JP2012189581A - 皮膚のストレス蓄積度の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】皮膚角層をテープストリッピング法などによって、非侵襲的に採取し、その中に含有されるHSP27の発現量を測定することでストレスの蓄積度を評価する。
【選択図】図2
Description
(1)皮膚角層のヒートショックプロテイン(HSP)27の発現量をあらかじめ又は同時に測定した正常なヒト皮膚のHSP27の発現量と対比することを特徴とする、ヒト皮膚のストレス蓄積度の評価方法。
(2)皮膚角層のHSP27の発現量をあらかじめ又は同時に測定した正常なヒト皮膚のHSP27の発現量と対比することを特徴とする敏感肌の評価方法。
(3)皮膚角質層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層細胞におけるHSP27の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたHSP27の発現量を健常肌の皮膚角層におけるHSP27の発現量と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする(1)又は(2)記載の評価方法。
(4)被験者の評価対象部位の角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるHSP27の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたHSP27の発現量を健常肌を有する人の前記評価対象部位の角層のHSP27の発現量と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする(1)又は(2)記載の評価方法。
(5)皮膚角層のヒートショックプロテイン(HSP)27の発現量をあらかじめ又は同時に測定した標本集団の皮膚のHSP27の発現量分布と相対比較することを特徴とする、ヒト皮膚のストレス蓄積度の評価方法。
(6)皮膚角層のHSP27の発現量をあらかじめ又は同時に測定した標本集団の皮膚のHSP27の発現量分布と相対比較することを特徴とする敏感肌の評価方法。
(7)被験者の評価対象部位の角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるHSP27の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたHSP27の発現量を標本集団の前記評価対象部位の角層のHSP27の発現量分布と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする(5)又は(6)記載の評価方法。
(8)皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである(3)、(4)又は(7)のいずれかに記載の評価方法。
本発明の評価方法は、皮膚角層におけるHSP27の存在量を指標とすることを特徴としている。
HSP27とは一連のヒートショック蛋白質ファミリーの一つとして知られている分子量27KDの蛋白質で分子シャペロンとしての機能を有している。免疫ストレスにともなって皮膚での遺伝子発現が増加することが知られている。
または、被験者のある評価対象部位の角層におけるHSP27の発現量を測定し、測定されたHSP27の発現量を、標本集団の同一評価対象部位の角層におけるHSP27の発現量の分布と比較してもよい。標本集団のHSP27の発現量の分布を使用することによって、より客観的な評価ができる。
(1)紫外線によるストレス負荷
健康な男10名を被験者として試験を実施した。
紫外線照射装置として、Multiple Solar Ultraviolet Simulator Model 601(ソーラーライト社製)を用い、光源に150Wキセノンランプを使用した。被験者の背部皮膚に、色素沈着を誘導するような紅斑が出るように照射強度を調整し、170秒間紫外線(UVB)を照射した。なお、紫外線照射部位と非照射部位とを比較することで、紫外線によるストレス蓄積を確認した。人工紫外線照射前及び照射から5、11、17日目にテープストリッピング法(角層チェッカー:アサヒバイオメッド)により皮膚角層サンプルを採取した。
ホモジナイズ用チューブに0.1%SDS/PBS(-)200ulを採取し、これに上記テープストリッピングした角層チェッカーを入れ、ホモジナイゼーション用ペッスルを用いて粘着面を擦ることによりテープより角層からタンパクを抽出した。
角層抽出液中に含まれるタンパク量はDC Protein Assay Kit (Bio-Rad製)にて定量した。
1.5μgの角層タンパクをXP PANTERA Gel(5-20%グラジェントゲル:DRC社製)を用いてSDS-PAGEによって分離後、タンパク質をPVDF膜に転写し、StartingBlock Blocking Buffer(Thermo Scientific社製)にてブロッキングを行った。1次抗体(HSP27 Polyclonal Antibody:Stressgen社製)を1000倍希釈、2次抗体(Goat anti-mouse IgG:invitrogen社製)を10000倍希釈で反応させた後、ECLplus(BD Bioscience社製)を用いて、LAS-4000mini(フジフィルム社製)で検出を行った。得られたバンドの発光強度はScience Lab 2004 Multi Gauge(フジフィルム社製)にて数値化を行った。あらかじめ遺伝子組み換えHSP27タンパク質を標準品として作成した検量線により、発光シグナルの強度をHSP27のタンパク質量として読み取って評価を行った。
紫外線による刺激(ストレス)を与えた被験者の角層のHSP27量の測定結果を表1、図1にしめす。紫外線が長期間にわたって皮膚にストレスを蓄積させることを確認した。
