CN103380375A - 皮肤的应激积累度的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题为提供一种新型的评价方法，其不会对使用者造成负担即可评价肌肤的应激积累度，进而可简便且确切地评价是否为敏感性肌肤。因此，通过胶带剥离法等，以非侵入式方式采集皮肤角质层，并通过测定其中含有的HSP27的表达量而评价应激积累度。

Description

皮肤的应激积累度的评价方法
技术领域
本发明涉及人体皮肤的应激积累度的评价方以及敏感性肌肤的评价方法。
背景技术
人体的皮肤时常与外界接触，并受到各种刺激。该刺激的代表性例子为紫外线。紫外线即使在外观上未使肌肤发生太大变化，在此情形下，仍会诱发皮肤细胞的DNA断裂或胶原蛋白的变性等，而引起皮肤老化。紫外线经常持续地对肌肤施加应激(stress)。此外，对女性而言，洗脸、化妆等日常行为也会对皮肤造成刺激，这些刺激会作为潜在应激而在肌肤上积累。而且，如对于这些刺激(应激)的抵抗力因某种原因减少时，即认定为敏感性肌肤。此种皮肤的外界刺激的积累度在本发明中称为皮肤的应激积累度。另一方面，敏感性肌肤指虽无明显的皮肤病变，但容易引起不利的、有害的反应的肌肤。而且，作于此种敏感性肌肤的原因，也可以说当应激的积累达到一定程度时，肌肤的敏感性会提高。此外，敏感性肌肤对外界刺激的抵抗力较健康肌肤低，可以说是容易发生皮肤问题的肌肤。近年来，意识到敏感性肌肤的女性有增加的趋势，在化妆品等方面也越来越期望有刺激性更小的产品。
在化妆品的销售现场，一直以来都是由美容专家进行问诊，评价肌肤应激的积累状况及是否为敏感性肌肤，而选择施加给肌肤的应激(刺激)少的化妆品。然而，近年来由于邮购销售等化妆品专家不在场的销售方法逐渐普及，因此，期望判定肌肤的应激状态，且即使不是专家也能对敏感性肌肤的程度进行简便地评价。如其可行，则即使不依赖美容专家问诊，使用者也可自行评价肌肤的应激状态和是否为敏感性肌肤，从而选择适当的化妆品。此外，可简单地选择更适合使用者肌肤的化妆品、化学焕肤(chemical peeling)剂，由此，可避免皮肤炎症等的肌肤问题及副作用，可更加提高化妆品的护肤作用、化学焕肤的施行等的有益性。因此，人们正在寻求一种方法，即使不依赖问诊，也能评价皮肤的外界刺激暴露过程(肌肤应激的积累度)，且客观地判别是否为敏感性肌肤。
在专利文献1中公开了以下方法，在皮肤上涂布化妆品后，将剥离出的皮肤角质层回收并进行观察，以评价皮肤的敏感性。然而，该方法需对每种化妆品全都进行检查，且无法评价使用者肌肤的应激积累度。
专利文献2中公开了以下方法，在皮肤上涂布如辣椒素酯类物质（capsinoids）的刺激性物质，以用于评价是否为敏感性肌肤。然而，使用如辣椒素酯类物质（capsinoids）的刺激性强的物质的试验方法，对受试者来说并不优选。
专利文献3中公开了以下方法，测定脸部角质层的钙卫蛋白(calprotectin)存在量，以评价是否为敏感性肌肤。
非专利文献1、2中有以下记载，因热休克蛋白(heat shockprotein，即HSP)27对作为表面活性剂的月桂基硫酸钠(SDS)所引起的皮肤刺激产生反应，而在皮肤上增加。
现有技术文献
专利文献
专利文献1日本特开平10-295648号公报
专利文献2日本特开2005-296007号公报
专利文献3日本专利第4469762号公报
非专利文献
非专利文献1Ingeborg L.A.Boxman,et al.,ExperimentalDermatology,2002,11,509-517.
非专利文献2Ingeborg L.A.Boxman,et al.,British Journal ofDermatology,2002,146,777-785.
