DE19842863A1

DE19842863A1 - Regulatorisches Protein aus humanen Keratinozyten

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Publication number: DE19842863A1
Application number: DE19842863A
Authority: DE
Inventors: Michael D Kramer; Michael Bechtel; Jeanette Reinartz; Birgit Schaefer; Reinhard Wallich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-09-19
Filing date: 1998-09-19
Publication date: 2000-04-27
Also published as: WO2000017232A3; DE19981873D2; EP1114157A2; AU1149100A; JP2002526060A; CA2342957A1; WO2000017232A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteine gleicht oder ähnlich (d. h. in Funktion und Wirkung gleich) ist. Sie betrifft außerdem eine isolierte Nukleinsäure, die ein solches für humane Keratinozyten typisches Polypeptid bzw. Protein kodiert, sowie die Verwendung dieses Polypeptids und dieser Nukleinsäure für nachweisende, insbesondere diganostische, und/oder für therapeutische Zwecke bzw. die Verwendung von Reagenzien, insbesondere rekombinanten Vektormolekülen und Antikörpern, gegen solche Moleküle. Das erfindungsgemäße Protein weist die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:2 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein durch Aminosäuresubstitution, -deletion, -isertion, -oder -inversion daraus enstandenes Allel oder Derivate dieser Aminosäureseqeunz auf, und die erfindungsgemäße Nukleinsäure weist entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleotidsequenzen oder eine hierzu komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser beiden Nukleotidsequenzen hybridisierenden Nukleotidseqeunz auf.

Description

Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ähnlich (d. h. in Funktion und Wirkung gleich) ist. Sie betrifft außerdem eine isolierte Nukleinsäure, die ein solches für humane Keratinozyten typisches Polypeptid bzw. Protein kodiert, sowie die Verwendung dieses Polypeptids und dieser Nukleinsäure für nachweisende, insbesondere diagnostische, und/oder für therapeutische Zwecke bzw. die Verwendung von Reagenzien, insbesondere rekombi nanten Vektormolekülen und Antikörpern, gegen solche Moleküle.

Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik werden in der Dermatotherapie zur Beein flussung epidermaler Störungen wie z. B. der Autoimmundermatosen "Pemphigus vulgaris" und "Bullöses Pemphigoid" im wesentlichen Medikamente mit breitem Wirkungsspektrum eingesetzt, wie z. B. lokal bzw. systemisch applizierte Glukokorti koide, Vitamin-A-Säure-Derivate, Antimetabolite und Zytostatika, oder es wird mit mehr oder weniger unspezifischen Maßnahmen wie z. B. der sog. "Farbstofftherapie" oder der "Lichttherapie" behandelt. Die bekannten Wirkstoffe bzw. Maßnahmen haben jedoch allesamt den Nachteil, daß sie wenig spezifisch sind und damit naturgemäß zahlreiche Nebenwirkungen hervorrufen.

Die Bereitstellung spezifischerer Wirkstoffe scheiterte bislang an dem in der Derma tologie seit langem bestehenden grundsätzlichen Problem, daß die Zahl der zellulären Zielmoleküle (Zielstrukturen, Targets), die als Angriffspunkt für eine (spezifische) Beeinflussung des zellulären Stoffwechsels - insbesondere unter medizinischen oder auch kosmetischen Gesichtspunkten - dienen könnten, in epidermalen Keratinozyten eng begrenzt ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, neue Zielstrukturen in epidermalen Keratinozyten bereitzustellen, die als Angriffspunkt für Diagnostika, Therapeutika, Kosmetika oder allgemein für die Beeinflussung des zellulären Stoffwechsels dienen können.

Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Proteins der eingangs genannten Art, das bei aktivierten Keratinozyten aufreguliert, d. h. vermehrt exprimiert bzw. produziert und auf einem höheren Konzentrationsspiegel gehalten wird, und das die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein durch Aminosäuresubstitution, -deletion, -insertion, oder -inversion daraus entstandenes Allel oder Derivat dieser Aminosäuresequenz aufweist. Das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 wird im folgenden auch mit Protein pKe#122 bezeichnet.

Eine weitere Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäure, die ein Protein kodiert, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ähnlich ist, und die entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleotidsequenz oder eine hierzu komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser beiden Nukleotidsequenzen hybridisierenden Nukleotidsequenz aufweist, wobei in diesem Sequenzprotokoll anstelle von "T" auch "U" stehen kann. Zu dieser erfindungsgemäßen Gruppe von Nukleinsäuren bzw. Nukleotidsequenzen gehören insbesondere auch Splice-Varianten und Sense- oder Anti sense-Oligonukleotide, die mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleotidsequenz hybridisieren, vorzugsweise identisch mit bzw. komplementär zu dieser sind.

Die Erfindung umfaßt infolgedessen auch Proteine bzw. Polypeptide der eingangs genannten Art, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche aus einer solchen Splice- Variante resultiert, insbesondere aus der Splice-Variante einer mRNA, die mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz identisch oder komplementär dazu ist.

Die erfindungsgemäßen Sense- oder Antisense-Oligonukleotide umfassen mindestens 6, vorzugsweise 8 bis 25 Nukleotide.

Der Begriff "hybridisiert" bezieht sich auf die im Stand der Technik bekannten Hybridi sierungsverfahren unter üblichen, insbesondere unter hoch stringenten Hybridisierungs bedingungen. Die konkreten Hybridisierungsparameter wählt der Fachmann anhand der eingesetzten Nukleotidsequenz und seines allgemeinen Fachwissens (vgl.: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1997, John Wiley & Sons Inc., Suppl. 37, Chapter 4.9.14).

Die erfindungsgemäße(n) Nukleinsäure(n) kann (können) sowohl aus einer natürlichen Quelle als auch synthetisch oder halbsynthetisch gewonnen werden. In der Praxis hat sich besonders seine Ausführung als cDNA bewährt.

Das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist und von der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure kodiert wird, und das im folgenden als Protein pKe#122 bezeichnet ist, wird in humanen epidermalen Keratino zyten aufreguliert, nämlich verstärkt exprimiert (produziert) und auf einem im Vergleich zum Ausgangszustand signifikant höheren Konzentrationsspiegel gehalten, wenn sich diese Zellen im "aktivierten" Zustand befinden, d. h. unter anderem im Zustand der Proliferation und/oder Migration, z. B. nach einer unfallbedingten Hautverletzung oder bei den autoimmunologisch ausgelösten bullösen Dermatosen "Pemphigus vulgaris" (ausgelöst durch Autoantikörper gegen Desmosomen) und "Bullöses Pemphigoid" (ausgelöst durch Autoantikörper gegen Hemidesmosomen). Der aktivierte Zustand der humanen epidermalen Keratinozyten äußert sich auch in einer im Vergleich zum Ruhezustand (Ausgangszustand) erhöhten Expression der bekannten Aktivierungsmarker uPA (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator) und uPA-R (Rezeptor für Urokinase-Typ Plasminogenaktivator) und kann anhand dieser Marker qualitativ und quantitativ nach gewiesen werden. (Vgl.: Schäfer B. M., Reinartz J., Bechtel M. J., Inndorf S., Lang E., und Kramer M. D., 1996: Dispase mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA-R, CD87), Exp. Cell Res. 228, S. 246-253).

Das Protein pKe#122 weist ein Serin/Threonin-Kinase-Motiv, mehrere (vier) Tyrosinkinasephosphorylierungsmotive und eine Kinase-Domäne mit ATP- Bindungsstelle auf. Es ist offensichtlich in Signalübertragungsvorgänge eingebunden, hat sehr wahrscheinlich eine Serin/Threonin-Kinase-Funktion und spielt eine mutmaßliche Rolle bei der Ausbildung von Zell-Zell- und/oder von Zell-Matrix-Verbindungen und/oder von Hemidesmosomen.

