包含至少一个生物或非生物聚合物。非生物聚合物的例子是PEG(聚乙二醇)。由此在该实施方案中，展示系统被认为是PEG化的。在靶部分为肽或蛋白的实施方案中，PEG聚合物可连接在至少一个靶部分的氨基酸序列的官能团上。或者，PEG聚合物可连接在包含在展示系统中的靶部分的至少一个拷贝内的糖链上。
可采用多种已知方法将靶部分并入展示系统。例如，通过半胱氨酸上的巯基共价连接。在特定的实施方案中，靶部分可与展示系统结合。或者，如果靶部分是蛋白或肽而展示系统也为蛋白或肽，编码靶部分的DNA片段可以并入编码展示系统的DNA，接着用已知的蛋白表达方法随展示系统表达。
在一个实施方案中，当展示系统是蛋白或肽时，其可包含大量的稳定折叠的蛋白结构域。为了改变展示系统的分子量，可以改变结构域的数量。在一个实施优选方案中，至少一个结构域含有能够接受来自靶部分或其局部的共价键的氨基酸。在另外的实施方案中，该至少一个结构域或该至少一个靶部分或其局部的拷贝可被修饰以便提供共价连接。除了靶部分或其局部以外，展示系统的结构域是惰性的，也就是说，这些结构域对特异于靶部分或其局部的结合伙伴无反应性。“惰性的”结构域控制展示系统的分子量，以促进样品的多重化。此处提到的多重化指易于将源自特定方法的信息容易地去卷积(deconvolution)，该方法采用测试和展示系统样品的混合以获得源自测试组分的信号和源自展示系统的信号。
展示系统的形式依赖于待检测和定量的靶部分的形式。例如，如果待定量的靶部分为核酸，那么展示系统可包括核酸序列。展示系统可包括已知分子量的DNA单位或结构域的序列。或者，展示系统可包括RNA单位。或者，如果靶部分为肽表位或蛋白，那么展示系统也可以包括肽单位或结构域，并且Western印迹或ELISA可用于定量样品中存在的靶部分。也可以设想杂组合可构成系统组成，即展示系统可包括肽和核酸。
靶部分或其局部可以为肽或蛋白序列。或者，或还有，靶部分或其局部可为表位或抗原序列。靶部分或其局部在展示系统线性序列中的位置可变。在本发明的一个实施方案中，展示系统在其序列中可具有靶部分或其局部的一个拷贝。在另一实施方案中，展示系统可包括靶部分或其局部的一个以上的拷贝。在特定实施方案中，展示系统可包括不同的靶部分或其局部。例如，在一个实施方案中，展示系统可包括蛋白序列以及金属或染料。在一实施方案中，靶部分之一可以是组氨酸-标签并且另外的靶部分可以是肽表位。在这些实施方案中，展示系统中的靶部分或其局部可以不是可存在于样品中的靶部分。
靶部分或其局部在展示系统内可为线性的或分枝的。也就是说，靶部分可通过支架物质的侧链共价连接。在此提及的“分枝的”指非线性并且聚合体通过侧链而非肽链骨架或核酸对等物(骨架由核糖/脱氧核糖环的碳3和碳5之间的磷酸二脂键形成，这里靶部分与核酸中其它位点的共价键相当于分枝结构)的共价键形成。
在此提到的蛋白或产品打算包括：蛋白复合物或片段；酶；酶产物或结合物；初级代谢物；激素或抗体。
当展示系统和/或靶部分为蛋白或肽，等电点(pI)可以是可控的。当使用的分离技术为2-D电泳时，该特定实施方案尤其有利。
在本发明的特定实施方案中，靶部分包括蛋白SERCA2a。展示系统可包括SERCA2a的表位。SERCA2a为肌质网Ca2+-ATPase家族的心肌同种型。在优选实施方案中，SERCA2a的表位包括氨基酸序列CLEPAILE。
在另一实施方案中，靶部分为在丝氨酸-38上磷酸化的蛋白SERCA2a。优选地，展示系统包括来自该蛋白的表位。优选地，该表位包括氨基酸序列31KLKERWGS(PO4)NEL41。
这里提到的特异性结合伙伴指对靶部分的拷贝具有特异的结合亲合性，并能够与其结合的任何分子。
优选地，结合伙伴选自包括抗体、RNA或DNA或肽适配体(peptideaptamer)或其它抗体等同物、染料、药物和金属螯合物的组。结合伙伴可以是与靶部分相同的种类，例如多肽与肽结合或核酸聚合物与核酸聚合物结合。或者，特异结合伙伴可与靶部分种类不同，例如核酸聚合物与肽/多肽结合；染料与肽/多肽结合。如果靶部分是抗体，其可为单克隆的，例如但并不限于A1或抗-His6，如果靶是多克隆抗体，例如其可以为但不限于PS-38、PT-17、CLEP或抗-Alexa荧光染料抗体。如果结合伙伴为抗体，其可与含有肽表位或染料表位的靶部分特异地结合。如果特异性结合伙伴为金属螯合物，其可例如为但不限于Ni+过氧化物酶形式的镍离子。
在本发明特定实施方案中，展示系统包括至少一个I27结构域和/或至少一个I39结构域，并且靶部分选自A1(LTRSAIRRAS)、PS-38(已定义)或PT17肽(RSAIRRAST(PO4)IEY)。
由此，本发明还提供校准标准，其简单、可靠和用户友好，以及使不同场合进行的实验的结果的准确比较成为可能。
在本发明的另一方面，提供了用于定量可能存在于样品中的靶部分的产品，该产品包括数个展示系统，每个展示系统包括靶部分或其局部的至少一个拷贝和与所述靶部分(target moiety)共价连结的至少一个结构域，其中结构域对特异于所述靶部分或其局部的结合伙伴无反应性，另外，其中产品中每个展示系统具有不同于其它展示系统的分子量。
在本发明另一方面，提供了用于定量样品中靶部分的试剂盒，该试剂盒包括展示系统，所述展示系统如前所述。任选地，该试剂盒另外包括特异于靶部分或其局部的结合伙伴。展示系统的结构域对结合伙伴是“惰性的”或无知觉的，即不与结合伙伴结合。任选地，试剂盒中可包括其使用说明书。
在本发明的一个实施方案中，展示系统作为阳性对照样品提供在试剂盒中。试剂盒另外含有抗体产品。该抗体产品可为结合伙伴。该展示系统包括将与抗体结合伙伴反应的靶部分或其局部，由此提供阳性对照。
在本发明的另一方面，提供了前述产品(展示系统)的用途，用于定量可能存在于样品中的靶部分。
在本发明的另一方面，提供了在可能含有靶部分的样品中定量靶部分的方法，包括：
a)提供展示系统，该展示系统包括可由结合伙伴识别的靶部分或其局部的至少一个拷贝和对所述结合伙伴是无反应性的至少一个结构域，所述靶部分的至少一个拷贝与支架的至少一个结构域共价键合；
b)对所述展示系统进行分离检测技术，其中所述展示系统以特定量存在；
c)产生至少一个包括由展示系统产生的信号强度对展示系统的量的比较点。
优选地，该方法包括任意一个或多个此前所述特征。
这里提到的基于分离的检测实验或技术可包括但不限于例如免疫分析的检测技术，其基于通过特异性识别存在于展示系统或样品中的靶部分的抗体或其它类型的特异结合伙伴的检测。这类分析包括斑点印迹、Western印迹、RIA、免疫沉淀以及荧光偏振。或者，本发明的方法可利用其它基于印迹的检测实验或技术，例如Northern印迹或Southern印迹或PCR。基于分离的技术也可以包括高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳、质谱和等电聚焦以及上述方法的组合(例如2D电泳，HPLC-MS)。可以设想本发明的方法也可以用在例如ELISA的技术中。在另外的实施方案中，质谱可用作检测方法，单独或与其它检测方法如HPLC联合应用。技术的选择取决于使用者对结合伙伴和靶部分的选择，并不意味着限制本发明的范围。本文以下以及在实例中给出了分离技术的适当选择。
优选地，该方法包括其它的步骤，该步骤将比较点或多个比较点与样品进行比较，以定量存在于样品中的靶部分。优选地，已知展示系统的分子量。或者，或另外，已知展示系统的pI。尤其有利的是了解展示系统的分子量，以便比较展示系统与可能含有靶部分或其局部的样品。在一个实施方案中，展示系统以单一量存在。在该实施方案中，将产生单个比较点。因此，在此实施方案中，展示系统用作内标。这可用来确认靶分子的检测已正确进行，其中展示系统起阳性对照和参考信号的作用。这在样品中无靶分子的情况下是尤其重要的(见图2的实施例)。
这里提到的术语“展示系统的量”，在一些实施方案中，可以认为是指展示系统的使用浓度。在其它实施方案中，术语“展示系统的量”，可以认为是指展示系统存在于样品中的密度。密度可以用几种方法定量，例如，检测样品的荧光强度或光强度。
