JP2015072226A - 検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】検体中に含まれる肌診断用の抗原を、抗原抗体反応を利用して、高感度にかつ迅速に検出することができる検査方法を提供すること。
【解決手段】本発明の検出方法は、検体５０中に含まれる肌診断用の特定の抗原５１を検出する方法であり、検体５０を貯留するための複数の穴部１１を備える基材と、抗原５１を特異的に認識する特異抗体４１と、ホスホリルコリン基を含む第１の単位およびカルボン酸誘導基を含む第２の単位を有するポリマー３１とを備え、穴部１１の底面（内面）２１には、ポリマー３１を介して、特異抗体４１が担持されている検出容器１と；抗原５１と、界面活性剤と、ビシンと、塩とを含有する検体５０とを用意する第１の工程と、検体５０を、穴部１１に供給して、特異抗体４１に抗原５１を認識させる第２の工程と、特異抗体４１が認識した抗原５１を観察する第３の工程とを有する。
【選択図】図３

Description

本発明は、検体中に含まれる肌診断用の抗原を検出する検査方法に関するものである。

検体中に含まれる、肌診断用の抗原を検出して、検出された抗原の種類やその組み合わせに応じて、肌の状態を診断することが行われている（例えば、特許文献１参照。）。

従来、この肌診断用の抗原の検出には、通常、ウェスタンブロット法、免疫組織化学分析法、蛍光共鳴エネルギー遷移測定法等が用いられている。

しかしながら、これらの方法では、検体の採取から抗原の検出までに長時間を要し、迅速な肌診断を検体採取者に対して行うことができず、検体採取時における肌状態に応じた処置を施すことができないという問題が生じる。

国際公開番号ＷＯ２００７／０４６４６３号公報

本発明の目的は、検体中に含まれる肌診断用の抗原を、抗原抗体反応を利用して、高感度にかつ迅速に検出することができる検査方法を提供することにある。

このような目的は、下記（１）〜（６）に記載の本発明により達成される。
（１） 検体中に含まれる肌診断用の特定の抗原を検出する検査方法であって、
前記検体を貯留するための複数の穴部を備える基材と、前記抗原を特異的に認識する特異抗体と、ホスホリルコリン基を含む第１の単位およびカルボン酸誘導基を含む第２の単位を有するポリマーとを備え、前記穴部の内面には、前記ポリマーを介して、前記特異抗体が担持されている検出容器と、
前記抗原と、界面活性剤と、ビシンと、塩とを含有する検体とを用意する第１の工程と、
前記検体を、前記穴部に供給して、前記特異抗体に前記抗原を認識させる第２の工程と、
前記特異抗体が認識した前記抗原を観察する第３の工程とを有することを特徴とする検査方法。

（２） 前記抗原は、ヒートショックプロテイン２７、アルギナーゼ１、マクロファージ遊走阻止因子、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、プロフィリン１、インターロイキン１ａ、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト、ガレクチン−７またはＰＡＲＫ７である上記（１）に記載の検査方法。

（３） 前記ポリマーは、下記一般式（２Ｂ）で表される共重合体である上記（１）または（２）に記載の検査方法。

（ただし、上記一般式（２Ｂ）において、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。ｎは、１〜１００の整数を示す。）

（４） 前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン （９） オクチルフェニルエーテル（NP-40）、ポリオキシエチレン （８）オクチルフェニルエーテル（Triton X）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween）、ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、３−［（３−コラミドプロピル） ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（CHAPS）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij）、スルホベタイン3（SB3）のうちの少なくとも１種である上記（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の検査方法。

（５） 前記塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＮＨ_４Ｃｌのうちの少なくとも１種である上記（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の検査方法。

（６）前期検体は、そのｐＨが５．０以上、１０．０以下である上記（１）ないし（５）のいずれか１項に記載の検査方法。

本発明によれば、検体中に含まれる肌診断用の抗原を、抗原の種類に関係なく、抗原抗体反応を利用して、高感度にかつ迅速に検出することができ、かつ、この検出結果に基づいて、適切な肌診断を実施することができる。

本発明の検査方法に用いられる検出容器の好適実施形態を模式的に示す部分縦断面図である。 図１に示す検出容器が有する穴部付近を部分的に拡大した部分拡大平面図である。 図１に示す検出容器を用いた検査方法の好適実施形態を説明するための縦断面図である。 本発明の検査方法に用いられる検出容器の他の構成例を模式的に示す図である。 実施例で用いた検出容器が備える穴部の底面における特異抗体担持領域の配列を示す部分拡大平面図である。 実施例で用いた５つの検出容器の配列関係を示す平面図である。 実施例で用いた５つの検出容器における蛍光度分布を示す平面視撮像写真である。 実施例の０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＨＳＰ２７濃度と蛍光量との関係を示すグラフである。 実施例の０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＭＩＦ濃度と蛍光量との関係を示すグラフである。 実施例の０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＩＬ−１ａ濃度と蛍光量との関係を示すグラフである。 実施例の０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＩＬ−１ｒａ濃度と蛍光量との関係を示すグラフである。 実施例の０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＰＡＲＫ７濃度と蛍光量との関係を示すグラフである。 実施例の０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるガレクチン−７濃度と蛍光量との関係を示すグラフである。

以下、本発明の検査方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
＜検出容器＞
まず、本発明の検査方法に用いられる検出容器の一例である検出容器１について説明する。

図１は、本発明の検査方法に用いられる検出容器の好適実施形態を模式的に示す部分縦断面図、図２は、図１に示す検出容器が有する穴部付近を部分的に拡大した部分拡大平面図である。

検出容器１は、検体中に含まれる肌診断用の特定の抗原を検出するために用いられるものであり、検体を貯留するための複数の穴部を備える基材と、抗原を特異的に認識する特異抗体と、穴部の内面に吸着したポリマーとを有するものである。

本実施形態では、基材１０に４つ（複数）の穴部（ウェル）１１が設けられている。
すなわち、検出容器１では、平板状をなす基材１０の下面から突出するように４つの有底円筒状をなす筒体１２が設けられており、これら筒体１２に対応するようにして、基材１０の上面で開口する穴部１１が４つ設けられている。

また、各穴部１１における底面（内面）２１のほぼ全面にはポリマー３１が吸着し（担持され）ている。

そして、特異抗体担持領域２２に対応する底面２１には、このポリマー３１を介して、特異抗体４１が担持されており、特異抗体非担持領域２３に対応する底面２１には、ポリマー３１を介して、特異抗体４１が担持されていない。すなわち、穴部１１の底面２１において、特異抗体担持領域２２に対応する位置では、ポリマー３１を介して、特異抗体４１が担持され、特異抗体非担持領域２３に対応する位置では、ポリマー３１が担持されているものの、特異抗体４１が担持されていない。