Im Stand der Technik ist es bekannt, daß Serin/Threonin-Kinasen in Keratinozyten die Funktion von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakten beeinflussen. Von S. Blum und Koautoren wurde gezeigt, daß die Lokalisation bestimmter Zellkontakt-Moleküle der Zonula adhaerens durch Aktivierung bzw. Inaktivierung der Serin/Threonin Kinase des Typs "Proteinkinase C (PKC)" beeinflußt werden kann (vgl. Blum S., Ness W., Petrow W., Achenbach F., 1994: Localization of protein kinase C in primary cultures of human keratinocytes in relation to cell contact proteins. Cell Sig. 6: 157-165). Und M. Serres und Koautoren haben gezeigt, daß die Behandlung von Keratinozyten in Zell kultur (HaCaT-Zellen) mit den Serin/Threonin-Phosphatase-Inhibitoren Okadainsäure, Calyculin und Pefabloc™ einerseits zu einem Verlust der Zell-Zell-Verbindungen und andererseits zu einer verstärkten Serin/Threonin Phosphorylierung des in die Zelladhä sion involvierten Linkerproteins β-Catenin führt (vgl. Serres M., Grangeasse C., Haftek M., Durocher Y., Duclos B., Schmitt D., 1997: Hyperphosphorylation of β- Catenin on serine-threonine residues and loss of cell-cell-contacts induced by calyculin A and okadaic acid in human epidermal cells. Exp. Cell. Res. 231: 163-172). Diese in- vitro-Befunde wurden an epidermalen Kertinozyten explantierter humaner Haut bestä tigt: nach Applikation von Okadainsäure (2 µM, 24 Std.) trat eine deutliche Störung epi dermaler Zell/Zell-Verbindungen mit Akantholyse auf. Weder PKC-Aktivatoren (wie z. B. Bryostatin-1 oder TPA = PMA = Phorbol Myristat Azetat) und PKC-Inhibitoren (Sphingosin, Staurosporin, Chelerythrine, H7 = 1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)-2-methyl piperazine) noch Inhibitoren oder Aktivatoren der Proteinkinase A (PKA), noch Tyrosin- Kinase- und Phosphatase-Inhibitoren oder weniger spezifische Phosphatase-Inhibitoren hatten einen derartigen Effekt auf die Zellen.

Auch bei der Ausbildung von Hemidesmosomen spielen Serin/Threonin-Kinasen eine wichtige Rolle (vgl. Mainiero F., Pepe A., Wary K. K., Spinardi L., Mohammadi M., Schlessinger J., Giancotti F. G., 1995: Signal transduction by the alpha6beta4 integrin: distinct beta4 subunit sites mediate recruitment of Shc/Grb2 and association with the cytoskeleton of hemidesmosomes. EMBO J. 14: 4470-4481).

Mit der isolierten Bereitstellung des Proteins pKe#122, nämlich mit der Beschreibung von Nukleotidsequenzen, die dieses Protein codieren, und mit der Angabe (einer) seiner Aminosäuresequenz(en) ist es möglich, den Stoffwechsel von physiologisch aktiven bzw. aktivierten Keratinozyten - und selbstverständlich auch von anderen das Protein pKe#122 exprimierenden Zellen - gezielt zu beeinflussen, insbesondere zu Zwecken der medizinischen und kosmetischen Therapie.

Die Erfindung betrifft desweiteren rekombinante DNS-Vektormoleküle, die eine erfin dungsgemäße Nukleinsäure umfassen, und die die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, in einer prokaryon tischen oder eukaryontischen Zelle aufweisen. Bei den DNS-Vektormolekülen handelt es sich vorzugsweise um das Plasmid pUEX-1 und/oder um das Plasmid pGEX-2T und/oder um das Plasmid pBK-CMV und/oder um das Plasmid pHR 2 (ein Abkömmling von Bluescript KS [Firma Stratagene, Heidelberg], enthält den humanen Keratin-14- Promotor), da sich diese Vektoren in der Praxis als sehr gut geeignet erwiesen haben. Als eukaryontische Zelle kommen insbesondere Zellen aus Zellkulturen, z. B. COS- Zellen, in Betracht, ebensogut kann die betreffende Zelle aber auch Bestandteil eines lebenden Organismus, z. B. einer transgenen Maus, sein.

Die Erfindung umfaßt deshalb auch transformierte Wirtszellen, die eine erfindungsgemä ße Nukleinsäure enthalten, die mit einem aktivierbaren Promotor gekoppelt ist, der in diesen Zellen natürlicherweise oder als Folgen einer Rekombination enthalten ist, und die (infolgedessen) die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, besitzen.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektormoleküls zur Herstellung transgener Säugetiere, insbesondere Mäuse oder Ratten.

Die erfindungsgemäßen Transfektanten eröffnen die Möglichkeit für Forschungs- und Entwicklungsarbeiten im Hinblick auf eine weitergehende Aufklärung der durch das Protein pKe#122-induzierten Veränderungen der Zellmorphologie und zellulären Basis funktionen wie Proliferation, Adhäsion, Migration und Differenzierung, insbesondere im Hinblick auf die Beantwortung der Frage, ob das Protein pKe#122 selbst eine "pathogene" Aktivität besitzt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Reagenz zum indirekten Nachweis eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, wobei dieses Reagenz dadurch charakterisiert ist, daß es wenigstens eine erfindungs gemäße Nukleinsäure umfaßt. "Zum indirekten Nachweis" bedeutet in diesem Zusam menhang, daß tatsächlich die das Protein kodierende mRNA direkt nachgewiesen wird - und somit das Protein nur indirekt (vermittels dieser mRNA).

Das Protein pKe#122 und die damit, d. h. mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz, verwandten Polypeptide, d. h. die Polypeptide, die durch Substitution, Deletion, Insertion und/oder Inversion von dieser Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ableitbar sind, oder die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus einer Splice-Variante einer mRNA resultiert, welche mit der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 oder einer Teilsequenz davon identisch oder komplementär dazu ist oder zumindest hybridisiert, bieten vielfältige Anwendungsmöglichkeiten auf dem Gebiet der dermatologischen Forschung und Entwicklung. Insbesondere können Antikörper gegen diese Polypeptide bzw. Proteine hergestellt werden, die dann mit entsprechender Modifikation entweder als Diagnostika oder als Therapeutika oder auch als Kosmetika ("cosmeceuticals") einsetzbar sind.

Die Erfindung umfaßt folglich auch die Verwendung eines solchen Proteins bzw. Poly peptids zur Herstellung eines (monoklonalen oder polyklonalen) Antikörpers gegen die ses Polypeptid, den besagten Antikörper selbst und ebenso seine Verwendung zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von dermatologischen Erkran kungen, zur kosmetischen Behandlung der Epidermis und zur diagnostischen, therapeu tischen und/oder kosmetischen Behandlung von anderen das Protein pKe#122 exprimie renden Geweben oder Organen.

Auch Sense- und/oder Antisense-Oligonukleotide kommen nach neueren wissenschaft lichen Erkenntnissen als Wirkstoffe für eine Pharmakotherapie in Betracht (vgl. G. Hart mann et al. 1998: Antisense-Oligonukleotide, Deutsches Ärzteblatt 95, Heft 24, C1115-C1119) - und überdies als Wirkstoffe mit einem in der Pharmakotherapie grundsätzlich neuen Wirkprinzip.

Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung erfindungsgemäßer Sense- oder Antisense-Oligonukleotide zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung, insbesondere von dermatologischen Erkrankungen, oder zur kosmetischen Behandlung insbesondere der Epidermis.