可以设想本发明的实施方案可用在来自不同生理状态下(例如，发育、疾病相对于对照状态等)的样品间的部分或整个细胞或组织的蛋白库(protein repertoire)的比较。现在，对某些形式的蛋白的翻译后修饰进行染色已成为可能，如磷蛋白和糖蛋白。将包括含有靶部分的展示系统的内标并入试验设计中，会改进数据的定量并且允许平行或不同场合进行的试验间结果的快速比较，其中所述靶部分为适当修饰的肽结构(磷酸肽、糖肽或其它修饰肽)。
优选地，展示系统以一系列变化的量存在。在此实施方案中，可产生多个比较点，由此可生成校准曲线。
在一个实施方案中，生成的比较点或校准曲线随后可用于定量样品中的靶部分。具体地，本发明生成的比较点或校准曲线将作为展示系统一部分的靶部分或其局部产生的信号强度相对于展示系统的浓度作图。然后对可能含有靶部分的样品进行进一步基于分离的检测技术。或者，样品与展示系统同时进行进一步的基于分离的检测技术。如观察到任何信号，信号的强度随后被测定。然后，比较点可用于相对于校准点或校准曲线中靶的量来表示样品中靶部分的量，以确定存在于样品中的靶部分的量。样品或展示系统产生的信号可以是例如但不限于化学发光。其它检测方法包括用于酶催化检测的显色底物，其为不溶性有色产物，如4-甲氧基-萘酚/H2O2用于基于过氧化物酶的抗-IgG，或基于荧光的检测系统，其利用连接到诸如抗体或蛋白A或蛋白G的检测试剂的荧光基团。放射性125I标记抗体或蛋白A蛋白G。在另外的实施方案中，可以利用涉及染料结合到展示系统的检测方法。可使用的染料包括但不限于，用于含有磷酸化氨基酸的蛋白的染料Pro-Q Diamond(Molecular Probes，OR，USA)以及用于含有糖类的部分的染料Pro-Q Emerald(Molecular Probes，OR，USA)。其它结合伙伴可为其它化学分子，例如药物或候选药物分子。
在此实施方案或其它实施方案中，检测技术可包括采用INDIATMHisProbeTM-HRP化学。PerbioTM INDIA HisProbeTM-HRP探针为辣根过氧化物酶(HRP)的镍(Ni2+)活化衍生物。活性配体为三齿螯合物，在随后的相互作用和靶部分的检测中允许Ni2+以活性形式被结合。活性螯合物具有与已报道的亚氨基二乙酸类似的结合能力，其中亚氨基二乙酸已在固相金属亲合层析(IMAC)中使用很长时间。除INDIATMHisProbeTM-HRP化学以外，可采用例如化学发光底物技术的其他检测技术。或者，可采用其它分离技术。
分离技术，如基于印迹的技术，可在展示系统上进行，以便展示系统作为充分聚集的或明显的带而迁移，与样品中的SERCA2a分离。一旦实施分离技术，本方法使使用者能够清晰地从样品中得到展示系统。这是一个多重化(multiplexing)的例子。由此，本发明提供一方法，其使得从分离技术试验中产生真正定量的数据成为可能。
在一个实施方案中，一个以上的展示系统可用于定量样品中的靶部分。在此实施方案中，每一展示系统可具有不同于其它使用的展示系统的分子量。例如，只含有一个结构域的展示系统与含有两个、三个、四个、五个或更多结构域的展示系统可被置于同一泳道(lane)或通道(channel)中，因此形成不同分子量展示系统的“梯状物”。优选地，每一展示系统具有相同靶部分或其局部的拷贝，以便于与可能含有靶部分的样品进行比较。
在此实施方案中，每一展示系统可具有与其它展示系统不同的浓度或量。或者，展示系统间的浓度或量可相同。一种或多种基于分离的检测技术可在数个展示系统上进行。然后基于分离的检测技术的结果可用于生成校准曲线，其可用于确定存在于样品中的靶部分的量。
因此，在一个实施方案中，展示系统出现在印迹的一个通道中，可能含有靶部分的样品出现在不同的通道中。在采用数个不同分子量的展示系统的实施方案中，所有的展示系统样品可加载进单一通道中，因此在单一泳道中提供了几个参考点。相似地，在采用含有以不同浓度存在的多个表达系统的样品的实施方案中，每一含有特定展示系统的样品可加载进同一泳道，由此提供在单一泳道内不同浓度的例子。在本发明的这些实施方案中，该方法允许同时在单一试验中检测展示系统和可能含有靶部分的样品。本实施方案有利地提供了展示系统和样品间明确的区分，尽管同时对二者进行基于分离的技术。
或者，展示系统和样品可以存在于印迹的同一通道或泳道中。
一实施方案提供了一展示系统，其包括能够与药物分子结合的靶分子或其局部，该药物分子为特异结合伙伴。然后，展示系统所产生的信号强度可与样品的信号强度比较。
在另一实施方案中，结合伙伴可以为着色剂或染料。此类着色剂的一种为Pro-Q Emerald(Molecular Probes)，当靶部分或其局部为糖蛋白时其可作为结合伙伴。另一个作为结合伙伴的着色剂的例子是Pro-Q Diamond(Molecular Probes)，其可与含有磷蛋白的靶部分结合。当结合伙伴为染料或着色剂时，展示系统的结构域必须为基本上“沉默的”并且必须不被染料或着色剂强烈地识别或检测。
优选地，结合伙伴为适配体(aptamer)。适配体为新合成的DNA或RNA配体，其被定义为能够针对氨基酸、药物、蛋白和其它分子而产生的人工核酸配体。适配体可以是双链DNA配体或单链RNA配体。它们通过反复的吸附、回收和再扩增(SELEX)，从复杂的合成核酸库中分离出来。RNA适配分子是与特异靶分子有亲合性的核酸分子。由于其配体结合特性，它们被当作核酸抗体。
展示系统还可含有标签或可检测的分子。标签可执行纯化展示系统的功能。应理解标记物可位于氨基端或羧基端或相对于展示系统的氨基酸序列插入内部。标记物或可检测分子的其它实例包括但不限于polyHis-标签、FLAG、STREP、GST或荧光标记如GFP。在另一实施方案中，标记物可包括展示系统的靶部分或其局部。
在另一实施方案中，免疫沉淀可用作分离方法。免疫沉淀允许纯化针对其已生成抗体的特定蛋白。因此，免疫沉淀可用于采用针对靶部分或其局部的抗体来分离展示系统，而该靶部分或其局部了构成展示系统的一部分，并且如果靶部分存在时，也可用于从样品中分离该靶部分。免疫沉淀后可继之以SDS-PAGE和免疫印迹分析。在本发明的此实施方案中，免疫沉淀派生物，亲合相互作用允许“拉下”特定靶物质，例如Ni-NTA珠拉下(his)6-标记的蛋白，谷胱甘肽珠拉下GST-标记的蛋白，其可用于监测该过程中各阶段的效力。
本发明提供展示系统可控的、可预测的制备。而且，其提供校准标准，该校准标准显示高质量特性，包括展示系统的接近均一的电泳行为，并多重化检测样品和展示系统样品。这具有提高样品处理量的优点。
在本发明的另一方面，提供了定量样品中SERCA2a蛋白的方法，该方法包括：
a)提供一蛋白，其包含可被抗体识别的SERCA2a表位的至少一个拷贝，以及对所述抗体无反应性的至少一个来自肌联蛋白的I27结构域，其中所述蛋白分子量已知；
b)对所述蛋白进行Western印迹，其中所述蛋白为特定浓度；
c)生成包括由该蛋白产生的信号强度相对于该蛋白的浓度的至少一个比较点。
优选地，蛋白为一系列变化浓度并且比较点包括数个比较点，因此提供校准曲线。优选地，通过样品产生的信号强度与校准曲线的比较，比较点或校准曲线继而用于确定存在于样品中的SERCA2a蛋白的量。在优选实施方案中，该表位包括氨基酸序列YLEPAILE。
在另一实施方案中，蛋白SERCA2a在丝氨酸-38磷酸化。优选地，该蛋白包含磷酸化的SERCA2a蛋白的表位。在特定实施方案中，该表位包含氨基酸序列31KLKERWGS(PO4)NEL41。
在本发明另一方面，提供定量存在于样品中的蛋白表位的量的方法，所述方法包括：
a)提供蛋白展示系统，该展示系统包括蛋白表位的至少一个拷贝以及至少一个其它蛋白结构域，其中所述展示系统分子量已知；
b)对所述展示系统进行Western印迹实验，其中所述展示系统为特定浓度；其中所述Western印迹实验利用特异于靶部分的结合伙伴；以及其中所述展示系统的蛋白结构域对结合伙伴无反应性；以及
c)生成包括由所述技术中的展示系统产生的信号强度对展示系统的浓度的比较点。