したがって、穴部１１に検体を供給することにより、特異抗体担持領域２２に対応する底面２１において、特異抗体４１が特異的に認識する抗原が、特異抗体４１およびポリマー３１を介して、穴部１１の底面２１に担持される。このようにして、穴部１１の特異抗体担持領域２２に対応する底面２１において、検体中に含まれる抗原が、特異抗体４１に認識されることにより検出される。

これに対して、特異抗体非担持領域２３に対応する底面２１には、ポリマー３１を介して、特異抗体４１が担持されていない。そのため、特異抗体４１が特異的に認識する抗原を底面２１に特異抗体４１を介して担持されることはない。よって、穴部１１の特異抗体非担持領域２３に対応する底面２１では、検体中に含まれる抗原が検出されることはない。

特異抗体担持領域２２は、底面２１において、図２に示すように、平面視で、それぞれ、円形状をなしており、各特異抗体担持領域２２の間に、特異抗体非担持領域２３が介在することで、各特異抗体担持領域２２が区画されている。

このような各特異抗体担持領域２２は、本実施形態では、格子状をなすように配置されており、図２に示すように、Ｘ方向に５つずつ、Ｙ方向に６つずつ配置されている。

ここで、各特異抗体担持領域２２において、底面２１にポリマー３１を介して担持される特異抗体４１の種類は、同一のもの、または異なるものの何れであってもよい。

複数の特異抗体担持領域２２において、底面２１にポリマー３１を介して担持される特異抗体４１の種類を同一のものとすることにより、かかる特異抗体４１で認識される同一の抗原を複数の特異抗体担持領域２２において検出することができる。そのため、検出すべき抗原の検出感度（検出信頼性）の向上が図られる。

また、複数の特異抗体担持領域２２において、底面２１にポリマー３１を介して担持される特異抗体４１の種類を異なる（異種の）ものとすることにより、かかる特異抗体４１で認識される抗原が異なるものとなる。そのため、複数の特異抗体担持領域２２において異種の抗原を検出することができることから、１回の検査、すなわち、１つの検体から複数の抗原を検出することができる。

かかる特性を考慮して、本実施形態では、Ｘ方向に配列する５つの特異抗体担持領域２２において、底面２１にポリマー３１を介して担持される特異抗体４１の種類は、同一のものとなっており、Ｙ方向に配列する６つの特異抗体担持領域２２において、底面２１にポリマー３１を介して担持される特異抗体４１の種類は、互いに異種のものとなっている。かかる構成とすることで、上述した効果の双方を発揮させることができる。

また、特異抗体担持領域２２の外周の平均径は、３００〜５００μｍ程度であるのが好ましく、３５０〜４５０μｍ程度であるのがより好ましい。

さらに、各特異抗体担持領域２２の中心同士の離間距離は、６００〜８００μｍ程度であるのが好ましく、６５０〜７５０μｍ程度であるのがより好ましい。

検体採取者の肌の状態を診断する際に指標として用いることができる抗原、すなわち、特異抗体４１により認識される抗原としては、例えば、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）２７、アルギナーゼ１、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プロフィリン（ＰＦＮ）１、インターロイキン１ａ（ＩＬ−１ａ）、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ガレクチン−７またはＰＡＲＫ７（ＤＪ−１）が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合せて用いることができる。

このような抗原を、肌診断の際に検体中から検出するためには、前述の通り、かかる抗原を特異的に認識する特異抗体４１を、ポリマー３１を介して底面２１に担持させる必要があるが、本発明では、ポリマー３１としては、以下に示すようなものが用いられる。

すなわち、ポリマー３１としては、ホスホリルコリン基を含む第１の単位とカルボン酸誘導基を含む第２の単位とを有する高分子物質であり、抗体や抗原の非特異的吸着を抑制する性質と、抗体を固定化する性質とを併せ持つものが用いられる。

より具体的には、第１の単位に含まれるホスホリルコリン基は抗体や抗原の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第２の単位に含まれるカルボン酸誘導基は捕捉分子を化学的に固定化する役割を果たす。

ポリマー３１として、かかる構成のものを用いることにより、後述する検出容器１の製造方法において、このポリマー３１を介して、特異抗体４１を底面２１に確実に担持させることができる。

第１の単位は、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。

また、これら第１の単位として用いられる基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第１単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基材１０の底面（表面）２１における非特異的吸着をより確実に抑制することができる。

ポリマー３１において、第１の単位の割合は、特に限定されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、５〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜４０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１５〜３０ｍｏｌ％である。

また、第２単位において、活性化されたカルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。活性化されたカルボン酸誘導体としては、例えば、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸等のカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。

カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、例えば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；−Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン等の基を有することができる。
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１Ｂ）に示される基とすることができる。

（ただし、上記式（１Ｂ）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）

また、上記式（１Ｂ）に示される一価の基は、例えば、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。

（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ^１はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ^２はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）

具体的には、上記式（ｐ）に示される基として、例えば、下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。

また、上記式（ｑ）に示される基として、例えば下記式（ｕ）、（ｖ）に示される基が挙げられる。

したがって、上記式（１Ｂ）に示される基は、例えば、下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。

カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため好ましく用いられる。穏やかな条件としては、例えば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。

なお、本明細書中において、「活性エステル基」とは、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものを言う。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。

このような活性エステル基としては、−ＣＯＯＲ”で表されるＲ”に上記酸性度が高い電子吸引性基を有するものが挙げられる。例えば上記Ｒ”がｐ−ニトロフェニルである、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基；上記Ｒ”がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基；上記Ｒ”がフタル酸イミドである、フタル酸イミド活性エステル基；上記Ｒ”が５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドである、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でも保存安定性と反応性の高さとのバランスの点からｐ−ニトロフェニル活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。

また、ポリマー３１において、第２の単位の割合は、特に限定されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、１〜３０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜２０ｍｏｌ％、さらに好ましくは２〜１５ｍｏｌ％である。

基材１０の底面（表面）２１に特異抗体が固定化される検出容器１において、第１単位と第２単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、例えば、ホスホリルコリン基を含む第１単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。

また、ポリマー３１は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、このポリマー３１は、共重合体とすることができる。

具体的には、ポリマー３１がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。かかる構成とすることで、ポリマー３１が適度に疎水化し、基材１０の表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。

また、ポリマー３１において、ブチルメタクリレート基を含む構成とする場合、このブチルメタクリレート基を含む繰り返し単位の割合は、特に限定されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、４０〜９５ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは５０〜９０ｍｏｌ％、さらに好ましくは６０〜８０ｍｏｌ％である。

なお、ブチルメタクリレート基を含むポリマー３１を、具体的には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第１単量体と、ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第２単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第３単量体との共重合体とすることができる。

すなわち、これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２Ｂ）で表される。

（ただし、上記一般式（２Ｂ）において、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。ｎは、１〜１００の整数を示す。）