发明内容
如上所述，期望有评价肌肤的应激积累度并客观地评价是否为敏感性肌肤的方法。期望该评价方法为非以外科方式取出皮肤而对皮肤造成刺激等的对使用者造成负担的方法。本发明的课题为提供一种使用生化指标的新型评价方法，该方法不会对使用者造成负担，即可评价肌肤的应激积累度，且可简便而确切地评价是否为敏感性肌肤。
本发明如下构成。
(1)一种人体皮肤的应激积累度的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的热休克蛋白(HSP)27的表达量与预先或同时测定的正常人体皮肤的HSP27的表达量进行对比。
(2)一种敏感性肌肤的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的HSP27的表达量与预先或同时测定的正常人体皮肤的HSP27的表达量进行对比。
(3)根据(1)或(2)中所述的评价方法，其特征在于，具备下述工序：采集工序，采集皮肤角质层；测定工序，测定所述采集工序中所采集的角质层细胞中的HSP27的表达量；以及对比工序，将所述测定工序中所测定的HSP27的表达量与健康肌肤的皮肤角质层中的HSP27的表达量进行对比。
(4)根据(1)或(2)中所述的评价方法，其特征在于，具备下述工序：采集工序，采集受试者的评价对象部位的角质层；测定工序，测定所述采集工序中所采集的角质层中的HSP27的表达量；以及对比工序，将所述测定工序中所测定的HSP27的表达量与具有健康肌肤者的所述评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量进行对比。
(5)一种人体皮肤的应激积累度的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的HSP27的表达量与预先或同时测定的样本组皮肤的HSP27的表达量分布进行相对对比。
(6)一种敏感性肌肤的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的HSP27的表达量与预先或同时测定的样本组皮肤的HSP27的表达量分布进行相对对比。
(7)根据(5)或(6)中所述的评价方法，其特征在于，具备下述工序：采集工序，采集受试者的评价对象部位的角质层；测定工序，测定所述采集工序中所采集的角质层中的HSP27的表达量；以及对比工序，将所述测定工序中所测定的HSP27的表达量与样本组的所述评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量分布进行对比。
(8)根据(3)、(4)及(7)中任一项所述的评价方法，其特征在于，采集皮肤角质层的工序通过胶带剥离(tape stripping)法进行。
根据本发明的评价方法，可通过测定角质层中的HSP27的表达量评价肌肤的应激积累度。此外，以该HSP27存在量为指标，可简便地评价肌肤是否为敏感性肌肤。而且，由于本发明的评价方法为以胶带剥离法等简便的操作方法来采集评价试样，所以，受试者的负担较少，任何人均可简单地进行评价。此外，因为是生物化学的试验方法，由任何人进行测定均会得到相同的结果，因此不必如以往一样通过与专家面谈的方式进行咨询。
附图说明
图1为表示由紫外线照射引起的应激负荷的积累反映在角质层中HSP27的表达量增加上的图。
图2为表示由SDS引起的低刺激的应激负荷反映在人体角质层中HSP27的表达量增加上的图。
图3为对属于敏感性肌肤的特应性皮炎患者的正常皮肤与炎症皮肤的角质层中的HSP27存在量进行测定的图。为确认即使在特应性皮炎患者的正常皮肤中也有应激积累的图。
图4为表示通过ELISA法测定健康者的各种部位皮肤中的HSP27的结果的图。越是日常暴露于应激下的部位，HSP27的测定值越高。
图5为表示样本组的HSP27表达量的直方图。
图6表示肌肤敏感性的问卷调查结果与HSP27量的关系。
图7表示室外活动经验的问卷调查结果与HSP27量的关系。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明的评价方法的特征为以皮肤角质层中的HSP27存在量为指标。
HSP27为已知作为一系列热休克蛋白质家族之一的分子量为27KD的蛋白质，并具有作为分子伴侣蛋白(molecular chaperon)的功能。已知会随着免疫应激增加，而皮肤中的基因表达增加。