优选地，展示系统为一系列变化的量，并且所述比较点为可用于生成校准曲线的数个比较点。在一个实施方案中，展示系统内靶部分数量的控制可通过选择具有期望数量的反应性残基的蛋白来实现，或可通过工程化蛋白序列以使其含有有限数目的用于蛋白表位共价连接的接受位点来实现。在优选实施方案中，仅有一个用于共价连接的位点。在另外的实施方案中，可以有多于一个用于蛋白表位与蛋白结构域连接以形成展示系统的位点。本发明的优点在于展示系统的分子量是可控的。这可以通过使用由大量稳定折叠的结构域组成的展示系统而实现。在此实施方案中，结构域为蛋白结构域。通过改变展示系统中结构域的数量，可改变展示系统的分子量。在优选实施方案中，这些结构域之一含有能够接受来自修饰的表位蛋白的共价键的氨基酸。其它结构域在这种意义上是惰性的，但是其存在是为了控制展示系统的分子量以利于样品多重化，并在多种组分存在时利于多种展示系统组分的分离(例如，下文所述的single shot应用，2D电泳的内标)。
本发明能够有利地精确控制展示系统的分子量，跨越很宽的Mr范围(10kDa-250kDa，根据需要或更大，或更小)。结果，本发明在标准和检测样品的多重化中将提供灵活性。它也允许校准标准技术的高级形式的发展，其使得校准标准的范围以“single shot”分配，因此极大地方便了最终使用者。在优选实施方案中，可具有不同分子量的一系列的展示系统加载进单一通道中经历分离技术。如果需要，本实施方案给使用者提供多种校准标准与样品比较。在优选的实施方案中，本发明的方法使用数个展示系统，它们可用于在单一试验中以提供一范围。数个展示系统可具有不同分子量并可混合在一起或以特定的摩尔比例掺合以得到一系列的展示系统，其可用于基于单一分离的试验中或在同一个展示系统进行两种检测。
现在，将仅通过举例的方式并参考附图对本发明进行描述，其中：
图1：显示丝氨酸-38展示系统(校准标准)的特异性识别。图1A显示校准标准(称作校准-38)的示意图。抗原表位肽共价键合于如参考文献9所述的串联体(I27)5的第三结构域的半胱氨酸残基。图1B显示由电喷雾质谱描述的校准-38的成分。产品(校准-38)与底物(I27)5组分和污染物分离。标记有*的组分包括在产物产率的计算中(5.4％)。C)校准-38(0.06-3.2pmol)和校准-αCLEP(0.3-60pmol总(I27)5蛋白)在10％SDS-PAGE凝胶电泳后，用抗体SERCA PS-38(1∶5000稀释)通过Western印迹进行分析。SERCA PS-38在加载量0.1pmol及以上检测到校准-38产品(～60kDa)。图1C显示仅校准-38被抗-SERCA-38抗体识别，其证实展示系统为免疫沉默的。
图2显示通过抗体SERCA PS-38未在大鼠心肌细胞中检测到SERCA磷酸化。因此，图2为阴性结果。如无其它说明，分离的大鼠心室肌细胞以0.5Hz电同步(paced)5分钟。细胞(A：10,000；B：2,500；杆状细胞计数)不经进一步的干预(对照泳道1)或用1μM异丙基肾上腺素(泳道2)处理；暴露于增加的刺激频率(2.5Hz，泳道3)；暴露于2.5mM的细胞外钙(泳道4)；或暴露于1μM calyculin A(泳道5)。A)校准-38(浓度范围0.01-3.2pmol)和大鼠肌细胞经SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺)并转移至PVDF膜。采用抗体SERCA PS-38(1∶5000)探测印迹，并用山羊抗兔IgG过氧化物酶连同增强的化学发光底物(SuperSignalWest Femto Maximum Sensitivity Substrate，Pierce)观测。B)在平行实验中，肌细胞通过15％SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜。采用抗体PT-17(1∶5000)检测苏氨酸17磷酸化的受磷蛋白。
图3：显示SDS-PAGE凝胶，其在不同泳道载有不同浓度用于SERCA2a蛋白的展示系统以及在单一泳道中含有包括SERCA2a蛋白的样品。图3显示本发明的实施方案用作阳性对照。
图4A：为具有5个相同I27结构域的(I27)5构建体的示意图。结构域3含有用于与具有巯基特异反应性基团的肽共价连接的游离巯基(C47)。图4A也显示相应基因中的独特限制性位点的位置。
图4B：为具有5个相同I27结构域和不同的I39结构域的I39-(I27)4构建体的示意图，因此显示了包括不同结构域的展示系统。I39结构域含有用于与具有巯基特异反应性基团的肽共价连接的游离巯基(C41)。图4B也显示相应基因中的独特限制性位点的位置。
图5：显示3种不同的肽(PS-38，PT17和A1)通过它们巯基特异的马来酰亚胺反应性基团成功地结合到相同和不同串联体(concatamer)的游离巯基基团。(A)＝(I27)5+PS-38/PT17或A1。(B)＝I39-(I27)4+PS-38/PT17或A1。(M＝标记物，kDa＝千道尔顿)。见实施例6。
图6为Western印迹，显示A1-(I27)5和A1-I39-(I27)4可与A1-(I27)1以不同的比例成功地掺合以给出校准标准的“梯状物”显示。(A)＝A1-(I27)5和A1-(I27)1间的掺合。(B)＝A1-I39-(I27)4和A1-(I27)1间的掺合。样品跑15％SDS-PAGE凝胶。结合和Western印迹如以前所述进行。
图7显示Pro-Q染色的凝胶(图7A)，显示磷酸化结合物的特异检测，在右手侧(图7B)，考马斯染色的凝胶显示每一样品的总蛋白量。标记物为PeppermintStick磷蛋白分子量标准(Molecular Probes)，其也在45(卵清蛋白＝磷酸化的)和23.6kDa(β-酪蛋白＝磷酸化的)处含有阳性对照。PS-38-(I27)5分别以不同的体积40μl和20μl加载。
图8为条形图，显示以总蛋白考马斯染色的百分比表示的Pro-Q染色的磷蛋白的光密度(采用AIDA图像分析仪(Raytest)测量)。图8显示相对于裸露的非结合串联体骨架和非磷酸化结合物的固有背景荧光，磷酸化结合物的光密度显著增加。
图9为条形图，显示当样品体积变化时，光密度的成比例变化。通过将磷酸化结合物的样品体积减半，样品的光密度也减少大约一半。因此，串联体/结合物可用作染料的校准标准。
图10A为Alexa-(I27)5(见实施例7)的示意图，图10B为Alexa-(I27)1(见实施例7)的示意图。
图11代表Alexa-(I27)5结合物(展示系统)(见实施例7)校准曲线。
图12：A1-(I27)5结合物(展示系统)的校准曲线。
图13：采用两不同的检测方法和两不同的识别表位证实对PS-38-(I27)5的检测。
图14：采用相同分子上两不同表位检测PT17-(I27)5。泳道1代表采用针对His6标签表位的第一单克隆抗体检测5pmol的PT17-(I27)5。泳道2代表相同的印迹，其经剥离(strip)，并用针对PT17肽生成的抗体再次探测。
图15显示PT17肽与(I39)1的结合。
图16为Western印迹，显示室温下PT17肽与(I39)1的结合。
图17显示A1-(I27)5结合物的免疫沉淀。
图18显示监视图17的IP实验的效率。
发明详细描述
构建体A：-(I27)5
对于肌联蛋白的I27结构域，半胱氨酸残基C47为表位肽共价连接的位点。(细节参考实施例2，“包括含有肌联蛋白I27结构域的支架蛋白的展示系统(称为(I27)5的实施方案的产生)。构建了编码串联的5拷贝I27的合成基因。I27的拷贝1、2、4和5无半胱氨酸残基，拷贝3保留单一的cys用于肽连接。(His)6模块包括在内，用于产物纯化。接头区含有独特的序列和限制性位点(见图4A)。
包含5个来自人肌联蛋白分子的I27结构域的构建体被插入pET3d的His6标签的下游。结构域I271、I272、I274、I275采用突变C47S和C67S去除了它们的半胱氨酸残基。结构域I273去除了位置63的半胱氨酸残基(C63S)，但在位置47保留有半胱氨酸残基(见图4A)。
构建体在BLR(DE3)pLysS细胞系(Novagen)中表达，在用1mMIPTG诱导后4h收集细胞。(I27)5构建体的示意图参见图4A。用于构建的独特限制性位点示于图4A中。
构建体B：-I39(I27)4
术语“I39”用作IMAGE克隆3965951的缩写，其为IMAGE协会提供的小鼠剪接因子3b，亚基5基因(登录号BC006603)的cDNA克隆。小鼠剪接因子3b，亚基5基因产物为10kDa的含有单一半胱氨酸残基的蛋白。