Eine technisch und wirtschaftlich bedeutende Einsatzmöglichkeit eines erfindungs gemäßen Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuren besteht nicht zuletzt auch darin, daß mit Hilfe eines solchen Moleküls in einem Screening-Verfahren aus einer sehr großen Anzahl bereitstehender Stoffe solche herausselektiert werden können, die spezifisch an die betreffende Nukleinsäure oder das betreffende Polypeptid binden. Diese Stoffe können dann als Ausgangsmaterial (Leitstruktur) für die Entwicklung pharmakologisch einsetzbarer Substanzen dienen und bieten damit die Voraussetzungen für die Entwicklung alternativer Pharmazeutika zur Diagnose und Therapie, insbesondere der eingangs erwähnten dermatologischen Erkrankungen.

Im Hinblick darauf betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Identifizierung von pharma kologisch einsetzbaren Substanzen, die an das Polypeptid bzw. die Nukleinsäure binden und dadurch dessen bzw. deren Funktion und/oder Expression beinflussen, insbesondere inhibierend oder aktivierend wirken.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Herstellungs- und Anwendungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung des Proteins pKe#122 A) Gewinnung bzw. Herstellung eines Polynukleotids, das das Protein pKe#122 kodiert

Als Polynukleotid-Quelle dienten humane epidermale Keratinozyten einer Zellkultur bzw. eines Zellkulturmodells, das in der Publikation von Schäfer B. M., Reinartz J., Bechtel M. J., Inndorf S., Lang E., und Kramer M. D., 1996: Dispase mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA R, CD87), Exp. Cell Res. 228, S. 246-253, ausführlich beschrieben ist. Auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Diese Zellkultur bzw. dieses Zellkulturmodell zeichnet sich dadurch aus, daß sie/es erlaubt, Keratinozyten durch enzymatische Zerstörung der Zell/Matrix-Kontakte, d. h. durch eine beispielsweise Dispase-induzierte Ablösung der Keratinozyten von der Kulturmatrix, vom ruhenden [uPA^-/uPA-R^-] in den aktivierten [uPA⁺/uPA-R⁺] Zustand zu überführen. Die Induktion des aktivierten Zustands ist reversibel: die (erneute) Ausbildung eines konfluenten (= maximal dicht gewachsenen), mehrschichtigen Zell verbands aus differenzierten Keratinozyten führt zur Abregulierung von uPA und uPA-R, d. h. zur Drosselung der Produktion und Einstellung auf einem niedrigeren Konzentrationsspiegel (siehe dazu die Publikation von Schäfer B. M., Stark H. J., Fusenig N. E., Rodd R. F., Kramer M. D., 1996 Differential expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA), its receptor (uPA-R), and inhibitor type-2 (PAI-2) during differentiation of keratinocytes in an organotypic coculture system, Exp. Cell Res. 220: 415-423).

Die Zellen dieser Zellkultur bzw. dieses Zellkulturmodells werden im folgenden auch als NHEK (= "normale humane epidermale Keratinozyten") bezeichnet.

Für die Bereitstellung der Zellkultur bzw. des Zellkulturmodells wurden folgende Maßnahmen durchgeführt: Mittels Hautbiopsie erhaltene humane epidermale Keratinozyten wurden über Nacht bei 4°C trypsiniert und anschließend nach der "feeder layer"-Technik von J. G. Rheinwald und H. Green (1975, Cell 6, 331-334) in Petrischalen oder 175 cm² Kulturflaschen für die Dauer von 8 Tagen in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) mit einem Gehalt von 10% (Vol./Vol.) fetalem Kälberserum (FCS) und Zusätzen an Adeninhemisulfat, Insulin, Transferrin, Trijodthyronin, Hydrocortison, Forskolin, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Gentamycin) unter Differenzierungsbedingungen, nämlich erhöhten Kalziumspiegeln, kultiviert (37°C, 7% CO₂). Die Kultivierung erfolgte damit gemäß herkömmlicher und im Stand der Technik geläufigen Bedingungen. Unter diesen Bedingungen bilden Keratinozyten konfluente zwei- bis dreischichtige sog. "Epidermisäquivalente" oder Keratinozyten-"Sheets" aus.

Diese Epidermisäquivalente oder Keratinozytensheets wurden durch eine 30-minütige Behandlung mit Dispase II (2,4 mg/ml in DMEM ohne FCS) von der Kulturmatrix abgelöst, zweimal in DMEM gewaschen und anschließend für die Dauer von 4 bzw. 8 Stunden in komplettem, konditioniertem DMEM inkubiert. Die Inkubation in konditioniertem DMEM erfolgte, um den Einfluß von frischem FCS auszuschließen. Während der Inkubation fand in diesen flotierenden Keratinozytensheets eine Aufregulierung der Expression der bekannten Aktivierungsmarker uPA und uPA-R sowie des hierin erstmals beschriebenen Proteins pKe#122 statt. Die uPA/uPA-R-Aufregulierung war mittels bekannten Techniken wie Enzyme-Linked- Immunosorbent-Assay (ELISA), In-situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz nachweisbar. Aus den inkubierten Zellen wurde mittels der im Stand der Technik bekannten Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode (vgl. Chromczynski P. and Sacchi N., 1986: Single-step method of RNA Isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159) die gesamte RNA gewonnen (Kit "RNA-Clean" der Firma AGS aus Heidelberg). Aus der Gesamt-RNA wurde die mRNA mittels Bindung an poly-T-beschichtete Kügelchen isoliert. Diese mRNA diente als Ausgangsmaterial für den nächstfolgenden Verfahrensabschnitt der Subtraktionsklonierung.

Für den Einsatz in Kontrollversuchen bzw. für Vergleichspräparate wurde mRNA von adhärenten Keratinozytensheets isoliert, und zwar nach dem gleichen Verfahrensmuster wie vorstehend beschrieben, ausgenommen der Abweichung, daß für die Dauer der Dispasebehandlung zusätzlich zu der Dispase ein Dispasehemmer, z. B. Phosphoramidon (100 µg/ml), appliziert wurde.

Nach dem Prinzip der Subtraktionsklonierung wurde eine Genbank erstellt, die vorzugs weise cDNA der dyshäsionsinduzierten Gene enthielt, d. h. solcher Gene, die nach Ablösung der Keratinozytensheets vermehrt in diesen (bzw. deren Zellen) exprimiert wurden. Zu diesem Zweck wurde die aus den Zellen der adhärenten Keratinozytensheets gewonnene mRNA erneut an poly-T-beschichtete Kügelchen gebunden, auf diesen in einzelsträngige cDNA umgeschrieben und anschließend gegen die mRNA von abgelösten, d. h. nicht-adhärenten Keratinozytensheets hybridisiert. Diejenigen mRNA- Moleküle, die lediglich im nicht-adhärenten Zustand, d. h. nach Dyshäsion exprimiert wurden und infolgedessen keinen Hybridisierungspartner fanden, verblieben im Überstand. Sie wurden in cDNA umgeschrieben und in den Klonierungsvektor pUEX-1 kloniert.