本发明中的敏感性肌肤是指虽无明显的皮肤病变，但容易引起不利的、有害的反应的肌肤。且也可以说是与健康肌肤相比，对外界刺激的抵抗力低、容易发生皮肤问题的肌肤。另一方面，健康肌肤是指不显示如上所述的敏感性肌肤的性质的健康正常的肌肤。在敏感性肌肤中，已知有使经皮水分丧失量(TEWL；transepidermal water loss)提高且使高频传导度(角质层水分量)降低等的趋势。此外，敏感性肌肤有时会发生斑疹、肌肤粗糙的情况。
角质层为位于皮肤最上层的组织，具有保护皮肤不受来自体外的异物或刺激侵害的功能。
本发明的评价对象部位，只要是可取得角质层的部分，也可包含任意部位，主要部位可列举如面部、颈部、上臂部。可按照以往的方法而得到取自这些部位的皮肤的角质层。然而，如前所述，由于以外科方式取出皮肤等方法会对使用者造成负担，所以，优选胶带剥离、刮擦等简便地得到角质层的方法。
如此准备的各试样中的HSP27的表达量可通过以往已知的方法进行测定。例如，可基于与针对HSP27的抗体的反应，使用酶免疫分析法(enzyme immunoassay)、放射免疫分析法(radioimmunoassay)、蛋白质印迹法(western blotting method)等方法。
从各试样中，将HSP27经由各种本身即为已知的生物化学方法，例如冻融法(freezing and thawing method)、超声波破碎法、均质法等而制备可溶性组分(soluble fraction)。提取后，迅速进行测定。
与健康肌肤相比，由于积累有应激的肌肤或敏感性肌肤角质层中的HSP27的表达量显著高，所以，以角质层中的HSP27的表达量多少为指标，即可简便地评价出应激积累度或肌肤是否为敏感性肌肤。本发明中所使用的角质层，可使用胶带剥离等通过角质胶带而仅采集角质层的表层部分的简单方法来进行采集。此外，本发明不对皮肤施加紫外线、化学物质等刺激，即可测定HSP27的表达量。因此，不对使用者造成负担下，即可评价使用者的肌肤是否为敏感性肌肤。特别是可简单地选择更适合使用者肌肤的化妆品、化学焕肤剂，由此，可避免皮肤的炎症等肌肤问题及副作用，更加发挥化妆品的护肤作用及有益性。
本发明的评价方法由以下工序构成：采集工序，采集角质层；测定工序，测定所述采集工序中所采集的角质层中的HSP27的表达量；以及对比工序，将所述测定工序中所测定的HSP27的表达量与健康肌肤的角质层中的HSP27的表达量进行对比。或者本发明的评价方法由以下工序构成：采集工序，采集角质层；测定工序，测定所述采集工序中所采集的角质层中的HSP27的表达量；以及对比工序，将所述测定工序中所测定的HSP27的表达量与样本组的角质层中的HSP27的表达量分布进行对比。以下说明此评价方法。
首先，将如上所述测定的HSP27的表达量与健康肌肤的角质层中的HSP27的表达量进行对比。此外，也可测定受试者的某评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量，将所测定的HSP27的表达量与具有健康肌肤者的同一评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量进行对比。具有健康肌肤者的角质层中的HSP27的表达量可通过使用来自复数名具有健康肌肤者的数据的平均值，更为客观地进行评价。
或者也可测定受试者的某评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量，将所测定的HSP27的表达量与样本组的同一评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量分布进行对比。通过使用样本组的HSP27的表达量分布，可更为客观地进行评价。
如此对比后的结果，当所测定的HSP27的表达量显著大于健康肌肤的HSP27的表达量时，或与样本组的HSP27的表达量分布相比，判断为HSP27的表达量大时，即可评价为应激的积累多，且可进一步评价为属于敏感性肌肤的可能性高。该健康肌肤的试样可采集于测定HSP27的人，也可采集于与测定HSP27的人不同的人。此外，该样本组可优选为以统计上有效的规模来随机抽出，但也根据目的优选例如按照性别、年龄的不同来抽出样本组。
此外，当受试者的某评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量显著大于具有健康肌肤者的同一评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量时，或是与样本组的同一评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量分布相比，判断为HSP27的表达量大时，也评价为应激的积累多。此外，当此数值显著高时，则评价为具有敏感性肌肤。