また、上記一般式（２Ｂ）において、第１〜第３単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。

ここで、上記一般式（２Ｂ）で示される共重合体は、ポリマー３１の適度な疎水化と、抗体の非特異吸着を抑制する性質と、抗体を固定化する性質とのバランスにより一層優れた構成である。このため、これを用いることにより、基材１０の表面をより確実にポリマー３１で被覆するとともに、ポリマー３１が吸着した基材１０上への非特異的吸着を抑制しつつ、抗体をさらに確実に共有結合により固定化して基材１０上に導入することができる。

また、検体採取者の肌の状態を診断する際に指標として用いることができる抗原、すなわち、特異抗体４１により認識される抗原として挙げた各種抗原は、具体的には、それぞれ、以下に示すようなものである。

すなわち、プロフィリン１（ＰＦＮ１：Ｇｅｎｅ ＩＤ ５２１６）は、生体内において広範囲に発現しているタンパク質であり、細胞内の細胞骨格構成タンパク質であるアクチンの重合・脱重合を調節するタンパク質として知られている。このようなプロフィリン１は、皮膚老化リスク評価の指標となり、特に、老化現象の対象として、シワ形成の指標（マーカー）として有効である。すなわち、検体中のプロフィリン１を検出してその発現量を測定することにより、シワ形成等の将来予測をすることができる。

また、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）は、熱等のストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して細胞を保護するタンパク質であり分子シャペロンとしての機能を有し、細胞内タンパク質輸送に関与するタンパク質でることが知られており、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。

アルギナーゼ１は分子質量３４，７３５Ｄａの細胞内タンパク質で、アルギニンをオルニチンと尿素に変換する酵素である。哺乳類《アルギナーゼ》の少なくとも２つの《アイソフォーム》（I型とII型）が存在し、それらは組織分布、細胞内局在性、免疫学的交差反応性、生理学的機能において異なる。この遺伝子が指令するアイソフォームI型は細胞質ゾル酵素であり、尿素循環の構成因子として肝臓で優先的に発現される。この酵素の遺伝的《欠損》は、《高アンモニア血症》を特徴とする《常染色体劣性遺伝疾患》である《アルギニン血症》をもたらす。このような、アルギナーゼ１は、紫外線リスクの指標（マーカー）として有効である。遺伝子塩基配列情報（ＡＲＧ１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．：１６：８７８９−８８０２（１９８８），Ｘ１２６６２）。アミノ酸配列情報（Ａｒｇｉｎａｓｅ−１，ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ．２０００Ｆｅｂ；７（２）：１３７−４４，Ｐ０５０８９）。

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）は、分枝質量４８，５２５Ｄａの分泌タンパク質である。ｕＰＡはプラスミノーゲンをプラスミンに変換するセリンプロテアーゼの一種。前駆体タンパク質（５５ｋＤａ）として細胞外へ分泌され、切断型（３５ｋＤａ）となってプロテアーゼ活性を示す。乳がんで多くの発現が見られるが、本発明では、皮膚老化マーカーの指標（マーカー）として有効である。遺伝子配列情報（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２７５９−２７７１，１９８５，ＢＣ０１３５７５）。アミノ酸配列情報（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ'ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６３：１０４３−１０５８，１９８２，Ｐ００７４９）。

マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、通常は血管中を血液とともに流動しており、能動的に適所にとどまることはできないマクロファージを、異物侵入場所に的確にとどめるための因子であり、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。

さらに、インターロイキン１ａ（ＩＬ−１ａ）は、炎症時における発熱や急性期タンパク質の産生誘導に関与する炎症性サイトカインであり、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。

インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、ＩＬ−１レセプターにＩＬ−１と同等の結合親和性を有するＩＬ−１の作用を拮抗的に阻害する一種の生体内インヒビターと考えられるものであり、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。

ガレクチン−７は、重層上皮に分布する糖鎖との結合に関与するタンパク質であり、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。

ＰＡＲＫ７（ＤＪ−１）は、パーキンソン病等に関与するタンパク質であり、肌ストレスマーカーの指標（マーカー）として有効である。

以上、説明したような検出容器１を用いた検出キットによれば、穴部１１において、それぞれ、上述したような抗原を検出することができる。そのため、得られた検出結果に基づいて、シワ、肌ストレス、紫外線ストレスおよび弾力性等の肌診断のための項目を検査することができる。

なお、本実施形態では、基材１０が４つの穴部１１を備える場合について説明したが、かかる場合に限定されず、基材は、少なくとも１つの穴部を備えていればよい。

＜検出容器の製造方法＞
上記のような検出容器１は、以下のようにして製造される。

本実施形態の検出容器の製造方法は、［Ａ］穴部を備える基材を用意する工程と、［Ｂ］穴部内にポリマーを担持させる工程と、［Ｃ］穴部内を洗浄する工程と、［Ｄ］穴部内の特異抗体担持領域に対応する位置に特異抗体を、ポリマーを介して担持させる工程と、［Ｅ］穴部内を洗浄する工程とを有する。

以下、各工程について、順次説明する。
［Ａ］まず、穴部１１を備える基材１０を用意する。
本実施形態では、基材１０に４つの穴部１１が１列に配列されているものが用意される。

この基材１０の構成材料としては、特に限定されず、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンのような直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィンおよび含フッ素樹脂等の樹脂材料が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

［Ｂ］次に、基材１０が備える穴部１１内にポリマー３１を担持させる。
この穴部１１内へのポリマー３１の担持は、本実施形態では、穴部１１の底面２１に対して施される。

ポリマー３１は、前述したとおり、ホスホリルコリン基を含む第１の単位とカルボン酸誘導基を含む第２の単位とを有する高分子物質である。

このような第１の単位と第２の単位とを有する高分子物質で構成されるポリマー３１の穴部１１の底面２１への担持は、例えば、第１の単位の単量体（モノマー）と、第２の単位の単量体（モノマー）とを、穴部１１内に供給し、これらを穴部１１内で重合させることにより行うことができる。

例えば、上記一般式（２Ｂ）で示される共重合体を底面２１上に担持させる場合には、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を溶媒中に混合して混合液を調製し、その後、この混合液を浸漬、吹きつけ等の公知の方法で穴部１１の底面２１に供給（塗布）し、穴部１１内においてラジカル重合等の公知の重合方法により、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡを重合させた後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行うことができる。

より具体的には、上記一般式（２Ｂ）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、例えば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体による溶液重合を行うことができる。

溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。

また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物等が用いられる。

より具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。

また、上記のように、ポリマー３１の合成と、ポリマー３１の底面２１への担持とを、穴部１１においてほぼ同時に実施する場合の他、予め合成されたポリマー３１を穴部１１の底面２１に供給して底面２１にポリマー３１を担持させるようにしてもよい。

この場合、例えば、予め合成したポリマー３１を有機溶剤に０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解したポリマー溶液を調製し、その後、このポリマー溶液を浸漬、吹きつけ等の公知の方法で底面２１に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより、底面２１にポリマー３１を担持させることができる。

