TWI600904B

TWI600904B - 皮膚應激蓄積度的評價方法

Info

Publication number: TWI600904B
Application number: TW103104529A
Authority: TW
Inventors: 石渡潮路; 加藤惠美子; 高橋美奈子
Original assignee: 芳珂股份有限公司
Priority date: 2013-02-22
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2017-10-01
Also published as: TW201514494A; CN104007057A; JP2014163749A; JP5775540B2; HK1199098A1

Description

皮膚應激蓄積度的評價方法

本發明涉及人類皮膚的應激蓄積度的評價方法。

人類皮膚時常與外界接觸並受到各種刺激。其刺激的代表性例子為紫外線。紫外線即使在未在外觀上給肌膚造成太大變化的情况下，仍會誘發皮膚細胞的DNA斷裂或膠原蛋白的變性等，而成為皮膚老化的原因，經常持續性地對肌膚造成應激。此外，對女性而言，洗臉、化妝等日常行為也會對皮膚造成刺激，這些刺激會作為潛在的應激而蓄積於肌膚。而且，對於這些刺激(應激)的抵抗力若因某種原因而減少時，即認為是敏感性肌膚。此種紫外線或氧化等導致的皮膚外界刺激的蓄積度在本發明中稱為皮膚的應激蓄積度。另一方面，敏感性肌膚是指雖無明顯的皮膚病變但容易導致不利、有害反應的肌膚。而且，作為此種敏感性肌膚的原因，據說是由於當應激的蓄積達到一定程度，肌膚的敏感性就會提高。此外，敏感性肌膚對外界刺激的抵抗力較健康肌膚低，可謂容易產生皮膚問題的肌膚。近年來，意識到敏感性肌膚的女性有增加的趨勢，在化妝品等方面也越來越期望有刺激更小的產品。

在化妝品的銷售現場，由美容專家進行問診並評價肌膚應激的蓄積狀况和是否為敏感性肌膚，從而選擇對肌膚造成應激(刺激)較小的化妝品。然而，近年來由於郵購銷售等化妝品專家不在場的銷售方法逐漸普及，因此，期望可判定肌膚的應激狀態，並且即使不是專家也能簡便地評價敏感性肌膚的程度。若此可行，即使不依靠專家的問診，也可透過評價使用者肌膚的應激狀態和是否為敏感性肌膚來自行選擇適合的化妝品。此外，可簡單地選擇更適合使用者肌膚的化妝品、化學煥膚(chemical peeling)劑，據此，可避免皮膚的炎症等的肌膚問題、副作用，而且可更加提高化妝品帶來的護膚作用、化學煥膚的施行等的有益性。如上所述，人們正在尋求一種方法，係即使不依靠美容專家的問診也能評價皮膚的外界刺激暴露過程(肌膚應激的蓄積度)，並且客觀地判別是否為敏感性肌膚。

在專利文獻1中公開了以下方法，係在皮膚上塗布化妝品，然後將剝離出的皮膚角質層回收並進行觀察以評價皮膚的敏感性。然而，該方法需對每種化妝品全都進行檢查，此外，無法評價使用者肌膚的應激蓄積度。

在專利文獻2中公開了以下方法，係在皮膚上塗布如辣椒素酯類物質(Capsinoids)的刺激性物質來評價是否為敏感性肌膚。然而，使用如辣椒素酯類物質的刺激性强的物質的試驗方法對受試者來說也不佳。

在專利文獻3中公開了以下方法，測定臉部角質層的鈣衛蛋白(calprotectin)存在量來評價是否為敏感性肌膚。

本申請人發現具有抗氧化作用的DJ-1蛋白質(別名PARK-7蛋白質)作為異位性皮膚炎標記物係有用的，故而提出了專利申請(專利文獻4)。另一方面，近年來逐漸表明該DJ-1蛋白質可作為各種疾病的標記物來利用。專利文獻4公開了特異性識別氧化型DJ-1蛋白質的抗體。其次，提出了透過使用該抗體測定氧化型DJ-1來診斷阿茲海默症、帕金森氏症的方法。此外，專利文獻5公開了透過測定腦脊液、血液等的DJ-1蛋白質來診斷腦損傷性疾病的方法。此外，專利文獻6提出了透過測定DJ-1蛋白質來診斷糖尿病性視網膜症的方法和試劑。