即，当评价为应激积累高时，可根据所测定的HSP27的表达量的程度来评价应激积累度的程度。当所测定的HSP27的表达量与健康肌肤的HSP27的表达量或样本组的表达量分布相比被判断为显著多时，则该肌肤强烈表现出敏感性肌肤的性质，且对外界刺激的抵抗力显著低于健康肌肤或样本组的平均，极容易发生皮肤问题的可能性高。此外，当所测定的HSP27的表达量与健康肌肤的HSP27的表达量相比仅为少量增加时，或是所测定的HSP27的表达量与样本组的HSP27的表达量分布相比被判断为略大于其平均值时，则该肌肤可被评价为：虽然应激的积累多于样本组的平均值，但仍未达到所谓对外界刺激的抵抗力低而会发生皮肤问题的敏感性肌肤的程度。
实施例
以下，对具体的实施例进行说明，但本发明并不限定于下述实施例。
[实施例1]
(实验1)由紫外线照射引起的皮肤应激积累度的试验
(1)由紫外线引起的应激负荷
以10名健康男性为受试者而实施试验。
作为紫外线照射装置，使用Multiple Solar UltravioletSimulator Model601(solar light公司制)，光源使用150W氙灯。调整照射强度，使受试者背部皮肤出现诱发色素沉积的红斑，并照射紫外线(UVB)170秒。另外，通过对比紫外线照射部位与非照射部位，确认由紫外线引起的应激积累。在人工紫外线照射前及照射后第5天、第11天、第17天，通过胶带剥离法(角质层测试片(horny layer checker)：Asahibiomed制)，采集皮肤角质层样品。
(2)皮肤角质层中的蛋白质的提取方法
在均质化用管中采集0.1%SDS/PBS(-)200μl，于其中放入上述经胶带剥离的角质层测试片，通过使用均质用研杵(pestle)刮擦粘附面，而从胶带上的角质层中提取蛋白质。
(3)皮肤角质层蛋白的定量
通过DC Protein Assay Kit(Bio-Rad制)，对角质层提取液中所含的蛋白量进行定量。
(4)以蛋白质印迹法进行HSP27的定量
使用XP PANTERA Gel(5-20%的梯度凝胶：DRC公司制)，通过SDS-PAGE将1.5μg的角质层蛋白分离后，将蛋白质转印到PVDF膜上，以封闭缓冲液（StartingBlock Blocking Buffer）(Thermo Scientific公司制)进行阻断(blocking)。将一级抗体(HSP27Polyclonal Antibody：Stressgen公司制造)稀释1000倍，将二级抗体(Goat anti-mouse IgG：invitrogen公司制造)稀释10000倍并使其反应后，使用ECLplus(BD Bioscience公司制造)，以LAS-4000mini(富士胶片公司制造)进行检测。以Science Lab2004Multi Gauge(富士胶片公司制造)将所得到的谱带(band)的发光强度进行数值化。根据以预先进行基因重组的HSP27蛋白质为标准品制作的校正曲线，将发光信号的强度作为HSP27的蛋白质量而读取并进行评价。
(5)结果
施加由紫外线引起的刺激(应激)的受试者的角质层HSP27量测定结果如表1、图1所示。确认出紫外线经过长时间而使应激在皮肤上积累。
[表1]
UV照射后的HSP27的变化量
照射后的天数 UV(-） UV(+)
0天 0.02±0.00 -
5天 0.03±0.03 0.02±0.02
11天 0.05±0.04 0.11±0.12
17天 0.05±0.05 0.16±0.24
                   ng/μg蛋白质
因紫外线照射而在皮肤上产生红斑，HSP27随天数增加。此评价为持续刺激的结果为应激积累。
[实施例2]
(实验2)十二基硫酸钠(SDS)引起的低刺激的应激积累试验
为了确认已知会使皮肤的HSP27增加的表面活性剂SDS的刺激是否会作为应激而积累，以健康肌肤的男女8名作为对象，进行以下试验。
(1)应激的负荷
在2天内，1天4次、每隔1小时以10%SDS水溶液清洗左前臂内侧部，以制作成肌肤粗糙(应激状态)。另外，将同一人的右前臂仅以水清洗，作为对照。此外，在确认左前臂的水分丧失量比处理前上升后，开始进行以下的测定。
(2)试样的采集与水分丧失量的测定
在肌肤粗糙处理后(第0天)、第2天、第3天、第5天、第7天、第14天测定水分丧失量，同时通过胶带剥离法采集角质层样品。另外，如第14天的水分丧失量的测定值仍未恢复至肌肤粗糙处理前的测定值时，则将测定延长至第21天、第28天。