PCR用于扩增该I39cDNA，并设计了在侧翼添加限制酶识别位点BssHII(5’)和SadI(3’)。采用这两种限制酶，(I27)5构建体的中间的I273结构域(图4A)用I39cDNA序列置换，产生了I39(I27)4构建体(图4B)。图4B显示用于构建的独特限制性位点。
I39(I27)4构建体在BLR(DE3)pLysS细胞系(Novagen)中表达，在1mM IPTG诱导后1h收集细胞。
构建体C：-I39pET14b。术语“I39”用作IMAGE克隆3965951的缩写，其为IMAGE协会提供的小鼠剪接因子3b，亚基5基因(登录号BC006603)的cDNA克隆，如上所述。
PCR用于扩增该I39cDNA，并设计了在侧翼添加限制酶识别位点BamHI(5’)和BIpI(3’)。采用这两限制酶，将PCR产物克隆进表达载体pET14b(Novagen)的相应位点。出于构建目的，该蛋白的C端残基被改变，N111T。I39pET14b构建体在Rosetta-gami B(DE3)pLysS细胞系(Novagen)中表达，在1mM IPTG诱导后4h收集细胞。
                       实施例1
本发明的方法用于检测样品中的蛋白SERCA2a。按照用于校准SERCA-PS38的方法，构建用于识别SERCA2a的C末端的抗体α-CLEPAILE的展示系统(校准标准)，让0.1微摩尔的肽YLEPAILE(单字母代码)与5微摩尔的4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)反应；通过凝胶过滤层析纯化肽交联复合物；在9M脲存在下将肽交联产物与(I27)5(0.02微摩尔)孵育。产物对水透析，并采用BCA测试和质谱法测定蛋白浓度，如实施例2“校准标准(展示系统)的SERCA PS-38识别”部分所述。
心肌肌质网样品中SERCA的定量
将心脏肌质网(10μg)和校准-CLEPAILE标准(15-0.05pmol)在10％SDS-PAGE凝胶的独立泳道上分离。样品转移至PVDF膜，并用特异于SERCA2a序列LEPAILE(1∶5000稀释)的抗体检测。结合到其表位的抗体用山羊抗兔IgG-过氧化物酶和商品化化学发光底物制剂(Pierce)检测。采用CCD相机检测化学发光(图3)。
样品中SERCA2a的定量可通过光密度分析法分析样品和校准标准的带强度而实现。应准备出光密度(相对背景信号经修正)相对于展示系统(校准标准)量的曲线图。该曲线图认为是校准标准曲线。样品的SERCA2a蛋白含量可采用校准标准曲线，通过将该样品的光密度信号(相对背景经修正)从该曲线图转变为皮摩尔的表位而计算出来。
以上实施例显示了本发明的展示系统和方法可用于阳性鉴定样品中的靶部分和定量样品中的靶部分的方式。
                       实施例2
实施例2显示了展示系统和本发明方法可用于阴性鉴定样品中的靶部分的方式，即靶部分不存在于样品中。
本发明的方法用于检测肌质网Ca2+-ATPase(SERCA2a)丝氨酸-38上的磷酸化。标准的Western印迹方法没有在激酶处理的肌质网囊泡和分离的大鼠心室肌细胞中检测到丝氨酸-38磷酸化的Ca2+-ATPase。
肌质网Ca2+-ATPase的心肌同种型(SERCA2a)在丝氨酸-38的磷酸化已被描述为能够非常明显地增强酶活性的调节事件。还未出现对这些观察结果的独立的证实。完全特异于Ca2+-ATPase上的磷酸化丝氨酸-38表位的多克隆抗体被用于评估分离的肌质网囊泡和分离的大鼠心室肌细胞中的SERCA2a的磷酸化。定量Western印迹方法没有在激酶处理的肌质网囊泡或合适刺激的心肌细胞中检测到丝氨酸-38磷酸化的Ca2+-ATPase。本发明的展示系统证明试验的检测灵敏度(0.03-0.1pmol)足以检测刚刚1％的Ca2+-ATPase分子在丝氨酸-38的磷酸化。尽管100kDa的磷蛋白明显存在于兔心脏SR制备物中，但没有被磷-丝氨酸-38特异的抗体识别(2)。
制备磷-特异抗体。
在Ser-38残基上磷酸化的Ca2+-ATPase肽(31KLKERWGS(PO4)NEL41)通过对肽31KLKERWGSNEL41进行CaMKII磷酸化而制备。磷肽通过反相高效液相色谱纯化到均质。采用碳二亚胺交联(3)将肽结合到匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)并对缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.2，150mM NaCl)充分透析。成年New Zealand White兔用～150μgKLH和连接的肽以间隔6周的方式免疫并在免疫后11天收集免疫血清。制备血清并保存在-70℃。这里描述了多克隆抗血清：针对磷酸化肽制备的SERCA PS-38。
包括包含肌联蛋白I27结构域的支架蛋白(称为(I27)5)的展示系统的实施方案的产生。
采用了编码突变形式的肌联蛋白I27结构域的串联体的基因。该构建体与Brockwell等描述的构架体(4)的不同之处在于两C-末端半胱氨酸残基被删除。在该整个研究中它被称为(I27)5。以Brockwell等描述的方式(4)表达和制备(I27)5。
展示系统：包括结合到串联体的肽的实施方案
将纯化的磷酸化Ser-38肽(31KLKERWGS(PO4)NEL41)(0.1μmol)与过量的4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)交联剂(5μmol)混合在含有0.1M磷酸钠、0.15M NaCl、pH为7.2的缓冲液中。在室温下孵育1h后，马来酰亚胺活化的肽通过采用Superdex Peptide HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)的凝胶过滤层析纯化。该层析采用0.1M磷酸钠、0.15M NaCl、pH为7.2和0.25ml/min的流速进行。合并目的组分，向该组分中加入尿素得到9M的尿素终浓度。(I27)5串联体(0.1μmol)加入到混合物中，并在室温下孵育2h。该结合物对水充分透析。最终产物(本发明的展示系统)保存在-20℃。同样的程序沿用于将SERCA2a肽(YLEPAILE)结合到(I27)5串联体以形成另一展示系统。蛋白浓度通过BCA分析(5)测定。
免疫印迹分析
如Laemmli(8)所述的方式，对心肌蛋白采用10％和15％的聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分离。分离后，蛋白通过半干印迹法转移到PVDF膜(Pall BioSupport，Portsmouth，UK)，非特异性结合位点在室温下用5％奶粉和Tris缓冲的盐水(pH 7.4)、0.1％Tween 20封闭2-4h。采用第一抗体：用于受磷蛋白的Thr-17磷酸化形式的PT-17(1∶5000)(6)；用于SERCA2a的α-CLEP(1∶5000)；以及特异于Ca2+-ATPase的Ser-38磷酸化形式的SERCA PS-38(1∶5000)抗血清在4℃对膜进行探测过夜。采用在兔中生成的辣根过氧化物酶标记的第二抗体(山羊抗兔IgG(H+L)；Jackson Immunochemicals；批号38179)或蛋白A过氧化物酶(Sigma)，并结合两增强的化学发光检测系统(SuperSignalWest Pico Chemiluminescent Substrate and SuperSignal West FemtoMaximum Sensitivity Substrate，Pierce)显现第一抗体。采用Fuji LAS-1000 Imaging System CCD Camera(AIDA软件用于分析)获取数据。