皮膚のHSP27を増加させることが知られている界面活性剤SDSの刺激がストレスとして蓄積されることを確認するため健常肌の男女8名を対象として以下の試験を行った。
1日4回1時間おきに2日間、左前腕内側部を10%SDS水溶液で洗浄して肌荒れ(ストレス状態)を作成した。なお同一人の右前腕を水のみで洗浄し、対照とした。また、左前腕が、水分蒸散量が処理前と比較して上昇していることを確認後に以下の測定を開始した。
肌荒れ処理後(0日目)、翌日、3日目、5日目、7日目、14日目に水分蒸散量を測定するとともにテープストリッピング法によって角層サンプルを採取した。なお、14日目においても水分蒸散量の測定値が、肌荒れ処理前の測定値まで戻らなかった場合は21日目、28日目まで測定を延長した。
なお、水分蒸散量の測定は、Courage&Khazaka社製テバメーターで測定した。角層は角層チェッカー(アサヒバイオメッド)により採取した。
実験1と同様に、ホモジナイズ用チューブに0.1%SDS/PBS(-)200ulを採取し、これに上記テープストリッピングした角層チェッカーを入れ、ホモジナイゼーション用ペッスルを用いて粘着面を擦ることによりテープより角層からタンパクを抽出した。
角層抽出液中に含まれるタンパク量はDC Protein Assay Kit(Bio-Rad製)にて定量した。
1.5μgの角層タンパクをXP PANTERA Gel(5-20%グラジェントゲル:DRC社製)を用いてSDS-PAGEによって分離後、タンパク質をPVDF膜に転写し、StartingBlock Blocking Buffer(Thermo Scientific社製)にてブロッキングを行った。1次抗体(Hsp27 PolyclonalAntibody:Stressgen社製)を1000倍希釈、2次抗体(Goat anti-mouse IgG:invitrogen社製)を10000倍希釈で反応させた後、ECLplus(BD Bioscience社製)を用いて、LAS-4000mini(フジフィルム社製)で検出を行った。得られたバンドの発光強度はScience Lab 2004 Multi Gauge(フジフィルム社製)にて数値化を行った。あらかじめ遺伝子組み換えHSP27蛋白質を標準品として作成した検量線により、発光シグナルの強度をHSP27のタンパク質量として読み取って評価を行った。
SDS洗浄による刺激(ストレス)を与えた被験者の角層、並びに対照のHSP27量の測定結果を表2、図2に示す。またあわせて水分蒸散量の変化を示す。
アトピー性皮膚炎患者は、皮膚が常に外界からの刺激を受け続けており、皮膚は常にストレス状態にある。このような状態にある患者の皮膚ストレスの蓄積度を測定した。
(1)皮膚角層採取方法
アトピー性皮膚炎であると診断された女性患者4名の皮膚炎を呈している頚部皮膚より角質チェッカー(2.5cm×2.5cm:アサヒバイオメッド製)を用い、テープストリッピングを行い、角層を採取した。また皮膚炎症状を呈していない上腕部皮膚からも同様にしてサンプリングを行った。
ホモジナイズ用チューブに1%SDS/PBS(-)200ulを採取し、これに上記テープストリッピングした角層チェッカーを入れ、ホモジナイゼーション用ペッスルで粘着面を擦ることによりテープ上の角層からタンパクを抽出した。
角層抽出液中に含まれるタンパク量はDC Protein Assay Kit(Bio-Rad製)にて定量した。
1.5μgの角層タンパクをXP PANTERA Gel(5-20%グラジェントゲル:DRC社製)を用いてSDS-PAGEによって分離後、タンパク質をPVDF膜に転写し、StartingBlock Blocking Buffer(Thermo Scientific社製)にてブロッキングを行った。1次抗体(Hsp27 Polyclonal Antibody:Stressgen社製)を1000倍希釈、2次抗体(Goat anti-mouse IgG:invitrogen社製)を10000倍希釈で反応させた後、ECLplus(BD Bioscience社製)を用いて、LAS-4000mini(フジフィルム社製)で検出を行った。得られたバンドの発光強度はScience Lab 2004 Multi Gauge(フジフィルム社製)にて数値化を行った。発光シグナルの強度をHSP27の相対量として評価を行った。
アトピー性皮膚炎患者並びに健常人の皮膚角層のHSP27量の測定結果を表3、図3に示す。
(1)試料の採取
健常な女性8名より、頬、あご下、前腕、臀部よりテープストリッピング法によって角層サンプルを採取した。1部位より4枚採取した。
ホモジナイズ用チューブに0.5%chapsバッファー400μlを入れ、これに上記テープストリッピングした角層チェッカーを入れ、ホモジナイゼーションによりテープより角層からタンパクを抽出した。1部位から採取した4枚をまとめて1本のチューブで抽出し、1サンプルとした。
角層抽出液中に含まれるタンパク量はDC Protein Assay Kit(Bio-Rad製)にて定量した。
角層抽出液中に含まれるHSP27量はTotal human HSP27 DuoSet ELISA kit(R&D systems製)にて測定した。結果を単位タンパク量当たりのHSP27量として表4、図4に示した。なお表記は平均値±S.E.で示した。
(1)試験試料の採取
無作為に選抜した女性445名を対象として、頬よりテープストリッピング法によって角層サンプルを採取した。サンプルは1部位より1枚採取した。
ホモジナイズ用チューブにRIPAバッファー500ulを入れ、これに上記テープストリッピングした角層チェッカーを入れ、ホモジナイゼーションによりテープより角層からタンパクを抽出した(抽出液A)。更に、抽出後の角層チェッカーを、別のホモジナイズ用チューブに移し、1%SDS含有50mMトリス塩酸バッファー500μlを入れ、ホモジナイゼーションによりテープに残った角層からタンパクを抽出した(抽出液B)。抽出液AはHSP27の定量および角層タンパクの定量に用い、抽出液Bは角層タンパクの定量に用いた。