Die daraus resultierende Genbank wurde zwecks Überprüfung anschließend noch einem Southernblot-Verfahren mit [³²P]-markierter cDNA adhärenter und nicht-adhärenter Keratinozytensheets unterworfen. Diejenige cDNA oder vielmehr die sie enthaltenden Wirtszellklone - hier der E. coli-Stamm MC1061 -, die nach Dyshäsion eine deutliche Aufregulation zeigten, wurden anschließend über Nacht bei 30°C unter üblichen Kultur bedingungen kultiviert bzw. vermehrt. Aus diesen E. coli-Klonen wurde die Plasmid- DNA (pUEX1-cDNA) herauspräpariert, und die aus dem pUEX1-Vektor heraus geschnittenen cDNA-Fragmente wurden mittels Random-priming [³²P]-markiert. Die markierte cDNA wurde als Sonde in Northernblots mit RNA aus adhärenten und nicht- adhärenten Keratinozytensheets eingesetzt. Die Klone, die cDNA enthielten, die bei Verwendung als Sonde im Northernblot-Verfahren kein oder nur ein geringes Signal mit der RNA adhärenter Keratinozyten, dagegen ein deutliches Signal mit RNA nicht- adhärenter Keratinozytensheets erkennen ließen, wurden für den nachfolgenden Verfahrensabschnitt der Sequenzierung ausgewählt.

Bei der Sequenzierung der betreffenden Klone mittels des "nicht-radioaktiven Cycle- Sequencing", das eine Modifikation der Sequenzierungsmethode nach Sanger darstellt, und mittlerweile eine dem Stand der Technik geläufige Methode ist, wurde unter anderem das Gen mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 gefunden. Dieses Gen und das zugehörige Protein erhielten die Bezeichnung pKe#122. Nähere Untersuchungen der zu dem Gen pKe#122 gehörigen d. h. pKe#122-spezifischen mRNA (aus abgelösten, d. h. nicht-adhärenten Keratinozytensheets) lieferten die Informationen, daß diese mRNA eine Größe von etwa 4,8 kb aufweist und nach Dispase-induzierter Ablösung eine Aufregulation zeigt. Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines Northernblots, der mit mRNA aus Keratinozytensheets (a) direkt nach bzw. (b) vier Stunden nach Dispase-induzierter Ablösung und mit [³²P]-markierter pKe#122-cDNA durchgeführt wurde. Dieses Ergebnis beinhaltet die Aussage, daß direkt nach der Ablösung wenig pKe#122-mRNA vorhanden oder jedenfalls nachweisbar war, vier Stunden später dagegen große Mengen vorlagen (eine breitere, farbintensivere Bande), und zwar in der Molekulargewichtszone von etwa 4,8 kb.

Die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 enthält am 3'-Ende an Position 2373-2375 ein Stopcodon, das den mutmaßlichen Ort des Transkriptionsendes vorgibt, und dem genau 28 Nukleinsäuren vor der poly-A-Site eine der sog. "Polyadenylation site" (AATAAA) sehr ähnliche Sequenz, nämlich AATAA, folgt.

Damit ergibt sich für die Gesamtstruktur des pKe#122-Gens, bzw. verallgemeinert eines Polynukleotids, das für das Protein pKe#122 kodiert, daß dieses Gen bzw. Polynukleotid mit der im Sequenzprotokoll SEQ IN NO: 1 dargestellten Nukeotidsequenz oder einer Teilsequenz davon identisch oder hierzu komplementär ist, oder ganz oder teilweise mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleotidsequenz oder mit einer Teilsequenz davon oder mit einer komplementären Sequenz zu einer dieser beiden hybridisiert, wobei in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 anstelle von "T" auch ein "U" stehen kann, und daß von diesem Gen bzw. Polynukleotid eine mRNA abgelesen wird, die einer cDNA von ca. 4,8 kb entspricht bzw. homolog ist.

B) Ableitung der Aminosäurenabfolge und Charakterisierung des Proteins pKe#122 anhand des dafür kodierenden Polynukleotids (pKe#122-Gens)

Anhand des genetischen Codes wurde mit Hilfe eines computergestützten Verfahrens (Programm: HUSAR = Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources, Version 4.0, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, 1997) von der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 eine Aminosäuresequenz abgeleitet, die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 dargestellt ist. Die strukturelle Analyse dieser Aminosäuresequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 mit eben diesem Programm lieferte die folgenden Informationen:

- die Aminosäureabfolge von Position 40 bis 63 (LGKGNFAVVKLARHRVTKTQVAIK) entspricht bekannten Proteinkinase-Motiven mit ATP-Bindungsstelle,
- die Aminosäureabfolge von Position 152 bis 164 (IVHRDLKTENLLL) entspricht bekannten Serin/Threonin-Proteinkinase-Motiven,
- die Aminosäureabfolgen von Position 238 bis 240 (TLR), von Position 475 bis 477 (TGR), von Position 485 bis 487 (STR) und von Position 600 bis 603 (TTR) entsprechen bekannten Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C,
- die Aminosäureabfolge von Position 138 bis 156 (WQILSAVEYCHDHHIFLHIVHRD) stellt das pKe#122-1-Peptid dar, gegen das der anti-Peptid-Antikörper "Anti-pKe#122-1" im Kaninchen hergestellt wurde (vgl. Beispiel 2),
- die Aminosäureabfolge von Position 481 bis 499 (LAEVSTRLSPLTAPCIVVS) stellt das pKe#122-2-Peptid dar, gegen das der anti-Peptid-Antikörper "Anti-pKe#122-2" im Kaninchen hergestellt wurde (vgl. Beispiel 2),
- die Aminosäureabfolge von Position 339-352 (NHFAAIYYLLLERL) stellt das pKe#122-3-Peptid dar, gegen das der anti-Peptid-Antikörper "Anti-pKe#122-3" im Kaninchen hergestellt wurde (vgl. Beispiel 2),
- die Aminosäureabfolge von Position 614-625 (GLARQVCQVPAS) stellt das pKe#122-4-Peptid dar, gegen das der anti-Peptid-Antikörper "Anti-pKe#122-4" im Kaninchen hergestellt wurde (vgl. Beispiel 2).

In Fig. 2 sind diese Strukturdaten des Proteins pKe#122 schematisch dargestellt. Fig. 2A zeigt das Proteinkinase-Motiv mit ATP-Bindungsstellen, das Serin/Threonin- Proteinkinase-Motiv und die vier Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C, und Fig. 2B zeigt die Sequenzabschnitte, gegen die anti-Peptid-Antikörper in Kaninchen hergestellt wurden.

Beispiel 2 Verwendung der Aminosäuresequenz des Proteins pKe#122 zur Herstellung polyklonaler Anti-Peptid-Antiköper

Mittels computergestützter Antigenizitätsanalyse unter Verwendung des in Beispiel 1 genannten Computerprogramms wurden Bereiche aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ausgewählt, die zur Produktion polyklonaler Anti-Peptid-Antikörper geeignet erschienen. Diese Bereiche wurden nach dem bekannten "Multiple-Antigenic- Peptide"-Verfahren (vgl.: Posnett D. N., Tam J. P., 1989: Multiple antigenic peptide method for producing antipeptide site-specific antibodies. Methods-Enzymol. 1998; 178: 739-746) in Form separater Peptide (pKe#122-1 bis -4, vgl. Abb. 2) mit einem Molekulargewicht von ca. 10-15 kD synthetisiert. Diese Peptide wurden ohne Zusatz einer Trägersubstanz zur adjuvanzunterstützten Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Details dieses Peptid-Herstellungsverfahrens und dieses Immunisierungsverfahrens sind im Stand der Technik allgemein geläufig. Die Prä- und Postimmunseren wurden mit dem allgemein bekannten Enzyme-Linked-Immunosorbent- Assay (ELISA) auf die Reaktivität mit den jeweils zur Immunisierung verwendeten Peptiden und Vergleichspeptiden getestet. Es war eine deutliche Immunisierung gegen die Peptide pKe#122-1, -122-2 und -122-4 nachweisbar. Zur Aufreinigung der polyklonalen Antikörper wurden die Postimmunseren zunächst einer Ammoniumsulfatfällung unterworfen und dadurch die IgG-Fraktion angereichert. Mit dieser angereicherten IgG-Fraktion wurde anschließend eine Immunaffinitätschromatograpie durchgeführt. Hierfür wurden jeweils die vier zur Immunisierung verwendeten Peptide pKe#122-1 bis -4 an Sepharose 4B immobilisiert und diese Peptid-Sepharose-4B-Konjugate in der Immunaffinitätschromatographie eingesetzt. Es resultierten drei weitgehend reine anti-Peptid-IgG-Fraktionen, nämlich anti-Peptid pKe#122-1, anti-Peptid pKe#122-2 und anti-Peptid pKe#122-4. Diese drei affinitätsgereinigten Antikörperfraktionen zeigten eine eindeutige Immunreaktion mit dem jeweils korrespondierenden Antigen-Peptid. In Tabelle 1 sind diese Ergebnisse dargestellt.