SERCA2在Ser-38的磷酸化已被描述为能够非常显著地激活Ca2+-ATPase活性的调节性特征。尽管该位点对SERCA2是特有的，其包含在SERCA1和SERCA2之间高度保守的蛋白片段中，特别是从残基39起。于是，这两蛋白有可能在该区域显示相似的结构。根据与存在两高分辨率结构的SERCA1的相似性来推论，预测SERCA2上的磷酸化Ser-38位点位于蛋白的表面暴露的高流动性片段中。该片段在酶的两构象极限(E1，E2；)中都保持暴露于溶剂中，这使其在这些状态下可由激酶和磷酸酶接近。这些属性还使它们自身适于抗体结合到该位点，由于它是表面暴露和高度流动性的。为了确定Ser-38磷酸化在心肌中的发生率(incidence)和作用，我们制备了针对此特征的磷酸化位点特异性抗体。针对序列31KLKERWGS(PO4)NEL41(如显示的，在Ser-38磷酸化)制备了多克隆抗体。因为该磷肽为抗体结合抗原的强力抑制剂(IC50 18nM)，而相应的去磷酸化肽不能干扰抗体：抗原识别，所以该多克隆抗血清SERCA PS-38完全特异于磷酸化肽。
校准标准(展示系统)的SERCA PS-38识别：
在证实多克隆抗体SERCA PS-38完全特异于磷酸化的Ser-38表位后，我们检测了心脏SR囊泡暴露于CaMKII之后SERCA中该残基的磷酸化状态。在这些Western印迹实验中未检测到SERCA。确认该阴性结果的基础是重要的，以便确保它提供有关Ser-38磷酸化发生率的信息，而不是记录抗体或实验的技术性失败。为此，我们构建了包括靶部分的展示系统，这时，靶部分即磷肽表位，已连接到已知分子量的惰性支架蛋白上。选择该支架蛋白是由于其含有肽连接的单一位点(图1A)，由此提供了用于呈现表位肽的统一结构，这对精确定量来说是理想的。
采用的展示系统包括5拷贝的肌联蛋白结构域(I27)的串联体，经突变去除串联体序列中除了一个半胱氨酸残基以外的所有半胱氨酸残基(图1A)。这种情况下纯化的磷表位肽作为靶部分经由蛋白中唯一的半胱氨酸(I27结构域3中的C47，示意性地表示在图1A中)结合到(I27)5串联体，通过质谱判断共价连接的肽的化学计量。这时，观察到低化学计量的肽连接到串联体(终产物质量54124Da，标记为校准-38；图1B)，其构成总制剂量的5.4％。然而，与串联体的该低水平的结合证明足以用于免疫检测(图1C)。图1C显示抗体SERCA PS-38识别修饰有相关磷肽的串联体产物(校准-38)，但不识别修饰有无关肽的相同串联体(I27)5(校准-αCLEP)，甚至在存在60pmol的串联体时。该校准标准作为单一的～60kDa分子种类在SDS-PAGE中迁移。此外，磷酸化表位通过抗体SERCA PS-38检测具有高灵敏度，采用标准(SuperSignalWest Pico，Pierce)ECL底物时低至0.1pmol表位肽的限度(图1C)。
校准标准(校准-38)含有某些小量的污染物。质谱上看到的51230Da的污染物似乎不收纳肽(在Western印迹实验中未检测到，图1C)。由于它构成总蛋白量的可观部分，该物质包括在产物(校准-38)百分比的计算中。(I27)5制剂的第二污染物为肽共价标记。它解释了高Mr(～250kDa，图1C)复合物的免疫染色。该产物在质谱中检测不到，因而少量存在于校准-38制剂中。它不构成总蛋白量的可观部分，排除在本研究中进行的定量中的考虑因素之外。
因此，我们认为，即使存在SERCA磷酸化，其也会导致在研究的细胞中产生少于0.03pmol的Ser-38磷蛋白(10,000活肌细胞)。在以前的研究中，在类似的干扰后肌细胞中的受磷蛋白的Ser-16磷酸化定量为8.5pmol/1,000细胞(7)，表明至少在本研究的10,000细胞中存在85pmol的受磷蛋白。由于受磷蛋白和SERCA以类似的量表达在心肌中(每个SERCA 2个受磷蛋白，(1)，我们可预料在进行的实验中有42pmol的SERCA。用这里描述的抗体我们没有检测到Ser-38磷蛋白，说明在用CaMKII刺激物处理的大鼠心肌细胞中少于0.1％的SERCA被磷酸化。本研究已表述了完全特异于SERCA2的磷酸化的Ser-38表位的多克隆抗体。该抗体能高灵敏度地(0.03-0.1pmol)检测校准标准中的磷酸化表位。但是，尽管有大量的SERCA(10-60pmol)呈现和100kDa的磷蛋白存在，它没有在多种动物种类的心脏SR样品中识别SERCA2。这表明SERCA在Ser-38没有磷酸化，或仅有小部分的SERCA分子(即少于～1％)在Ser-38磷酸化。在分离的心肌细胞中的CaMKII激活采用4种独立的刺激实现，该刺激导致在受磷蛋白Thr-17上的磷酸化。这些都没有导致该抗体可检测到的SERCA的Ser-38磷酸化，尽管在同样的实验中免疫检测到0.03pmol的校准标准。这表明在完整心肌细胞中0％-0.1％的SERCA分子在Ser-38上被磷酸化以应答CaMKII激活刺激。该研究没有提供这样的证据，即SERCA2a的Ser-38磷酸化为心肌细胞或心肌SR制备物中的显著事件。
                       实施例3
如图5所示，三种不同的肽(PS-38，PT17和A1)经由它们巯基特异的马来酰亚胺(malemide)反应性基团结合到相同和不同构建体上的游离巯基。(A)＝(I27)5+PS-38、PT17或A1。(B)＝I39-(I27)4+PS-38、PT17或A1。(M＝标记物，kDa＝千道尔顿)。
结合反应通过混合1∶100摩尔比的串联体(相同和不同的)(溶解在含有20mM NaPO4，0.5M NaCl和8M尿素的结合缓冲液中)到GMBS修饰肽(溶解在H2O中)中而进行。GMBS为异双功能性交联剂。这里所用的，其含有针对巯基的反应基团。GMBS的胺反应性基团用于在肽的化学合成时将该分子连接到肽的N端。让该混合物在室温保持2小时。
每一反应的样品在12％SDS-PAGE凝胶上跑胶，并转移过夜，用于Western印迹。每一肽的特异性抗体用于检测结合物：
PS-38第一抗体＝兔抗PS-38多克隆(5000份稀释液中1份)。
PT17第一抗体＝兔抗PT17多克隆(5000份稀释液中1份)。
A1第一抗体＝小鼠抗A1单克隆(5000份稀释液中1份)。
第二抗体用于增强第一抗体的信号。对于兔第一抗体，采用山羊抗兔HRP(辣根过氧化物酶)第二抗体(5000份稀释液中1份)。对于小鼠第一抗体，采用山羊抗小鼠HRP第二抗体(5000份稀释液中1份)。印迹采用Perbio SuperSignal West Pico Chemiluminescent试剂盒(反应细节见上)成像。
                       实施例4
结合物与无关抗体没有交叉识别
结合到A1、PS-18或PT17肽的(I27)5和I39-(I27)4(如实施例3中)和裸露(未结合)的串联体骨架的样品用12％SDS-PAGE凝胶分离，进行三份。将胶转移至膜过夜，用于Western印迹。该膜随后分为三份，并用特异于每一肽的表位的抗体探测。因此，抗体应仅识别它们特异的表位，不应识别不同肽上的表位或串联体本身的任一部分。我们得到的Western印迹(数据未示出)显示每一抗体仅识别其特异的肽(该抗体针对其而产生)上的表位，而不识别任何其它肽的表位。还有，抗体不识别和结合裸露的串联体(无靶部分的展示系统)自身。
                       实施例5
不同大小结合物(展示系统)的掺合
如实施例3中所述产生的(I27)5和I39-(I27)4与A1肽的结合物以及(I27)1与A1肽的结合物掺合在一起(分别为A1-(I27)5+A1-(I27)1和A1-I39-(I27)4+A1-(I27)1)，以显示在同一样品中的至少两种不同大小的结合物的混合物可分离、清楚地分开并被探测。该掺合不限于基于相同串联体结构域的结合物(conjugate)，还可在结合物之一具有不同的功能结构域(I39-(I27)4)时进行。见图6。
                       实施例6
用磷蛋白特异性染料对校准标准/结合物染色
结果见图7和图8。PS-38-(I27)5，PT17-(I27)5和Al-(I27)5样品在12％SDS-PAGE凝胶上分离并用称为Pro-Q Diamond(MolecularProbes)的磷蛋白特异的染料染色。只有PS-38-(I27)5和PT17-(I27)5应被检出，因为只有PS-38和PT17被磷酸化。A1未被磷酸化，因此，检测不到A1-(I27)5。所有的样品和方法按照染料制造商的说明书进行。