專利文獻

專利文獻1：日本特開平10-295648號公報

專利文獻2：日本特開第2005-296007號公報

專利文獻3：日本專利第4469762號公報

專利文獻4：WO2007/046463號公報

專利文獻5：日本特表第2007-506086號公報

專利文獻6：日本特開第2009-168819號公報

如上所述，期望有評價紫外線或氧化等導致的肌膚應激的蓄積度並客觀地評價是否為敏感性肌膚的方法。較佳為該評價方法並非以外科方式取出皮膚或對皮膚造成刺激等的給使用者造成負擔的方法。本發明的課題在於提供不會對使用者造成負擔，且可評價肌膚的應激蓄積度的使用生物化學指標的新穎的評價方法。

本發明由以下內容構成。

(1)一種人類皮膚的應激蓄積度的評價方法，其特徵在於，將皮膚角質層的DJ-1表現量與預先或同時測定的正常人類皮膚的DJ-1表現量進行比較。

(2)根據(1)所述的評價方法，其具備下述步驟：採集步驟，其係採集受試者的評價對象部位的角質層；測定步驟，其係測定所述採集步驟所採集的角質層中的DJ-1表現量；和比較步驟，其係將所述測定步驟所測定的DJ-1表現量與具有健康肌膚者的所述評價對象部位角質層中的DJ-1表現量進行比較。

(3)根據(1)或(2)中所述的評價方法，其具備下述步驟：採集步驟，其係採集受試者的評價對象部位的角質層；測定步驟，其係測定所述採集步驟所採集的角質層中的DJ-1表現量；和比較步驟，其係將所述測定步驟所測定的DJ-1表現量與樣本組的所述評價對象部位角質層中的DJ-1表現量分布進行比較。

(4)根據(1)至(3)中任一項所述的評價方法，其中，採集皮膚角質層的步驟係透過膠帶剝離法進行。

(5)根據(1)至(4)中任一項所述的評價方法，其中，人類皮膚的應激蓄積度為紫外線損傷或氧化所導致的應激蓄積度。

根據本發明的評價方法，可透過測定角質層中的DJ-1表現量來評價肌膚的應激蓄積度。進而，由於本發明的評價方法以膠帶剝離法等簡便的操作方法來採集評價試樣，所以受試者的負擔較少且任何人均可簡便地進行評價。此外，因為其為生物化學的試驗方法，由任何人進行測定皆可得到相同的結果，因此不需要如以往一樣透過與專家面談的方式進行諮詢。