另外，水分丧失量的测定用Courage＆Khazaka公司制Tewameter进行测定。角质层为通过角质层测试片(Asahibiomed制)采集。
(3)皮肤角质层中的蛋白质的提取方法
与实验1同样，通过在均质化用管中采集0.1%SDS/PBS(-)200μl，于其中放入上述经胶带剥离的角质层测试片，使用均质用研杵刮擦粘附面，而从胶带上的角质层中提取蛋白质。
(4)皮肤角质层蛋白的定量
通过DC Protein Assay Kit(Bio-Rad制)，对角质层提取液中所含的蛋白量进行定量。
(5)通过蛋白质印迹法进行HSP27的定量
使用XP PANTERA Gel(5-20%的梯度凝胶：DRC公司制)，通过SDS-PAGE将1.5μg的角质层蛋白分离后，将蛋白质转印到PVDF膜上，以封闭缓冲液（StartingBlock Blocking Buffer）(Thermo Scientific公司制)进行阻断。将一级抗体(HSP27Polyclonal Antibody：Stressgen公司制)稀释1000倍，将二级抗体(Goat anti-mouse IgG：invitrogen公司制造)稀释10000倍并使其反应后，使用ECLplus(BD Bioscience公司制造)，以LAS-4000mini(富士胶片公司制造)进行检测。以Science Lab2004Multi Gauge(富士胶片公司制造)将所得到的谱带的发光强度进行数值化。根据以预先基因重组的HSP27蛋白质为标准品制作的校正曲线，将发光信号的强度作为HSP27的蛋白质量而读取并进行评价。
(6)结果
施加了由SDS清洗引起的刺激(应激)的受试者的角质层以及对照的HSP27量的测定结果如表2、图2所示。此外，一并表示水分丧失量的变化。
[表2]
SDS刺激引起的变化
Figure BDA0000367362830000121
由SDS清洗引起的皮肤水分的丧失，于第1天达到峰值并缓慢地恢复，但HSP27到第14天都在增加。此评价为皮肤应激积累。
(实验3)特应性皮炎患者的应激积累度的评价
特应性皮炎患者的皮肤常持续不断地受到来自外界的刺激，皮肤经常处于应激状态。测定处于此种状态下的患者的皮肤应激积累度。
(1)皮肤角质层的采集方法
对诊断为特应性皮炎的4名女性患者的呈现皮肤炎的颈部皮肤，使用角质测试片(2.5cm×2.5cm：Asahibiomed制)，进行胶带剥离，采集角质层。另外，也对未呈现皮肤炎症状的上臂部皮肤以相同操作进行取样。
同样，也对3名健康女性的颈部皮肤、上臂部皮肤进行取样，以作为对照。
(2)皮肤角质层中的蛋白质的提取方法
通过在均质化用管中采集1%SDS/PBS(-)200μl，于其中放入上述经胶带剥离的角质层测试片，以均质用研杵刮擦粘附面，从胶带上的角质层中提取蛋白质。
(3)皮肤角质层蛋白的定量
通过DC Protein Assay Kit(Bio-Rad制)，对角质层提取液中所含的蛋白量进行定量。
(4)通过蛋白质印迹法进行HSP27的定量
使用XP PANTERA Gel(5-20%的梯度凝胶：DRC公司制)，通过SDS-PAGE将1.5μg的角质层蛋白分离后，将蛋白质转印到PVDF膜上，以封闭缓冲液（StartingBlock Blocking Buffer）(Thermo Scientific公司制)进行阻断。将一级抗体(Hsp27Polyclonal Antibody：Stressgen公司制)稀释1000倍，将二级抗体(Goat anti-mouse IgG：invitrogen公司制造)稀释10000倍并使其反应后，使用ECLplus(BD Bioscience公司制造)，以LAS-4000mini(富士胶片公司制造)进行检测。以Science Lab2004Multi Gauge(富士胶片公司制造)将所得到的谱带的发光强度进行数值化。将发光信号的强度作为HSP27的相对量而进行评价。
(5)结果
特应性皮炎患者以及健康者的皮肤角质层中的HSP27量测定结果如表3、图3所示。
[表3]
测定部位 HSP27发光强度
健康者臂部 841417±290490
健康者颈部 861255±517352
特应性皮炎患者(AD)臂部(非皮肤炎部位) 12175507±13096705
特应性皮炎患者(AD)颈部(皮肤炎部位) 27209365±2850409