使用的标记物为PeppermintStick磷蛋白分子量标准(MolecularProbes)，它们在45(卵清蛋白＝磷酸化的)和23.6kDa(β-酪蛋白＝磷酸化的)还含有阳性对照。PS-38-(I27)5分别以40和20μl的不同体积上样。
Pro-Q染色的凝胶(图7的左手侧)显示优先从非磷酸化的结合物或蛋白中特异性地检测磷酸化的结合物。这可通过磷酸化蛋白相对非磷酸化蛋白增加的光密度看出，非磷酸化蛋白确实具有某些背景荧光(也可从PeppermintStick磷蛋白的非磷蛋白组分看出)。
                       实施例7
结合物的完全定量和校准标准的产生
采用荧光团(Alexa Fluor 488(Molecular Probes))，可以确定在结合实验中产生的结合物(展示系统)的准确量。按制造商的说明书，将(I27)5和(I27)1与100倍摩尔过量的巯基反应性Alexa Fluor 488反应。见图10。该结合混合物对水透析以除去过量的未结合荧光团。采用荧光计(测量结合物发出的荧光)、分光光度计(A280nm测量总蛋白含量，A493nm测量Alexa Fluor 488含量)以及荧光团制造商(Molecular Probes)提供的公式确定结合程度。经计算，在(I27)5和Alexa Fluor 488之间(产生Alexa-(I27)5)为100％结合，在(I27)1和Alexa Fluor 488之间(产生Alexa-(I27)1)为12％结合。现在已确定标记程度，可产生精确和真实的结合物校准。
校准曲线的Alexa-(I27)5结合物在15％SDS-PAGE凝胶上上样，重复三份，转移用于Western印迹，然后用抗-Alexa Fluor(兔多克隆IgG组分)第一抗体(3000份稀释液中1份)探测，随后是山羊抗兔HRP第二抗体(5000份稀释液中1份)。然后该印迹如前述方式进行显色。还在该凝胶上上样Alexa-(I27)5和Alexa-(I27)1的三种不同的混合物，显示出结合物的掺合能力(blending capability)不受结合到串联体上的实体(entity)的影响或由其确定。该Western印迹(未示出)证实结合到串联体上的部分不限于肽。
7种不同量的校准物形成校准线：5pmol、2.5pmol、1.25pmol、0.63pmol、0.31pmol、0.16pmol和0.08pmol的Alexa-(I27)5，三次重复上样。
对每种量的Alexa-(I27)5测量每条带的光密度，计算相似量的平均值并在Excel中制图以形成校准线(图12，均值+/-标准偏差)。这种校准线随后可用于确定样品的之前未知的量。
                       实施例8
采用A1-(I27)5的校准线确定犬肌质网中受磷蛋白的量
校准线的5pmol、2.5pmol、1.25pmol、0.63pmol、0.31pmol、0.16pmol和0.08pmol的A1(I27)5)上样在15％SDS-PAGE上，重复三份，转移用于Western印迹并探测A1表位，如上所述。A1表位来自称为受磷蛋白的蛋白(PLB)，该受磷蛋白存在于肌质网(SR)膜上。三个犬肌质网(CSR)的样品也上样于凝胶/印迹，采用识别CSR中PLB的A1表位(与存在于用于产生A1-(I27)5结合物的A1肽上的A1表位相同)的抗A1(小鼠单克隆)第一抗体确定样品中的PLB的量。
7种不同量的校准物形成校准线(图12)：5pmol、2.5pmol、1.25pmol、0.63pmol、0.31pmol、0.16pmol和0.08pmol的A1-(I27)5三次重复上样。对每种量的A1-(I27)5测量每条带的光密度，计算相似量的平均值并在Excel中制图以形成校准线(图12，均值±标准偏差)。这种校准线可用于确定每一CSR样品中的之前未知的PLB量。采用图12中的线，计算每一CSR样品中的PLB的pmol量。
                       实施例9
采用两种不同的检测方法和两种不同的识别表位检测PS-38-(I27)5构建体
对于图13，道1-4表示20、15、10和5pmol的PS-38-(I27)5结合物上样。在插图A中，印迹用PerbioTM INDIA HisProbeTM-HRP探针检测。在剥离(strip)之后，该印迹用特异于PS-38结合肽的多克隆抗体再次探测，插图B。该印迹再一次剥离，最终用针对His-6标签的单克隆抗体(Novagen)探测，插图C。
图13的插图A显示采用识别His6标签表位的非抗体介导的PerbioTM INDIA HisProbeTM-HRP探针对PS-38-(I27)5构建体的检测。因而，在该实施方案中，His-6标签被认为是靶部分之一。
图13的插图B显示采用针对PS-38肽产生的第一抗体对PS-38-(I27)5构建体的检测。(插图B中在约150kDa处的另外的带被认为是构建体的寡聚体，但也可能是污染物)。
图13的插图C显示采用针对His6标签产生的第一抗体对PS-38-(I27)5结合物的检测。因而，该第一抗体被认为是特异的结合伙伴，His6标签为靶部分。
插图A、B和C表示展示系统(presentation system)可由不同的检测方法和采用不同的结合伙伴识别，即通过修饰的酶(插图A)和抗体(插图B和C)。此外，在相同展示系统上的不同靶部分可用于检测：His6表位(插图A和C)和PS-38肽的表位(插图B)。
                       实施例10
对于图15，显示了不含有I27模块的(I39)1结构域。在室温下相对(I39)1采用100摩尔过量的GMBS-PT17完成结合。将样品在15％SDS-PAGE凝胶上分离，转移用于Western印迹，并用抗-PT17抗体探测，如前所述。该印迹显示在室温下结合后PT17-(I39)1的检测。
                       实施例11
A1-(I27)1和A1-(I27)5结合物的免疫沉淀
A1-(I27)1结合物利用标准方法采用抗-A1的特异单克隆抗体免疫沉淀。通过采用Western印迹分析回收的样品(不同量)，有可能采用A1-(I27)1的校准线确定回收量。在这次试验中，免疫沉淀没有成功，回收0％的A1-(I27)1(数据未示出)。
A1-(I27)5结合物利用标准方法采用抗-A1的特异单克隆抗体沉淀。通过采用Western印迹分析回收的样品(不同量)，有可能采用校准曲线确定回收量。图17显示A1-(I27)5IP样品和A1-(I27)5校准物的Western印迹。7种不同量的校准物形成校准线：5pmol、2.5pmol、1.25pmol、0.63pmol和0.31pmol的A1-(I27)5。
对每种量的A1-(I27)5校准物测量每条带的光密度，并在Excel中制图以形成图18的线。该校准线用于确定IP后回收的A1-(I27)5量。采用曲线图，在IP后回收的A1-(I27)5的pmol量计算如下。
A1-(I27)5明显地被免疫沉淀(道A1回收的样品2)，而几乎不被蛋白A珠单独沉淀(对照回收)。校准曲线样品和免疫沉淀样品的光密度测定使免疫沉淀中的0.53pmol A1-(I27)5的计算成为可能。如果100％有效，应回收30pmol的A1-(I27)5，因此该过程为1.77％有效。
该数据还允许鉴定该过程的何处导致低效。对样品对照上清和A1上清的定量使得描述通过A1抗体在免疫沉淀过程结束时去除的A1-(I27)5物质成为可能。这对于可能的100pmol为50pmol，即50％有效。免疫沉淀后的多种清洗步骤造成产物的大量损失，导致最终的产率(或效率)为1.77％。这里的定量方法允许描述实验(或工业)过程中各个步骤的有效性。
因此，应理解的是该实施例中的本发明的展示系统和方法还可用于监视IP技术所有阶段的效率，以便评估该过程中的哪个点是最低/高效，并会从改进中获益。还相信本发明的的展示系统和方法还可用于监视其它技术的效率。
参考文献
1.Colyer，J.，Wang，J.H.(1991)J Biol Chem.266，17486-93.