Mit dem Immunserum gegen das Peptid pKe#122-1, dem polyklonalen Antikörper anti- pKe#122-1, wurden außerdem Zellysate der Keratinozytenlinie HaCaT und der Keratinozytensheets 8 Stunden nach Ablösung mit Dispase (= nicht-adhärente Keratinozytensheets) im Westernblot-Verfahren auf die Expression des Proteins pKe#122 getestet. Sowohl in den HaCaT-Zellen als auch in den Zellen der abgelösten (nicht-adhärenten) Keratinozytensheets wurde eine Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kD nachgewiesen. Der zum Experiment zugehörige Westernblot ist in Beispiel 3B(2) ausführlich beschrieben und in Fig. 3 dargestellt. Er zeigt sowohl in HaCaT-Zellen als auch in den nicht-adhärenten Keratinozytensheets ein Protein der Größe ca. 70 kD.

Der polyklonale Anti-Peptid-Antikörper pKe#122-1 wurde darüberhinaus mit dem hier in Beispiel 5 beschriebenen rekombinanten ca. 100 kD GST-pKe#122-Fusionsprotein (Fraktion 85 in Abb. 10B) im Immunoblot-Verfahren ausgetestet. Der polyklonale Anti- Peptid-Antikörper pKe#122-1 reagierte mit dem Fusionsprotein. Diese positive Reaktion wurde durch Vergleich mit Kontrollversuchen bestätigt, bei denen anstelle des Anti- Peptid-Antikörpers pKe#122-1 ein anti-GST-Antikörper, oder aber normales Kaninchen- IgG eingesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und in Fig. 4 dargestellt. Spur "a" in Fig. 4 zeigt den Kontrollansatz mit Ziege-Normal-IgG, Spur "b" in Fig. 4 zeigt den Ansatz mit Ziege-anti-GST-IgG, Spur "c" in Fig. 4 zeigt den Ansatz mit Kaninchen- Normal-IgG und Spur "d" in Fig. 4 zeigt den Ansatz mit Kaninchen-anti-pKe#122-1.

Beispiel 3 Verwendung des Proteins pKe#122 bzw. gegen das Protein oder gegen die mRNA des pKe#122-gerichtete Reagenzien zum Nachweis des aktivierten Zustands humaner epidermaler Keratinozyten A) Verwendete Keratinozyten

Als Versuchszellen bzw. Targetzellen (= Zielobjektzellen) dienten HaCaT-Zellen und humane epidermale Keratinozyten der Zellkultur bzw. des Zellkulturmodells (NHEK), das in der Publikation B. M. Schäfer und Koautoren (a. a. O.) ausführlich beschrieben und hier im Beispiel 1(A) kurz zusammengefaßt ist. Auf den Inhalt dieser Publikation wird auch an dieser Stelle ausdrücklich Bezug genommen. Desweiteren wurden Hautbiopsien auf die Expression des pKe#122-Proteins untersucht.

B) Nachweisverfahren, die auf der Anwendung der gegen das Protein pKe#122 gerichteten Antikörper beruhen 1. Immunhistologie

Mit Hilfe eines Kryotoms werden 5 µm-dicke Gefrierschnitte von Geweben aus Hautbiopsien von klinisch unauffälliger Normalhaut und klinisch auffälliger, läsionaler Haut infolge der Erkrankungen Pemphigus vulgaris, Bullöses Pepmphigoid und Psoriasis vulgaris hergestellt. Diese werden bei Raumtemperatur getrocknet und in 100% Azeton fixiert (anstelle von Azeton kann ebensogut auch 100% Methanol, 100% Ethanol oder 4%-iges Paraformaldehyd verwendet werden). Danach werden die Schnitte gemäß im Stand der Technik bekannter sog. "Blockierungsverfahren" behandelt, um unspezifische Bindungsstellen für den Antikörper zu blockieren. Im vorliegenden Beispielfall wurden zwei Blockierungsschritte durchgeführt: (1.) eine Blockierung mit Avidin/Biotin und (2.) eine Blockierung mit Normalserum. Im ersten Blockierungsschritt wurde die Avidin/Biotin-Blockierung unter Verwendung des Avidin-Biotin-Blockierungskits der Firma Vector-Laboratories nach Herstellervorschrift durchgeführt, d. h. es wurde bei Raumtemperatur zunächst 15 Minuten mit der Avidin-Fertiglösung und nachfolgend 15 Minuten mit der Biotin-Fertiglösung inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte mit 10 Vol.% Normalserum in PBS (Normalserum der Spezies, aus der der Zweit- Antikörper stammt, hier Ziege-Normalserum; PBS = Phosphate buffered saline = Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2-7,4) für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Im Anschluß an die Blockierung werden die Schnitte in PBS mit einem Gehalt an 5 µg/ml anti-Peptid-pKe#122-1 für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Entfernung des nichtgebundenen Antikörpers werden die Schnitte anschließend in PBS mit einem Gehalt an 0,2% (Gewicht/Volumen) bovinem Serumalbumin gewaschen. Es folgt die Inkubation mit einem beispielsweise Biotin-markierten und gegen Kaninchen-IgG- gerichteten Antikörper aus der Ziege (1 : 500 verdünnt in PBS/ 0,2% BSA; 30 Minuten bei Raumtemperatur), ein weiterer Waschschritt sowie die Aufbringung eines mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3-markierten Streptavidins (1 : 1000 in PBS/0,2% BSA verdünnt). Anstelle von Cy3 kann auch ein anderer Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung des Streptavidins verwendet werden, z. B. FITC. Nach einem letzten Waschschritt werden die Schnitte mit Eindeckmedium, z. B. Elvanol oder Histogel, eingedeckt und im Fluoreszenzmikroskop untersucht und ausgewertet. In Fig. 5 sind die Ergebnisse eines derart durchgeführten Immunfluoreszenznachweises gezeigt: Der anti-pKe#122-1 IgG Antikörper färbt auf Normalhautschnitten Keratinozyten im Bereich der epidermalen Basalmembranzone an (Fig. 5A). Bei Färbung von Biopsien läsionaler Haut infolge der Erkrankungen Pemphigus vulgaris (Fig. 5B), Bullösem Pemphigoid (Fig. 5C) oder Psoriasis vulgaris (Fig. 5D) zeigt sich eine auffällig starke Färbung in epidermalen Keratinozyten, insbesondere im Bereich epidermaler Läsionen. Dort hat demnach eine verstärkte Expression und eine offensichtlichen Aufregulation des Proteins pKe#122 stattgefunden.