如表3、图3所表明，健康者的HSP27几乎不存在于角质层中，但从特应性皮炎患者的患部皮肤中则检测出高浓度的HSP27。此外，从特应性皮炎患者的正常皮肤中检测出的HSP27虽未达呈现皮肤炎的部位的程度，但与健康者相比为高浓度。由以上结果可知，经常受到应激的特应性皮炎患者的皮肤为有应激积累。此外，可确认出并非特应性皮炎患部的皮肤的HSP27也相对为高。由以上结果可确认出作为敏感性肌肤的指标，测定HSP27有用。
[实施例3]
(实验3-2)测定常受到外界的应激的面部与较未受到应激的前臂部、臀部皮肤的HSP27，评价积累于皮肤的应激的程度。
试验方法
(1)试样的采集
通过胶带剥离法，从8名健康女性的脸颊、下颌、前臂、臀部采集角质层样品。1个部位采集4片。
(2)皮肤角质层中的蛋白质的提取方法
在均质化用管中放入0.5%chaps缓冲液400μl，在其中放入上述经胶带剥离的角质层测试片，通过均质化而从胶带上的角质层中提取蛋白质。将从1个部位所采集的4片试样一起用1支管进行提取，作为1个样品。
(3)皮肤角质层蛋白的定量
通过DC Protein Assay Kit(Bio-Rad制)，对角质层提取液中所含的蛋白量进行定量。
(4)以ELISA法进行HSP27的定量
以Total human HSP27DuoSet ELISA kit(R&D systems制)测定角质层提取液中所含的HSP27量。将结果作为每单位蛋白量的HSP27量，如表4、图4所示。
另外，标记以平均值±S.E.表示。
[表4]
皮肤部位的HSP27测定结果
部位 测定结果
脸颊 127.6±30.6
下颌 63.85±37.34
前臂 30.02±10.44
臀部 9.92±3.12
pg/μg蛋白质
如表4、图4的结果所表明，HSP27的测定结果为在日常应激高的面部(脸颊)特别高，露出较少的臀部则显著低。由以上结果可表明，HSP27可作为评价皮肤的日常应激的指标。
[实施例4]
(实验4)测定样本组的角质层中的HSP27，作成直方图(histogram)。
试验方法
(1)试验试样的采集
以随机抽选的445名女性作为对象，通过胶带剥离法从脸颊采集角质层试样。试样为从1个部位采集1片。
(2)皮肤角质层中的蛋白质的提取方法
在均质化用管中放入RIPA缓冲液500μl，于其中放入上述经胶带剥离的角质层测试片，通过均质化而从胶带上的角质层中提取蛋白质(提取液A)。进一步将提取后的角质层测试片移至其他均质化用管中，放入含有1%SDS的50mM Tris-HCL缓冲液500μl，通过均质化而从残留于胶带上的角质层中提取蛋白质(提取液B)。提取液A用于HSP27的定量及角质层蛋白的定量，提取液B用于角质层蛋白的定量。
(3)皮肤角质层蛋白的定量
以BCA protein assay(Pierce制)对角质层提取液中所含的蛋白量进行定量。
以提取液A与提取液B的蛋白质量的总计作为总蛋白质(total protein)量。
(4)以ELISA法进行HSP27的定量
以Total human HSP27DuoSet ELISA kit(R&D systems制)测定角质层提取液中所含的HSP27量。结果为对每单位蛋白量的HSP27量进行分析。样本组的HSP27的表达量的频率分布表如表5所示，直方图如图5所示。
[表5]
样本组的HSP27的频率分布表
HSP27(pg/μg总蛋白质）
Figure BDA0000367362830000181
如表5、图5所示，HSP27的表达量分布于从0.4pg/μg总蛋白质～超过50pg/μg总蛋白质的值为止的大范围。平均值为15.0pg/μg总蛋白质。与该频率分布相比，判断为HSP27的表达量大的标准可自由设定，例如，可将平均值15.0pg/μg总蛋白质以上的值判断为HSP27的表达量大，由于10.0pg/μg总蛋白质的累积频率为约50%，所以，也可将超过10.0pg/μg总蛋白质的值判断为HSP27的表达量大。无论如何，均可判断为HSP27的表达量越大，则人体皮肤的应激积累度越大。
另外，实验4的HSP27的表达量为实验3的脸颊部HSP27的表达量的1/10，其原因为在实验4的蛋白质提取方法中，在提取包含HSP27的蛋白质后，使用含有1%SDS的50mM Tris-HCL缓冲液提取角质层中的蛋白质，因而与实验3相比实验4的总蛋白质的检测量增加。实验3、实验4在提取HSP27的工序上无差异，因HSP27的溶解性高，所以用该工序能充分提取。另一方面，通过实验4所追加的以SDS提取的方法，虽可提取出蛋白质的几乎全部量，但无法测定该提取液中的HSP27。由于实验3与实验4的提取工序不同，所以无法对比实验3与实验4的数据，但可进行实验3的数据之间的对比、实验4的数据之间的对比。
[实施例5]
(实验5)关于人体皮肤的应激积累度的问卷调查结果与HSP27量的对比