有機溶剤としては、特に限定されないが、エタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールが基材１０の穴部１１を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。

［Ｃ］次に、穴部１１内を洗浄する。
具体的には、穴部１１内に洗浄液を供給した後、この洗浄液を除去して廃棄することで、穴部１１内を洗浄する。なお、洗浄液の供給の後、洗浄液を穏やかに攪拌するのが好ましい。これにより、洗浄液中に、穴部１１にポリマー３１として担持されなかった、第１の単位の単量体および第２の単位の単量体をより確実に分散させることができるため、穴部１１内の洗浄効率を向上させることができる。

本工程で用いる洗浄液としては、特に限定されないが、ポリマー３１の分解が生じるのを防止するために、等張液が好ましく用いられる。この等張液には、後述する検査方法の工程［３］で説明するのと同様のものが挙げられる。

また、本工程は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、穴部１１にポリマー３１として担持されなかった第１の単位の単量体および第２の単位の単量体をより確実に除去することができる。

この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。

［Ｄ］次に、穴部内の特異抗体担持領域に対応する位置に、抗原を特異的に認識する特異抗体４１を、ポリマー３１を介して担持させる。

すなわち、本実施形態では、底面２１において、Ｘ方向に５つ、Ｙ方向に６つずつ、それぞれ格子状に配列された特異抗体担持領域２２に対応する位置に、特異抗体４１を、ポリマー３１に固定化することにより、ポリマー３１を介して担持させる。

この際、Ｘ方向に１列に配列された５つの特異抗体担持領域２２に対応する底面２１の位置には、同一の種類（同種）の特異抗体４１がポリマー３１を介して担持され、Ｙ方向に１列に配列された６つの特異抗体担持領域２２に対応する底面２１の位置には、異なる種類（異種）の特異抗体４１がポリマー３１を介して担持される。

この特異抗体４１のポリマー３１への固定化は、例えば、特異抗体４１を溶解または分散させた液体（固定化液）を、基材１０（穴部）において、ポリマー３１が吸着した底面２１の特異抗体担持領域２２に対応する位置に、選択的に供給（点着）し、その後、静置して乾燥させることにより行うことができる。

また、底面２１の特異抗体担持領域２２に対応する位置に対する固定化液の供給は、かかる位置に固定化液を供給し得る方法であればいかなる方法を用いて行なってもよいが、例えば、インクジェット法、ナノインプリント法およびナノインク法等のうちの１種を用いて行うのが好ましい。これらの方法によれば、底面２１の特異抗体担持領域２２に対応する位置に、優れた精度で固定化液を選択的に供給することができる。

具体的には、インクジェット法では、固定化液を、ヘッドが備えるノズルから液滴として特異抗体担持領域２２に吐出することにより行われる。これにより、固定化液が特異抗体担持領域２２の形状に描画（供給）される。

また、ナノインプリント法では、特異抗体担持領域２２の形状に対応してパターニングされた型に固定化液を付着させた状態で、特異抗体担持領域２２にこの型を接触させることにより行われる。これにより、型に付着している固定化液が特異抗体担持領域２２の形状に転写（供給）される。

さらに、ナノインク法では、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）や原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）のような走査プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）に備えられるプローブ（探り針）をペン先として用いることにより行われる。そして、このプローブを底面２１に当接した状態で、固定化液をプローブに伝わせつつ、特異抗体担持領域２２内を移動させる。これにより、固定化液が特異抗体担持領域２２の形状に描出（供給）される。

［Ｅ］次に、穴部１１内を洗浄する。
これにより、固定化液中に含まれる特異抗体４１のうち、ポリマー３１に固定化しなかった特異抗体４１が、穴部１１外に廃棄される。

穴部１１内を洗浄する方法としては、前記工程［Ｃ］で説明したのと同様の方法が用いられる。

また、穴部１１内の洗浄後には、特異抗体非担持領域２３において、特異抗体４１を固定化した以外の底面２１に残存するポリマー３１の官能基を不活性化処理するのが好ましい。特異抗体４１を固定化する官能基が活性エステル基やアルデヒド基の場合は、アルカリ化合物、または一級アミノ基を有する化合物で不活化処理することができる。

アルカリ化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウム等を好ましく用いることができる。

一級アミノ基を有する化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等を好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。

以上の工程を経ることにより、検出容器１が製造される。
＜検査方法＞
次に、この検出容器１を用いた、肌診断用の特定の抗原を検出する検査方法について説明する。

図３は、図１に示す検出容器を用いた検査方法の好適実施形態を説明するための縦断面図である。

本実施形態の検査方法は、検体中に含まれる特定の抗原を検出する検査方法であって、［１］検出容器と、検出すべき抗原を含有する検体とを用意する工程と、［２］前記検体を穴部内に供給する工程と、［３］穴部内を洗浄する工程と、［４］前記抗原を特異的に認識し、かつ標識化された標識化特異抗体を含有する処理液を穴部内に供給する工程と、［５］穴部内を洗浄する工程と、［６］標識化特異抗体が備える標識部位を観察する工程とを有する。

以下、各工程において、検出容器１が備える穴部１１における底面２１の特異抗体担持領域２２で、検体中に含まれる肌診断用の特定の抗原が検出される過程を、順次説明する。

［１］ まず、図３（ａ）に示す検出容器１と、検出すべき抗原５１を含有する検体５０を用意する（第１の工程）。

検体５０には、例えば、検体採取者の皮膚（肌）に粘着テープを貼り付けて、この粘着テープに角層を粘着させ、その後、純水、超純水、イオン交換水等の水のような分散媒中に、この角層を分散させたものを用いることができる。

本発明では、このような検体５０は、抗原５１の他に、さらに、界面活性剤と、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ；C₆H₁₃NO₄）と、塩とを含有する。検体５０をこれらのものを含有するものとすることにより、次工程［２］において、検体５０を、穴部１１内に供給した際に、検体５０に含まれる抗原５１の特異抗体４１による特異的な認識能を向上させることができる。

したがって、底面２１の特異抗体担持領域２２に対応する位置において、ポリマー３１を介して特異抗体４１が担持されるが、特異抗体４１の種類によっては、ポリマー３１に対する結合率が低いものが存在する。すなわち、特異抗体４１の種類によっては、特異抗体４１が連結していないポリマー３１が多く残存しているものが存在するが、たとえ、このような場合であっても、本発明では、抗原５１の特異抗体４１による認識能が向上していることから、後工程［６］における標識化特異抗体６１が備える標識部位の観察を確実に行うことができる。換言すれば、検体５０中に抗原５１が含まれることを確実に観察することができる。