2. Immuno-Blot ("Western-Blot") und Dotblot

In Fig. 3 ist der Nachweis des pKe#122-Proteins mittels Westernblot-Verfahren unter Verwendung von anti-pKe#122-1 dargestellt. Hierfür wurden Zellysate der Keratino zytenlinie HaCaT (Proben "HaCaT") und von Keratinozytensheets 8 Stunden nach Dispasebehandlung (Proben "NHEK 8h") elektrophoretisch in einem SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Proteine wurden nach Standardverfahren auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen wurde eine Inkubation mit 5 Gew.-% Milchpulver/TBS-Puffer durchgeführt. Anschließend wurden die (Protein-)Streifen mit der Bezeichnung "anti-122-1" in 3%- Milchpulver/TBS-Puffer unter Zusatz von anti-pKe#122-1-Antikörpern (1 µg/ml) und die (Protein-)Streifen mit der Bezeichnung "rbIgG" in 3%-Milchpulver/TBS-Puffer unter Zusatz von Kaninchen-Normal-IgG (1 µg/ml) jeweils bei 4°C für ca. 18 Stunden (über Nacht) inkubiert. Die Nitrozellulosemembran wurde danach mit TBS/Tween- und TBS-Puffer gewaschen und mit einem Enzym-markierten Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper in 3%-Milchpulver/TBS-Puffer inkubiert. Nach erneutem Waschen mit TBS/Tween und TBS wurden die gebundenen Antikörper mit einem peroxidase spezifischen Lumineszenzsubstrat (hier beispielsweise das ECL-System der Firma Amersham-Buchler) sichtbar gemacht und autoradiographisch dargestellt. Auch eine alternative Markierung mit chromogenen Substraten ist gut möglich.

Die Zellysate können auch ohne vorhergehende elektrophoretische Auftrennung direkt auf eine Nitrozellulosemembran geblottet und wie vorstehend beschrieben weiter behandelt werden.

3. Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA)

Mikrotiterplatten werden mit rekombinantem pKe#122/GST-Fusionsprotein in unter schiedlichen Konzentrationen (10-0 ng/ml) beschichtet. Unspezifische Bindungsstellen werden durch Behandlung mit 0,1 Gew.-% Gelatine in PBS (PBS/Gelatine) blockiert. Anschließend werden die beschichteten Vertiefungen mit anti-pKe#122-1 IgG (1 µg/ml) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert (siehe Fig. 6A, geschlossene Kreise). Der Kontrollansatz erfolgt mit Kaninchen Normal-IgG in gleichen Konzentrationen (siehe Fig. 6A, offene Kreise). Nach einem Waschschritt mit 0,05 Vol.% Tween-20 in PBS (PBS/Tween) erfolgt eine Inkubation mit Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Kaninchen IgG (1 : 10 000 in PBS/Tween). Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung ungebundener enzymmarkierter Antikörper wird das farblose Peroxidase-Substrat Ortho- Phenylendiamin zugesetzt, welches durch die Peroxidase in ein farbiges Produkt umgewandelt wird. Anstelle von Ortho-Phenylendiamin sind auch andere Peroxidasesubstrate mit Farbumschlag einsetzbar. Die Quantifizierung der Farbbildung und damit des gebundenen Antikörpers erfolgt durch Absorptionsmessung in einem Mikrotiterplattenphotometer bei 490 gegen 405 nm (Ordinate). Das Ergebnis eines solchen Versuchs ist in Fig. 6A dargestellt. Es zeigt, daß die Farbkonzentration der Menge des an die Platte gebundenen pKe#122-Fusionsproteins proportional ist. Daraus folgt, daß bei Einsatz von Proben bekannter Antigenkonzentrationen, sog. Standards, durch Vergleich die Quantifizierung einer unbekannten Antigenmenge möglich ist.

Zur Quantifizierung des pKe#122-Proteins in komplexen Lösungen wird die Durch führung eines Sandwich-ELISA (Fig. 6B) bevorzugt. Hierzu wird eine Mikrotiterplatte mit einem gegen pKe#122 gerichteten Antikörper (z. B. Kaninchen anti-pKe#I22/GST- Fusionsprotein, 1 µg/Vertiefung) beschichtet. Dann werden die noch verbliebenen unspezifischen Bindungsstellen der Mikrotiterplatte mit PBS/Gelatine blockiert. Anschließend wird die Mikrotiterplatte mit unterschiedlichen Konzentrationen des pKe#122/GST-Proteins (10-0 ng/ml) in Ansatz gebracht. Nach einem Waschschritt mit PBS/Tween wird die Platte mit einem zweiten Peroxidase-markierten anti-pKe#122- Antikörper (z. B. peroxidase-markiertem Kaninchen anti-pKe#122-1 (Peptid)-Antikörper) inkubiert (z. B. eine Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur). "Peroxidase" steht hier stellvertretend für praktisch jede beliebige Markierung des Antikörpers, z. B. mit Enzymen, Fluoreszenzmolekülen oder Lumineszenzmolekülen. Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung ungebundener enzymmarkierter Antikörper wird das farb lose Peroxidase-Substrat Ortho-Phenylendiamin zugesetzt, welches durch die Peroxidase-Aktivität in ein farbiges Produkt umgewandelt wird. Die Quantifizierung der Farbbildung erfolgt durch Absorptionsmessung in einem Mikrotiterplattenphotometer bei 490 gegen 405 nm (Ordinate). Das Ergebnis eines solchen Versuchs ist in Fig. 6B dargestellt. Es zeigt, daß die Farbkonzentration der Menge des an die Platte gebundenen pKe#122 proportional ist. Durch dieses Testverfahren ist folglich eine Quantifizierung der unbekannten Menge des pKe#122 in einer Probe möglich. Dabei steht die Substanz Ortho-Phenylendiamin hier stellvertretend für jedes beliebige Peroxidase-Substrat, das infolge der Peroxidase-Aktivität seine Farbe nachweisbar ändert.

Anstelle des hier beispielhaft verwendeten polyklonalen Antikörpers "anti-pKe#122-1" können ebensogut monoklonale Antikörper, die gegen das Protein pKe#122 gerichtet sind, eingesetzt werden, und zwar sowohl im einfachen ELISA (= Enzyme linked immunosorben assay) als auch im Sandwich-ELISA.

Beispiel 4 Nachweis pKe#122-spezifischer mRNA in Zellen mittels reverser Polymerasekettenreaktion

Mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde pKe#122-spezifische RNA in Zellen von Keratinozytensheets (NHEK) nach Dispasebehandlung und in HaCaT-Zellen nach gewiesen. Hierfür wurde RNA aus Zellen von Keratinozytensheets (NHEK) nach Dispasebehandlung und unterschiedlich langer weiterer Inkubationszeiten und aus HaCaT-Zellen jeweils mit Standardmethoden (Guanidinium-Thiocyanat-Phenol- Chloroform-Extraktionsmethode, siehe auch Beispiel 1A) isoliert und in cDNA nach Standardmethoden umgeschrieben. Diese cDNA wurde einer PCR unterzogen, bei der aus der pKe#122-spezifischen cDNA ein Teilfragment von ≈ 350 kb amplifiziert wurde. Als Primer-Paar wurde eine Kombination aus den Primern "pKe#122-forward 3" (tgagcaggcgctgggtatcatgcag) und "pKe#122-reverse 2" (tcaccgggaacaagaagggccacct) eingesetzt. Es wurden 10 ng cDNA mit je 10 µM Primer zusammen mit einem Gemisch aus hitzestabiler DNA-Polymerase, ATP, TTP, GTP, CTP und Polymerasepuffer (vgl. z. B.: Current protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1997, John Wiley & Sons. Inc. Suppl. 37, Chapter 15), hier im Beispiel in Form des im Handel gebrauchsfertig erhältlichen "PCR-Master-Mix" der Firma Clontech, in Ansatz gebracht. Zusätzlich wurden folgende Kontrolluntersuchungen durchgeführt: 1. der vorstehend beschriebene Ansatz mit dem Plasmid pUEX-1/pKe#122 anstelle der cDNA, 2. die Kit-interne Positivkontrolle, 3. der vorstehend beschriebene Reaktionsansatz ohne Zusatz von cDNA (Negativkontrolle 1), 4. der vorstehend beschriebene Ansatz mit cDNA aus Zellen von Keratinozytensheets (NHEK) 2 Stunden nach Dispasebehandlung, ohne Zusatz von Primern (Negativkontrolle 2). Die Reaktionsprodukte der PCR-Reaktion wurden im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Fig. 7 zeigt das Ergebnis dieser Auftrennung. Es gilt: Spur 1 = Molekulargewichts-Marker, Spur 2 = NHEK T0, Spur 3 = NHEK T2, Spur 4 = NHEK T4, Spur 5 = NHEK T8, Spur 6 = HaCaT, Spur 7 = frei, Spur 8 = Positivkontrolle (pUEX-1; mit pKe#122 als Insert), Spur 9 = Negativkontrolle (Ansatz mit cDNA ohne Primer), Spur 10 = Kit-spezifische Positivkontrolle zur Funktionskontrolle der PCR, Spur 11 = Negativkontrolle (Ansatz mit Primer ohne cDNA), Spur 12 = Molekulargewichts-Marker. Ein PCR-Produkt der erwarteten Größe von ≈ 350 kb wurde in den Spuren 3, 4, 5, 6 und 8 nachgewiesen, das heißt: pKe#122- spezifische mRNA wurde in Zellen von Keratinozytensheets zum Zeitpunkt 2 (T2), 4 (T4) und 8 (T8) Stunden nach dispase-induzierter Ablösung und ebenso in HaCaT-Zellen nachgewiesen.

Diese Technik ermöglicht den Nachweis der pKe#122-Expression auch in den Fällen, in denen der Nachweis des pKe#122-Proteins aufgrund zu niedrigen Expressionsspiegels mit immunhistologischen Methoden, dem ELISA-, Dotblot- oder Westernblot-Verfahren nicht gelingt.

Beispiel 5 Herstellung von Vektormolekülen mit der Fähigkeit zur Expression des Proteins pKe#122 in prokaryontischen bzw. eukaryontischen Zellen

Zur Herstellung bzw. Expression des rekombinanten pKe#122-Proteins wurden zwei Wege beschritten. Zum einen wurden zwei pKe#122-Gluthathion-S-Transferase (GST)- Fusionsproteine, pKe#122/GST-I und pKe#122/GST-II, (Vektor pGEX; siehe Fig. 8) zu dem Zweck der Expression in Bakterien (E. coli DH5α) hergestellt. Zum anderen wurde ein pKe#122-FLAG-Fusionsprotein (Vektor pBK-CMV; siehe Fig. 9) zu dem Zweck der Expression in eukaryontischen Zellen (cos-Zellen) hergestellt.

Die pKe# 122-Gluthathion-S-Transferase-(GST)-Fusionsproteine wurden in E. coli (DH5α) durch IPTG-Induktion zur Expression gebracht. Nach der Induktion wurde das bakterielle Lysat im Westernblot mit anti-GST-Antikörpern untersucht, und zwar im Vergleich zu pKe#122-Gluthathion-S-Transferase (GST)-Vektor tragendem, nicht- induziertem Bakterienlysat sowie zu Lysat von Bakterien, die ausschließlich GST exprimierten. Das Produkt dieses Westernblots ist in Fig. 10A abgebildet: Spur (a) zeigt die Kontroll-Transfektante (GST ohne Insert) vor IPTG-Induktion, Spur (b) zeigt die Kontroll-Transfektante (GST ohne Insert) nach IPTG-Induktion, Spur (c) zeigt pKe#122/GST-I vor IPTG-Induktion, Spur (d) zeigt pKe#122/GST-I nach IPTG- Induktion, Spur (e) zeigt pKe#122/GST-II vor IPTG-Induktion, und Spur (f) zeigt pKe#122/GST-II nach IPTG-Induktion.

Wie aus der Abbildung ersichtlich, war ein Gemisch unterschiedlich großer GST- positiver Banden nachweisbar und zwar ausschließlich nach IPTG-Induktion. Die höchstmolekulare Bande hatte ein Molekulargewicht von ca. 100 kD (Fraktion 85), die niedrigstmolekulare Bande von ca. 26 kD, was dem Molekulargewicht des reinen GST- Proteins entspricht. Die genannten Daten weisen darauf hin, daß es in E. coli zu einem Abbau des rekombinanten pKe#122-GST-Fusionsproteins kommt. Die exprimierten Fusionsproteine (Spur d) lagen als unlösliche Proteinaggregate in den sog. "inclusion bodies" vor, weshalb eine Aufreinigung mittels Prep-Cell durchgeführt wurde. Die Fraktionen dieser PrepCell-Reinigung wurden dann mittels Standardverfahren elektro phoretisch aufgetrennt und mittels des bereits oben beschriebenen Immuno-Blot- Verfahrens mit anti-GST-Antikörpern analysiert. Das Produkt dieses Aufreinigungs verfahrens ist in Fig. 10B abgebildet. Die Aufreinigung ergab ein Gemisch unterschied lich großer GST-Fusionsproteine. Die stärkste Bande, d. h. die Mehrzahl der GST- Fusionsproteine, wies ein apparentes Molekulargewichtsmarker von 65 kD auf. Das erlaubt den Schluß, daß das 65 kD pKe#122-GST-Fusionsprotein aus dem GST-Protein und einem ca. 40 kD großen Fragment des Proteins pKe#122 besteht. Das 65-kD- pKe#122/GST-Fusionsprotein wurde zur Herstellung eines polyklonalen Antiserums in Kaninchen herangezogen. Die Herstellung und Charakterisierung der Antikörper erfolgte wie in Beispiel 2 für die anti-Peptid-Antikörper beschrieben.

Die höchstmolekulare Bande hatte ein apparentes Molekulargewicht von ca. 100 kD (vgl. Abb. 10B, Fraktion 85). Das erlaubt den Schluß, daß das 100 kD-pKe#122-GST- Fusionsprotein aus dem GST-Protein und einem ca. 70-75 kD großen Fragment des Proteins pKe#122 besteht (vgl. auch Fig. 4 und dazugehörige Beschreibung in Beispiel 2).

Im eukaryontischen System wurde der pBK-CMV-pKe#122-Vektor (Fig. 9) in sog. Cos-Zellen, d. h. in Zellen der im Stand der Technik allgemein bekannten Cos-Zellinie, transformiert. Die Cos-Zellen wurden nach Standardverfahren durch Behandlung mit DEAE-Dextran/Chloroquin zur Aufnahme der Plasmid-DNA gebracht. Danach wurden die transformierten Zellen zwei Tage unter Standardbedingungen (37°C und 7% CO₂) inkubiert. Die Cos-Zellen wurden lysiert und im Immuno-Blot-Verfahren analysiert unter Verwendung eines Antikörpers gegen das FLAG-Epitop bzw. des anti-Peptid- Antikörpers anti-pKe#122-1 IgG. Fig. 11 zeigt das Produkt des Immuno-Blots: Spur a zeigt die nichttransfizierten Cos-Zellen, Spur b zeigt ein FLAG-Kontrollprotein und Spur c zeigt mit pKe#122-FLAG Vektorkonstrukt transfizierte Cos-Zellen. Die Spur c weist eine Bande mit einem ungefähren Molekulargewicht von 80 kD auf, die von dem anti- FLAG-Antikörper angefärbt wurde. Spur b zeigt ein FLAG-markiertes Kontrollprotein, das die Funktionalität des anti-FLAG-Antikörpers demonstriert.