第1圖為表示HaCaT細胞負荷過氧化氫所導致的氧化應激且測定細胞內蛋白量的結果的圖。

第2圖為表示HaCaT細胞負荷過氧化氫所導致的氧化應激且測定細胞內DJ-1量的結果的圖。

第3圖為表示測定HaCaT細胞負荷過氧化氫所導致的氧化應激時的釋放到培養液中的DJ-1量的結果的圖。

第4圖為研究BSO所導致的蛋白生成所及影響的圖。

第5圖為研究BSO所導致的培養人表皮角化細胞的麩胱甘肽(glutathione)生成濃度的圖。

第6圖為表示負荷麩胱甘肽生成抑制劑(即BSO)與過氧化氫所導致的應激的人表皮角化細胞分泌到細胞培養液中的LDH量的圖。

第7圖為表示負荷麩胱甘肽生成抑制劑(即BSO)與過氧化氫所導致的應激的人表皮角化細胞的細胞內蛋白量的圖。

第8圖為表示負荷麩胱甘肽生成抑制劑(即BSO)與過氧化氫所導致的應激的人表皮角化細胞的細胞內DJ-1量的圖。

第9圖為表示負荷麩胱甘肽生成抑制劑(即BSO)與過氧化氫所導致的應激的人表皮角化細胞分泌到細胞培養液中的DJ-1量的圖。

第10圖為表示培養人表皮角化細胞照射UVB 24小時後的細胞內蛋白量且表示根據UVB照射量的蛋白量减少的圖。

第11圖為表示培養人表皮角化細胞照射UVB 24小時後的細胞內DJ-1量且表示根據UVB照射量的DJ-1量增加的圖。

第12圖為表示培養人表皮角化細胞照射UVB 24小時後的培養上清液中的DJ-1量且表示根據UVB照射量的DJ-1量增加的圖。

第13圖為表示人背部照射UVB(應激負荷)後的DJ-1的測定結果且意味著照射所導致的應激持續殘留於皮膚角質層的圖。

第14圖為表示肌質的問卷調查結果與相對應的DJ-1量的圖。

第15圖為表示習慣性地照射紫外線的經歷的問卷調查結果與相對應的DJ-1量的圖。

第16圖為表示隨機抽選的205名女性的皮膚DJ-1分布的圖。柱狀圖表示DJ-1的每單位角質層蛋白的濃度及人數。折線圖表示其累計人數。

以下，對本發明進行詳細說明。

本發明評價方法的特徵在於以皮膚角質層中的DJ-1的存在量為指標。

DJ-1是分子量為21kDa的細胞內蛋白質。如上所述，其被鑑定為與帕金森氏症有關的蛋白質，之後表明其與皮膚創傷癒合過程中的再上皮化(re-epithelialization)有關。此外，從其立體結構提示也可作為蛋白酶發揮作用。

本發明使用敏感性肌膚、健康肌膚這樣的用語。敏感性肌膚是指雖無明顯的皮膚病變但容易導致不利、有害反應的肌膚。此外，其對外界刺激的抵抗力較健康肌膚低，也可謂容易產生斑疹、肌膚粗糙等皮膚問題的肌膚。另一方面，健康肌膚是指不會表現出如上所述的敏感性肌膚性質的健康且正常的肌膚。

此外，角質層是指位於皮膚最上層的組織。角質層具有保護皮膚不受來自體外的異物、刺激的作用。

本發明中的評價對象部位只要是可得到角質層的部分，則可包含任意部位，作為主要的部位，可列舉面部、頸部、上臂部，根據以往的方法可得到來自這些部位的皮膚的角質層。但是，如前所述，由於外科摘取皮膚等的方法會給使用者造成負擔，故較佳為膠帶剝離、摩擦等可簡便地得到角質層的方法。

如此準備的各試樣中的DJ-1表現量可透過以往已知的方法進行測定。例如，基於與DJ-1的抗體的反應，可使用酶免疫分析法、放射免疫分析法、西方墨點法等的方法。

將DJ-1從各試樣用其自身已知的生物化學方法，例如透過凍融法、超音波破碎法、勻漿法等來製備可溶性組分，並在萃取後快速測定。

由於蓄積了應激的肌膚或敏感性肌膚的角質層中的DJ-1表現量顯著較健康肌膚高，因此以角質層中的DJ-1表現量的多少為指標，可簡便地評價應激蓄積度或肌膚是否為敏感性肌膚。本發明所使用的角質層可透過膠帶剝離法等使用角質膠帶僅採集角質層表層部分的簡單的方法進行採集。此外，本發明可不對皮膚造成紫外線或化學物質等的刺激來測定DJ-1的表現量。因此，可不對使用者造成負擔來評價使用者肌膚的應激蓄積度。特別是可簡單地選擇更適合使用者肌膚的化妝品或化學煥膚劑，據此，可避免皮膚的炎症等肌膚問題或副作用，並進一步發揮化妝品帶來的護膚作用。

本發明的評價方法由下述步驟構成：採集步驟，其係採集角質層；測定步驟，其係測定所述採集步驟所採集的角質層中的DJ-1表現量；和比較步驟，其係將所述測定步驟所測定的DJ-1表現量與健康肌膚角質層中的DJ-1表現量進行比較。此外，本發明的評價方法由下述步驟構成：採集步驟，其係採集角質層；測定步驟，其係測定所述採集步驟所採集的角質層中的DJ-1表現量；和比較步驟，其係將所述測定步驟所測定的DJ-1表現量與樣本組角質層中的DJ-1表現量分布進行比較。以下，對該評價方法進行說明。

首先，將上述所測定的DJ-1表現量與健康肌膚角質層中的DJ-1表現量進行比較。此外，也可測定受試者的某一評價對象部位角質層中的DJ-1表現量，再將所測定的DJ-1表現量與具有健康肌膚者的同一評價對象部位角質層中的DJ-1表現量進行比較。透過使用來自多名具有健康肌膚者的數據平均值，可更為客觀地評價具有健康肌膚者的角質層的DJ-1表現量。

或者，也可測定受試者的某一評價對象部位角質層中的DJ-1表現量，再將所測定的DJ-1表現量與樣本組的同一評價對象部位角質層中的DJ-1表現量分布進行比較。透過使用樣本組的DJ-1表現量分布可更為客觀地進行評價。

如此比較後的結果為，當所測定的DJ-1表現量顯著較健康肌膚的DJ-1表現量大時，或是相較於樣本組的DJ-1表現量分布而判斷為DJ-1表現量大時，即可評價為應激的蓄積大。該健康肌膚的試樣可從測定DJ-1者採集，也可從與測定DJ-1者的不同者採集。此外，該樣本組較佳為以統計上有效的規模來進行隨機抽樣，但也較佳為根據不同目的例如按照性別、年齡來抽取樣本組。

此外，當受試者的某一評價對象部位角質層中的DJ-1表現量顯著較具有健康肌膚者的同一評價對象部位角質層中的DJ-1表現量大時，或是相較於樣本組的同一評價對象部位角質層中的DJ-1表現量分布而判斷為DJ-1表現量大時，也評價為應激的蓄積大。此外，當該數值顯著高時則評價為具有敏感性肌膚。

即，可根據所測定的DJ-1表現量的程度來評價應激蓄積的程度。當所測定的DJ-1表現量相較於健康肌膚或者樣本組的表現量分布而被判斷為顯著多時，該肌膚表現出較强的敏感性肌膚的性質，並且其對外界刺激的抵抗力相較於健康肌膚或樣本組的平均值而顯著低，極易發生皮膚問題的可能性高。

透過試驗例、實施例對本發明進行說明。且本發明不限定於下述實施例。

實施例

試驗例1

測定氧化應激所導致的來自皮膚細胞中的DJ-1量的變化。製作用於確認DJ-1功能的弱化(knockdown)DJ-1基因的細胞，並進行氧化應激負荷試驗。

使用來自人的細胞株，即HaCaT細胞(J.Cell Biol.106：761-771(1988).)(購自DKFZ(Deutsches Krebsforschungszentrum))，確認氧化應激與DJ-1蛋白的關係。此外，透過siRNA抑制DJ-1基因的表現(弱化)，確認 DJ-1蛋白表現量的變化。

(1)HaCaT細胞培養及過氧化氫(H₂O₂)處理所導致的氧化應激的負荷及siRNA處理導致的DJ-1基因的弱化操作

將HaCaT細胞用PBS(-)洗滌後，透過胰蛋白酶處理剝離細胞，以1200rpm離心3分鐘得到細胞。使用含10%FBS的DMEM培養基進行培養，以5000個細胞/cm²的密度接種到培養瓶中，每隔2至3天在生長中(subconfluent)的狀態下進行繼代。

將HaCaT細胞用含10%FBS的DMEM培養基以2.1×10⁵個細胞/well接種到12孔盤中並培養24小時後，將siRNA(終濃度3nM、Hs_PARK7_6 FlexiTube siRNA,SI02662107,Qiagen公司製)、轉染試劑(2μl/孔，HiPerFect Transfection Reagent,301707,Qiagen公司製)與所述培養基混合，在室溫下放置10分鐘。接著添加100μl/孔的該混合液。未處理的細胞作為對照組。

另外，作為弱化操作的陰性對照組，使用AllStars陰性對照siRNA(Qiagen公司製)進行同樣的操作。

培養48小時後，添加H₂O₂(Wako製)0、250、500、750、1000μM，24小時後回收培養上清液，將細胞用PBS(-)洗滌後，添加100μl/孔的細胞裂解液(50mM Tris-HCl,1mM Na₃VO₄,0.4% NP-40,120mM NaCl)，從而得到細胞溶解液。

(2)細胞蛋白量的測定

使用BCA蛋白套組(Thermo Scientific公司製)測定細胞溶解液的蛋白量。根據套組實驗指南進行測定。

(3)DJ-1表現量的測定

使用DouSet Park7/DJ-1 ELISA套組(R&D公司製)測定上清液中及細胞溶解液中的DJ-1量。根據套組實驗指南進行測定。

(4)結果

過氧化氫(H₂O₂)所導致的應激負荷的各細胞的細胞蛋白量如第1圖所示。另外，培養上清液中的DJ-1量、細胞溶解液(細胞內)的DJ-1量分別如第2圖、第3圖所示。且測定結果用每3個孔的平均值±標準偏差(S.D.)表示。

H₂O₂濃度依賴性地使細胞內蛋白量减少。

另外，可確認H₂O₂作為强的應激而對細胞造成影響。

進而，培養液的H₂O₂濃度在750μM的條件下，用DJ-1 siRNA處理後的弱化細胞與陰性對照組相比，細胞內蛋白量顯著减少。(第1圖)。

無論在哪種細胞中，當培養液中的H₂O₂濃度為1000μM時，細胞中的DJ-1量均增加。

另一方面，培養液中的H₂O₂濃度低時培養上清液中的DJ-1量也增加。

可確認過氧化氫所導致的氧化應激在細胞內外均使DJ-1增加(第2、3圖)。

進而，無論培養液中是否有H₂O₂，陰性對照組的細胞(非弱化細胞)與對照組相比細胞內DJ-1量均增加。認為這是轉染處理所產生的影響。

透過DJ-1 siRNA處理，細胞中的DJ-1量與陰性對照組相比降低約40%。

從以上的試驗可知，在來自人類皮膚的HaCaT細胞中，為了應對應激而生成DJ-1，其生成量因siRNA干擾而被抑制。

試驗例2

根據試驗例1可確認DJ-1基因為了應對應激而表現DJ-1。接著，使用人表皮角化細胞(角質形成細胞)初代培養細胞，測定氧化應激所導致的DJ-1量的變化。另外，測定改善了氧化所導致的細胞損傷的麩胱甘肽生成能力降低且應激抵抗力降低的角化細胞的DJ-1量的變化。

(1)麩胱甘肽合成抑制劑所導致的氧化應激抵抗力降低的細胞的製作

將人表皮角化細胞(Lonza公司)用PBS(-)洗滌後，透過胰蛋白酶處理剝離細胞，以1200rpm離心3分鐘得到細胞。使用EpiLife培養基(Life Technologies)進行培養，以5000至7000個細胞/cm²的密度接種到培養瓶中，每隔4至7天在生長中的狀態下進行繼代。

將人表皮角化細胞以1×10⁵個細胞/35mm盤接種到EpiLife培養基(Gibco公司)中，培養至成為約5成的細胞密度。

使用麩胱甘肽合成抑制劑L-Buthionine-sulfoximine(BSO：Sigma-Aldrich公司)，確定首先導致麩胱甘肽合成抑制的最適BSO濃度。

將BSO添加到細胞培養液中，24小時後用胰蛋白酶處理細胞並回收，進行麩胱甘肽測定。將檢測不到麩胱甘肽的BSO濃度作為接下來的氧化應激試驗條件。

(2)過氧化氫(H₂O₂)所導致的氧化應激負荷試驗的實施

將人表皮角化細胞(Gibco公司)以1×10⁵個細胞/35mm盤接種到EpiLife培養基(Gibco公司)中，培養至成為約5成的細胞密度。接著，添加BSO使成為上述(1)所確定的BSO濃度(50μM或100μM)，進一步經過24小時後，添加過氧化氫使成為0、0.5、1mM。添加過氧化氫後進一步培養24小時，回收培養上清液。另外，將細胞用PBS(-)洗滌後用100μl細胞裂解液進行回收。

使用所得到的培養上清液及細胞測定LDH(乳酸脫氫酶)量、蛋白量、DJ-1量。

(3)蛋白定量

使用BCA蛋白套組(Thermo Scientific公司製)測定細胞溶解液的蛋白量。

(4)LDH的測定

使用細胞毒性偵測套組^PLUS(LDH)(Roche Applied Science公司)測定培養上清液中的LDH。根據套組實驗指南進行測定，用490nm處的吸光度表示。

(5)DJ-1表現量的測定

使用DuoSet Park7/DJ-1 ELISA套組(R&D公司製)測定上清液中及細胞溶解液中的DJ-1量。根據套組實驗指南進行測定。

(6)麩胱甘肽測定

將透過胰蛋白酶處理回收的細胞用PBS(-)洗滌，用100μl的MES緩衝液再懸浮。透過超音波處理1分鐘作為細胞溶解液，使用麩胱甘肽試驗套組(Cayman Chemical公司)測定麩胱甘肽量。根據套組實驗指南進行測定。

(7)結果

添加了BSO的細胞中的蛋白量如第4圖所示，麩胱甘肽量如第5圖所示。

另外，添加過氧化氫所導致的應激負荷的細胞培養上清液中的LDH量如第6圖所示，DJ-1量如第7圖所示。

另外同樣地，細胞中的蛋白量如第8圖所示，DJ-1量如第9圖所示。

表明對蛋白質生成沒有影響且抑制麩胱甘肽生成的BSO濃度為50μM或100μM。其次，表明在該濃度下麩胱甘肽生成被抑制的細胞因過氧化氫導致的氧化應激而使LDH的釋放被促進(第6圖)、蛋白質量减少(第7圖)。

另外，可確認DJ-1也依賴於過氧化氫的濃度而上升(第8圖、第9圖)。

從以上的試驗例1、試驗例2的結果表明，DJ-1反映了伴隨人表皮氧化的應激，其生成量受麩胱甘肽生成能力、基因干擾導致的複製低下的影響。另外，可知越是沒有氧化應激抵抗力的細胞越是生成DJ-1。即，判斷為細胞的抵抗力降低時DJ-1增加。

試驗例3

與試驗例2同樣，使用人表皮角化細胞(角質形成細胞)初代培養細胞，測定紫外線照射所導致的DJ-1量的變化。

(1)人表皮角化細胞的培養及紫外線的照射方法

將人表皮角化細胞(Gibco公司)以1×10⁵個細胞/35mm盤接種到EpiLife培養基(Gibco公司)中，在培養第3天將細胞用PBS(-)洗滌後加入1ml PBS(-)，使用三共電氣製的燈，將UVB以0.2mW/cm²的强度照射10、20、30mJ/cm²。照射後更換成培養基，培養24小時後回收培養上清液，將細胞用200μl細胞裂解液回收，與試驗例1、試驗例2同樣地進行蛋白定量、DJ-1量的測定。

(2)結果

培養上清液中的蛋白量如第10圖所示。另外，培養細胞中的DJ-1量如第11圖所示，上清液中的DJ-1量如第12圖所示。

人表皮角化細胞照射UVB，24小時後的DJ-1量依賴於UVB的照射光線量而受到損傷且蛋白量减少。另一方面，細胞內、細胞外的DJ-1量均增加，尤其是培養上清液中的增加量較大。

根據以上的試驗例1至3，表明人表皮角化細胞的DJ-1值反映了應激的水平。

試驗例4

由於試驗例1至3表明在人表皮角化細胞中DJ-1反映了應激，所以對是否反映人實際的皮膚應激進行試驗。即，作為應激對人類皮膚直接照射紫外線，從而觀察、測定DJ-1表現量的變化。

(1)試驗方法

<紫外線照射>

具有健康肌膚的10名男性的背部使用紫外線照射裝置(DERMARAY、Terumo Clinical Supply Co.,Ltd.製)，照射20、40、60、80、100mJ/cm²紫外線。根據照射次日的紅斑確定最小紅斑劑量(Minimum Erythema Dose：MED)。使用該值在背部照射相當於0、0.5、1.0MED的紫外線，且在照射7、14天後使用角質層測試片(ASAHIBIOMED公司)透過膠帶剝離法採集角質層。

<角質層中DJ-1測定>

在放入了玻璃珠與500μl T-PER緩衝液(Thermo scientific公司)的試管中，放入採集了角質層的角質層測試片，用漩渦混勻器振動25分鐘來萃取角質層蛋白。各樣品的蛋白量用BCA蛋白試驗套組(Thermo Scientific公司)進行測定。測定為在10μl角質層樣品中加入200μl按照試劑A：試劑B=50：1混和的液體，在60℃培養30分鐘後，測定562nm處的吸光度。同時，用胎牛血清白蛋白(BSA)製作標準曲線。從該標準曲線與吸光度的值計算蛋白量。

角質層萃取液中所包含的DJ-1量使用人類Park7/DJ-1 DuoSet(R&D systems公司)進行定量。

(2)結果

每單位蛋白的DJ-1測定結果如第1圖第13圖所示。紫外線照射7、14天後與非照射部位相比，照射0.5、1.0MED紫外線的部位角質層中DJ-1量顯著增加。

表明透過測定DJ-1可確認人類皮膚應激的狀態。

試驗例5

由於試驗例1至3表明了在人表皮角化細胞中DJ-1反映了應激，所以對是否反映人實際的皮膚應激進行試驗。即透過調查問卷對肌質(敏感性)進行提問，並比較其回答與臉頰中DJ-1量。

(1)試驗方法

<調查問卷>

對具有健康肌膚的575名女性關於肌質(敏感性)進行提問，使其回答“不敏感”、“稍敏感”、“敏感”中的任一種。

<角質層採集>

從做了調查問卷的具有健康肌膚的575名女性的臉頰部使用角質層測試片(ASAHIBIOMED公司)透過膠帶剝離法採集角質層。

<角質層中DJ-1測定>

(2)結果

調查問卷的結果如下，非敏感：281名、稍敏感：193名、敏感：101名。每位調查問卷回答者的單位蛋白的DJ-1測定結果如第14圖所示。可知越敏感DJ-1量越高。

試驗例6

由於試驗例1至3表明了在人皮膚角化細胞中DJ-1反映了應激，所以對是否反映人實際的皮膚應激進行試驗。即透過調查問捲進行如下提問，以往是否有海上運動等習慣性地照射紫外線的經歷，並比較其回答與臉頰中DJ-1量。

(1)試驗方法

<調查問卷>

對具有健康肌膚的386名女性進行如下提問，以往是否有海上運動等習慣性地照射紫外線的經歷，使其回答“無”、“有”中的任一種。

<角質層採集>

從做了調查問卷的具有健康肌膚的386名女性的臉頰部使用角質層測試片(ASAHIBIOMED公司)透過膠帶剝離法採集角質層。

<角質層中DJ-1測定>

(2)結果

調查問卷的結果如下，無：223名、有：163名。每位調查問卷回答者的單位蛋白的DJ-1測定結果如第15圖所示。可知越是具有習慣性地照射紫外線的經歷的回答者DJ-1量越高。

試驗例7

為了掌握人類皮膚的應激蓄積狀態，以大量受試者為對象來測定角質層的DJ-1。

(1)試驗方法

1)試驗試樣的採集

將隨機抽選的205名女性作為對象，從臉頰透過膠帶剝離法採集角質層樣品。樣品為1個部位採集1枚

2)皮膚角質層中DJ-1測定方法

透過與試驗例4同樣的方法進行。

在放入了玻璃珠與500μl T-PER緩衝液(Thermo scientific公司)的試管中，放入採集了角質層的角質層測試片，用漩渦混勻器振動25分鐘來萃取角質層蛋白。各樣品的蛋白量用Pierce BCA蛋白試驗套組(Thermo Scientific公司)進行測定。測定為在10μl角質層樣品中加入200μl按照試劑A：試劑B=50：1混和的液體，在60℃培養30分鐘後，測定562nm處的吸光度。同時，用胎牛血清白蛋白(BSA)製作標準曲線。從該標準曲線與吸光度的值計算蛋白量。

角質層萃取液中所包含的DJ-1量使用人類Park7/DJ-1 DuoSet(R&D systems,DY3995E)進行定量。

(2)結果

測定結果如第16圖所示。

如第16圖所示，DJ-1的表現量分布於從0.3pg/μg總蛋白質到超過5.0pg/μg總蛋白質的值為止的大範圍。平均值為2.6pg/μg總蛋白質。與該頻率分布相比而判斷為DJ-1的表現量大的標準可自由地進行設定，例如，將平均值為2.6pg/μg總蛋白質以上的值判斷為DJ-1的表現量大。或者，由於2.3pg/μg總蛋白質的累積頻率為約50%，所以也可將超過2.3pg/μg總蛋白質的值判斷為DJ-1的表現量大。其次，可判斷為DJ-1的表現量越大則人類皮膚的應激蓄積度越大。

Claims

一種人類皮膚的應激蓄積度的評價方法，其係具備：採集步驟，係以外科方式以外的方式採集受試者的評價對象部位的角質層；比較步驟，係將前述所採集之角質層的DJ-1表現量與預先或同時測定的正常人類皮膚的DJ-1表現量進行比較；所述人類皮膚的應激蓄積度為紫外線損傷或氧化所導致的應激蓄積度。
如申請專利範圍第1項所述的評價方法，其進一步具備測定步驟，其係測定所述採集步驟所採集的角質層中的DJ-1表現量；所述比較步驟，係將所述測定步驟所測定的DJ-1表現量與具有健康肌膚者的所述評價對象部位角質層中的DJ-1表現量進行比較。
如申請專利範圍第1項所述的評價方法，其進一步具備測定步驟，其係測定所述採集步驟所採集的角質層中的DJ-1表現量；所述比較步驟，係將所述測定步驟所測定的DJ-1表現量與樣本組的所述評價對象部位角質層中的DJ-1表現量分布進行比較。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的評價方法，其中，所述外科方式以外的方式係膠帶剝離法。