从实验4的样本组中随机抽出189名，实施有关人体皮肤的应激积累度的问卷调查，将其结果与HSP27的表达量进行对比。
(1)肌肤的敏感性的问卷调查
让受试者选择该受试者的肌肤是“非敏感”、“略为敏感”、“敏感”这3种中的任一种。
对受试者提示下述敏感性的10个主要原因，让受试者自行判断为属于非敏感(不敏感)、略为敏感（稍敏感）、敏感（敏感）中的哪一种。
1使用化妆品曾出现过泛红或感到过搔痒
2曾出现过高清凉感(凉爽性)的化妆品与肌肤不合
3曾出现过含有乙醇的化妆品与肌肤不合
4曾出现过含有香水或香料的化妆品与肌肤不合
5由于肌肤脆弱而慎选化妆品
6曾出现过因按摩等物理性刺激而使肌肤状态变差
7即使在日常生活中，照到紫外线时肌肤就容易泛红、刺痛
8出汗后曾出现过搔痒感
9曾与化妆品或清洁剂不合而出现泛红或搔痒
10曾有过因化妆品造成的肌肤问题而就医的体验
预测选择“敏感”者的人体皮肤的应激积累度高，选择“非敏感”者的人体皮肤的应激积累度低。
(2)肌肤的敏感性的问卷调查结果与HSP27量的关系
肌肤的敏感性的问卷调查结果与HSP27量的关系如表6、图6所示。
[表6]
Figure BDA0000367362830000201
以HSP27量10.0pg/μg总蛋白质为基准，判定为低于基准值的人的人体皮肤的应激积累度低，高于基准值的人的人体皮肤的应激积累度高时，具有与受试者的自我感觉相应的趋势。
(3)户外活动经验的问卷调查
让受试者针对户外活动经验选择“有”、“无”中的任一个。
作为户外活动，例示体育运动或园艺活动。
预测回答为“有”户外活动经验的人的人体皮肤的应激积累度高，回答为“无”的人的人体皮肤的应激积累度低。
(4)户外活动经验的问卷调查结果与HSP27量的关系
户外活动经验的问卷调查结果与HSP27量的关系如表7、图7所示
[表7]
Figure BDA0000367362830000211
以HSP27量10～15pg/μg总蛋白质的范围为基准，判定为低于基准值的人的人体皮肤的应激积累度低，高于基准值的人的人体皮肤的应激积累度高时，具有与受试者的因户外紫外线引起的应激积累度相应的趋势。

Claims (8)

1.一种人体皮肤的应激积累度的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的热休克蛋白即HSP27的表达量与预先测定的正常人体皮肤的HSP27的表达量进行对比。
2.一种敏感性肌肤的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的HSP27的表达量与预先测定的正常人体皮肤的HSP27的表达量进行对比。
3.根据权利要求1或2中所述的评价方法，其特征在于，具备下述工序：采集工序，采集皮肤角质层；测定工序，测定所述采集工序中所采集的角质层细胞的HSP27的表达量；以及对比工序，将所述测定工序中所测定的HSP27的表达量与健康肌肤的皮肤角质层中的HSP27的表达量进行对比。
4.根据权利要求1或2中所述的评价方法，其特征在于，具备下述工序：采集工序，采集受试者的评价对象部位的角质层；测定工序，测定所述采集工序中所采集的角质层中的HSP27的表达量；以及对比工序，将所述测定工序中所测定的HSP27的表达量与具有健康肌肤者的所述评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量进行对比。
5.一种人体皮肤的应激积累度的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的HSP27的表达量与预先或同时测定的样本组皮肤的HSP27的表达量分布进行相对对比。
6.一种敏感性肌肤的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的HSP27的表达量与预先或同时测定的样本组皮肤的HSP27的表达量分布进行相对对比。
7.根据权利要求5或6中所述的评价方法，其特征在于，具备下述工序：采集工序，采集受试者的评价对象部位的角质层；测定工序，测定所述采集工序中所采集的角质层中的HSP27的表达量；以及对比工序，将所述测定工序中所测定的HSP27的表达量与样本组的所述评价对象部位的角质层中的HSP27的表达量分布进行对比。
8.根据权利要求3、4及7中任一项所述的评价方法，其特征在于，采集皮肤角质层的工序通过胶带剥离法进行。
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