Beispiel 6 Beeinflussung von Keratinozyten durch pKe#122-spezifische Antisense-Oligonukleotide

Antisense-Nukleotide werden von Zellen, auch Keratinozyten, aufgenommen (vgl. G. Hart mann et al. 1998: Antisense-Oligonukleotide, Deutsches Ärzteblatt 95, Heft 24, C1115-C1119) und binden an die in der Zelle vorliegende mRNA und hemmen deren Translation und damit die Expression (vgl. Y.-S. Lee, et al. 1997: Definition by specific antisense oligonucleotides of a role for proteinkinase Ca in expression of differentiation markers in normal and neoplastic mouse epidermal keratinocytes, Molecular Carcinogenesis 18, S. 44-53). Geeignete Antisense-Oligonukleotide wurden anhand der pKe#122-spezifischen Nuldeotidsequenz (SEQ NO: 1) hergestellt. Sie wurden mit geeignetem Puffermedium (sog. "Oligopuffer") auf eine Konzentration von 100 µM eingestellt. HaCaT-Zellen wurden bei 37°C und 7% CO₂ bis zu einer Konfluenz von 70-80% kultiviert. Die Zellen wurden abtrypsiniert (10 Minuten 0.2% EDTA, 5-10 Minuten 0,1% Trypsin) und auf eine Konzentration von 25 000 Zellen/ml eingestellt. Pro Vertiefung einer 96-well-Platte wurden 100 µl Zellsuspension (entspricht 2500 Zellen) einpipettiert. Die Zellen wurden 1 Stunde inkubiert, danach erfolgte die Zugabe des Antisense-Oligonukleotids (2 µl einer 100 µM-Lösung) und eine weitere Inkubation von 24-48 Stunden. Als Negativkontrolle dienten Zellansätze, denen Oligonukleotid mit der gleichen Basenverteilung aber zufällig ausgewählter Sequenz zugegeben wurden.

Die solcherart behandelten Zellen wurden mit Hilfe eines Mikroskops hinsichtlich phänotypischer Veränderungen in den Zellen untersucht. Das Ergebnis der mikrosko pischen Analyse ist in Fig. 12 und Fig. 13 dargestellt: Fig. 12a zeigt subkonfluente HaCaT-Kulturen, die mit pKe#122-spezifischen Antisense-Oligonukleotiden behandelt worden sind, Fig. 12b zeigt subkonfluente HaCaT-Kulturen, die mit Kontroll-Oligo nukleotiden behandelt worden sind, Fig. 13a zeigt konfiuente HaCaT-Kulturen, die mit pKe#122-spezifischen Antisense-Oligonukleotiden behandelt worden sind, Fig. 13b zeigt konfluente HaCaT-Kulturen, die mit Kontroll-Oligonukleotiden behandelt worden sind, und Fig. 13c zeigt einen Detailausschnitt aus Fig. 13a.

Die mikroskopischen Untersuchungsergebnsisse demonstrieren, daß im Vergleich zu Kontroll-Oligonukleotiden die Anzahl der Zellen in den mit dem spezifischen Antisense- Oligonukleotid behandelten Kulturen deutlich reduziert ist. Das läßt auf eine durch das antisense-Oligonukleotid verursachte Verminderung der zellulären Proliferation schließen. Nach Erreichen der Konfluenz fanden sich in den mit antisense-Oligo nukleotiden behandelten HaCaT-Kulturen stark vergrößerte Zellen, die in den mit Kontroll-Oligonukleotiden behandelten Kulturen nicht zu finden waren. Diese großen Zellen entsprechen in ihrer Morphologie differenzierten Keratinozyten. Der Befund läßt darauf schließen, daß mit pKe#122-spezifischen antisense-Oligonukleotiden behandelte Zellen eine vermehrte Tendenz zur Differenzierung aufweisen.

Zusammengefaßt führt die Behandlung mit pKe#122-spezifischen Oligonukleotiden zu einer deutlichen Beeinflussung der Proliferation und Differenzierung.

SEQUENZPROTOKOLL

Tabelle 1

Charakterisierung der Anti-Peptid-Antikörper. Aus den jeweiligen Seren wurde die IgG- Fraktion mittels Ammoniumsulfat-Fällung angereichert. Die jeweiligen IgG-Präparationen wurden mit dem korrespondierenden und den irrelevanten Peptiden in einem Peptid-ELISA ausgestestet. In einem weiteren Schritt wurde die IgG-Präparation auch auf dem gereinigten Fusionsprotein GST-pKe#122-1 im Immuno-Blot getestet.

Claims

1. Isoliertes Polypeptid,
das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ähnlich ist, und
das die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein durch Aminosäuresubstitution, -deletion, -insertion, oder -inversion daraus entstandenes Allel oder Derivat dieser Aminosäuresequenz aufweist.

2. Isolierte Nukleinsäure,
die ein Protein codiert,
das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ähnlich ist,
die entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz
oder die hierzu komplementäre Nukleotidsequenz
oder eine Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen
oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser beiden Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist.

3. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese Nukleinsäure aus einer natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Quelle gewonnen ist.

4. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß diese Nukleinsäure eine cDNA ist.

5. Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß diese Nukleinsäure ein Sense- oder Antisense-Oligonukleotid ist, das mindestens 6, vorzugsweise 8 bis 25 Nukleotide umfaßt und mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleotidsequenz oder Teilsequenzen davon hybridisiert.

6. Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß diese Nukleinsäure eine Splice-Variante ist, die mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleotidesquenz hybridisiert.

7. Isoliertes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus einer Splice-Variante einer mRNA resultiert, welche
entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz
oder die hierzu komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen
oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser beiden Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist.

8. Rekombinantes DNS-Vektormolekül, das eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 6 umfaßt, und das die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und in aktivierten Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle aufweist.

9. Rekombinantes DNS-Vektormolekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Vektormolekül das Plasmid pUEX-1 oder pGEX-2T oder pBK-CMV oder pHR 2 ist.

10. Transformierte Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 6 enthält, welche mit einem aktivierbaren Promotor gekoppelt ist, der in der Wirtszelle natürlicherweise oder als Folgen einer Rekombination enthalten ist, und die die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und in aktivierten Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, aufweist.

11. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Zytokeratin-14-Promotor und die Wirtszelle ein Keratinozyt ist, oder daß der Promotor der CMV-Promotor und die Wirtszelle eine Cos-Zelle ist.

12. Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder eines Vektormoleküls nach Anspruch 8 zur Herstellung transgener Säugetiere, insbesondere Mäuse oder Ratten.

13. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 7 zur Herstellung eines Antikörpers gegen dieses Polypeptid und/oder damit verwandte Proteine.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von insbesondere dermatologi schen Erkrankungen oder zur kosmetischen Behandlung insbesondere der Epidermis eingesetzt wird.

15. Antikörper, der spezifisch mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 7 reagiert.

16. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 15 zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von dermatologischen Erkrankungen oder zur kosmetischen Behandlung der Epidermis.

17. Reagenz zum indirekten Nachweis eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und in aktivierten Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz wenigstens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 6 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 7 umfaßt.

18. Verwendung eines Sense- oder Antisense-Oligonukleotids nach Anspruch 5 zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von insbesondere dermatologi schen Erkrankungen oder zur kosmetischen Behandlung insbesondere der Epidermis.

19. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 7 oder einer Nukleinsäure nach Anspruch 2 zur Identifizierung von medizinisch, kosmetisch oder pharmakologisch einsetzbaren Substanzen, die an das Polypeptid bzw. die Nukleinsäure binden und dadurch dessen/deren Funktion und/oder Expression beeinflussen, insbesondere als Inhibitoren oder Aktivatoren wirken.