角層抽出液中に含まれるタンパク量はBCA protein assay(Pierce製)にて定量した。抽出液Aと抽出液Bのタンパク量の合計をtotal protein量とした。
角層抽出液中に含まれるHSP27量はTotal human HSP27 DuoSet ELISA kit(R&D systems製)にて測定した。結果は単位タンパク量当たりのHSP27量にて解析した。標本集団のHSP27発現量の度数分布表を表5に、ヒストグラムを図5に示した。
尚、実験4のHSP27の発現量は、実験3の頬部のHSP27の発現量の1/10であるが、これは、実験4のタンパク抽出方法では、HSP27を含むタンパク質を抽出した後に、1%SDS含有50mMトリス塩酸バッファーを用いて角層のタンパク質を抽出しており、実験3と比べて実験4の全タンパク質の検出量が増加したことが原因である。実験3、実験4ともにHSP27を抽出する工程には差がなく、HSP27は溶解性が高いため、当該工程で十分に抽出される。一方、実験4で追加した、SDSによる抽出方法によりタンパク質のほぼ全量を抽出することができるが、当該抽出液中のHSP27を測定することはできない。実験3と実験4の抽出工程が異なるため、実験3と実験4のデータを比較することはできないが、実験3のデータ間の比較、実験4のデータ間の比較は可能である。
実験4の標本集団から、無作為に189名を抽出し、ヒト皮膚のストレス蓄積度に関するアンケートを実施し、その結果とHSP27の発現量を対比した。
被験者に、被験者の肌が、「非敏感」、「やや敏感」、「敏感」の3種類のうちのいずれであるか選択させた。
下記敏感性の10の要因を被験者に提示し、非敏感(敏感ではない)、やや敏感(やや敏感である)、敏感(敏感である)のいずれに該当するか被験者に自己判断させた。
1 化粧品を使って赤みやかゆみを感じることがある
2 清涼感の高い(スーッした)化粧品が肌にあわないことがある
3 エタノールが入った化粧品が肌にあわないことがある
4 香水や香料が入った化粧品が肌に合わないことがある
5 肌が弱いので化粧品を慎重に選んでいる
6 マッサージなど物理的な刺激によって肌の状態が悪くなることがある
7 普段の生活でも紫外線を浴びたりすると肌が赤くなったり、ヒリヒリしやすい
8 汗をかいた後にかゆみがでることがある
9 化粧品や洗剤があわずに赤みやかゆみがでる
10 化粧品の肌トラブルにより通院した経験がある
「敏感」を選択する者は、ヒト皮膚のストレス蓄積度が高く、「非敏感」を選択する者はヒト皮膚のストレス蓄積度が低いと予想した。
肌の敏感性のアンケート結果とHSP27量の関係を表6、図6に示す。
被験者に、屋外活動経験について、「あり」、「なし」のうちでいずれかを選択させた。
屋外活動として、スポーツやガーデニングを例示した。
屋外活動経験「あり」と回答するものはヒト皮膚のストレス蓄積度が高く、「なし」と回答するものはヒト皮膚のストレス蓄積度が低いと予想した。
屋外活動経験のアンケート結果とHSP27量との関係を表7、図7に示す。
Claims (8)
- 皮膚角層のヒートショックプロテイン(HSP)27の発現量をあらかじめ測定した正常なヒト皮膚のHSP27の発現量と対比することを特徴とする、ヒト皮膚のストレス蓄積度の評価方法。
- 皮膚角層のHSP27の発現量をあらかじめ測定した正常なヒト皮膚のHSP27の発現量と対比することを特徴とする敏感肌の評価方法。
- 皮膚角質層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層細胞におけるHSP27の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたHSP27の発現量を健常肌の皮膚角層におけるHSP27の発現量と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする請求項1又は2記載の評価方法。
- 被験者の評価対象部位の角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるHSP27の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたHSP27の発現量を健常肌を有する人の前記評価対象部位の角層のHSP27の発現量と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする請求項1又は2記載の評価方法。
- 皮膚角層のヒートショックプロテイン(HSP)27の発現量をあらかじめ又は同時に測定した標本集団の皮膚のHSP27の発現量分布と相対比較することを特徴とする、ヒト皮膚のストレス蓄積度の評価方法。
- 皮膚角層のHSP27の発現量をあらかじめ又は同時に測定した標本集団の皮膚のHSP27の発現量分布と相対比較することを特徴とする敏感肌の評価方法。
- 被験者の評価対象部位の角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるHSP27の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたHSP27の発現量を標本集団の前記評価対象部位の角層のHSP27の発現量分布と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする請求項5又は6記載の評価方法。
- 皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである請求項3、4又は7のいずれかに記載の評価方法。
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