2.Goodfriend，T.，Fasman，G.，Levine，L.(1964)Science 144，1344-1346.
3.Gopalakrishna，& Anderson(1982)Biochem.Biophys.Res.Comm.104，830-836
4.Brockwell，D.J.，Beddard，G，S.，Clarkson，J.，Zinober，R.C.，Blake，A.W.，Trinick，J.，Olmsted，P.D.，Smith，D.A.，Radford，S.E.(2002)Biophys J.83，458-72.
5.Li，C，Wang，J.H.，Colyer，J.(1990)Biochem.29，4535-4540.
6.Drago，G.A.，Colyer，J.(1994)J.Biol.Chem 269，25073-25077.
7.Brette，F.，Calaghan，S.C.，Lappin，S.，White，E.，Colyer，J.，LeGuennec，J.Y.(2000)Am J Physiol Heart Circ Physiol 279，H1963-71.
8.Laemmli，U.K.(1970)Nature Lond.227，680-685.
9.Rodriguez，P.，Jackson，W.A.，& Colyer，J.(2004)J.Biol.Chem.279，17111-17119

Claims (56)

1.一种用于定量样品中存在的靶部分的展示系统，所述展示系统包括可由结合伙伴识别的靶部分或其局部的至少一个拷贝和共价连接到所述靶部分的支架的至少一个结构域，所述结构域对特异于所述靶部分或其局部的结合伙伴无反应性。
2.如权利要求1所述的展示系统，其中所述靶部分或其局部的所述拷贝选自包括DNA或RNA序列、肽、抗原性结构或化学个体或部分的组。
3.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述靶部分还包括糖类、代谢物辅因子、半抗原或由磷酸、亚硝酸基团、硫酸基团或糖基磷脂酰肌醇(GPI)基团进行的修饰。
4.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述展示系统的所述支架物质具有可控特性。
5.如权利要求4所述的展示系统，其中所述可控特性为相对分子质量(Mr)或重量(Mwt)或等电点(pI)。
6.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述支架物质为蛋白。
7.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述支架物质包括至少一个天然或非天然氨基酸，在残基的侧链内具有至少一个或多个化学基团。
8.如权利要求7所述的展示系统，其中所述化学反应性酸基选自包括谷氨酸、天冬氨酸上的羰基，酪氨酸、半胱氨酸和赖氨酸上的羟基的组。
9.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述支架包括一个或多个化学反应性半胱氨酸和/或赖氨酸残基。
10.如权利要求9所述的展示系统，其中所述反应性半胱氨酸和/或赖氨酸残基的数目或者通过从含有希望数目的反应性半胱氨酸和/或赖氨酸基团的天然来源选择所述支架蛋白来控制，或者通过从蛋白序列选择性突变得到或去掉反应性残基或使选择的支架蛋白的一个或多个反应性半胱氨酸和/或赖氨酸残基无作用来控制。
11.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述支架选自包括以下成员的组：肌联蛋白的I27结构域；剪接因子3b的亚基(亚基5)I39结构域；Corti器蛋白(Mus musculus)；线粒体(Mus musculus)热休克蛋白；剪接因子3B亚基5(Mus musculus)；泛醇-细胞色素C还原酶复合物泛醌结合蛋白；E1B蛋白(人腺病毒11型)；伴侣蛋白(Arabidopsis thaliana)；光系统II反应中心H蛋白(Arabidopsisthaliana)；线粒体[前体](Homo sapiens)NADH-泛醌氧化还原酶亚基；信号识别颗粒蛋白(Mus musculus)；以及DNA聚合酶δ亚基4(Musmusculus)。
12.如权利要求11所述的展示系统，其包括权利要求11所述的任何一种或多种所述支架的组合。
13.如权利要求11所述的展示系统，其包括数个相同的支架。
14.如权利要求11所述的展示系统，其包括多个相同结构域或不同结构域作为其混合物或掺合物。
15.如权利要求11所述的展示系统，其包括多个来自肌联蛋白的支架I27结构域，以及其中至少一个结构域或单位被工程化为具有单个用于肽连接的半胱氨酸残基，而所有其它或选定数量的I27结构域或单位缺少半胱氨酸残基或其它选自包括赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的组的反应性残基。
16.如权利要求11所述的展示系统，其包括至少一个或多个剪接因子3b的亚基(亚基5)支架I39结构域。
17.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述支架结构域约为10kDa。
19.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述支架线性单位或结构域串联连接。
20.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其包括至少一种生物或非生物聚合物。
21.如权利要求20所述的展示系统，其中所述非生物聚合物为PEG(聚乙二醇)。
22.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述靶部分的拷贝或者通过半胱氨酸残基上的巯基采用共价连接并入所述展示系统中，或对于所述靶部分为蛋白或肽且所述展示系统也为蛋白或肽的情况，编码所述靶部分的DNA片段被并入编码所述展示系统的DNA中，然后随所述展示系统表达。
23.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中除了所述靶部分或其局部的所述拷贝之外，所述展示系统的所述结构域对所述样品靶部分或其局部的所述特异性结合伙伴基本上为惰性或无反应性。
24.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述靶部分或其局部的所述拷贝与存在于所述样品中的所述靶部分不同。
25.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其包括所述靶部分的多个拷贝。
26.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述靶部分或其局部的所述拷贝在所述展示系统内是线性的或分枝的。
27.如权利要求26所述的展示系统，其中所述靶部分的所述拷贝为分枝的，以至于所述共价连接为经由所述支架物质的侧链实现。
28.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其中所述结合伙伴选自包括单克隆抗体、多克隆抗体、RNA或DNA或肽适配体或其它抗体等同物、染料、药物和金属螯合物的组。
29.如前述权利要求任一项所述的展示系统，其包括至少一个I27结构域和/或至少一个I39结构域以及选自包括A1、PS-38或PT17肽的组的靶部分。
30.一种产品在定量可能存在于样品中的靶部分中的用途，所述产品包括数个展示系统，每一展示系统包括靶部分或其局部的至少一个拷贝和共价连接到所述靶部分的所述拷贝的至少一个结构域，其中所述结构域对特异于所述靶部分或其局部的结合伙伴无反应性，此外，其中每一展示系统具有不同于所述产品中其它展示系统的分子量。
31.如权利要求30所述的用途，其作为阳性对照或内标或用于生成校准曲线。
32.一种用于定量样品中的靶部分的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-29任一项所述的展示系统。
33.一种在可能含有靶部分的样品中定量所述靶部分的方法，所述方法包括：
a)提供展示系统，所述展示系统包括可由结合伙伴识别的靶部分或其局部的至少一个拷贝和对所述结合伙伴无反应性的至少一个结构域，所述靶部分的至少一个拷贝与支架的所述至少一个结构域共价键合；
b)对所述展示系统进行分离检测技术，其中所述展示系统以特定量存在；
c)产生至少一个包括由所述展示系统产生的信号强度对所述展示系统的量的比较点。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述展示系统以单一的特定量存在。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述展示系统以一系列的不同量存在。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述不同量处于印迹的相同或不同泳道或通道。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述比较点为数个比较点，它们一起提供校准曲线。
38.如权利要求35-37任一项所述的方法，其还包括所述比较点或数个比较点与所述样品的比较，以定量存在于所述样品中的所述靶部分。
39.如权利要求33-38任一项所述的方法，其中所述展示系统具有已知的分子量或pI。
40.如权利要求33-39任一项所述的方法，其中所述展示系统包括非生物聚合物、核酸分子、肽、蛋白或它们的组合。
41.如权利要求33-40任一项所述的方法，其中所述展示系统包括数个串联连接的结构域。
42.如权利要求33-41任一项所述的方法，其中所述展示系统包括相同的单位或结构域或不同或相异的单位或结构域。
43.如权利要求33-42任一项所述的方法，其中所述展示系统的所述单位对特异于所述靶部分或其局部的所述结合伙伴无反应性。
44.如权利要求33-43任一项所述的方法，其中所述靶部分或其局部的所述拷贝包括DNA序列、RNA、蛋白或肽、糖类、半抗原、磷酸、亚硝酸基团、硫酸基团、GPI基团、表位、抗原性结构或化学个体。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述靶部分的所述拷贝包括SERCA2a或在丝氨酸-38上磷酸化的SERCA2a。
46.如权利要求33-45任一项所述的方法，其中所述展示系统包括不同的靶部分或其局部。
47.如权利要求33-46任一项所述的方法，其中所述靶部分或其局部的所述拷贝在所述展示系统内为线性或分枝的。
48.如权利要求33-47任一项所述的方法，其中所述特异性结合伙伴包括对所述靶部分具有特异的结合亲和性并能与其结合的分子。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述结合伙伴包括抗体、DNA序列、RNA序列、染料、金属螯合物或药物分子。
50.如权利要求33-49任一项所述的方法，其中所述基于分离的检测技术包括斑点印迹、Western印迹、RIA、荧光偏振、ELISA、Northern印迹、Southern印迹、PCR、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳、1D电泳、等电聚焦、质谱或上述技术的组合。
51.如权利要求33-50任一项所述的方法，其中所述展示系统起阳性对照的作用，用于检测样品中存在或不存在靶部分。
52.如权利要求33-50任一项所述的方法，其中所述展示系统通过提供单点校准起内标的作用。
53.如权利要求33-50任一项所述的方法，其中所述展示系统用于产生多个比较点，以便提供校准曲线。
54.如权利要求33-50任一项所述的方法，其中所述展示系统用于监视免疫沉淀和/或免疫沉淀过程各阶段的效率。
55.如权利要求33-54任一项所述的方法，其还包括权利要求2-29所述的任意一个或多个特征。
56.一种定量样品中蛋白表位的方法，所述方法包括：