界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および陽イオン性界面活性剤が挙げられ、これらのうちのいずれであっても良いが、非イオン性界面活性剤としてのポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（NP-40、Triton X）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij）；両性界面活性剤としての３−［（３−コラミドプロピル） ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（CHAPS）、スルホベタイン3（SB3）；陰イオン性界面活性剤としてのラウリル硫酸ナトリウム（SDS）であることが好ましく、これらのうちの１種または２種以上を組み合せて用いることができる。これらの中でも、特に、ポリオキシエチレン （９） オクチルフェニルエーテル（NP-40）、ポリオキシエチレン （８）オクチルフェニルエーテル（Triton X）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween）、ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、３−［（３−コラミドプロピル） ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（CHAPS）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij）、スルホベタイン3（SB3）であることが好ましい。

また、塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＮＨ_４Ｃｌ等が挙げられ、これらの中でも、ＮａＣｌであるのが好ましい。

界面活性剤および塩として、これらのものを用いることにより、検体５０に含まれる抗原５１の特異抗体４１による認識能をより向上させることができる。

検体５０中における界面活性剤の濃度は、好ましくは０．００００１％以上、５%以下程度、より好ましくは０．０１％以上、１％以下程度に設定される。

また、検体５０中におけるビシンの濃度は、好ましくは１ｍＭ以上、５０ｍＭ以下程度、より好ましくは２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以下程度に設定される。

さらに、検体５０中における塩の濃度は、好ましくは１０ｍＭ以上、３００ｍＭ以下程度、より好ましくは１５０ｍＭ以上、２００ｍＭ以下程度に設定される。検体５０中における界面活性剤、ビシンおよび塩の濃度をかかる範囲内に設定することにより、前記認識能をさらに向上させることができる。

また、検体５０のｐＨは、好ましくは５．０以上、１０．０以下程度、より好ましくは６．５以上、８．５以下程度に設定される。これにより、抗原５１の破壊を防止しつつ、前記認識能をさらに向上させることができる。

［２］次に、図３（ｂ）に示すように、検体５０を、穴部１１内に供給する（第２の工程）。

これにより、特異抗体担持領域２２において、特異抗体４１に検体５０が接触する。このとき、検体５０中に、抗原５１が含まれていると、特異抗体（一次抗体）４１に抗原５１が特異的に認識される。

なお、検体５０中には、この抗原５１以外の抗原（図３（ｂ）中の●や★）が含まれているが、特異抗体４１は、抗原５１を特異的に認識する。そのため、この抗原５１以外の抗原が検体５０中に含まれていたとしても、特異抗体４１は、他の抗原を認識することなく、抗原５１を選択的に認識する。

その結果、特異抗体担持領域２２において、穴部１１の底面２１に、検体５０中に含まれる抗原５１が、ポリマー３１および特異抗体４１を介して選択的に担持（吸着）される。

なお、この検体５０を穴部１１内に留置しておく時間は、１〜３０分程度であるのが好ましく、５〜１５分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、特異抗体４１が認識する抗原５１の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。

また、処理時における検体５０の温度は、０〜４０℃程度であるのが好ましく、１０〜３７℃程度であるのがより好ましい。

検体５０の温度をかかる範囲内に設定することにより、検体５０中に含まれる抗原５１がより迅速かつ選択的に認識されるようになる。

なお、特異抗体非担持領域２３に対応する穴部１１の底面２１には、ポリマー３１を介して特異抗体４１が担持されていない。そのため、検体５０中に抗原５１が含まれていたとしても、特異抗体非担持領域２３に対応する位置では、抗原５１が底面２１に担持されることを的確に抑制または防止することができる。

［３］次に、穴部１１内を洗浄する。
具体的には、穴部１１内に洗浄液を供給した後、この洗浄液を除去して廃棄することで、穴部１１内を洗浄する。なお、洗浄液の供給の後、洗浄液を穏やかに攪拌するのが好ましい。これにより、洗浄液中に、穴部１１に担持されなかった抗原５１や、検体５０中に含まれる抗原５１以外の抗原をより確実に分散させることができるため、穴部１１内の洗浄効率を向上させることができる。

本工程で用いる洗浄液としては、特に限定されないが、特異抗体４１および抗原５１に変性・変質が生じるのを防止するために、等張液が好ましく用いられる。なお、本明細書中において、「等張液」とは、細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体のことを言うこととする。これにより、溶媒または分散媒が抗原に接触した際に、細胞内に存在するのと同様の浸透圧を維持することができるため、抗原の破壊を防止することができる。

この等張液には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水等を用いることができる。
また、この等張液には、必要に応じて、各種界面活性剤が添加されていても良い。

界面活性剤としては、例えば、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなアルキルグルコシド系非イオン界面活性剤、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（Ｔｗｅｅｎ２０）のようなポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

また、本工程は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、穴部１１に担持されなかった抗原５１をより確実に除去することができる。

この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。

［４］次に、標識化特異抗体６１を含有する処理液６０を穴部１１内に供給する（第４の工程）。

この標識化特異抗体６１は、特異抗体４１と同様に、抗原５１を特異的（選択的）に認識するとともに、標識部位により標識化された二次抗体として機能するものである。

かかる標識化特異抗体６１を含む処理液６０を穴部１１内に供給することにより、特異抗体担持領域２２において、標識化特異抗体６１は、図３（ｃ）に示すように、抗原５１を認識する。

その結果、ポリマー３１と、特異抗体４１と抗原５１とを介して、穴部１１の底面に標識化特異抗体６１が担持（吸着）される。

なお、抗原５１が認識（吸着）されていない特異抗体４１には、当然、標識化特異抗体６１が特異抗体４１を認識することができないため、標識化特異抗体６１が担持されることはない。

また、標識化特異抗体６１を標識化するための標識部位としては、特に限定されないが、酵素、蛍光物質および吸光物質等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

このように標識化特異抗体６１を用いて、抗原５１を標識化すれば、後工程［６］において、標識化特異抗体６１が有する標識部位を観察することにより、特異抗体４１に担持された抗原（マーカー）５１の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体５０中の抗原５１の量を定量することが可能となる。

なお、処理液６０を穴部１１内に留置しておく時間は、１〜３０分程度であるのが好ましく、５〜１５分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、標識化特異抗体６１が認識する抗原５１の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。

また、処理時における処理液６０の温度は、０〜４０℃程度であるのが好ましく、１０〜３７℃程度であるのがより好ましい。

また、処理液６０のｐＨは、特に限定されないが、５〜１０程度とするのが好ましく、６〜８程度とするのがより好ましい。

処理液６０の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、処理液６０中に含まれる標識化特異抗体６１がより迅速かつ選択的に認識するようになる。

また、処理液６０としては、標識化特異抗体６１を含有すればよく、特に限定されるものではないが、標識化特異抗体６１を等張液中に溶解したものが好適に用いられる。
さらに、等張液としては、前記工程［３］で説明したのと同様のものが挙げられる。

［５］次に、穴部１１内を洗浄する（第５の工程）。
これにより、処理液６０中に含まれる標識化特異抗体６１のうち、抗原５１を認識しなかった標識化特異抗体６１が、穴部１１外に廃棄される。

穴部１１内を洗浄する方法としては、前記工程［３］で説明したのと同様の方法が用いられる。

［６］次に、穴部１１内に担持された標識化特異抗体６１が備える標識部位を観察する。

例えば、標識部位が酵素である場合、この酵素との反応により、発色または吸光する基質７１を穴部１１内に供給し、その反応に伴う発色または吸光を観察することにより、抗原５１の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体５０中の抗原５１の定量を間接的に行うことが可能となる（図３（ｄ）参照。）。

また、標識部位が蛍光物質または吸光物質である場合、穴部１１に光を照射し、この光照射に伴う認識部位の発色または吸光を観察することにより、抗原５１の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体５０中の抗原５１の定量を間接的に行うことが可能となる。

なお、本実施形態では、上述した、穴部内を洗浄する工程［３］と、処理液を穴部内に供給する工程［４］と、穴部内を洗浄する工程［５］と、標識化特異抗体が備える標識部位を観察する工程［６］とで、特異抗体が認識した抗原を観察する第３の工程が構成される。

以上のようにして、穴部１１において、検体５０中における抗原５１を観察すること、すなわち、抗原５１の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体５０中の抗原５１の定量を行うことができる。

したがって、前述の通り、本実施形態では、Ｙ方向に配列する６つの特異抗体担持領域２２において、底面２１にポリマー３１を介して担持される特異抗体４１の種類は、互いに異種のものとなっている。そのため、かかる特異抗体４１で認識される抗原も異なるものとなることから、隣接する特異抗体担持領域２２において異種の抗原の有無を観察することができる。

よって、検出容器１を用いた検査方法によれば、検体５０中に含まれる肌診断用の抗原を、抗原抗体反応を利用して高感度に検出することができるとともに、さらに、Ｙ方向に配列する特異抗体担持領域２２において、ほぼ同時に異なる抗原の有無を観察することができるため、抗原の検出を迅速に行うことができる。

そして、複数の抗原の検出結果に基づいて、シワ、肌ストレス、紫外線ストレスおよび弾力性の項目の検査を行えるため、検体採取者（被検者）に対して、検体採取時における肌状態に応じた処置を施すことができる。

＜検出容器の他の構成例＞
なお、本発明の検査方法に用いられる検出容器は、上述したような検出容器１の構成のものに限定されず、例えば、以下のような検出容器１００の構成のものであってもよい。

図４は、本発明の検査方法に用いられる検出容器の他の構成例を模式的に示す図（図４（ａ）は、部分縦断面図、図４（ｂ）は、側面図）である。

かかる構成例の検出容器１００は、図４（ａ）に示すように、平板上をなす基材１５と、厚さ方向に貫通した４つ（複数）の貫通孔１７を有するシート１６とを有している。

この検出容器１００において、基材１５と、シート１６とは、それらの平面視形状が一致するように形成されており、基材１５上にシート１６を重ねるようにして貼付されている。これにより、基材１５の上面２５と、貫通孔１７の内周面とで、検体が供給される穴部１１が構成される。

かかる構成の検出容器１００が備える穴部１１において、上面２５は、検出容器１が備える穴部１１における底面２１と同様に、特異抗体担持領域２２に対応する位置には、ポリマー３１を介して、特異抗体４１が担持されており、特異抗体非担持領域２３に対応する位置には、ポリマー３１を介して、特異抗体４１が担持されていない。

したがって、検出容器１００においても、穴部１１に検体を供給することにより、特異抗体担持領域２２に対応する上面２５において、特異抗体４１が特異的に認識する抗原が、特異抗体４１およびポリマー３１を介して、穴部１１の上面２５に担持されることにより、穴部１１の特異抗体担持領域２２に対応する上面２５において、検体中に含まれる抗原が、特異抗体４１に認識されることにより検出される。

これに対して、特異抗体非担持領域２３に対応する上面２５には、ポリマー３１を介して、特異抗体４１が担持されていないため、特異抗体４１が特異的に認識する抗原を上面２５に特異抗体４１を介して担持されることはない。よって、穴部１１の特異抗体非担持領域２３に対応する上面２５では、検体中に含まれる抗原が検出されることはない。

また、検出容器１００では、シート１６は、図４（ｂ）に示すように、シート１６を基材１５から剥離可能となっている。

このようなシート１６の構成材料としては、例えば、シリコーン系樹脂、環状ポリオレフィン、ポリスチレン等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上の組み合せて用いることができる。

また、基材１５の構成材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンのような直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィンおよび含フッ素樹脂等の樹脂材料が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

シート１６および基材１５の構成材料の組み合わせを上記のようなものとすることにより、シート１６の下面１８は、基材１５の上面２５に対して粘着性を確実に示すため、シート１６から基材１５を容易に剥離することができるようになる。

なお、シート１６と基材１５との間には、必要に応じて剥離可能な接着層が設けられていてもよい。

かかる構成の検出容器１００は、例えば、以下のようなＩ）〜III）の製造方法により製造することができる。

Ｉ）前述した検出容器１の製造方法における、工程［Ａ］において、基材１５およびシート１６をそれぞれ用意した後、工程［Ｂ］〜工程［Ｅ］を、すなわち、基材１５の上面２５へのポリマー３１および特異抗体４１の担持を、基材１５にシート１６を貼付することなく実施し、その後、基材１５にシート１６を貼付することにより製造する方法。

II）前述した検出容器１の製造方法における、工程［Ａ］において、基材１５およびシート１６をそれぞれ用意した後、工程［Ｂ］〜工程［Ｃ］を、すなわち、基材１５の上面２５へのポリマー３１の担持を、基材１５にシート１６を貼付することなく実施し、その後、基材１５にシート１６を貼付した後、さらに、工程［Ｄ］〜工程［Ｅ］を、すなわち、基材１５の上面２５へのポリマー３１を介した特異抗体４１の担持を実施することにより製造する方法。

III）前述した検出容器１の製造方法における、工程［Ａ］において、基材１５およびシート１６をそれぞれ用意した後、基材１５にシート１６を貼付し、その後、工程［Ｂ］〜工程［Ｅ］を、すなわち、基材１５の上面２５へのポリマー３１および特異抗体４１の担持を、実施することにより製造する方法。

なお、III）の方法によれば、貫通孔１７の内周面にポリマー３１が担持されるため、穴部１１内に検体が供給された際に、貫通孔１７の内周面に抗原が不本意に吸着するのを的確に抑制することができる。

また、かかる構成の検出容器１００を用いた、肌診断用の特定の抗原を検出する検査方法は、例えば、前述した検出容器１を用いた検査方法における、工程［１］〜工程［５］を基材１５にシート１６を貼付した状態で実施し、その後、基材１５からシート１６を剥離し、この状態で工程［６］を、すなわち、標識化特異抗体が備える標識部位の観察を実施することにより行うことができる。このように、平板上をなす基材１５単独で標識部位を観察する構成とすることにより、シート１６で視界を遮られることなく、抗原等を介して上面２５に担持された標識部位を確実に観察することができる。さらに、平板上をなす基材１５は、スライドガラス等と同様に取り扱うことができるため、特殊な装置を用いることなく、標識部位を観察することができる。

以上、本発明の検査方法を、図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。

例えば、本発明の検査方法では、必要に応じて、１以上の任意の目的の工程を追加してもよい。

次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．ポリマーの合成
まず、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」と記載）、ｎ−ブチルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」と記載）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載。）を脱水エタノールに溶解させた。

そこに、さらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載、和光純薬工業社製）を添加し、均一になるまで撹拌することで、モノマー混合溶液を作製した。

なお、モノマー混合溶液中における、それぞれのモル比は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に７０：２７：３である。

その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集することによりポリマーを得た。

なお、上述したｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）については、以下に示すようにして合成した。

まず、０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂製、「Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００」）を２０ｍＬのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。

次に、−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業社製）およびクロロホルム２０ｍＬの均一溶液をゆっくりと滴下した。

そして、−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してＭＥＯＮＰを得た。

２．検出容器の製造
（１）まず、図１に示すような、４つの穴部１１を備えるポリエチレン樹脂で構成される基材１０を用意した。

（２）次に、前記ポリマーの合成において合成したポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを４つの穴部にそれぞれ点着したのち乾燥させることで、各穴部の底面に、ポリマーを導入した。

（３）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
なお、洗浄液としては、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を用いた。

（４）次に、特異抗体の１μｇ／ｍＬ リン酸バッファー溶液を調製し、これを各穴部１１の底面２１における特異抗体担持領域２２に対応する位置に点着したのち、室温下で一晩静置した。

なお、Ｘ方向に５つ１行に配列された特異抗体担持領域２２は、これらを１組としてＹ方向に６つ１列に配列されている。これらＸ方向に５つ１行に配列された特異抗体担持領域２２を、図５に示すように、Ｙ方向に向かって順番にＹ１〜Ｙ６とした。

そして、Ｙ１の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体（一次抗体）として抗ＨＳＰ２７抗体（R&D Systems社製、「Human TotalHSP27 ELISAキット」の抗体セット）を、Ｙ２の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＭＩＦ抗体（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ ＭＩＦ ELISAキット」の抗体セット」）を、Ｙ３の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＩＬ−１ａ抗体（IL-1a antibody（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ IL-1a ELISAキット」）を、Ｙ４の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＩＬ−１ｒａ抗体（IL-1ra antibody（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ IL-1ra ELISAキット」）を、Ｙ５の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＰＡＲＫ７抗体（Ｈｕｍａｎ ＰＡＲＫ７ ELISAキット」）を、Ｙ６の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ｇａｌｅｃｔｉｎ−７抗体（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ Galectin7 ELISAキット」）を、それぞれ、点着した。

（５）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
なお、洗浄液としては、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を用いた。

以上の工程を経ることで、検出容器１を製造した。なお、本実施例おいては、この検出容器１を合計１０個用意した。

３．サンプルの調製
［実施例］
３−１．標準検査液の調製
（１）まず、抗原として、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７；R&D Systems社製、「Human Total HSP27 ELISAキット」の抗原）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ；R&D Systems社製、「Ｈｕｍａｎ ＭＩＦ ELISAキット」の抗原）、インターロイキン１ａ（ＩＬ−１ａ；IL-1a antibody（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ IL-1a ELISAキット」）、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ IL-1ra ELISAキット」の抗原）、ＰＡＲＫ７（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ ＰＡＲＫ７ ELISAキット」）およびガレクチン−７（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ Galectin7 ELISAキット」）の６種類のものを用意した。

（２）次に、ＨＳＰ２７、ＭＩＦ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｒａ、ＰＡＲＫ７およびガレクチン−７の標準検査液中における含有量が、それぞれ、２ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬとなるように、これら抗原をＴ−ＰＥＲ Tissue Protein Extraction Reagent（Thermo Scientific社製、「78510」）に溶解することにより標準検査液を調製した。

（３）次に、この標準検査液を、それぞれ、２倍〜６４倍にまで希釈することにより、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍および６４倍希釈標準検査液を調製した。なお、各抗原を含有しないＴ−ＰＥＲ Tissue Protein Extraction Reagentを０倍希釈標準検査液とした。

３−２．検体の調製
（１）まず、１２名の被験者から、それぞれ、その皮膚（肌）に粘着テープを貼り付けることで、粘着テープに角層を粘着させた。

（２）次に、粘着テープに粘着した角層を、それぞれ、Ｔ−ＰＥＲ Tissue Protein Extraction Reagentに溶解することにより検体１〜１２を調製した。

３−３．標識化特異抗体含有液の調製
（１）まず、標識化特異抗体（二次抗体）として、ビオチン標識 HSP27 antibody（R&D Systems社製、「Human TotalHSP27 ELISAキット」の抗体セット）、ビオチン標識 MIF antibody（R&D Systems、「「Ｈｕｍａｎ ＭＩＦ ELISAキット」の抗体セット」）、ビオチン標識 MIF antibody（R&D Systems、「「Ｈｕｍａｎ ＭＩＦ ELISAキット」の抗体セット」）、ビオチン標識 IL-1a antibody（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ IL-1a ELISAキット」）、ビオチン標識 IL-1ra antibody（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ IL-1ra ELISAキット」）、ビオチン標識 ＰＡＲＫ７ antibody （R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ ＰＡＲＫ７ ELISAキット」）およびビオチン標識 ガレクチン−７ antibody （R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ Galectin7 ELISAキット」）を用意した。

（２）次に、ビオチン標識 HSP27 antibody、ビオチン標識 MIF antibody、ビオチン標識 MIF antibody、ビオチン標識 IL-1a antibody、ビオチン標識 IL-1ra antibody、ビオチン標識 ＰＡＲＫ７ antibodyおよびビオチン標識 ガレクチン−７ antibodyの標識化特異抗体含有液中における含有量が、それぞれ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２ｕｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬ、０．６μｇ／ｍＬ、０．６μｇ／ｍＬおよび０．６μｇ／ｍＬとなるように、これら標識化特異抗体をＰＢＳ溶液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解することにより標識化特異抗体含有液を調製した。

［比較例］
前記実施例で説明した３−１．標準検査液の調製および３−２．検体の調製で用いたＴ−ＰＥＲ Tissue Protein Extraction Reagentに代えてＰＢＳを用いたこと以外は、前記実施例と同様にして、０倍〜６４倍希釈標準検査液および検体１〜１２を調製した。

４．各種抗原の検出
［実施例］
（１）まず、前記２．製造容器の製造で製造した検出容器１を５つ用意し、これらをそれぞれ＃１〜＃５として、図６に示すように、左側から右側に向かって配列させ、それぞれが有する４つの穴部１１を、上側から下側に向かって１〜４とした。

（２）次に、前記３．サンプルの調製で調製した実施例の標準検査液および検体を、それぞれ、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１に、表１に示すような位置関係となるようにして、点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。

（３）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
なお、洗浄液としては、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を用いた。

（４）次に、標識化特異抗体含有液を、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１に、それぞれ、点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。

（５）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
なお、洗浄液としては、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を用いた。

（６）次に、Ｃｙ３標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を調製し、これを＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１に、それぞれ、点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置した。

（７）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
なお、洗浄液としては、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を用いた。

（８）その後、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
その結果、図７に示すような蛍光度分布が観察された。

また、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、それぞれ、Ｙ１の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＨＳＰ２７抗体が担持されているが、これらのうちの＃１、＃２の検出容器１が有する１〜４の穴部１１について、０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＨＳＰ２７濃度と蛍光量との関係を図８に示すように求めた。その結果、ＨＳＰ２７濃度と蛍光量との間に明らかな相関性が認められた。また、＃３〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、検体４の蛍光量が１６０８未満となっており、検体中にＨＳＰ２７が含まれているとは言えない結果となった。

さらに、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、それぞれ、Ｙ２の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＭＩＦ抗体が担持されているが、これらのうちの＃１、＃２の検出容器１が有する１〜４の穴部１１について、０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＭＩＦ濃度と蛍光量との関係を図９に示すように求めた。その結果、ＭＩＦ濃度と蛍光量との間に明らかな相関性が認められた。また、＃３〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、全ての検体１〜１２の蛍光量が４７４以上となっており、検体中にＭＩＦが含まれていると言える結果となった。

また、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、それぞれ、Ｙ３の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＩＬ−１ａ抗体が担持されているが、これらのうちの＃１、＃２の検出容器１が有する１〜４の穴部１１について、０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＩＬ−１ａ濃度と蛍光量との関係を図１０に示すように求めた。その結果、ＩＬ−１ａ濃度と蛍光量との間に明らかな相関性が認められた。また、＃３〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、検体２、４、６〜９、１１の蛍光量が２１２８未満となっており、検体中にＨＳＰ２７が含まれているとは言えない結果となった。

さらに、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、それぞれ、Ｙ４の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＩＬ−１ｒａ抗体が担持されているが、これらのうちの＃１、＃２の検出容器１が有する１〜４の穴部１１について、０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＩＬ−１ｒａ濃度と蛍光量との関係を図１１に示すように求めた。その結果、ＩＬ−１ｒａ濃度と蛍光量との間に明らかな相関性が認められた。また、＃３〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、検体４の蛍光量が２８３１未満となっており、検体中にＨＳＰ２７が含まれているとは言えない結果となった。

また、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、それぞれ、Ｙ５の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ＰＡＲＫ７抗体が担持されているが、これらのうちの＃１、＃２の検出容器１が有する１〜４の穴部１１について、０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるＰＡＲＫ７濃度と蛍光量との関係を図１２に示すように求めた。その結果、ＰＡＲＫ７濃度と蛍光量との間に明らかな相関性が認められた。また、＃３〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、全ての検体１〜１２の蛍光量が１０８２以上となっており、検体中にＭＩＦが含まれていると言える結果となった。

さらに、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、それぞれ、Ｙ６の特異抗体担持領域２２に対応する位置の底面２１には、特異抗体として抗ガレクチン−７抗体が担持されているが、これらのうちの＃１、＃２の検出容器１が有する１〜４の穴部１１について、０倍〜６４倍希釈標準検査液に含まれるガレクチン−７濃度と蛍光量との関係を図１３に示すように求めた。その結果、ガレクチン−７濃度と蛍光量との間に明らかな相関性が認められた。また、＃３〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１において、検体４の蛍光量が１８０９未満となっており、検体中にＨＳＰ２７が含まれているとは言えない結果となった。

［比較例］
前記実施例で説明した、工程（２）において、実施例の標準検査液および検体に代えて比較例の標準検査液および検体を用いた以外は、前記実施例と同様にして、＃１〜＃５の検出容器１が有する１〜４の穴部１１について、それぞれ、蛍光測定を行った。

その結果、ＩＬ−１ａ濃度と蛍光量との間、ＩＬ−１ｒａ濃度と蛍光量との間、ＰＡＲＫ７濃度と蛍光量との間、ガレクチン−７濃度と蛍光量との間に相関性を認めることができなかった。

１、１００ 検出容器
１０ 基材
１１ 穴部
１２ 筒体
１５ 基材
１６ シート
１７ 貫通孔
１８ 下面
２１ 底面
２２ 特異抗体担持領域
２３ 特異抗体非担持領域
２５ 上面
３１ ポリマー
４１ 特異抗体
５０ 検体
５１ 抗原
６０ 処理液
６１ 標識化特異抗体
７１ 基質

Claims (6)

1. 検体中に含まれる肌診断用の特定の抗原を検出する検査方法であって、
   前記検体を貯留するための複数の穴部を備える基材と、前記抗原を特異的に認識する特異抗体と、ホスホリルコリン基を含む第１の単位およびカルボン酸誘導基を含む第２の単位を有するポリマーとを備え、前記穴部の内面には、前記ポリマーを介して、前記特異抗体が担持されている検出容器と、
   前記抗原と、界面活性剤と、ビシンと、塩とを含有する検体とを用意する第１の工程と、
   前記検体を、前記穴部に供給して、前記特異抗体に前記抗原を認識させる第２の工程と、
   前記特異抗体が認識した前記抗原を観察する第３の工程とを有することを特徴とする検査方法。
2. 前記抗原は、ヒートショックプロテイン２７、アルギナーゼ１、マクロファージ遊走阻止因子、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、プロフィリン１、インターロイキン１ａ、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト、ガレクチン−７またはＰＡＲＫ７である請求項１に記載の検査方法。
3. 前記ポリマーは、下記一般式（２Ｂ）で表される共重合体である請求項１または２に記載の検査方法。
   

   

   （ただし、上記一般式（２Ｂ）において、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。ｎは、１〜１００の整数を示す。）
4. 前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン （９） オクチルフェニルエーテル（NP-40）、ポリオキシエチレン （８）オクチルフェニルエーテル（Triton X）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween）、ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、３−［（３−コラミドプロピル） ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（CHAPS）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij）、スルホベタイン3（SB3）のうちの少なくとも１種である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の検査方法。
5. 前記塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＮＨ_４Ｃｌのうちの少なくとも１種である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の検査方法。
6. 前記検体は、そのｐＨが５．０以上、１０．０以下である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の検査方法。

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