(b)提供蛋白展示系统，所述展示系统包括所述蛋白表位的至少一个拷贝和至少一个其它蛋白结构域，其中所述展示系统分子量已知；
b)对所述展示系统进行Western印迹实验，其中所述展示系统为特定浓度；其中所述Western印迹实验利用特异于所述靶部分的结合伙伴；以及其中所述展示系统的所述蛋白结构域对所述结合伙伴无反应性；以及
c)生成包括由所述技术中的展示系统产生的信号强度对所述展示系统的浓度的比较点。
57.如权利要求56所述的方法，其还包括权利要求2-29所述的任意一个或多个特征。
CN2005800072530A 2004-01-06 2005-01-06 用于对结合进行定量的试剂及方法 Expired - Fee Related CN1930477B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0400122.8 2004-01-06
GBGB0400122.8A GB0400122D0 (en) 2004-01-06 2004-01-06 Method of quantifying binding
PCT/GB2005/000015 WO2005066630A2 (en) 2004-01-06 2005-01-06 Agents for and method of quantifying binding

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1930477A true CN1930477A (zh) 2007-03-14
CN1930477B CN1930477B (zh) 2013-03-27

Family

ID=31503431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800072530A Expired - Fee Related CN1930477B (zh) 2004-01-06 2005-01-06 用于对结合进行定量的试剂及方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7939265B2 (zh)
EP (1) EP1711835B1 (zh)
JP (1) JP4829797B2 (zh)
CN (1) CN1930477B (zh)
AU (1) AU2005204085B2 (zh)
CA (1) CA2552548C (zh)
GB (1) GB0400122D0 (zh)
WO (1) WO2005066630A2 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0400122D0 (en) 2004-01-06 2004-02-11 Badrilla Ltd Method of quantifying binding
US20100086938A1 (en) * 2006-11-29 2010-04-08 Takashi Shimada Mass spectrometry of biological sample using immunoprecipitation
WO2015181631A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-03 Oslo Universitetssykehus Hf Serca2-pde3a interaction peptides and uses thereof
CN105277692A (zh) * 2014-07-24 2016-01-27 江苏维赛科技生物发展有限公司 一种测定水产品中的孔雀石绿酶联免疫吸附法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4521521A (en) * 1983-03-11 1985-06-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Particle reagent size distribution measurements for immunoassay
US5484885A (en) * 1989-07-05 1996-01-16 Emory University Chemotactic, antibiotic and lipopolysaccharide-binding peptide fragments of CAP37
US5759775A (en) * 1994-10-27 1998-06-02 Genetech, Inc. Methods for detecting nucleic acids encoding AL--1 neurotrophic factor
DE19638745C2 (de) * 1996-09-11 2001-05-10 Schering Ag Monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des menschlichen VEGF - Rezeptorproteins (KDR)
US6342345B1 (en) * 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
DE19842863A1 (de) * 1998-09-19 2000-04-27 Kramer Michael Regulatorisches Protein aus humanen Keratinozyten
US6818418B1 (en) * 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US20030059461A1 (en) * 2000-06-06 2003-03-27 Sibtech, Inc. Molecular delivery vehicle for delivery of selected compounds to targets
US20020107640A1 (en) * 2000-11-14 2002-08-08 Ideker Trey E. Methods for determining the true signal of an analyte
DE10059720A1 (de) * 2000-11-30 2002-06-06 Roche Diagnostics Gmbh Verwendung intramolekular kovalent vernetzter Proteine als Bindepartner in Immunoassays
WO2002064816A2 (en) * 2001-02-09 2002-08-22 Mcgill University Multiple determinants for metabolic phenotypes
GB0400122D0 (en) 2004-01-06 2004-02-11 Badrilla Ltd Method of quantifying binding

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005066630A3 (en) 2005-10-13
US20070184450A1 (en) 2007-08-09
CA2552548C (en) 2014-04-01
GB0400122D0 (en) 2004-02-11
AU2005204085B2 (en) 2011-05-26
JP2007518088A (ja) 2007-07-05
JP4829797B2 (ja) 2011-12-07
AU2005204085A1 (en) 2005-07-21
CA2552548A1 (en) 2005-07-21
EP1711835A2 (en) 2006-10-18
CN1930477B (zh) 2013-03-27
WO2005066630A2 (en) 2005-07-21
EP1711835B1 (en) 2013-08-14
US7939265B2 (en) 2011-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240192221A1 (en) Protein sequencing method and reagents
CN1297820C (zh) 一种蛋白质组分析方法
CN1759319A (zh) 生物液中肾上腺髓质素原中间区域部分肽的诊断检测,和实施这样的检测的免疫检测方法
CN101048662A (zh) 阿尔茨海默氏病的检验方法及诊断试剂
CN106065028B (zh) 新的自身免疫疾病的诊断
US20220291241A1 (en) Assay for the detection of alpha-synuclein seeding activity associated with synucleinopathies
CN1930477A (zh) 用于对结合进行定量的试剂及方法
CN1993619A (zh) 作为β细胞衰竭靶标/标志的TIMP－2
CN1732261A (zh) 用于诊断肝脏疾病的标志蛋白质以及使用该蛋白质诊断肝脏疾病的方法
WO2012125805A2 (en) Protein biomarkers for the diagnosis of prostate cancer
JP2024056971A (ja) ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法
JP2007232631A (ja) 生細胞内の特定タンパク質の定量方法および標準蛍光マイクロビーズの作製方法
CN1839319A (zh) 用于诊断视网膜血管病的包含醛缩酶的组合物以及应用它诊断的方法
CN1864068A (zh) 用小表位抗体降低样品复杂度的方法
US20240094228A1 (en) Method of measuring cholesterol levels by using immunogenic method
CN1535380A (zh) 鉴定微生物
WO2019012019A1 (en) NEW BINDING AGENT AND DOSAGE FOR PIVKA
US20200057082A1 (en) Method of measuring cholesterol levels by using immunogenic method
CN104066749A (zh) 用于特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途
WO2010038831A1 (ja) 細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査のための方法、組成物およびキット
US9751922B2 (en) Protein tag, tagged protein, and protein purification method
Darii et al. Quantification of target proteins using hydrogel antibody arrays and MALDI time-of-flight mass spectrometry (A2M2S)
CN117686721A (zh) 来源于鸡的生物标志物postn及其筛选方法和应用
CN1795273A (zh) 多肽的用途
Castillo Mass Spectrometry-Based Approaches for Targeted Quantitative Proteomics in Biomarker Development

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130327

Termination date: 20220106

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee